DE2554530C2 - Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin - Google Patents
Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-SerinInfo
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Description
L-Serin ist eine bekannte Aminosäure, die als Nahrungsmittelzusatz, in der Arzneimittel- und Kosmetik-Industrie
verwendet wird. L-Serin ist auch Ausgangssubstanz zur Herstellung anderer wertvoller
Verbindungen wie beispielsweise Methylserin. L-Serin kann für die Herstellung synthetischer Fasern Bedeutung
erlangen, da optisch aktives Serin neben L-Alanin und Glycin Hauptbestandteil der Naturseide ist.
Nach bekannten Verfahren wird !.Serin dadurch
gewonnen, daß DL-Serin synthetisch hergestellt und dann zur Gewinnung von L-Serin in die entsprechenden
optischen Isomeren getrennt wird.
Die japanische Patentschrift 17 728/67 betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von L-Serin,
welchem zusätzlich zur Kohlenstoff- und Energiequelle DL-GIycerinsäure zugesetzt wird.
Aus der DT-PS 19 16 421 ist ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von L-Serin bekannt,
welches Kohlenhydrate oder Kohlenwasserstoffe als Substrate einsetzt Die in diesem Verfahren verwendeten
Mikroorganismen benötigen Isoleucin zum Wachstum.
Es ist auch ein Verfahren bekannt, bei dem Glycin, im Stoffwechesl eine Vorstufe von Serin, mikrobiell zu
L-Serin umgesetzt wird (J. Agric. Chem. Soc. Jap, 48 [2],
125-129, 1974). Als Kohlenstoff- und Energiequelle wird nach diesem mikrowellen Verfahren bevorzugt
Glukose verwendet.
Dem Verfahren der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der Verwendung einer teuren
und fermentationstechnisch ungünstigen KobJ«-nstoff-
und Energiequelle der bekannten Verfahren zu vermeiden und L-Serin mikrobiologisch auf Methanolbasis und
unter Zugabe der preiswerten Serinvorstufe Glycin zu erzeugen. Erst die Kombination dieser Stoffe führt zur
Lösung der Aufgabe der Erfindung in Verbindung mit den neuen Mikroorganismen.
Es wurde nun ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin gefunden, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß in einem mit Luft oder 02-angereicherter Luft begastem Reaktor bei einer
Reaktionstemperatur von 20 —400C mit dem fakultativ
Methanol verwertenden Bakterium Pseudomonas sp. DSM 672 oder mit Mutanten dieses Baktierums, bei
denen der Serin-Abbau geblockt ist, unter Verwendung anorganischer Nährstoffe eine Submerskultur erzeugt
wird, wobei zunächst die Vermehrung des Bakteriums bei einer Methanol-Konzentration von 0,1 — 1,0 Vol.-%
als Kohlenstoff- und Energiequelle und bei einem pH-Wert von 6,5 — 8,0 durchgeführt wird, und zur
Produktion des L-Serins durch die erhaltenen Bakterien sodann die Methanol-Konzentration auf einen konstanten
Wert zwischen 0,5 — 2,0 Vol.-%, die Anfangs-Glycin-Konzentration auf einen Wert von 0,5 —2,0 Gew.-% und
der pH-Wert auf 8,0 — 9,0 eingestellt werden, die Zellmasse aus dem Kulturfiltrat abgetrennt und
schließlich das L-Serin in bekannter Weise aus dem Kulturfiltrat isoliert wird.
Es wurde weiter ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Mutante der Stamm
DSM 673 eingesetzt wird.
Ferner wurde ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die führung des
Reaktors mechanisch erfolgt und daß eine Reaktortemperatuvon 28 — 33°C eingestellt wird.
Es wurde außerdem ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das Kulturfiltrat
teilweise in den Reaktor zurückgeführt wird.
Weiter wurde ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Vermehrung des
Bakteriums oder der Mutanten kontinuierlich in einem ersten Reaktor erfolgt und diese in einen zweiten
Reaktor überführt und dort unter den Bedingungen der Produktion behandelt wird. Es wurde noch ein
Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die L-Serin-Prcduktion durch das Bakterium
unter Zusatz von oberflächenaktiven Stoffen oder die Zellwand beeinflussenden Substanzen /.weeks Erhöhung
der Permeabilität erfolgt, vorzugsweise unter Zusatz von Lauryl-Sulfat. Ferner wurde ein Verfahren
gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als
N-Quelle Harnstoff und/oder NH4- bzw. NOj-Salze
eingesetzt werden.
Für das Verfahren der Erfindung zur Herstellung von
L-Serin wird der Methanol verwertende Mikroorganismus Pseudomonas sp. DSM 672, der aus einer
Bodenprobe isoliert wurde, oder die Mutante DSM 673 eingesetzt
Das Bakterium Pseudomonas sp. DSM 672 ist bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen
mit der Nummer DSM 672 und die Mutante mit der Nummer DSM 673 hinterlegt Das Bakterium DSM 672
ist durch folgende Eigenschaften charakterisiert:
1. Zellmorphologie:
Stäbchen in Grenzen
beweglich, mit einer polaren Geißel
Stäbchen in Grenzen
beweglich, mit einer polaren Geißel
2. Kolonienmorphologie:
kräftig rosa, rund und glatt, etwa 0,5 — 2 mm
Durchmesser nach 3—4 Tagen
Durchmesser nach 3—4 Tagen
3. Stammeigenschaft:
gram-negativ, Zelltrockenmasse kräftig rosa
4. Physiologie:
streng aerob, Methanol-Dehydrogenase positiv,
Hydroxypyruvat-Reduktase positiv,
Hexosephosphat-Synthetase negativ
Hydroxypyruvat-Reduktase positiv,
Hexosephosphat-Synthetase negativ
5. Wachstumseigenschaften:
Min. Opt.
Max.
Temperatur ( C") 5-10 28-33 37
pH 6,0 7-8 9,0
Melhanolkonz. (%M v'/V) 0,2 0,5-1,5 4,0
Pseudomonas sp. DSM 672 kinn auf Methanol und auf bestimmten organischen Säuren wie Succinat,
Pyruvat und Malat als Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen, dagegen nicht auf Methan, Methylamin,
Äthanol, Acetat oder Glukose.
Das Verfahren der Erfindung kann auch mit Mutanten des Pseudomonas sp. DSM 672 Stammes
durchgeführt werden, die sich vom Wildtyp dadurch unterscheiden, daß sie auf Succinat als einziger
Kohlenstoff- und Energiequelle nicht mehr ohne Zugabe von Glycin wachsen können. Solche Mutanten
lassen sich mit Hilfe chemischer und physikalischer Methoden gewinnen. Diese besitzen auch die L-Serin-Ansammlungsfähigkeit
des Ausgangsstammes. Zu den Maßnahmen, mit denen die genannten Mutanten erzeugt werden können, gehören beispielsweise Röntgen-
und Ultraviolettstrahlen, Behandlungen mit Stickstoff-Senfgasen oder organischen Peroxiden.
Das Verfahren der Erfindung wird durch folgende Beispiele beschrieben:
Eine Agar-Schrägröhrchen-Kultur von Pseudomonas sp. DSM 672 auf definiertem Medium wird in ein
flüssiges Medium von 100 ml/Kolben überführt, welches vorher 20 min bei 1200C sterilisiert und dann aseptisch
mit 1 % Methanol versetzt wurde.
Das Medium enthält folgende Nährstoffe: KH2PO4, 0,30 g; Na2HPO4, 0,45 g; (NH4J2SO4, 0,20 g; MgSO4 · 7 H2O, 0,04 g; CaCI2 · 2 H2O, 2,0 mg; FeSO4 · 7 H2O, 1,0 mg; MnSO4 · H2O, 0,5 mg; (NH4J2Mo7O24 · 7 H2O, 0,1 mg und 1 ml Methanol ad 100 ml destilliertem Wasser. Diese Kultur wird bei 300C
Das Medium enthält folgende Nährstoffe: KH2PO4, 0,30 g; Na2HPO4, 0,45 g; (NH4J2SO4, 0,20 g; MgSO4 · 7 H2O, 0,04 g; CaCI2 · 2 H2O, 2,0 mg; FeSO4 · 7 H2O, 1,0 mg; MnSO4 · H2O, 0,5 mg; (NH4J2Mo7O24 · 7 H2O, 0,1 mg und 1 ml Methanol ad 100 ml destilliertem Wasser. Diese Kultur wird bei 300C
ίο auf einer Rotationsschüttelmaschine aerob 40 Stunden
inkubiert 1% dieser gewaschenen Kultur dient als Inokulum für eine Flüssigkultur gleicher Zusammensetzung
des Mediums und gleichen Inkubationsbedingungen außer der Inkubationszeit Während der Inkubation
werden in Abständen von 15—20 Stunden insgesamt zweimal weitere 1% Methanol zugegeben. Vor jeder
Zugabe wird der pH-Wert der Submerskultur mit 1 n-NaOH auf 7,0 eingestellt. Nach 45-60 Stunden
Vermehrungsphase wird der pH-Wert auf 8,5 mit 1 n-NaOH korrigiert nochmals 2% (V/V) Methanol und
gleichzeitig 2% (G/V) Glycin zugegeben. Nach weiteren 30 — 50 Stunden werden 4 g/i L-Serin im Nährmedium
nachgewiesen.
Ein Reaktor, gefüllt mit 101 Nährlösung gleicher
Zusammensetzung wie im Beispiel 1 wird 10 Min. bei 121°C sterilisiert, auf 30°C abgekühlt, aseptisch mit
0,5% (V/V) Methanol versetzt und mit 200 ml Inokulum von Pseudomonas sp. DSM 672 hergestellt wie im
Beispiel 1, beimpft. Die Submerskultur wird bei 300C und unter Einsatz eines Blatt-Rührers mit einer
Belüftungsrate von 600 l/h/Gesamtansatz gezüchtet. In der ersten Phase der Züchtung wird die Methanol-Konzentration
auf 0,5 Vol.-% automatisch konstant gehalten, außerdem wird automatisch mit einer
pH-Regulierstation durch Zusatz einer 12vol.-°/oigen Ammoniaklösung ein pH-Wert von 7,0 aufrechterhalten.
Nach 40-60 Stunden wird der pVi Wert auf 8,5 eingestellt und bis zum Abbruch des Züchtungsprozesses
auf diesem Wert konstant gehalten. Gleichzeitig wird die Methanolkonzentration auf 2% erhöht und auf
diesefn Wert konstant gehalten. Gleichzeitig werden zu diesem Zeitpunkt 2% Glycin zugegeben und die
Belüftungsrate auf 200 l/h/Gesamtansatz gesenkt. Nach 80-100 Stunden Prozeßdauer beträgt die L-Serinkonzentration
in der Nährlösung 5-6 g/l.
Da:, Verfahren wird gemäß Beispiel 2 durchgeführt,
jedoch die Mutante DSM 673 des Pseudomonas sp.
DSM 672 Stammes eingesetzt. Die Ausbeute an L-Serin im Nährmedium beträgt unter den praktisch gleichen
Prozeßbedingungen 8—10 g/l.
Claims (8)
1. Verfahren zur mikrowellen Herstellung von
L-Serin, dadurch gekennzeichnet, daß in > einem mit Luft oder Orangereicherter Luft
begasten Reaktor bei einer Reaktionstemperatur von 20—400C mit dem fakultativ Methanol verwertenden
Bakterium Pseudomonas sp. DSM 672 oder mit Mutanten dieses Bakteriums, bei denen der ι ο
Serin-Abbau geblockt ist, unter Verwendung anorganischer Nährstoffe eine Submerskultur erzeugt
wird, wobei zunächst die Vermehrung des Bakteriums bei einer Methanol-Konzentration von 0,1 —1,0
Vol.-% als Kohlenstoff- und Energiequelle und bei is
einem pH-Wert von 6,5—8,0 durchgeführt wird, und zur Produktion des L-Serins durch die erhaltenen
Bakterien sodann die Methanol-Konzentration auf einen konstanten Wert zwischen 0,5 — 2,0 Vol.-°/o, die
Anfangs-Glycin-Konzentration auf einen Wert von :o 0,5-2,0 Gew.-% und der pH-Wert auf 8,0-9,0
eingestellt werden, die Zellmasse aus dem Kulturfiltrat abgetrennt und schließlich das L-Serin in
bekannter Weise aus dem Kulturfiltrat isoliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch I1 dadurch gekenn- 2s
zeichnet, daß man als Mutante den Stamm DSM 673 einsetzt.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rührung des
Reaktors mechanisch erfolgt. \υ
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 —3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Reaktortemperatur von
28-33°Ceingestelltwird.
?. Verfahren nach den Ansprüchen 1 —4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturfiltrat teilweise in ?s
den Reaktor zurückgeführt wird.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 —5, dadurch gekennzeichnet, daß die Vermehrung des Bakteriums
oder der Mutanten kontinuierlich in einem ersten Reaktor erfolgt und diese in einen zweiten
Reaktor überführt und dort unter den Bedingungen der Produktion behandelt wird.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 -6, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Serin-Produktion durch
das Bakterium unter Zusatz von oberflächenaktiven Stoffen oder die Zellwand beeinflussenden Substanzen
zwecks Erhöhung der Permeabilität erfolgt, vorzugsweise unter Zusatz von Lauryl-Sulfat.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 —7, dadurch gekennzeichnet, daß als N-Quelle Harnstoff ,η
und/oder NH4- bzw. NOj-Salze eingesetzt werden.
Priority Applications (6)
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