PL80325B1 - - Google Patents

Description

Sposób wytwarzania bialka na drodze aerobowej hodowli mikroorganizmów Eumycetes Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania bialka na drodze hoidowli mikroorganizmów Eumy¬ cetes io duzej zawartosci bialka, w warunkach aerobowych i w odpowiedniej oieozy hodowlanej.Znane sposoby syntezy bialka polegaja na stoso¬ waniu jako zródla wegla substancji zawierajacych weglowodany, takich jak melasa, a w nowszych metodach stosuje sie równiez w tym celu weglo¬ wodory.Stwierdzono, ze mase komórkowa o duzej zawar¬ tosci bialka otrzymuje sie z wysoka wydajnoscia i w siposób technicznie dogodny, jezeli jako zródlo wegla w cieklej pozywce hodowlanej stosuje sie mieszanine alifatycznych kwasów jedno- i dwu- kartooksylowych, zawierajacych 'mniej niz 8 ato¬ mów wegla. Tego rodzaju tanie zródlo wegla sta¬ nowia popluczyny, otrzymywane przy 'wytwarzaniu cykloheksanonu z cykloheksanu lub z cykloheksa- nolu, na skutek plukania surowego produktu kon¬ cowego woda i/lub rozcienczonym lugiem.Warunkiem uzyskania dobrych wyników przy stosowaniu pozywki zawierajacej takie zródlo we¬ gla jest utrzymanie war-tosci pH srodowiska ho¬ dowlanego 5,5—S. Poniewaz zas w miare rozwoju mikroorganizmów w cieklym srlodowisku hodowla¬ nym maleje stezenie kwasu, (przeto korzystnie jest stosowac dodatek srodka obnizajacego wartosc pH srodowiska, ma przyklad dodatek kwasu siarkowego lub innego, albo stosowac buforowane srodowisko hodowlane. 10 15 20 25 30 Sposóib wedlug wynalazku umozliwia wytwarza¬ nie bialka na drodze hodowli mikroorganizmów Eumycetes o duzej zawartosci bialka w warunkach aerobowych i w odpowiedniej cieklej pozywce, a cecha tegio sposobu jest to, ze jako zródlo wegla w 'pozywce stosuje sie rndeszanine alifatycznych kwasów jedno- i dwukarboksylowych o mniej niz 8 atomach wegla i podczas hodowania mikroorga¬ nizmu utrzymuje wartosc pH srodowiska 5,5—8.Sposób wedlug wynalazku ma duze znaczenie w technice, gdyz produkcja cykloheksanom! wzrasta piawasnie, a popluczyny otrzymywane podczas tej produkcji odprowadza sie do scieków dopiero po kosizttownym ich oczyszczeniu, np. metoda biologicz¬ nego rozkladu zawartych w nich kwasów. Wynala¬ zek umozliwia wiec nie tylko doigodny sposób syn¬ tezy bialka, ale równiez i wykorzystanie uciazli¬ wych produktów odpadkowych w celu przerobie¬ nia ich na cenny produkt.Zigodnie z wynalazkiem stosuje sie rózne gatunki Eumyicetes, na' przyklad Caindida, Trichosporm, Oospora, Hansenula, Pullwlaria, Aspergillus, Peni* cilliuim, Yerituria i Rotrytes. Szczególnie dobre wy¬ niki uzyskuje sie przy stosowaniu szczeków droz¬ dzy nalezacych do gatunku Candida, takiich jak Candida lipolytica, Candida brumptii, Candida tro- piicalis i Candida utilis. Dobre wyniki daja równiez szczepy takie jak Trichcsporon cutaneum i Oospo¬ ra, laetiis. .Oprócz zródla wegla srodowisko hodowlane po^ 803253 80325 4 wim.no oczywiscie zawierac i inne skladniki odzyw¬ cze, mianowicie zródlo azotu, fosforu, magnezu i ewentualnie witaminy. Jako zródlo azotu stosuje sie na przyklad azotan amonowy, siarczan amono¬ wy, octan amonowy, mocznik i aminokwasy. Zródlo fosforu stanowia na przyklad pierwszo- i drugo- rzejdowe fosforany sodu, potasu i amonu, a zródlem magnezu jest na przyklad sianczain luib chlorek magnezowy. Mozna tez stosowac 'dodatek skladni¬ ków wpsomagajacych wzroslt, na przyklad takich, jakie znajduja sie w wyciagu z drozdzy lub w wy¬ warze kukurydzianym.Proces wedlug wynalazku prowadzi sie syste¬ mem periodycznym lub ciaglym, w temperaturze stosowanej ogólnie przy hodowli mikroorganizmów, to jest w temperaturze okolo 25—37°C. Stwierdzo¬ no, ze jezeli proces prowadzi siie metoda ciagla, to w przypadku dodania do srodowiska równiez ta¬ kiego zródla wegla, które jest latwo wykorzysty¬ wane przez mikroorganizmy, mozna stosowac o wiele wyzsize stezenie kwasów jedno- i dwukarbo- ksylowych niz w procesie periodycznym. W przy¬ padku szczepów Candida takim dodatkowym zró¬ dlem wegla jest na przyklad gjlilkoza, a w przypad¬ ku szczepów Trichosporon kwas octowy.W procesie ciaglym osiaga sie bardzo dobre wy¬ niki, jezeli na i g wegla w postaci kwasów jedno- i dwukairtooksylowych dodatek-latwiej wykorzy¬ stywanego wegla wynosi 1—10 mg. Zródlo wegla w postatai kwasów jedno- i dwukarboksylowych do-' daje sie w sposób ciagly przy stezeniu 25—30 g/litr w przeliczeniu na wegiel.Sposób wedlug wynalazku stosuje sie w znanych urzadzeniach stosowanych do syntezy 'bialka. Spo¬ sób tein jest blizej wyjasniony w nizej podanych przykladach.Przyklad I. Selekcje kilku 'mikroorganizmów prowadzi sie w ten sposób, ze 1 g skórki koziego seria miesza sie homogeniczlnie iz 100 ml wodnego roztworu chlorku sodowego o stejzeniu 0,8% wa¬ gowych i otrzymana zawiesine rozmazuje sie po rozcienczeniu na agarze o wartosci pH 6,5 i zawie¬ rajacym w 1 litrze nastepujace skladniki: kwas adypinowy 1 g kwas maslowy 0,5 g kwas walerianowy 0,7 g kwas hydroksykaproniowy 0,7 g kwas octowy 0,05 g siarczan amonowy 3 g pierwszorzedowy fosforan potasowy 7 g siarczan magnezowy siedmiowodny 0,4 g wyciag drozdzowy 0,1 g agar 15 g Po hodowli w ciagu 5 dni w temiperaturze 30°C wyasabnia sie z srodowiska agarowego szereg czy¬ stych kultur zasadniczo gatunku Candifda.Przyklad II. SzcEep Candida bruimptii otrzy¬ many w sposób opisany w przykladzie I zaszczepia sie na wyciagu sodowym i poddaje hodowli na wsitrzasarce w temiperaturze 30°C w ciagu 18 go¬ dzin. 0,2 ml otrzymanej kultury wstepnej dodaje $ia w toofflWe o pojemnosci 3QQ ml do 50 ml cieczy hodowlanej o wartosci pH 6,5 i zawierajacej w 1 li¬ trze nastepujace skladniki: kwas adypinowy 1,00 g kwasmaslowy 0,50 g 5 kwas walerianowy 0,74 g kwas hydroksykapromowy 0,76 g kwas octowy 0,10 g siarczan amonowy 3,00 g pierwszorzedowy siarczan potasowy 7,00 g io siarczan magnezowy siedmiowodny 0,40 g wyciag drozdzowy 040 g Nasltepnie prowadzi sie hodowle w temperaturze 30°C w ciagu 24 godzin, po czym otrzymana mase komórkowa odwirowuje sie, plucze i suszy. 15 w przeliczeniu na 1 litr cieczy hodowlanej otrzy¬ muje sie 1,5 g komórek drozdzowych. Zawartosc surowego bialka w. drozdzach wynosi 54% wa¬ gowych.Przyklady III. Szczep Candida lipolytica otrzymany w sposób opisany w przykladzie I ho¬ duje sie na wyciagu slodowym w sposób opisany w pirzykladzie II. W fermantatorze o pojemnosci 1,5 litra zaszczepia sie 1 litr cieczy hodowlanej za pomoca 10. ml otrzymanej kullltury wstepnej.Ciecz hodowlana przygotowuje sie w ten 'sposób, ze do 50 ml popluczyn otrzymanych przy wy¬ twarzaniu cykloheksanami dodaje sie 3 g siarcza¬ nu anionowego, 1 g pierwszorzedowego fosfora- 0 nu potasowego, 0,4 g MgS04 • 7H20 i 1 ml na- moku kukurydzianego, po czym dopelnia sie woda do 1 litra. Zastosowane popluczyny zawieraja w 1 litrze 1,44 gramorównowaznika mieszaniny kwa¬ sów, z czego na poszczególne ikwasy przypadaja nastepujace gramOTÓwnowazniki: 35 kwas mrówkowy kwas octowy kwas propionowy kwas maslowy 40 kwas walerianowy y-waletriolaktoin kwas kapronowy kwas e-hydroksykapronowy kwas bursztynowy 45 kwas szczawiowy kwas glutarowy kwas adypinowy 50 0,114 0,054 0,028' 0,088 0,308 0,068 0,076 0,158 0,028 0,010 0,080 0,262 Po zaszczepieniu miesza sie srodowisko za po¬ moca mieszadla o 1200 obrotach/minute, utrzymu¬ jac temperature 28°C i doprowadzajac w ciagu 1 godziny 60 litrów powietrza. Wartosc pH srodo¬ wiska doprowadza sie sitale do 6,5 przez dodawa¬ nie kwasu siarkowego. Otrzymana miase komór¬ kowa odwirowuje sie, przemywa i suszy. W prze¬ liczeniu na II litr cieklego srodowiska otrzymu¬ je sie 2,4 g suchej masy komórkowej o zawar¬ tosci surowego bialka wynoszacej 54°/o wagowe.Wegiel zawarty w kwasach organicznych zostal przerobiony w 84%.Przyklad IV. Szczep Candida itropicalas wy- osabinia sie w sposób opisany w przykladzie I i hoduje na wyciagu slodowym. 0,2 'ml tak Otrzy¬ manej kultury wstepnej dodaje sie do kolby 65 w 'pojeminosoi 300 ml, zawierajacej ciekle srodo-5 wdisiko hodowlane o wartosci pH 5,5, które w 1 litrze zawiera nastepujace skladniki: 80325 6 kwas octowy kwas piropionowy kwias maslowy kwas walerianowy kwas szczawiowy kwas bursztynowy kwas glutarowy kwas adypinowy kwas 8-hydrdksyikapronowy siarczan amonowy kwasny siarczan potasowy siarczan magnezowy wyciag drozdzowy 0,27 g 0,H g 0,18 g 0,05 g 0,74 g 0,15 g 0,40 g 1,42 g 0,56 g 3,00 g 1,00 g 0,20 g 0,50 g Hodowle prowadzi sie w ciagu 48 godzin w wstrzasarce, w temperaturze 30°C, po czym 5 m!l otrzymanej cieczy hodowlanej zaszczepia sie ponownie w 50 mil cieczy hodowlanej o podanym wyzej skladzie. Po uplywie 36 godzin w tempe¬ raturze 30°C w przeliczeniu na 1 litr cieczy ho¬ dowlanej otrzymuje sie 1,2 g suchych drozdzy.Przyklad V. Szczep Candida utilis var. ma¬ jor po wstepnym holdowaniu ma ekstrakcie slo¬ dowym w ciagu 24 godzin w temperaturze 32°C hoduje sie w sposób opisany w przykladzie III w cieczy hodowlanej o skladzie podanym w przy¬ kladzie III. Nastepnie prowadzi sie hodowle w sposób ciagly, dodajac w ciagu 1, gadziny 60 ml cieczy otrzymanej w ten sposób, ze mie¬ sza sie 250 ml popluczyn o sikladzie podanym w przykladzie III, 7,5 g siarczanu amonowego, 5 g fosforanu jednopotasowego, 2 g MgS04l7H20, 2 g wyciagu idiriozdzowego i 2 g glikozy, po czym dopelnia sie woda do 1 litra.W ciagu 1 godziny odjprowadza sie z fermemlta- tora w sposób ciagly 60 ml cieczy hodowlanej i przez dodawanie kwasu siarkowego utrzymuje sie wartosc pH w fermemtatorze wynoszaca 6,5.W przeliczeniu na 1 litr cieczy hodowlanej otrzy¬ muje sie 13,5 g suszonych drozdzy o zawartosci surowego bialka wynoszacej 55°/o wagowych.Prowadzac proces w analogiczny sposób, ale bez dodatku glikozy, stezenie komórek drozdzy w cieczy hodowlanej powoli spada i po uplywie 72 godzin wydajnosc suchych drozdzy w przeli¬ czeniu na 1 g cieczy hodowlanej wynosi mniej niz 1 g.Przyklad VI. Szczep Oospora lactis, wy¬ osobniony w sposób opisany w przykladzie I, ho¬ duje sie metoda ciagla, jak opisano w przykla¬ dzie V. W ciagu 1 godziny odprowadza sie 80 ml cieczy hodowlanej zawierajacej drozdze i dopro¬ wadza 80 ml swiezej cieczy hodowlanej. W prze¬ liczeniu na 1 litr cieczy hodowlanej otrzymuje sie 13,5 g suchej masy komórkowej, zawierajacej 39% wagowych surowego bialka.Przyklad VII. Szczep Oandida lipolytica, wyosobniony w sposób opisany w przykladzie I, hoduje sie wstepnie na pozywce z ekstraktu slo¬ dowego i nastepnie poddaje hodowli w ciagu 24 godzin, w cieczy hodowlanej opisanej w przykla¬ dzie III, a nastepnie hoduje metoda ciagla, odpro¬ wadzajac w ciagu 1 godziny 100 iml cieczy zawie- 5 rajacej drozdze i doprowadzajac 100 ml swiezej cieczy. Swieza ciecz hodowlana przygotowuje sie w tein .sposób, ze 250 iml popluczyn w skladzie po¬ danym w przyikladzie III miesza sie z 7,5 g siar¬ czanu amonowego, 5 g fosforanu jednopotasowego, io 2 g Mg MgS04.7H20, 0,05 g wyciagu drozdzowego i 1 g glikozy, po czym dopelnia sie woda do obje¬ tosci 1 litra.Hodowle prowadzi sie systemem ciaglym, doda¬ jac Ikwasu siarkowego w celu utrzymania wartosci 15 pH srodowiska 6,5. Ciecz hodowlana odprowadza sie z tego fermentatora do drugiego naczynia o pojemnosci uzytkowej, po czym równoczesnie w ciagu 1 godziny do drugiego naczynia doprowa¬ dza sie 200 iml swiezej cieczy hodowlanej o wyzej 20 podanym skladzie i przez dodatek kwasu siarko¬ wego utrzymuje wartosc pH 6,5. Ciecz w drugim naiczyniu miesza sie za pomoca mieszadla turbino¬ wego i w ciagu 1 godziny doprowadza 70 litrów powietrza. Z drugiego naczynia odprowadza sie 25 w ciagu 1 godziny 300 ml cieczy zawierajacej drozdze. W przeliczeniu na -1 litr cieczy otrzymuje sie 8,7 g suchyeh drozdzy o zawartosci surowego bialka 66,5% wagowych. 30 PL

Claims (7)

1. Zastrzezenia p a !t e n t o W e 1. sposób wytwarzania bialka na drodze aero- bowej hodowli mikroorganizmów Euimycetes o du¬ zej zawartosci bialka, znamienne tym, ze hodowle 35 prowadzi sie w cieczy hodowlanej zawierajacej mieszanine alifatycznych kwasów jedno- i dwu- karbolksyiowych o mniej niz 8 atomach wegla i podczas hodowania .mikroorganizmów utrzymuje sie wartosc pH cieczy hodowlanej wynoszaca 40 5,5—8.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze sltosuje sie mieszanine alifatycznych kwasów jed¬ no- i dwukatfboksylowych, stanowiaca popluczyny otrzymywane przy plukaniu produktu otrzymywa- 45 neigo przy wytwarzaniu cykloheksianonu.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 i 2, znamienny tym, ze jako mikroorganizm stosuje sie szczep z ga- tuniku Candida.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze 50 stosuje sie szczep Candida lipolytica, Candida bruiripltii, Candida tropicalis lub Candida utilis.
5. 5. Sposób wedlug zastrz. 1 i 2, znamienny tym, ze jako miikrooganizm stosuje sie szczep z rodzaju 6. Trichosiporon cutaineum lub Oospora lactiis. 55
6. 6. Sposób wedlug zastrz. 1^5, znamienny tym, ze proces hodowli prowadza sie metoda ciagla i w przeliczeniu na r- g wej$La zawartego w cieczy hodowlanej w postaci kwasów jedno- i dwukar- bolksylowych dodaje sie do tej cieczy 1—10 mg 60 wegla w postaci zródla latwiej wykorzystywanego.
7. 7. Sposób wedlug zastrz. 1—6, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w temperaturze 25—37°C. PL