DE3019254C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellen mit einem hohen Gehalt an wärmebeständiger Acetatkinase. Der Anspruch 2 nennt eine Ausgestaltung dieser Erfindung.

Da Acetatkinase ein endobakterielles Enzym ist, wird sie im allgemeinen hergestellt, indem man die Bakterienzellen zerstört und das Enzym aus der überstehenden Flüssigkeit extrahiert. Diese überstehende Flüssigkeit enthält auch eine Reihe weitere, aus den Bakterienzellen stammenden Substanzen, wobei es außerordentlich schwierig ist, das gewünschte Enzym abzutrennen und zu reinigen. Wie in Journal of Biochemistry, Bd. 84, Nr. 1, 193-203 (1978) beschrieben wird, kann man Acetatkinase reinigen durch ein komplexes Verfahren, bei dem man die Bakterienzellen zerstört, Nukleinsäure unter Verwendung von Streptomycin entfernt, die gebildete überstehende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat aussalzt und das Präzipitat aus dem erhaltenen Rohenzym dann durch komplizierte Stufen, wie Chromatographie über Diäthylaminoäthylzellulose (DEAE) über eine Hydroxyappatitkolonne, über eine Ultrogelsäure und über eine DEAE-Sephadexsäule unterwirft. Ein weiteres kompliziertes Verfahren zur Reinigung von Acetatkinase wird in Methods in Enzymology, Bd. I, Seiten 591 bis 595, beschrieben und beinhaltet die Stufen, die Bakterienzellen zu zermahlen und sie dann einer Kombination von zwei Acetonfraktinierungen und drei Aussalzstufen mit Ammoniumsulfat zu unterwerfen.

Da diese Verfahren komplex und zeitraubend sind, sind die Kosten zur Herstellung von Acetatkinase pro Enzymeinheit sehr hoch, und dies ist ein Nachteil bei der industriellen Entwicklung von Bioreaktoren.

Ein weiterer Nachteil bei der Herstellung von Acetatkinase ist die niedrige Produktivität der Bakterienzellen. Da Acetatkinase ein endobakterielles Enzym ist, könnte man die Produktivität ganz allgemein erhöhen, wenn man weitere Nährquellen in einen Fermentortank, in dem die Kultivierung durchgeführt wird, im Falle eines absatzweisen Verfahrens gibt, oder indem man den Koeffizienten der Sauerstoffübertragungskapazität erhöht, indem man den Tank unter Druck setzt und/oder Sauerstoff hindurchleitet und dadurch die Menge an Bakterienzellen erhöht. Bei diesen Kultivierverfahren ist es jedoch schwierig, die logarithmische Wachstumsphase andauern zu lassen und deshalb wird es wünschenswert, die Zellen zu ernten, die gerade dabei sind, in die stationäre Phase überzugehen. Infolgedessen wird der Gehalt des gewünschten endobakteriellen Enzyms vermindert oder man benötigt eine längere Zeit für die Kultivierung. Auch die Herstellungskosten nehmen wegen des zunehmenden Verbrauchs an Kulturmedium und Sauerstoff zu. Obwohl man die Menge der schließlich gebildeten Zellen erhöhen kann, nimmt die Menge der gewünschten Zellen pro Zeiteinheit und pro Einheit für die Kosten der Kultivierung und damit die Produktivität des Enzyms tatsächlich ab. Wendet man diese üblichen bekannten Verfahren auf Bakterien an, die die Fähigkeit haben, Acetatkinase zu bilden, so ist der Gehalt an in den Bakterienzellen gebildeter Acetatkinase viel geringer als der bei Bakterienzellen, die in einem absatzweisen Verfahren mit verminderter Produktivität der Zellen und einer Ernte während der logarithmischen Wachstumsphase kultiviert werden.

Enzyme, die an einem energiemetabolischen System teilnehmen, wie Glycerokinase oder Acetatkinase, werden als Bestandteilsenzyme bezeichnet und werden in den Bakterienzellen unabhänig von den Kultivierungsbedingungen erzeugt. In Journal of Applied Bacteriology, Bd. 38, Seiten 301 bis 304 (1975), wird festgestellt, daß die Bildung von Rhodanase und Glycerokinase als einem endobakteriellen Enzym untersucht wurde unter Verwendung von kontinuierlichen Kultivierungsverfahren und daß der Gehalt an Enzym pro Zelleinheit von der Art der Kohlenstoffquelle im Nährmedium abhängig ist, aber nicht durch den Verdünnungsgrad beeinflußt wird. Gemäß einem Aufsatz in Journal of Bacteriology, Bd. 133, Nr. 2, Seiten 992 bis 1001 (1978), wurde die Beziehung zwischen dem Gehalt an Acetatkinase pro Zelleinheit von Escherichia coli und der spezifischen Wachstumsrate in einem kontinuierlichen Kultivierungsverfahren untersucht und es wurde keine Beziehung zwischen dem Gehalt an Acetatkinase pro Zelleinheit und der spezifischen Wachstumsrate festgestellt. Weiterhin wird in Journal of Applied Chemistry and Biotechnology, Bd. 26, Seiten 324 bis 325 (1976) festgehalten, daß die Herstellung von α-Amylase aus Bacillus stearothermophilus untersucht wurde, und daß die Bildung von α-Amylase als exobakterielles Enzym proportional der Menge an Bakterienzellen ist. In Journal of Applied Chemistry wird jedoch nicht erwähnt, daß man die Produktivität von α-Amylase pro Zelleinheit erhöhen kann.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellen mit einem hohen Gehalt an wärmebeständiger Acetatkinase zu zeigen, das mit hohem Wirkungsgrad arbeitet.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Bakterienzellen mit einem hohen Gehalt an wärmebeständiger Acetatkinase sind solche, die einen höheren Gehalt an Acetatkinase haben als Acetatkinase enthaltende Bakterienzellen, die während der logarithmischen Wachstumsperiode in einem absatzweisen Verfahren erhalten wurden.

Als thermophile Bakterien vom Genus Bacillus mit der Eigenschaft, Acetatkinase zu erzeugen, können erfindungsgemäß alle Bakterien vom Genus Bacillus verwendet werden, die in der Lage sind, wärmebeständige Acetatkinase zu bilden. Die wärmebeständige Acetatkinase ist eine solche Acetatkinase, bei welcher die maximale Restaktivität an Acetatkinase bei 90% oder mehr der ursprünglichen Aktivität und vorzugsweise 95 oder insbesondere 100% gehalten werden kann, wenn man den folgenden Wärmebeständigkeitsversuch durchführt. Dieser Wärmebeständigkeitstest besteht darin, daß man die Acetatkinase mit einer Pufferlösung während 15 Minuten bei 50°C behandelt. Die Konzentration und der pH der Pufferlösung werden auf einen geeigneten Bereich, in Abhängigkeit von der Art der gebildeten Acetatkinase, eingestellt. Im allgemeinen beträgt jedoch die Konzentration und der pH der Pufferlösung 5 mM bis 500 mM bzw. 2 bis 11. Geeignete Konzentrationen und pH-Werte für die beschriebene Acetatkinase liegen bei etwa 50 mM bzw. 6,5 bis 8,0. Die Aktivität wurde nach dem Verfahren gemäß J. Biol. Chem., Bd. 249, Seite 2567 (1974) gemessen. Beispielsweise kann Bacillus stearothermophilus als bevorzugtes Bakterium erwähnt werden. Spezifische Bakterienstämme von Bacillus stearothermophilus, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind solche, die unter den Hinterlegungsnummern ATCC 7953, ATCC 8005 und ATCC 10149 hinterlegt worden sind. Diese Stämme sind besonders geeignet, weil sie schnell wachsen und einen hohen Gehalt an wärmebeständiger Acetatkinase pro Zelleinheit ergeben. Von diesen Stämmen werden ATCC 7953 und ATCC 10149 besonders bevorzugt, weil sie eine gute Stabilität haben und andere gute Verfahrenseigenschaften bei einer kontinuierlichen Kultivierung aufweisen.

In einem Nährmedium zum Kultivieren der erfindungsgemäß eingesetzten Bakterien können Kohlenhydrate, wie Glukose, Saccharose, Fruktose, Stärkehydrolysate, Melasse und Sulfitablauge, organische Säuren, wie Essigsäure und Milchsäure, und auch Alkohole, Öle und Fette, Fettsäuren und Glyzerin als Kohlenstoffquellen verwendet werden, soweit die angewandten Bakterien diese Stoffe assimilieren können. Beispiele für im Nährmedium verwendbare Stickstoffquellen sind anorganische und organische Materialien, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniak, Aminosäuren, Pepton, Fleischextrakt und Hefeextrakt. Weiterhin können auch anorganische Salze von Kalzium, Natrium, Zink, Eisen, Magnesium, Mangan, Kupfer und Kobalt und Phosphorsäure oder auch Spuren von Metallsalzen, Maisquellwasser , Vitamine, Nucleinsäure verwendet werden. Jedes allgemeine Nährmedium für Bakterien kann auch verwendet werden.

Die erfindungsgemäße Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen mit Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff von wenigstens 0,5 ppm, bezogen auf das Gewicht, vorgenommen. Die Kultivierungstemperatur liegt zwischen 40 bis 75°C und vorzugsweise bei 48 bis 61°C, weil die verwendeteten Bakterienstämme thermophil sind. Der pH des Nährmediums wird zwischen etwa 4,5 bis 9,0 und vorzugsweise bei 6,8 bis 8,0 gehalten.

Der Verdünnungsgrad (abgekürzt D) wird durch folgende Gleichung (I) angegeben:

worin

D den Verdünnungsgrad (l/h) F die Geschwindigkeit, mit der die Ausgangsflüssigkeit in den Fermentor gegeben und von diesem wieder abgezogen wird (l/h) (die einströmende und die abströmende Menge ist im wesentlichen identisch), und V die Menge (l) der Flüssigkeit in dem Fermentor bedeutet.

Die µ _max bei der Erfindung bezeichnet die maximale Wachstumsgeschwindigkeit (l/h) an Bakterien unter den Kultivierungsbedingungen bei einer kontinuierlichen Kultivierung. Sie bezeichnet insbesondere die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit, wenn eine Substanz bei einer kontinuierlichen Kultivierung (chemostatisch; Herdert, Elsworth, Telling, Journal of General Microbiology, Bd. 14, Nr. 8, Seiten 601 bis 622, 1956), D erhöht und die Konzentration der Zellen nicht mehr länger auf einem bestimmten Wert gehalten werden kann (d. h. zur Zeit des "Auswaschens" wie nachfolgend angegeben wird). Zum Beispiel kann die µ _max eines thermophilen Bakteriums gemäß der Erfindung in folgender Weise bestimmt werden: 1,5 bis 20 l eines Nährmediums werden in einen Fermentor mit einer Kapazität von 2 bis 30 l eingegeben und dabei das Medium auf 40 bis 75°C und vorzugsweise 48 bis 61°C, und einen pH von 4,5 bis 9,0 und vorzugsweise 6,0 bis 8,0 gehalten. Dann impft man mit dem Bakterium an und kultiviert absatzweise. Wenn das Bakterium zu wachsen beginnt und die Konzentration der Kohlenstoffquelle in der Kulturbrühe nicht mehr als 0,01 Gew.-% beträgt, wird ein Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie das zu Beginn in den Fermentor eingegebene verwendet und eine kontinuierliche Kultivierung des Bakteriums beginnt, wobei die Kohlenstoffquelle der einzige wachstumsbegrenzende Faktor ist. Auf diese Weise kann eine kontinuierliche Kultivierungsmethode, die von der Umgebung abhängig ist (chemostatisch), eingestellt werden. Wenn die kontinuierliche Kultivierung einen stationären Zustand erreicht hat, wird D stufenweise erhöht und die Konzentration der Bakterienzellen in der Fermentierungsbrühe und die Menge an Restkohlenstoffquelle wird periodisch gemessen. Wenn D allmählich zunimmt und den spezifischen Wachstumsgrad des Bakteriums übersteigt, beginnt die Konzentration des im stationären Zustand gehaltenen Bakteriums abzunehmen und andererseits die Konzentration an Kohlenstoffquelle zuzunehmen und der stationäre Zustand der kontinuierlichen Kultivierung kann dann nicht länger aufrechterhalten werden, wenn der Verdünnungsgrad D weiter erhöht wird. Dieser Zustand wird als "Auswaschzustand" bezeichnet und der spezifische Wachstumsgrad zu dieser Zeit des "Auswaschens" ist µ _max .

Der µ _max -Wert für bestimmte Bakterien variiert in Abhängigkeit von der Art des Nährmediums und den Kultivierungsbedingungen, aber ist ein konstanter Wert, wenn sich die Kombination dieser Faktoren nicht verändert. Ist der Wert einmal bestimmt worden, so kann er über einen langen Zeitraum als gesichert angesehen werden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es erforderlich, daß die kontinuierliche Kultivierung durchgeführt wird, indem man D auf wenigstens 0,9 µ _max der verwendeten Bakterien einstellt. Der Gehalt an Acetatkinase in den Bakterienzellen, die man bei einer kontinuierlichen Kultivierung erhält, indem man D auf wenigstens 0,9 µ _max der erfindungsgemäß verwendeten Bakterien einstellt, übersteigt den Maximalgehalt an Acetatkinase pro Zelleinheit der Bakterienzellen, die man in einem absatzweisen Verfahren erhält. Wenn D in der Nähe von µ _max gehalten wird, so ist der Gehalt an Acetatkinase in den Bakterienzellen 1,3mal größer als der in einem absatzweisen Verfahren erhaltenen Zellen. Andererseits ist der Acetatkinasegehalt in Bakterienzellen, die kontinuierlich bei einem D von weniger als 0,9 µ _max kultiviert werden, niedriger als bei Zellen, die absatzweise erhalten wurden.

Erfindungsgemäß kann D, nachdem die übliche Vorkultivierung und absatzweise Kultivierung bis zu einer gewünschten Zellkonzentration erfolgte, überwacht werden, indem man auf eine kontinuierliche Kultivierung umstellt. Die Überwachung von D kann während der gesamten Kultivierung erfolgen. Es ist jedoch vorteilhaft, die Kultivierung der letzten Phase des logarithmischen Wachstums der absatzweisen Kultivierung auf die kontinuierliche Kultivierung umzustellen und dann wird D unmittelbar auf den gewünschtenWert eingestellt.

Eine erfindungsgemäße Ausführungsform wird unter Bezugnahme auf beispielsweise Bacillus stearothermophilus NCA 1503 erläutert. Wird dieser Stamm in ein Glukose als Kohlenstoffquelle enthaltendes Nährmedium bei einer Optimaltemperatur (57°C) und einem Optimal-pH (6,8) in einem l-Fermentor (in den 20 l der Kulturbrühe eingebracht wurden) kontinuierlich kultiviert, so beträgt der gemessene µ _max -Wert unter diesen Bedingungen 1,1 (l/h). Um eine kontinuierliche Kultivierung bei D = µ _max durchzuführen wird frisches Nährmedium der gleichen Zusammensetzung kontinuierlich in den Fermentor in der 1,1fachen Menge der zuvor in den Fermentor eingebrachten pro Stunde zugegeben, d. h. in einer Menge von 22 l/h gemäß Gleichung (I) unter Verwendung einer Dosierpumpe, und gleichzeitig wird die Kulturbrühe mit der gleichen Geschwindigkeit aus dem Fermentor abgezogen.

Die Isolierung der Acetatkinase aus den erfindungsgemäß erhaltenen Bakterienzellen kann in üblicher Weise erfolgen. Zum Beispiel kann man die Zellen zerstören, sie dann Zentrifugieren und zu der erhaltenen Enzymlösung ein organisches Lösungsmittel oder verschiedene Salze zugeben und Acetatkinase fraktioniert reinigen oder sie durch Absorption auf einen Träger reinigen. Ein Beispiel für ein solches Verfahren wird in dem vorerwähnten Journal of Biochemistry, Bd. 84, Nr. 1, Seiten 193 bis 203, 1978, beschrieben. Werden die nach der Reinigung gemäß diesem Verfahren erhaltenen Kristalle hinsichtlich ihrer Eigenschaften untersucht durch Elementaranalyse, Absorption im Ultraviolettbereich, Messung des Molekulargewichtes und dergleichen, so stimmt sie vollständig mit denen einer Acetatkinase überein, die aus Bakterienzellen gewonnen wurden, welche durch übliche absatzweise Verfahrensmaßnahmen gebildet wurden.

Die erfindungsgemäß kultiviert und geernteten Bakterienzellen haben einen höheren Gehalt an Acetatkinase pro Zelleinheit als Zellen, die durch absatzweise Verfahren erhalten wurden; die Produktivität der Zellen ist somit hoch. Die Acetatkinase kann somit mit guter Effizienz gewonnen werden und die Kosten für die Extraktion und Reinigung pro Gewichtseinheit Acetatkinase können erheblich gesenkt werden. Da das erfindungsgemäße Verfahren ein kontinuierliches Kultivierungsverfahren ist, und die Kultivierung durch Überwachung von D ermöglicht wird, hat dies außerdem den Vorteil, daß man die Kultivierung leicht überwachen kann und daß die Kultivierungsbedingungen automatisch aufrechterhalten werden.

In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung ausführlicher beschrieben. Der Gehalt an Acetatkinase wurde in den Beispielen wie folgt bestimmt: Die Enzymaktivität an Acetatkinase wurde gemäß Journal of Biological Chemistry, Bd. 249, Seite 2567, 1974 festgestellt. Die Enzymaktivität, die zur Verminderung der Absorption von 1 Mikromol NADH bei 340 nm pro Minute benötigt wird, wird als eine Einheit (mit U bezeichnet) definiert. Die Produktivität an Acetatkinase wird als der Gehalt an Acetatkinase (U/g Trockenzelle) × Produktivität der Zelle (g Trockenzelle/l/h) definiert.

Beispiele 1 und 2 und Vergleichsversuche 1, 2 und 3

Verwendeter Stamm Bacillus stearothermophilus ATCC 7953

Zusammensetzung des Nährmediums, enthaltend Glucose als Kohlenstoffquelle und weitere Bestandteile:

Glucose1,3 g (NH₄)₂SO₄1,0 g Hefeextrakt0,5 g KH₂PO₄0,5 g Na₂HPO₄ · 12 H₂O0,5 g MgSO₄ · 7 H₂O0,1 g Leitungswasser zum Auflösen der
obigen Bestandteile1 l

Vorkultivierung

In einen 100 ml Erlenmeyer-Kolben wurden 20 ml des obigen Nährmediums gegeben und in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben wurden 100 ml des gleichen Nährmediums gegeben. Jeder der Kolben wurde mit einem Wattestopfen verschlossen, mit Dampf bei 121°C und 1 bar während 10 Minuten sterilisiert. Nach dem Kühlen wurden 5 mg lyophilisierter Zellen, erhalten von der American Type Culture Collection, aseptisch, in den 100 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Mit einem Drehschüttler wurden die Zellen bei 55°C während 24 Stunden unter Drehen und Schütteln mit einer Geschwindigkeit von 160 Upm kultiviert. Die Trübung in der Kulturbrühe nahm zu. Die Absorption in der Kulturbrühe bei 660 nm (nachfolgend als OD_{660 nm} bezeichnet) erreichte 0,8 bis 1,0. Die erhaltene Kulturbrühe wurde dann in einer Menge von 5 ml in den 500 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert und unter den gleichen Bedingungen wie vorher wurde die Flasche unter Schütteln während mehreren Stunden gedreht. Die OD_{660 nm} erreichte etwa 1,0. Dann wurde die Kultivierung unter Schütteln und Drehen abgebrochen, das erhaltene Produkt wurde als Vorkulturbrühe für die Hauptkultivierung verwendet.

Hauptkultivierung

In einen 30 l Fermentor wurden 20 ml eines Nährmediums der oben angegebenen Zusammensetzung vorgelegt und dann wurde 15 Minuten mit Dampf bei 121°C und 1 bar sterilisiert. Nach Einstellung einer Kultivierungstemperatur auf 57 ± 1°C und Einstellen des pH-Wertes auf 6,5 bis 7,0 (eingestellt mit 4 N NaOH) und einer Luftzugabemenge von 20 l/min und einer Rührgeschwindigkeit von 900 Upm wurde etwa 1 l der Vorkulturbrühe zum Inokulieren zugegeben und die absatzweise Kultivierung begonnen. Da während der Kultivierung Schaum gebildet wird, wurde eine geringe Menge eines Antischaummittels zugegeben. Das Wachstum der Zellen wurde bei OD_{660 nm} bestimmt. Nach Beginn des logarithischen Wachstums nach etwa 2,5 Stunden erreichte OD_{660 nm} den Wert von 1,0. Die Glucose in der Kulturbrühe war nahezu vollständig verbraucht (gemessen nach der Somogyi Nelson Methode). Deswegen wurde die Kultivierung auf eine kontinuierliche umgestellt. Da der µ _max - Wert des vorliegenden Stammes zuvor mit 1,2 (l/h) gemessen worden war, wurde ein sterilisiertes Nährmedium der vorerwähnten Zusammensetzung kontinuierlich in einer Menge von 24,0 l/h mittels einer Dosierpumpe zugegeben und in der gleichen Menge aus dem Fermentor abgezogen. Auf diese Weise wurde D auf 1,00 µ _max (Beispiel 1) eingestellt und die kontinuierliche Kultivierung wurde durchgeführt unter Verwendung des Nährmediums in einer 5fachen Menge der Menge der Kulturbrühe in dem Fermentor.

Dann wurde D stufenweise auf 0,90 µ _max [(21,6 l/h), Beispiel 2] 0,83 µ _max [(20,0 l/h), Vergleichsversuch 1] bzw. 0,67 [(16,0 l/h), Vergleichsversuch 2] verändert und die kontinuierliche Kultivierung wurde durchgeführt unter Verwendung des Nährmediums in einer 5fachen Menge gegenüber der Kulturbrühe in dem Fermentor.

Der Gehalt an Acetatkinase in den so erhaltenen Bakterienzellen wurde gemessen und die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. In Tabelle 1 werden auch die bei der absatzweisen Kultivierung (Vergleichsversuch 3) erzielten Ergebnisse gezeigt). Diese Daten wurden bei der absatzweisen Kultivierung vor der Umstellung auf eine kontinuierliche Kultivierung gemessen.

Tabelle 1

Aus den Ergebnissen in Tabelle 1 ist ersichtlich, daß bei einem Wert von D von wenigstens 0,9 µ _max der Gehalt an Acetatkinase pro Zelleinheit höher ist als bei einem absatzweisen Verfahren, wodurch die Reinigungskosten des Enzyms vermindert werden können und die Produktivität der Zellen hoch ist, und daß die Produktivität an Acetatkinase bis zu dem 4,2fachen gegenüber dem bei einem absatzweisen Verfahren erzielten aufgrund der synergistischen Wirkung der vorerwähnten Faktoren erhöht wird. Wenn andererseits D kleiner als 0,9 µ _max ist, so ist der Gehalt an Acetatkinase pro Zelleinheit geringer als bei einem absatzweisen Verfahren und die Produktivität an Zellen ist besser als bei einem absatzbaren Verfahren. Wegen der hohen Kosten für Extraktion und Reinigung ist ein solches Verfahren aber nicht wirtschaftlich.

Beispiele 3 und 4 und Vergleichsversuche 4 und 5

Verwendeter Stamm: Bacillus stearothermophilus NCA 1503
Zusammensetzung des Nährmediums:

Glucose (Kohlenstoffquelle)1,3 g Hefeextrakt1,0 g Pepton0,5 g KH₂PO₄0,5 g Na₂HPO₄ · 12 H₂O0,5 g MgSO₄ · 7 H₂O0,1 g ZnSO₄ · 7 H₂O0,01 g MnSO₄ · 7 H₂O0,01 g CuSO₄ · 5 H₂O0,01 g CoCl₂ · 6 H₂O0,01 g Leitungswasser zum Auflösen der
Bestandteile1 l

Vorkultivierung

Die Vorkultivierung in dem obigen Nährmedium wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt.

Hauptkultivierung

In einen 30 l Fermentor wurden 20 l des obigen Kulturmediums vorgelegt und sterilisiert (121°C, 1 bar, 15 Minuten). Bei einer Kultivierungstemperatur von 55 ± 1°C, einem pH von 6,5 bis 7,0 (eingestellt mit 4 N NaOH), einer Luftzuführgeschwindigkeit von 20 l/min und einer Rührgeschwindigkeit von 900 Upm wurde die absatzweise Kultivierung in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Nach etwa 2,5 Stunden seit Beginn der Kultivierung wurde eine OD_{660 nm} von 1,2 (0,56 g Trockenzellen/l) erreicht und die Glucose in der Kulturbrühe war nahezu vollständig verbraucht und nahm auf weniger als 0,01 Gew.-% ab. Unmittelbar darauf wurde die kontinuierliche Kultivierung begonnen. Da µ _max des angewandten Stammes zuvor mit 1,4 (l/h) bestimmt worden war, wurde das zuvor erwähnte sterilisierte Nährmedium in einer Menge von 28,0 l/h eingeführt und die Kulturbrühe aus dem Fermentor in der gleichen Geschwindigkeit abgezogen, wodurch D auf 1,00 µ _max (Beispiel 3) eingestellt wurde. Die kontinuierliche Kultivierung wurde durchgeführt indem man ein Nährmedium in der 5fachen Menge der Menge der in dem Fermentor enthaltenen Kultivierungsflüssigkeit anwendete. In gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurde D stufenweise auf 0,90 µ _max bei einer Zufuhr- und Abzugsgeschwindigkeit von 25,2 l/h (Beispiel 4) und 0,75 µ _max bei einer Zufuhr- und Abzugsgeschwindigkeit von 21,0 l/h (Vergleichsversuch 4) verändert und die kontinuierliche Kultivierung wurde unter Bildung der Bakterienzellen durchgeführt.

Der Gehalt an Acetatkinase in den so erhaltenen Zellen wurde gemessen und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. In Tabelle 2 werden auch die bei der absatzweisen Kultivierung (Vergleichsversuch 5) erzielten Werte gezeigt. Diese Daten wurden während der absatzweisen Kultivierung vor dem Übergang auf eine kontinuierliche Kultivierung gemessen.

Tabelle 2

Aus Tabelle 2 geht hervor, daß auch bei einer Veränderung des Stammes die Beziehung zwischen D und dem Gehalt an Acetatkinase pro Zelleinheit bestehen blieb. Die Bakterienzellen, die mit einem D von wenigstens 0,9 µ _max gebildet worden waren, zeigten einen höheren Gehalt an Acetatkinase als solche, die nach dem absatzweisen Verfahren erhalten wurden.

Beispiele 5 und 6 und Vergleichsversuche 6 und 7

Angewendeter Stamm: Bacillus stearothermophilus NCA 1503

Zusammensetzung des Nährmediums: Wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß anstelle von Glucose 1,2 g Glycerin verwendet wurden.

Vorkultivierung

Die Vorkultivierung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 2 unter Verwendung des vorerwähnten Nährmediums durchgeführt, wobei Glycerin als Kohlenstoffquelle verwendet wurde.

Hauptkultivierung

Die Hauptkultivierung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 2 eingeleitet. Nach etwa 3 Stunden erreichte OD _{660 nm} 0,9 (0,48 g Trockenzellen/l) und die Konzentration an Glycerin in der Kulturbrühe betrug weniger als 0,01 Gew.-% (gemessen bei 170°C durch Gaschromatografie GC-3 BT, 5% Polyäthylenglykol 2 M Säule). Dann begann die kontinuierliche Kultivierung. Der µ _max -Wert des hier verwendeten Stammes unter Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle war zuvor mit 1,1 (l/h) gemessen worden. D wurde deshalb stufenweise in gleicher Weise wie in Beispiel 1 auf 1,00 µ _max mit einer Zufuhr- und Abzugsgeschwindigkeit von 22,0 l/h (Beispiel 5), auf 0,90 µ _max mit einer Zufuhr- und Abzugsgeschwindigkeit von 19,8 l/h (Beispiel 6) und auf 0,75 µ _max mit einer Zufuhr- und Abzugsgeschwindigkeit von 16,5 l/h (Vergleichsversuch 6) geändert und eine kontinuierliche Kultivierung wurde zum Erhalt der Bakterienzellen durchgeführt.

Der Gehalt der Zellen an Acetatkinase wurde dann gemessen und die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. Zum Vergleich werden in Tabelle 3 auch die bei einer absatzweisen Kultivierung (Vergleichsversuch 7) erzielten Ergebnisse gezeigt. Diese Ergebnisse wurden für die absatzweise Kultivierung gemessen, bevor man zur kontinuierlichen Kultivierung überging.

Tabelle 3

Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, daß auch bei einer Änderung der Kohlenstoffquelle von Glucose zu Glycerin sich die Beziehung zwischen dem Verdünnungsgrad D und dem Gehalt von Acetatkinase pro Zelleinheit nicht verändert. Die Bakterienzellen, die man bei einer Einstellung von D auf wenigstens 0,9 µ _max erhielt, hatten einen höheren Gehalt an Acetatkinase als Zellen, die durch ein absatzweises Verfahren erhalten wurde.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellen mit einem hohen Gehalt an wärmebeständiger Acetatkinase durch Kultivierung von thermophilen Bakterien vom Genus Bacillus mit der Fähigkeit, wärmebeständige Acetatkinase zu produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung kontinuierlich mit einem Verdünnungsgrad (D) im Bereich von 0,9 µ _max bis 1,0 µ _max durchgeführt wird, wobei (D) der Verdünungsgrad (l/h) und µ _max der maximale spezifische Wachstumsgrad des Bakteriums unter kontinuierlichen Kultivierungsbedingungen bedeutet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus stearothermophilus ATCC 7953, ATCC 8005 oder ATCC 10 149 kultiviert.