JPS5878594A - 抗生物質ｂ−４１ｄ、ｅ及びｇの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は駆虫剤及び殺ダニ剤とし【有用な抗生物質Ｂ−
４１Ｄ　、　ＩＣ及びＧを工業的に有利に製造する方法
に関する。

Ｂ−４１Ｄ　、　ｌ及びＧは、ストレプトマイセス属に
属するＢ−４１生産菌１例えばＢ−４１−１４１株の培
養によって得られる抗生物質であって、次の構造式を有
し、 Ｂ−４１Ｄ：Ｒ５−１１Ｂ−４１１ Ｂ−４１Ｇ：Ｒ■ａｎ。

動物に寄生する嬬虫とくに線虫及び動植物に寄生するダ
ニの駆除等に有効であることは、特開昭１８−３２４８
１号公報、特願昭５５−１５１１４１号明細書及び特願
昭Ｓ＠　−７０１１号明細書に知られている。

ところで、通常の方法でＢ−４１生産菌を培養した場合
、上記構造式に対応して２５位がメチル基であるＢ−４
１ＡＩ、ムＳ　＊　Ｂｌ及び２５位がエチル基であるＢ
−４１Ａ４　、　Ｂｓ　、！２などを同時に生産するた
め％２Ｓ位がイソプロピル基である最も活性なり−４１
Ｄ　、　ｌ及びＧをより収率よく生産する方法が望まれ
る。

本発明者等は％Ｂ−４１生産菌を培養するに際し、培地
に特定の物質を添加するととによな。

Ｂ−４１Ｄ　、　Ｒ及びＧが高収量で生産されることを
見い出した。

本発明は、ストレプトミセス属に属するＢ−４１生産菌
を培養してＢ−’４１Ｄ、ｌ及びＧを製造するに際し、
バリン、イソ酪酸、イソ吉草酸。

！−ケトイソ吉草酸、イソカプロン酸、これらの酸の塩
またはエステル、イソブタノール及びそのエステルから
選ばれた１種または２種以上を培地−に添加することを
特徴とするＢ−４１Ｄ　。

罵及びＧの製造法である。

Ｂ−４１生産曹１例えばストレプトミセス属Ｂ−４１−
１４６株は通産省工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第１４３１号として寄託されており、その菌学
的性状は特開１８Ｓｏ　−Ｈ４２２号公報に詳しく記載
されている。本発明において使用する菌には、上記Ｂ−
４１−１４１１株を例えばＸ線照射、紫外線照射、放射
線照射１人工変異剤を用いて人工変更したものであって
、Ｂ−４１Ｄ　、　ｍｅ及びＧの生産能を有するものは
包含される。

本発明の方法におい【培地中に添加するバリンは５体又
はＤＬの光学異性体が用いられる。

バリン、イソ酪酸、イソ吉草酸％２−ケトイソ吉草酸、
インカブ−・ン酸のうちではＬ−またはＤＬバリン、イ
ソ酪酸、２−ケトイソ吉草酸は好適に用いられる。これ
らの酸の塩としてはナトリウム塩、カリウム塩などがあ
げられ、エステルとしてはメチル、エチル、ｎ−ブチル
のような低級アルキルエステルまたはベンジルエステル
があげられる。イソブタノール及びそのエステルも用い
、ることかでき、エステルとしては酢酸、プロピオン酸
のような低級飽和脂肪鎖とのエステルがあげられる。上
記添加物のｕ（３−ラベル化合物を用いた実験では生成
物の２Ｓ位にイソプロピル基が特異的に取り込まれてい
ることが確認された。

培地に対するこれら添加物の添加量は一般的にｋｔ　Ｏ
，００１〜Ｉ　Ｗ、ｉ　９％、好ましくは０．００５〜
（ＬｏｔＷ／Ｑ　％が添加される。添加時期は培地の調
製時または培養中の適宜の段階で添加してもよい。

Ｂ−４１生産菌の培養に用いられる培地は該微生物が利
用しうる栄養源を含むものならよく、上記添加物を添加
するほか、炭素源としてはグルコース、しよ糖、殿粉、
グリセリン、水あめ、糖蜜。

大豆油などが使用され、窒素源としてはスキム建酵母菌
体、コーンスチープ・リカー、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム等が使用される。

このはか必要に応じて炭酸カルシウム、食塩、塩化カリ
、リン酸塩類を添加することができる。

培養法とし【は、一般の抗生物質を生産する方法と同じ
く液体培養法、とり！ＩＣ深部培養法が最も適している
。培養は好気的条件下で行なわれ、培養に適当な温度は
２２〜３０℃であるが多くの場合２８℃付近で培養する
。培地の液性は概ねｐＨ５，５〜ｇｏの間でよく、望ま
しくはｐＨ約６．５〜７．５の中性近傍でよりよい結果
をうろことができる。培養はＢ−４１Ｄ　、　ｌおよび
Ｇの蓄積濃度が最大となる進行なうが、これに要する時
間は、培養の方法、温度、培地の組成など条件によって
差はあるものの、通常約５〜１５日程度である。

Ｂ−４１各成分の検定にあたっては次の方法が用いられ
る。すなわち、培養物３−を小試験管にとり、アセトン
Ｔ−を添加量とうして抽出しμｔをＴＬＯ用板（メルク
社製％Ｋｉｅａｓ１ｇｓｌ　＠ＯＦ２５４）上の所定の
位置に吸着せしめ、これなジオキサン：四塩化炭素（ｔ
ａ　：　１１２　）で４時間展開後。

二波長クロマトスキャナを用いて２４５ｏｍの波長（ブ
ランクは、１８０ｎｍ　）で測定し、その吸収量を標準
物質のそれと比較し、算出する。

Ｂ−４１Ｄ　、　ＫおよびＧを培養物から採取するにあ
たっては、活性炭、アルミナ、シリカゲルなどの吸着剤
、ダイヤイオン）ＩＦ−１０、ＨＰ−２０（三菱化成社
製）などの合成吸着剤、アビセル（旭化成社製）、Ｐ紙
などの固定剤、イオン交換樹脂、イオン交換ゲルｒ過剤
などが使用され５るが、以下に示す採取方法が最も効果
的である。

培養物を、けいそう土などのｅ過助剤を用いて戸別し、
ここで得られたケーキをメタノール抽出することにより
、目的物はメタノール水に溶解してくる。これに水を加
えた後、ｎ−へキサンで抽出し、これを減圧下で濃縮す
ることにより、目的物を含有するオイル状物質が得られ
めカラムに吸着せしめ、Ｑ−ヘキサンＳアセトン（９ｓ
：５）で溶出し、Ｂ−４１Ｄを含有するフ５りＶ＝ｓ：
ｙ、Ｂ−４１Ｂを含有するフラクションおよびＢ−４１
Ｇを含有するフラクションを集める。各フラクションは
減圧下で濃縮し、ここで得られた残置を少量のｎ−ヘキ
サン：酢酸エチル（２１１）Ｋ溶解し、室温に放置する
とＢ−４１Ｄ　、　Ｂ−４１Ｋ　、　Ｂ−４１Ｇカそれ
ぞれ結晶状に得られる。

本発明の方法によれば特［Ｂ−４１Ｄ　、　Ｉｌｉおよ
びＧ成分の生成比率が非常に高く、また生成量も増大す
るので、分離精製が容易になり工業生産上きわめて有利
な方法である。

以下実施例を挙げて１本発明を具体的に説明する。

実施例１゜ 種培地（シュクロース１チ、ポリペプトンα３５−１Ｋ
２ＨＰＯ４１０５Ｔｏ　）　　１０・−を５００５ｇ工
＃レンマイヤーフラスコに分注し、滅菌後、Ｂ−４１−
１４％株を１白金耳接種し、４８時間２８０で培養し、
種培養とした。

この１ｗｌ１を主培地（グルコース４チ、大豆粉１チ、
スキムミルク１９Ｇ　、Ｈａｃｌ　（Ｌ３　％　、　コ
−ｙスチープ・す、カー１２チ及びｃｆｉｃｏ、　Ｑ、
０５９６）　２０−含むｔｏｏ　ｓｇエルレンマイヤー
フラスコ［４！８１し、２１℃で３日振と５培養したの
ち、ＤＬ−バリア　−２−’ＣヲＩＬ０１　ＷＡＩＴｏ
　Ｋ　ｆＬ　ルヨ５１１Ｃｆｌｋ加し、さらに２日間培
養した。培養終了時、培養物中に生成したＢ−４１群抗
生物質のうちＢ−４１Ｄの占める割合は約１１５％、Ｉ
Ｃの割合は１畠チ及びＧの割合はＳチであった。なお添
加物なしに培養したときり、ｌおよびＧの占める割合は
、それぞれｓｙ＊、ｓチおよび２チであった。

ＤＬ−バリン−２−“Ｃを添加して培養した培養物をｒ
過し、菌体をメタノール抽出した。

これに水を加えて５０嗟メタノール溶ｉ［ＫＬ。

ｎ−ヘキサンで抽出した。得られたｎ−ヘキナン層は芒
硝で脱水後、減圧下で濃縮し、オイル状物質を得た。こ
のオイル状物質なシリカゲルカラムさら［ａ−バーカラ
ム（メルク社製）で精製し、Ｂ−４１物質の各成分を単
離した。得られた各成分中の“Ｃの敗り込み、４００メ
ガヘルツの”　Ｃ−’ＮＭＲ及びマス・スペクトルで測
定したトコ口、Ｄ　Ｌ　−Ａ　リｙ　−２−”　Ｏｆ）
　’　ＣカＢ　−４１Ｄ　、　ＲおよびＧのＣ−２５位
に特異的に取り込まれている事がわかった。

実施例２ 実施例１０種培養物をグルコース＠’ｌｘ、アスパラギ
ン（Ｌｍ％、ロイシンａｓｈ、リン酸第２カリウム＋Ｌ
ｏｓｓ、硫酸マグネシウムＱ、０５チ、食塩ｏ、ｏｓｌ
、塩化カルシウム０．０２％、硫酸亜鉛αＯＯＳチ、硫
酸マンガン１００１チ、硫酸第１鉄（ＬＯＯ２嗟及び微
量のビタミン類からなる培地２Ｏ−Ｋｔ−づつ接種し、
Ｌ−バリン、イソ酪酸。

２−ケトイソ吉草酸、インカプロン酸及びイソブタノー
ルを第１表１．−示す条件で添加して、２１Ｃで８日間
振と５培養した結果、第１表に示す結果が得られた。

第　　１　　表 実施例龜 実施例ＩＫ示した種培地を調製し、その６・・ｍヲ２＠
０（１−エルレンマイヤーフラスコに分注し、滅菌した
。これｉ（Ｂ−４１−１４６株を１白金耳縁種し、４１
時間２１Ｃで培養を行ない、この２００１−エルワンマ
イヤーフラスコ２本ヲ３０１ジャー・ファメンタＫＩ４
した。ジャー・ファメンタには、グルコース４チ、大豆
粉’ｑｋｓコーンスターチ（Ｌ５１！、スキムミルク１
チ、コーンスチープ・リカ−０，２１，食塩Ｑ、８％及
び０ａＯ０３ａｏｓ　％を含有する培地２０Ｊを仕込み
、ｐｌＮを７．２〜７．５ＫＩＩｉ１６し、十分に滅麹
しておいた。

Ｍ養期間中）’！、２１℃、内圧（Ｌ５　Ｌ９　／　ｃ
ｊに保持した。３日培養後ＤＬ−バリンをａｏｔｌ添加
しさらに５日間培養した。Ｂ−４１群抗生物質総生産量
のうちＤは＠８−（重量比）の割合を占めた。同条件で
ＤＬ−バリンを添加せず培養した場合には、Ｂ−４１Ｄ
の割合はａＳチにとどまった。ＤＬ−バリンを添加し【
得られた培養物２０ＪのｐＨ″ｔｉｔ酸で３とし、セラ
イトＩ　ＫＦを加えて加圧Ｐ遇する゛と約３９のケーキ
が得られた。

これをＩＳＡのメタノールで抽出し、ｒ別し、得られた
メタノール溶液Ｉ　ＳＪＫ水１・１を加え、２０Ｊのｎ
−ヘキサンで抽出した。得られたｎ−へキサン層は芒硝
で脱水後、４０〜４５　Ｃ水浴中で減圧下論縮すると！
３１のオイルが得られた。これを約３０−のｎ−ヘキサ
ンにとかし、あらかじめ２峙のシリカゲルなｎ−ヘキサ
ンでつめであるカラムＫｖＬ着せしめ、ｎ−ヘキサン：
アセトン（９５：５）で゛展開した。その結果目的物質
Ｂ−４％Ｄを含有するフラクションをＩＳＡ得た。これ
らを前述と同様の条件で濃縮するとＢ−４１Ｄの粗結晶
が得られた。これをｎ−ヘキサン：酢酸エチル（２０１
）に溶解ｖｋ。

室温に放置し、析出する結晶を１取し、Ｂ−４１ｐの精
結晶２１０■を得た。

特許出願人　三共株式会社 代、埋入　弁理士樫出庄治 手続補正書（自発） 昭和５７年１１月１５日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第１７８０６１号 ２、発明の名称 抗生物質Ｂ−４１Ｄ、Ｅ及びＧの製造法３、補正をする
者 事件との関係　特許出願人 住所　〒１０３東京都中央区日本橋本町３丁目１番地の
６名称　　　（１８５）三共株式会社 代表者　取締役社長　　河村喜典 ４、代理人 居所　〒１４０東京部品川区広町１丁目２番５８号三共
株式会社内 ５、補正により増加する発明の数　　なし６、補正の対
象　　明細−の発明の詳細な説明の欄７、補正の内容　
別紙の通シ １、　明細書第１０頁３行目の「取り込み」ｔ「堆り込
みを」と訂正する。

２　同第１１頁２行目の「Ｄ−４１Ｊを「Ｂ−４１Ｊと
訂正する。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ストレプトマイセス属に属する抗生物質Ｂ−４１
   生産菌を培養してＢ−４１Ｄ　、　ｌ及びＧを製造する
   に際し、バリン、イソ酪酸、イノ吉草酸％２−ケトイソ
   吉草酸、イソカプロン酸。 これら酸の塩ま、たはエステル、イソブタノール及びそ
   のエステルから選ばれた１種または２種以上を培地に添
   加することを特徴とするＢ−４１Ｄ　、　ｌ及びＧの製
   造法。 １Ｂ−４１生産菌がストレプミセス属Ｂ−４１−１４１
   株である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 寡　Ｂ−４１Ｄを製造するための特許請求の範囲第２項
   記載の製造法。 ４　ストレプトミセス属Ｂ−４１−１４＠株を、Ｌ−ま
   たはＤＬ−バリン、イソ酪酸、２−ケトイソ吉草酸およ
   びこれらの酸の塩またはエステルから選ばれた１糧また
   は２種以上を添加した培地に培養してＢ−４１Ｄを製造
   する特許請求の範囲第１項記載の製造法。