Procédé et appareil pour la culture de micro-organismes. L'invention est relative à un procédé et à un appareil pour la culture de micro-orga nismes (bactéries, levures, moisissures, proto zoaires, algues inférieures, etc.).
Elle permet de réaliser une production continue à débit réglable, avec un rendement élevé, tout en assurant la constance et l'homo généité des propriétés du produit.
Le procédé selon l'invention est caracté risé par le fait que l.'on effectue une addition continue de milieu neuf à une culture homo- ne, addition compensée par la soustraction, également. continue, d'un volume égal de cul ture, la culture en traitement étant, en outre, soumise à. une action de brassage assurant le maintien de son homogénéité en tout point malgré l'addition et la soustraction susvisées.
L'invention sera maintenant décrite en ré férence au dessin ci-annexé, dans lequel: La fig. 1 montre schématiquement en coupe une première forme d'exécution de l'ap pareil pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
La fig. 2 montre, semblablement, une deuxième forme d'exécution dudit appareil. La fig. 3, enfin, montre en coupe schéma tique l'une des extrémités d'un appareil de ee genre, conçue pour assurer une étanchéité bactériologique parfaite.
On rappellera préalablement, pour la clarté de l'exposé, que les procédés utilisés jusqu'à présent pour la culture de micro organismes sont discontinus, à la fois dans l'espace et dans le temps. Ils comportent gé néralement plusieurs stades: ensemencement, croissance (laquelle comporte elle-même plu sieurs phases distinctes), récolte. On peut dire que, non seulement ils présentent les inconvé nients techniques inhérents à tous les procé dés discontinus, mais encore ils ne permettent pas d'utiliser pleinement les propriétés repro ductrices des micro-organismes.
Puisque, en effet, dans ces procédés discontinus, la den sité des cultures (richesse en micro-orga nismes) est variable d'un minimum à un maxi mum, en cours de traitement, le taux de crois sance maximum ne prévaut que pendant une fraction du cycle de production, alors qu'en raison du caraétère exponentiel de la crois sance des populations microbiennes, il y au rait intérêt à maintenir constamment la den sité maximum compatible avec la croissance au taux maximum.
En procédant conformément à l'invention, on remédie à ces inconvénients.
Toutefois, pour obtenir les meilleurs résul tats, il est indiqué, en outre d'une part, d'opérer l'addition et la sous traction sous un débit tel que la densité (ou richesse en germes) de la culture demeure sensiblement constante, et, d'autre part, lorsqu'on opère en présence d'une phase gazeuse (air), d'accroître les pos sibilités d'échange entre la phase gazeuse et la phase liquide, en particulier pour assurer le maintien de l'équilibre de saturation entre l'oxygène de l'air et l'oxygène dissous. A cet effet, on opère avantageusement de façon<U>que</U> .du liquide se trouve toujours sous forme de films en mouvement sur des surfaces internes de la. capacité, et en contact avec la phase ga zeuse.
Pour ce qui est du-débit à choisir de pré férence, on a noté que, si l'on appelle D le rapport du volume débité d par unité de temps au volume l' de la culture se trouvant dans la capacité de traitement - volume qu'on peut. supposer constant, pour un traite ment déterminé, puisque l'addition égale la soustraction - et si on désigne par y, le taux de croissance de la culture dans l'appareil, ce débit. doit satisfaire à la relation:
EMI0002.0008
<I><U>D</U> <SEP> _ <SEP> D</I>
<tb> logarithme <SEP> népérien <SEP> de <SEP> 2 <SEP> 0,69 Si P.",s,-, est le taux de croissance maximum de l'organisme considéré dans le milieu choisi, l'équation d'équilibre exige que D soit égal ou inférieur à la limite suivante
EMI0002.0010
<B>D <SEP> <I><U>#_-</U></I> <SEP> IÀ</B>mnx <SEP> X <SEP> 0,69. Cette expression permet de calculer le dé bit maximum d'un appareil de culture.
Dans le cas, par exemple, des bactéries E. Coli (pour la fabrication de vaccins, d'enzymes, etc.) en milieu riche (bouillon de viande), on sait que le taux de croissance horaire est de l'or dre de 3, ce qui donne pour valeur maximum de D D=3X0,69-2,08. Si l'on s'arrange pour que le volume l' de la phase liquide, c'est-à-dire de la culture dans la. capacité de traitement soit V = 300 litres on trouve pour le débit horaire maximum: d <I>=</I> VD = 300 X 2,08 = 620 litres.
L'appareil représenté en fig. 1 comprend un cylindre 1 horizontal ou sensiblement hori zontal, muni à ses extrémités de deux touril lons 2 et 3 reposant sur des palier> à roule ments à billes 4. et 5. Le cylindre est animé d'un mouvement de rotation par 1'interiné- . diaire d'une poulie 6 entraînée par un mo teur 7.
Les tourillons sont obturés par des capots 8 et 9 fixés au bâti (le l'appareil et amovibles. Des joints à chicanes assurent l'étanchéité bac tériologique de la fermeture. Les tubulures et autres organes nécessaires au fonctionnement de l'appareil pénètrent dans le cylindre à tra vers les capots où ils sont serrés par (les joints étanehes.
La surface intérieure du cylindre est munie d'une nervure en forme de spirale 10 dont le pas et la hauteur seront déterminés par le type de fabrication envisagé. Le chauffage à température constante est assuré soit en pla çant le cylindre dans une enceinte therniosta- tique, soit. en disposant des résistances électri ques à. la surface ou à l'intérieur même du cylindre ou par tout. autre moyen.
Le système thermostat.ique quel qu'il soit pourra être réglé par un régulateur 11 plongé clans la culture elle-même.
L'arrivée de milieu neuf est assurée par une tubulure 12 à. l'une des extrémités. lie débit est réglé par une pompe ou par Lui débit- mètre ou tout autre dispositif, par exemple une pompe à débit variable 50. Le départ d'une quantité équivalente de liquide est assuré par un siphon 13 à niveau réglable, aboutissant à l'autre extrémité du cylindre. Au lieu d'un siphon, on pourra également em ployer une pompe à débit réglable ou tout autre dispositif adéquat.
Le dispositif com porte, en outre, une tubulure 1.1 d'arrivée (le gaz (air ou tout autre mélange gazeux appro prié, stérilisé par chauffage ou filtration) et une tubulure de départ 15. D'autres tubulures, telles qu'une tubulure spéciale pour l'ense mencement, 16, pourront être adjointes à. l'ap pareil.
On peut même, si on le désire, placer à l'intérieur clé l'appareil une source (le rayon- nement. (infrarouge, ultraviolet, rayons X, etc.).
Il est à noter que, dans la réalisation re présentée, la hauteur H du niveau de liquide (culture en traitement) est supérieure à la Hauteur h de la spirale 10. On voit ainsi que le liquide est amené à circuler constamment en circuit fermé selon les flèches fi, f2: il en résulte l'action de brassage cherchée, assurant l'homogénéité de la culture dans toutes ses parties, malgré l'apport en 12 et le départ cii 13.
Dans le mode de réalisation de la fig. 2, on a disposé, dans le cylindre 1, des cylindres coaxiaux, de surfaces continues ou perforées, tels que 22, 23, ayant des longueurs et dia mètres inférieurs à ceux du premier, auquel ils peuvent être fixés par des entretoises 24, 25, 26, 27. Mais ils pourraient tourner indé pendamment du premier, éventuellement en sens inverse, étant entraînés par des moyens einématiques (par exemple arbres concentri- (lues) tels que représentés schématiquement selon les références 101.à 104.
Dans ce cas, les entretoises susvisées, au lieu de bloquer les cylindres les uns par rapport aux autres, assu reraient. seulement leur centrage. Ils peuvent. être, ou non, munis de nervures hélicoïdales ou autres analogues à la nervure 10 (fig. 1) et tournant, le cas échéant, dans des sens oppo sés pour assurer un brassage énergique. Even- t.uellement, le cylindre 1. pourrait être fixe, et. seulement les cylindres 22, 23 rotatifs, solu tion qui pourrait faciliter l'arrivée et le dé part des liquides et des gaz.
De toute faon, étant ouverts à leurs extrémités (de faon à laisser l'air ou les gaz circuler librement) et partiellement immergés, ils augmentent les surfaces d'échange entre les phases liquide et gazeuse.
Dans certains cas, et notamment pour des appareils de grandes dimensions, il y a inté rêt à assurer une étanchéité bactériologique aussi élevée que possible par des moyens appro priés. Ceux-ci pourront consister, notamment, en des chicanes ménagées dans les paliers des appareils ou en tous autres endroits et munies (le dispositifs stérilisants tels que des tubes à rayons ultraviolets, recevant une forme appropriée au but visé. Ainsi, malgré que les dits paliers ne soient pas parfaitement étan ches aux gaz, la stérilité est maintenue puis que les gaz pouvant s'introduire par les joints sont rendus stériles.
Sur la fig. 3, illustrant l'un des modes de réalisation desdits moyens, l'extrémité du tou rillon 3 porte un élément cylindrique coaxial 140 obturé à sa base 150. Entre les cylindres 3 et 140 se trouve un élément cylindrique 160 solidaire du capot 9 qui forme, en outre, cou vercle grâce au rebord 170. De chaque côté du cylindre 160 sont placés des tubes à va peur de mercure 180 qui seront, par exemple. enroulés en spirales et qui sont alimentés par une source extérieure à l'aide de bornes, non représentées sur le dessin et fixées au capot. L'air qui rentrerait éventuellement en suivant le trajet indiqué par les flèches est donc for cément soumis au rayonnement ultraviolet et, par suite, stérilisé.
Le capot 9 est fixe. Il est, par exemple, so lidaire du bâti de l'appareil ou du palier 5 sur lequel reposent les cylindres tournants. Aucun contact mécanique n'existe entre les éléments du tourillon et ceux du capot.
Dans un appareil tel que ceux représentés, à titre d'exemple, pour la mise en oeuvre de l'invention, on peut prévoir une légère sur pression à l'intérieur de leur capacité, ce qui permet d'éviter que l'ozone formé notamment par les rayons ultraviolets, dans les disposi tifs stérilisateurs susvisés, ne pénètre à l'inté rieur. L'atmosphère pourrait alors, en effet, devenir toxique. Il suffit, pour obtenir cette surpression, de régler convenablement les dé bits gazeux à travers les conduits tels que 14, 15 (fig. 1).
La culture de micro-organismes, à l'aide de l'appareil de la fig. 1, se fera par exemple de la façon suivante Le cylindre 1 est d'abord rempli de mi lieu neuf jusqu'à un certain niveau corres pondant au volume liquide V que l'on désire maintenir en permanence dans l'appareil, donc au débit horaire à prévoir (débit qui est lié au volume V par la formule visée plus haut). On opère une stérilisation, par exem ple par Tyndallisation (stérilisation en des sous de 100 C par plusieurs chauffages suc cessifs), par la vapeur ou par tous autres moyens, en utilisant le système de chauffage à thermostat, ou en plaçant le tout dans -Lui autoclave de dimensions appropriées.
Les diverses tubulures une fois connectées stérilement et la température réglée, on ense mence le milieu stérilement par la tubulure<B>16</B> et l'on met. en marche le moteur. La vitesse clé rotation sera réglée de faon à obtenir un brassage efficace et rapide et une aération suffisante. Le brassage est assuré dans le plan perpendiculaire à l'axe par la rotation elle- même, et dans le plan des génératrices par la spirale 10. L'équilibre entre la phase gazeuse et la phase liquide sera en même temps assuré grâce à la vaste surface d'aération représentée par la surface du liquide lui-même, augmentée des surfaces humides du cylindre et de la spi rale.
La croissance des germes est alors suivie par des prises d'essais effectuées à intervalles appropriés, jusqu'à. ce qu'on aboutisse à la densité désirée.
A partir de ce moment la production peut être mise en route de faon continue par l'ar rivée de liquide neuf en 12, selon le débit que l'on s'est fixé. Dans la réalisation repré sentée, le siphon 13 assure l'écoulement, à par tir de l'appareil, d'un débit. de culture égal au débit de milieu neuf introduit.
Si le rapport D est choisi inférieur à la limite susvisée, ou à peu près égal à cette limite, l'installation fournit une culture qui est parfaitement homogène et dont la densité demeure constante dans l'espace et dans le temps. Ladite installation travaille donc tou jours à la densité la plus favorable et le ren dement. est. optimum.
II y a lieu de noter d'ailleurs que: d'une part, la production peut être inter rompue à tout moment par arrêt du débit, et reprise très rapidement, sans nouvelle stéri lisation ou nouvel ensemencement, tant qu'une fraction suffisante des germes seront encore vivants, et, d'autre part, entre les limites déterminées par la capacité de l'appareil et les propriétés de l'organisme utilisé; la production horaire pourra être modifiée à, tout moment et, ame née à la valeur voulue en modifiant le vo lume V, c'est-à-dire le niveau du liquide dans l'appareil, et en modifiant le débit- dans la même proportion, le rapport D restant le même ou continuant à satisfaire à la même condition.
On peut aussi modifier le débit sans modifier le volume j'.
D'ordinaire, le taux de croissance s'ajuste automatiquement au débit. d suivant. la rela tion
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de sorte que le procédé donne le moyen de régler le taux de croissance de la culture et de la fixer à toute valeur inférieure ou à peu près égale au taux maximum de l'organisme considéré sur le milieu considéré, donc de fixer et de déterminer une des carac téristiques essentielles de la croissance, carac téristique dont dépendent en très grande par tie les qualités et propriétés (lu produit.
Il est, à noter qu'il ne sera pas toujours intéressant de travailler dans les conditions de débit cor respondant à la valeur maximum de itt.. Dans chaque cas particulier, on choisira, en agis sant sur le débit d à l'entrée et à la sortie, la valeur du rapport D qui correspond à l'équa- t.ion susvisée pour la valeur de /c choisie. Le procédé permet donc bien ce réglage, à vo lonté, du taux de croissance.
L'invention présente donc de nombreux avantages par rapport aux procédés et appa reils du genre en question déjà, existants, no tamment et en résumé possibilité d'une production continue, possibilité d'obtenir automatiquement, un réglage déterminé pour le taux de croissance de la culture et la densité des germes, ladite culture demeurant toujours homogène, possibilité d'obtenir un produit toujours égal à lui-même dans l'espace et dans le temps, possibilité d'obtenir un rendement horaire bien meilleur, donc, à égalité de débit, une capacité moindre pour les appareils à prévoir (le volume V de liquide à traiter, à égalité de débit d, étant moindre), et possibilité de modifier le débit d lorsque désiré, dans les conditions indiquées plus haut.
Il va de soi que l'on pourrait prévoir plu sieurs phases de traitement successives à des débits différents, selon toute loi de répétition désirée, et appliquer le procédé à la culture de micro-organismes anaérobies.
Il est. entendu aussi que les moyens de brassage, pour l'obtention de l'homogénéité, pourraient être autres que ceux décrits, et. comporter par exemple des plaques animées de mouvements de plongée, puis d'extraction, par rapport au liquide de culture, le tout. de façon à obtenir des films liquides minces sur lesquels les échanges puissent être accélérés an maximum.
Il est entendu aussi qu'une pression peut éventuellement être prévue, voire une d6pres- sion. L'atmosphère gazeuse peut. être intro duite au début. des opérations et s'y maintenir pendant tout le traitement, ou elle peut, au contraire, être renouvelée de Tacon continue on discontinue.