DE1954223A1 - Herstellung von eiweissreicher Zellsubstanz - Google Patents

Herstellung von eiweissreicher Zellsubstanz

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Description

1 95A223
Kennzeichen 2121 ^ ** w
Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann Dr.R. Koenigsberger - Dipl. Phys. R. Holzbau«-
Dr. F. Zumstein jun.
Patentanwälte
8 München 2, Bräuhausstraße 4/III
STAMICARBON N.V., HEERLEN (die Niederlande)
Herstellung von eiweissreicher Zellsubstanz
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zu der Herstellung von Eiweiss durch das Züchten eiweissreicher Eumycetes unter aeroben Bedingungen in einer dazu geeigneten KulturflUssigkeit,
Als Kohlenstoffquelle für eine solche Eiweisssynthese hat man früher bereits verschiedene Rohstoffe vorgeschlagen. So ist die Anwendung von kohlenhydrathaltigem Material, wie z.B. Melasse, für diesen Zweck schon längst bekantt; als weitere Kohlenstoffquelle werden in letzterer Zeit Kohlenwasserstoffe genannt.
Es wurde nunmehr gefunden, dass unter Anwendung einer KulturflUssigkeit, welche als Kohlenstoffquelle ein Gemisch von aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit weniger als 8 C-Atome enthalt, auf technisch interessante Weise und in hoher Ausbeute eiweissreiche Zellmasse gewonnen werden kann. Eine solche sehr billige Kohlenstoffquelle steht in der Praxis in reichlichem Masse zur Verfügung in Form von Waschwasser, das bei der Herstellung von Cyclohexanon aus Cyclohexan oder Cyclohexanol durch Auswaschen des rohen Endproduktes mit Wasser und/oder verdünnter Lauge anfällt.
Bei Anwendung einer KulturflUssigkeit, welche als Kohlenstoffquelle eine Mischung von aliphatischen Mono - und Dicarbonsäuren enthält, kann nachweislich ein ausgezeichnetes Resultat erhalten werden, falls während der Zucht von eiweissreichen Eumycetes der pH-Wert der KulturflUssigkeit auf einem Wert zwischen 5,5 und 8 aufrechterhalten wird. Weil während des Wachstums des Mikro-
009822/U27
Organismus die Säure-konzentration in der KulturflUssigkeit nachlässt, empfiehlt es sich während dieses Wachstums ein pH-erniedrigendes Mittel, wie z.B. Schwefelsäure oder eine derartige Säure, beizugeben, oder von einer gepufferten KulturflUssigkeit auszugehen.
Die Erfindung schafft deshalb ein Verfahren zu der Herstellung von Eiweiss durch das Züchten eiweissreicher Eumycetes unter aeroben Bedingungen in einer dazu geeigneten KulturflUssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man in der KulturflUssigkeit ein Gemisch aus aliphatischen Mono- und Dicarbon- ^ säuren mit weniger als 8 C-Atomen als Kohlenstoffquelle verwendet und während der Zucht des Mikroorganismus das pH der KulturflUssigkeit auf einem Wert zwischen 5,5 und 8 aufrechterhält.
Das erfindungsgemässe Verfahren is mit Rücksicht auf die stete Zunahme der Cyclohexanonproduktion von grosser praktischer Bedeutung für die Verarbeitung des bei dieser Produktion anfallenden Waschwassers. In der Praxis darf nämlich dieses Vifaschwasser meistens nur nach einer kostspieligen Reinigung, beispielsweise durch biologischen Abbau der im Waschwasser vorkommenden organischen Säuren, abgelassen werden. Erfindungsgemäss findet nich nur eine Reinigung des betreffenden Waschwassers statt, es wird ausserdem, ohne dass eine Vorreinigung erforderlich ist, ein wertvolles Produkt erhalten.
Zur Durchfuhrung des erfindungsgemässen Verfahrens können mehrere Gattungen der Eumycetes verwendet werden werden, wie z.B. die Gattungen Candida, Trichosporon, Oospora, Hansenula, Pullularia, Aspergillus, Penicillium, Venturia und Botrytes. Ausgezeichnete Ergebnisse werden erhalten bei Anwendung von der Gattung Candida angehörigen Hefestä'mmen, wie z.B. von Candida lipolytica, Candida brumptii, Candida tropicalis und Candida utilis-Stämme. Stämme von z.B. Trichosporon cutaneum und Oospora lactis lassen sich gleichfalls mit gutem Erfolg verwenden,
Ausser einer Kohlenstoffquelle soll die KulturflUssigkeit selbstverständlich auch andere Nährstoffe enthalten, wie Stickstoffquellen,Phosphatquellen, Magnesiumquellen und gegebenenfalls auch Vitamine. Geeignete Stickstoffquellen sind z.B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat, Harnstoff und Aminosäuren. Als Phosphatquelle können z.B. die primären und sekundären Phosphate von Natrium, Kalium und Ammonium dienen. Als Magnesiumquelle können z.B. Magnesiumsulfat oder Magnesiumchlorid benutz werden. Auch wachstumiörcternde Stoffe, z.B. solche, welche sich-. i*? Hefeextrakt c'lar im Maisquellwasser befinden können beigegeben werden.
009822/1427 original inspected
Das erfindungsgemässe Verfahren kann sowohl in diskontinuierlichem wie in kontinuierlichem Betrieb bei Temperaturen stattfinden, welche im allgemeinem zum ZOchten von Mikrooganismen geeignet sind, z.B. Temperaturen von 25-37 °C.
Findet das erfindungsgemässe Verfahren im Dauerbetrieb statt, so hat man ferner festgestellt, dass beim Zusatz einer geringen Menge einer von dem betreffende Mikroorganismus leicht anzugreifenden Kohlenstoffquelle zu der KulturflUssigkeit, wie z.B. Glukose bei Anwendung von Candida-Stammen, oder Essigsäure bei Anwendung von Trichosporon-Stämmen, eine weit höhere Konzentration an Mono- und Dicarbonsäuren möglich ist als bei nich-kontinuierlichem Betrieb. Bei kontinuierlicher Durchführung des Verfahrens ist ein ausgezeichnetes Resultat erreichbar, falls je Gramm Kohlenstoff in der mono- und dicarbonsäuren Kohlenstoffquelle 1 bis 10 mg Kohlenstoff in Form einer leicht angreifbaren Kohlenstoffquelle in die KulturflUssigkeit eingemischt werden. Die mono- und dicarbonsaure Kohlenstoffquelle kann der KulturflUssigkeit in einer Konzentration van 25-3O g je Liter, berechnet als Kohlenstoff, kontinuierlich beigegeben werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren, das mit Hilfe üblicher Methoden
im Gebiet der biologischen Eiweisssynthesen anwendbar is, wird in den nachfolgenden Beispielen erörtert, ohne dass sich die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt,
Beispiel 1
Mehrere geeignete Mikroorganismen werden auf nachfolgende Weise selektiert: 1 g der Rinde von Ziegenkäse wurde nach Vermischen mit 1OO ml einer wässerigen Kochsalzlösung (Konzentration 0,8 Gew«%) homogenisiert. Die so gebildete suspension wurde nach Verdünnung auf ein Agar-Medium {pH 6,5) von nachfolgender Zusammensetzung ausgestrichen:
Adipinsäure 1 g je Liter
Buttersäure 0,5 g je Liter
Valeriansäure 0,7 g je Liter
Hydroxycapronsaure O,7 g je Liter Essigsäure O,05 g je Liter
AfflmoniUfflsulfat 3 g je Liter
prieSres Kaliumphosphat 7 g je Liter Magnesiumsulfat 7 aq 0,4 g je Liter Hefeextrakt 0,1 g je Liter
15gJeutar 009822/ U27
Nach fünftägigem Bebrüten bei 30 C wurden mehrere Reinkulturen im wesentlichen von der Gattung Candida aus dem Agar-Medium abgesondert.
Beispiel 2
Ein gemä*ss Beispiel 1 abgesonderter stamm von Candida brumptii wurde in Malzextrakt geimpft und anschliessend 18 Stunden lang in einem Schüttelinkubator bei 30 °C bebrütet.
Eine Menge von 0,2 ml der so erhaltenen Vorkultur wurde in 50 ml einer in einem 300 ml-Kolben befindlichen Kulturflüssigkeit (pH 6,5) von nach- ^ folgender zusammensetzung geimpft:
Adipinsäure 1,00 g je Liter
Buttersaure 0,50 g je Liter
Valeriansffure 0,74 g je Liter
Hydroxycapronsäure 0,76 g je Liter
Essigsäure 0,10 g je Liter
Ammoniumsulfat 3,00 g je Liter
primäres Kaliumsulfat 7,00 g je Liter
Magnesiumsulfat 7 aq 0,40 g je Liter
Hefeextrakt 0,10 g je Liter
Nach 24-stündigem Bebrüten bei 30 C wurde die so gebildete Zellmasse abzentrifugiert, gewaschen und getrocknet« Es wurden 1,5 g Hefezellen je Liter KuI-turflUssigkeit erhalten. Der Roheiweiss-Gehalt der Hefe betrug 84 Gew.%.
Beispiel 3
Ein gemäss Beispiel 1 abgesonderter Stamm von Candida lipolytica wurde auf ahnliche Weise wie in Beispiel 2 in Malzextrakt vorgezüchtet.
Von der so erhaltenen Vorkuitur wurden 10 ml in 1 Liter einer in einem Fermenter von 1,5 Liter Inhalt befindlichem Kulturflttssigkeit geifflpft« Diese Kulturflössigkeit wurde in der Weise gebildet, dass tau« einer Menge van 50 ml Waschwasser der cyclohexanonherstellung 3 g Ammoniurasulfat, 1 g Monökäliumphosphat, 0,4 g Magnesiumsulfat 7 aq und 1 el "MalsqUellwasser" beigab, worauf auf 1 Liter mit Wasser aufgefüllt wurde«
Bas benutzte Waschwasser enthielt je Liter 1,44 Gfatnüäquivälent säure, wovon;
009822/U21
0,114 Grammäquivalent Ameisensäure 0,054 Grammäquivalent Essigsäure 0,028 Grammäquivalent Propionsäure 0,088 Grammäquivalent Buttersäure 0,308 Grammäquivalent Valeriansäure 0,068 Grammäquivalent yi-Valerolacton 0,076 Grammäquivalent capronsäure 0,158 Grammäquivalent e-Hydroxycapronsäure 0,028 Grammäquivalent Bernsteinsäure 0,010 Grammäquivalent Oxalsäure 0,080 Grammäquivalent Glutarsäure 0,262 Grammäquivalent Adipinsäure
Nach Impfung wurde die KulturflUssigkeit im Fermenter 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 28 C mit einem Turbinenrtthrer (1200 u/min) gerührt und mit 60 Liter Luft je Stunde belüftet; dabei wird der pH-wert durch fortwährenden Zusatz von Schwefelsäure auf 6,5 gehalten. Anschliessend wurde die so gebildete Zellsubstanz zentrifugiert, gewaschen und getrocknet.
Es bildeten sich 2,4 g getrocknete Zellmasse mit einem Roheiweiss-Gehalt von 54 Gew.%. Wie sich zeigte war die ursprüngliche in den organischen SSfuren anwesende Kohlenstoffmenge zu 84 % umgesetzt worden.
Beispiel 4 '"
Ein gemffss Beispiel 1 abgesonderter stamm von Candida tropicalis wurde in Malzextrakt vorgezüchtet.
Von der so erhaltenen Vorkultur wurde 0,2 ml in 50 ml einer in einem 300 ml-Kolben befindlichen Kulturflüssigkeit (pH 5,5) von nachfolgender Zusammensetzung geimpft ι
Essigsäure . 0,27 g je Liter
Propionsäure . 0,11 g je Liter
Buttersäure 0,18 g je Liter
Valeriansäure 0,05 g je Liter
Oxalsäure 0,74 g je Liter
Bernsteinsäure 0,15 g je Liter
Glutarsäure 0,40 g je Liter
Adipinsäure 1,42 g Je Liter ORIGINAL INSPECTED
0Q9822/U27
β-Hydroxycapronsäure 0,56 g je Liter
Ämmoniumsulfat 3,00 g je Liter
Mono-kaliumsulfat 1,00 g je Liter
Magnesiumsulfat 0,20 g je Liter
Hefeextrakt 0,50 g je Liter
Nach 48-stUndiger Zucht auf einem Schottelinkubator bei 3O C wurden 5 ml der
. so erhaltenen KulturflUssigkeit in 50 ml Kulturflussigkeit von obenerwähnter Zusammensetzung Ubergeimpft. Nach 36-stündigem Zuchten bei 3O C fiel je Liter KulturflUssigkeit eine Menge von 1,2 g Trockenhefe an.
Beispiel 5
De Stamm Candida utilis var. major wurde nach einer Vorzüchtung in
Malzextrakt 24 Stunden lang bei 32 C auf dieselbe Weise und in derselben KulturflUssigkeit gezüchtet wie in Beispiel 3.
Das Züchten wird anschliessend im Dauerbetrieb fortgesetzt, wobei stündlich 60 ml einer KulturflUssigkeit beigegeben wurden, welche man dadurch erhielt, dass 250 ml des im Beispiel 3 genannten Waschwasseis 7,5 g Ammonium-Sulfat, 5 g Mono-kaliumphosphat, 2 g Magnesiumsulfat 7 aq, 2g Hefeextrakt und 2 g Glukose zugesetzt wurden, wonach auf 1 Liter alt Wasser aufgefüllt wurde.
Stündlich wurden 60 ml Kulturflüssigkeit kontinuierlich aus dem Fermenter abgeführt. Der pH-wert der Lösung im Fereenter wurde durch Beigabe von f Schwefelsäure auf einem Wert von 6,5 gehalten. Je Liter Kulturflüssigkeit bildeten sich 13,5 g Trockenhefe mit einem Roheiweiss-Gehalt von 55 Gew.%»
Bei Wiederholung dieses Dauerversuchs, allerdings ohne Zusatz von Glukose, Hess die Konzentration der Hefezellen _■ Fereenter langsam nach und die Ausbeute an Trockenhefe war nach 72 Stunden bis unter 1 g je Liter KulturflUssigkeit abgesunken.
Beispiel 6
Auf gleiche Weise wie in Beispiel 5 wurde ein auf die im Beispiel 1 genannte Weise abgesonderter Stamm von Oospora lactia im Bauerbetrieb gezüchtet. Stündlich wurden aber 80 ml frischer Kulturflüssigkeit zugeführt und gleichfalls 80 ml hefehaltiger KulturflUssigkeit abgeführt. Die abgehende KulturflUssigkeit enthielt 13,5 g trockne Zellsubstenz- -je^L-ter »it eine« Roheiweiss-Gehalt von
39 '^"
ORIGINAL INSPECTED
Beispiel 7
Ein gemSss Beispiel 1 abgesonderter Stamm von Candida lipolytica wurde nach Vorzüchtung ie Malzextrakt auf dieselbe Weise und in derselben KulturflUssigkeit wie in Beispiel 3 24 Stunden lang gezüchtet.
Das ZOchten wurde anschliessend im Dauerbetrieb fortgeführt, wobei stündlich 1OO ml frische Kulturflüssigkeit in den Fermenter eintreten und 100 ml hefehaltige Kulturfltfssigkeit aus ihm abgehen. Die frische Kulturflüssigkeit entstand dadurch, dass 250 ml des in Beispiel 3 erwähnten Waschwassers 7,5 g Ammoniumsulfat, 5 g Mono-kaliumphosphat, 2 g Magnesiumsulfat 7 aq, 0,05 g Hefeextrakt und 1 g Glukose beigegeben wurden, wonach bis zu 1 Liter mit Wasser* nachgefüllt wurde.
Durch Zusatz von schwefelsaure konnte der pH-Wert im Fermenter auf einem Wert von 6,5 gehalten werden.
Die kontinuierlich aus dem Fermenter abgehende hefehaltige Kulturflüssigkeit wurde kontinuierlich einem zweiten Fermenter mit einem Nutzinhalt von 1 Liter zugeführt. In dieses Fermenter, in den zugleich stündlich 200 ml der vorhin genannte frischen Kulturflüssigkeit eingemischt wurden, wurde der pH-Wert durch Beigabe von Schwefelsäure gleichfalls auf 6,5 gehalten. Die Flüssigkeit im zweiten Fereenter wurde mit einem Turbinenrührer gerührt und mit 70 Liter Luft je Stunde belüftet. Stündlich konnten aus dem zweiten Fermenter kontinuierlich 300 »1 hefehaltige KulturflUssigkeit mit einem Gehalt von 8,7 g Trockenhefe je Liter gewonnen werden. Der Roheiweiss-Gehalt der Trockenhefe betrug 66,5 %.

Claims (7)

  1. PATENTANSPRÜCHE
    1, Verfahren zu der Herstellung von Eiweiss durch Züchten eiweissreicher Eumycetes unter aeroben Bedingungen in einer dazu geeigneten Kulturflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kulturflüssigkeit ein Gemisch aus aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit weniger als 8 C-Atomen als Kohlenstoffquelle verwendet und wahrend der Zucht des Mikroorganismus der pH der Kulturflüssigkeit auf eine« Wert zwischen 5,5 und 8 gehalten wird.
  2. 2. Verfahren geaSTss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man sich als
    Kohlenstoff quelle eines Gewi.scb.es von Mono- und Dicarbonsäuren bedient,
    009822/1427
    1354223
    das, bei der Herstellung von Cyclohexanon beim Waschen des rohen Endproduktes im Waschwasser anfallt.
  3. 3. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus ein Stamm der Gattung Candida benutzt wird.
  4. 4. Verfahren gemSss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man einen einer der Arten Candida lipolytica, Candida brumptii, Candida tropicalis und Candida utilis angehörigen Stamm wählt.
  5. 5. Verfahren gemä*ss einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikrooganismus einen zu einer der Arten Trichosporon cutaneum und Oospora laetis gehörenden Stamm verwendet.
  6. 6. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, da:>s das Verfahren im Dauerbetrieb durchgeführt wird und der Kulturflüssigkeit je g Kohlenstoff in der mono- und dicarbonsäuren Kohlenstoffquelle 1 bis 10 mg Kohlenstoff in Form einer leicht angreifbaren Kohlenstoffquelle zugesetzt werden.
  7. 7. Verfahren gemSss einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass wahrend des ZUchtens des Mikroorganismus die Temperatur aui cintm Wert zwischen 25 und 37 C gehalten wird.
    BAD ORIGINAL
    009822/14??
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