DE2755171B2

DE2755171B2 - Verfahren zur Herstellung von Proteinen aus Methanol unter Verwendung methylotropher Mikroorganismen

Info

Publication number: DE2755171B2
Application number: DE2755171A
Authority: DE
Inventors: Bruno Saint Cloud Cabane; Pierre Montpellier Galzy
Original assignee: PCUK-PRODUITS CHIMIQUES UGINE KUHLMANN COURBEVOIE (FRANKREICH)
Current assignee: PCUK-PRODUITS CHIMIQUES UGINE KUHLMANN COURBEVOIE (FRANKREICH)
Priority date: 1976-12-14
Filing date: 1977-12-10
Publication date: 1980-06-04
Also published as: DE2755171C3; JPS5374561A; NL7713782A; DK143710B; US4416987A; CH628681A5; IT1093044B; GB1563884A; DK143710C; DK554177A; DE2755171A1

Description

JO

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen aus Methanol unter Verwendung methylotropher Mikroorganismen. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen weisen ein verbessertes Verhalten bezüglich der _J5 Herstellung von Methanol (Geschwindigkeit, Ausbeute an Biomasse/Methanol, Affinität für Methanol) auf.

Bei Verfahren zur Herstellung von Proteinen durch einzellige Organismen besitzt der Mikroorganismusstamm eine beträchtliche Bedeutung. Für die Verwen- ₄₍) dung eines gegebenen kohlenstoffhaltigen Substrats ist einerseits der biologische Wert des Produktes (nicht vorhandene Toxizität, Nährwert) und andererseits die ökonomischen Bedingungen der industriellen Produktion von Proteinen in kontinuierlicher Weise von dem ₄-, Stamm abhängig. Dies sind insbesondere die kinetischen Leistungen des Stammes, die die Form der industriellen Einrichtung und damit der notwendigen Investitionen bestimmen. Ein Verfahren zur Herstellung von bakteriellem Protein aus Methanol mittels methylotropher _v) Stämme ist beispielsweise in der DE-OS 20 59 277 beschrieben.

Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren ermöglicht es, verbesserte Stämme von methylotrophen Mikroorganismen zu verwenden, die das Methanol y, metabolisch über den Weg des Serins verwenden und auf eine große Anzahl von Mikroorganismen angewendet werden. Unter diesen werden beispielsweise folgende genannt:

Bacillus, Micrococcus, Arthrobacter, ^wl

Flavobacterium, Pseudomonas, Aeromonas,
Methylomonas, Rhodopseudomonas,
Methylococcus, Klebsiella, Rhodospirillum,
Rhodomicrobium, Hyphomicrobium,
Acinetobacter, Achromobacter, Moraxella. ⁶^'

Die fakultativen methylotrophen Mikroorganismen, die das Methanol über den Weg des Serins verwenden, sind sehr verbreitet Diejenigen, die durch bekannte Methoden isoliert worden sind (aufeinanderfolgendes Aufnehmen aus einem Milieu mit Methanol als einziger kohlenstoffhaltiger Quelle), besitzen oft mittelständige kinetische Leistungen.

Einige sind in der Literatur beschrieben, und zwar insbesondere in folgenden Texten:

W. Härder, MM. Atwood, J. R. Quayle J. Gen.

MicrobioL(1973)78 155-163,
Asthana und Coil. Biotechnol. Bioeng.

(1971)13,923und(1971)8,923,
M. Reuss u. a. Coil. Eur. J. AppL Microbiol.

(1975)1295—305,
Wittenbury u. a. J. Gen. Microbiol-

(1970)61205,
Hirsh u. a. Conti Archiv. Fin Fikrobiologie

(1964)43:358,
Ogata u. a. Coll. J. Ferment Technol.

(1970)48:470.

Die bekannten Verfahren zum Isolieren von Stämmen durch kontinuierliche Selektion ermöglichen es, leistungsfähige Stämme zu isolieren, jedoch sind die Versuche langwierig (wenigstens 1 Monat an Experimentierarbeit im kontinuierlichen Fermentierer), schwierig und die Ergebnisse ungewiß. Andererseits verwirklicht man auf diese Weise nur eine Anreicherung und es ist unerläßlich, aus der erhaltenen komplexen Flora den leistungsfähigsten Mikroorganismus zu isolieren.

Es wurde gefunden, daß die Widerstandsfähigkeit gegenüber Glycin bei den Stämmen, die Methanol über den Weg des Serins metabolisieren, gewöhnlich eine vermehrte Verwendung von Methanol mit sich bringt (Vergrößerung von μπι, Abnahme des Ks für Methanol).

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Proteinen aus Methanol unter Verwendung methylotropher Mikroorganismen ist dadurch gekennzeichnet, daß man aus einem fakultativ methylotrophen Ausgangswildstamm eine Methanol über den Weg des Serins verwendende und gegenüber dem Ausgangsstamm hinsichtlich der Steigerung der Affinität für Methanol und hinsichtlich der Verringerung der Protein-Erzeugungszeit auf dem methanolhaltigen Substrat verbesserte, methylotrophe Mutante gewinnt,

wobei die Mutante unempfindlich bleibt gegenüber der Wirkung von Glycin bei Konzentrationen dieser Aminoessigsäure, die wenigstens zehnmal höher sind als diejenigen, die das Verhindern d^r Verwendung des Methanolsubstrats (Steigerung von Ks) bei dem wilden Stamm beginnen lassen,
oder wobei die Mutante in einem Milieu mit Methanolsubsu ut und 0,5 bis 2% Glycin wachsen kann, während der entsprechende Ausgangswildstamm in Anwesenheit dieser Glycinkonzentrationen nicht wachsen kann,

und daß man diese Mutante aerob züchtet.

Die Verbesserung besteht demnach einerseits in einer Steigerung der Affinität für Methanol (Abnahme des Ks) und andererseits in einer Verringerung der Erzeugungszeil auf dem methanolhaltigen Substrat.

Das dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrundeliegende Prinzip besteht somit im Auswählen von gegenüber Glycin resistenten Mutationen aus fakultativen methylotrophen Stämmen. Die Kultur kann in folgender Weise vorgenommen werden:

20

Zunächst werden die Zellen der Wildstämme vorzugsweise in exponentteller Wachstumsphase aufgenommen und dann auf dem Selektionssieb (festes Milieu für methylotrophe Mikroorganismen +0,5 bis 2% Glycin) entweder direkt oder nach vorheriger Einwirkung eines physikalischen oder chemischen Mutationsmittels ausgebreitet

Alle auf diese Weise ausgewählten und gegenüber Glycin in einer Konzentration von 0,5 bis 2% widerstandsfähigen Stämme werden sodann aerob auf einem Methanol enthaltenden Substrat gezüchtet

Die verbesserten Stämme werden in ein Kulturmilieu eingesetzt, das Mineralsalze, Stickstoff in anorganischer Form und Methanol in veränderlicher Konzentration von 0,1 bis 2% (Gewicht/Volumen) enthält Das Methanol, das durch Filtrieren sterilisiert wird, wird dem im Autoklav bei 120° C während 30 min behandelten Milieu zugesetzt Der pH-Wert wird zwischen 6 und 8 eingestellt

Die Kultivierung wird in sterilen Bechergläsern unter Rühren derart vorgenommen, daß die Belüftung nicht beschränkt wird, und bei Temperaturen, die zwischen 25 und 45°C variieren können.

Die Gewinnung der Zellen geschieht durch Zentrifugieren. Das Maß des spezifischen Wachstumsgrades wird festgestellt indem die Vergrößerung des Trockengewichtes der Zellen pro Volumeneinheit als Funktion der Zeit gemessen wird. Die Konzentration von Methanol in dem Kulturmilieu wird durch Gaschromatographie gemessen.

Die erhaltenen Stämme können nicht nur für die Synthese von Proteinen aus Methanol, sondern auch zur biologischen Entfernung von Methanol aus einem Abwasser, zur eventuellen Verminderung von Methanol in fermentierten Getränken und allgemein für die r> gesamte Fermentierung unter Verwendung von Methanol gleichzeitig mit einem kohlenstoffhaltigen Substrat verwendet werden.

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Beispielen erläutert. 41)

Beispiel 1

Ein als zu der Art Pseudomonas stuzeri gehörend identifizierter Ausgangswildstamm wird auf folgendem Milieu kultiviert: <r>

daß 10⁸ bis 10⁹ Zellen pro ml untergebracht werden, bevor sie auf dem Milieu M\ mit 2,5% Agar versehen und mit 2% Glycin vervollständigt ausgebreitet werden.

Die Petrischalen werden in einen Wärmeschrank bei 3O⁰C angeordnet Das Auftreten von resistenten Mutanten ergibt sich am Ende von wenigen Tagen. Die Kolonien werden abgenommen und in flüssigem Milieu M\ eingeimpft um bezüglich ihrer methylotrophen Eigenschaften getestet zu werden.

Man erhält mehrere gegenüber Glycin resistente Mutanten. Das Studium der kinetischen Leistungen eines dieser Mutanten führte zu den nachfolgenden Ergebnissen auf dem Kulturmilieu Mj.

Generationszeit
Ks Methanol

100 min
20 ppm

Die wirksame Produktion von Biomasse am Ende von 3 Tagen betrug bei dieser verbesserten Kultur 0,40 g pro 1 g Methanol.

Beispiel 2

Andere Mutanten des Ausgangswildstammes von Beispiel 1, die gegenüber 2% Glycin resistent waren, wurden durch eine Behandlung vor der Zellensuspen-

sion mit 2% Äthylmethansulfonat während 2 h bei 30° C und einem pH-Wert von 7,4 isoliert. Man stellt die gleichen Verbesserungen wie bei dem Mutanten von Beispiel i fest, das heißt eine Verminderung der Generationszeit und insgesamt eine starke Abnahme

κι von Ks:

Wilder Stamm

Mutierter Stamm

■so Wilder Stamm

55

g = 5 h 45 min Ks = 830 ppm

Kulturmilieu (M\)

NH₄Cl 3 g

Na₂HPO₄ 3 g

KH₂PO₄ 0,5 g

CaCl₂ 0,01 g

FeSO₄ 0,001 g

ZnCl₂ 0,001 g

MnSO₄ 0,001 g

MgSO₄ 0,5 g

CH₃OH 5 g

Wasser 1 I
pH-Wert auf 6,8 eingestellt

Die Temperatur der Kultur beträgt 30° C.

Die Generationszeit dieses Stammes ist dann 120 min und seine scheinbare Affinitätskonstante für Methanol ist Ks = 1090 ppm.

Die wirksame Produktion von Biomasse am Ende von drei Tagen der Kultivierung beträgt 0,30 g für 1 g Methanol.

Die wiederaufgenommene Zellensuspension dieser g = 4 h 20 min Kultur wird in physiologischem Wasser so verdünnt, Ks = 450 ppm

g = 120 min
Ks = 1090 ppm
g = 88 min
Ks = 20 ppm

Beispiel 3

Die Behandlung von Beispiel 1 wird auf einem methylotrophen Ausgangswildstamm von Pseudomonas aeruginosa angewendet. Man isoliert auf einem Selektiersieb (Milieu Mi + 0,5% Glycin) die gegenüber Glycin resistenten Mutanten.

Die kinetischen Leistungen dieser neuen Stämme (auf dem Milieu M\) werden im Verhältnis zu dem wilden Stamm stark verbessert.

Mutierter Stamm

g = 3 h 30 min Ks = 100 ppm

Beispiel 4

Die Behandlung von Beispiel 1 wird auf einen methylotrophen Stamm von Micrococcus Varians angewendet, wobei Stämme isoliert werden, die bezüglich Methanol verbesserte Leistungen in bezug auf den wilden Stamm aufweisen.

Wilder Stamm

65 Mutierter Stumm

g = 3 h 30 min Ks = 150 ppm

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Proteinen aus Methanol unter Veir/endung methylotropher Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einem fakultativ methylotrophen Ausgangswildstamm eine Methanol über den Weg des Serins verwendende und gegenüber dem Ausgangsstamm hinsichtlich der Steigerung der Affinität für Methanol und hinsichtlich der Verringerung der Protein-Erzeugungszeit auf dem methanolhaltigen Substrat verbesserte, methylothrope Mutante gewinnt

wobei die Mutante unempfindlich bleibt gegenüber der Wirkung von Glycin bei Konzentratio- '⁵ nen dieser Aminoessigsäure, die wenigstens zehnmal höher sind als diejenigen, die das Verhindern der Verwendung des Methanolsubstrats (Steigerung von Ks) bei dem wilden Stamm beginnen lassen,

oder wobei die Mutante in einem Milieu mit Methanolsubstrat und 0,5 bis bis 2% Glycin wachsen kann, während der entsprechende Ausgangswildstamm in Anwesenheit dieser Glycinkonzentrationen nicht wachsen kann,

und daß man diese Mutante aerob züchtet.

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