DE69834736T2

DE69834736T2 - Verfahren für die biotransformation von colchicon-verbindungen in die entsprechenden 3-glykosyl-derivate

Info

Publication number: DE69834736T2
Application number: DE69834736T
Authority: DE
Inventors: Ezio Bombardelli; Cesare Ponzone
Original assignee: Indena SpA
Current assignee: Indena SpA
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-09-30
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2018-10-01
Also published as: EP1019521B1; ATE328106T1; KR100536676B1; HUP0004840A2; NO20001706D0; PL190865B1; CA2305046C; PT1019521E; NO320096B1; ITMI972255A1; SK285923B6; DE69834736D1; AU745222B2; EP1019521A1; AU1028399A; NO20001706L; WO1999018229A1; CZ20001196A3; HUP0004840A3; DK1019521T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die mit Hilfe von ausgewählten mikrobiellen Stämmen bewirkte Biotransformation von colchicinoiden Verbindungen zu den entsprechenden 3-O-Glycosylderivaten. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt Verbindungen in hohen Ausbeuten und hoher Reinheit bereit, die ausgehend von den zitierten Colchiconverbindungen ausschließlich am C-3 von dem aromatischen Ring A glycosyliert sind.
Die durch das erfindungsgemäße biotechnologische Verfahren erhaltenen Verbindungen, insbesondere Thiocolchicoson (3-O-Glucosylthiocolchicon; d.h. mit Bezug auf Formel (I), R₁ = -OCH₃ und R₂ = -SCH₃), sind Wirkprinzipien von bemerkenswerter pharmakologischer Bedeutung, hauptsächlich für die Herstellung von neuen Antitumorwirkstoffen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Eine Vielzahl von Bemühungen wurde unternommen, um stark spezifische Glycosidierungen von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und verwandten colchicinoiden Verbindungen, entweder mit Hilfe von chemischen Reaktionen oder durch Biotransformation, zu erhalten.
Der chemische Weg besteht in Folgen von komplizierten unspezifischen Reaktionen, die, nicht selektiv verschiedene Molekülstellen einbeziehend, zu einem Gemisch von glycosidierten Derivaten führen, wobei einige davon unwirksam sind. Deshalb sind die Umwandlungsausbeuten zu dem wirksamen Produkt, das speziell am C-3 des aromatischen Rings glycosidiert ist, sehr niedrig.
Der biologische Ansatz betrifft im Wesentlichen die Biotransformation von colchicinoiden Verbindungen (die indi rekt mit Colchiconverbindungen verwandt sind), wie Colchicin und Thiocolchicin, durch eine Kultur von Centella Asiatica, zu am C-2 und C-3 des aromatischen Rings monoglycosidierten Derivaten; wobei eine solche Transformation deshalb nicht sehr selektiv ist und spärliche Ausbeuten und Produktivität bereitstellt (Solet, J.M., et al., Phytochemistry 33, 4, 817–820, 1993).
Andere Bemühungen, colchicinoide Verbindungen zu biotransformieren, ergaben einfache Demethylierungen der an den aromatischen Ring (am C-2 und am C-3) gebundenen Methoxygruppen, durchweg immer gekennzeichnet durch begrenzte Ausbeuten und Produktivität und durch eine schlechte Regioselektivität.
Somit versuchten Hufford C.D. et al. (J. Pharm. Sc., 68, 10, 1239–1242, 1979), unter Anwendung von Streptomyces griseus und/oder Streptomyces spectabilis, und Bellet P. et al. (GB-923421, 1959), unter Anwendung von verschiedenen Stämmen von Streptomyces und von anderen Spezies von Bakterien und Pilzen, Colchicin und seine Derivate in die entsprechenden 3-demethylierten Derivate zu transformieren. Die Ergebnisse dieser bekannten Verfahren bestätigen, was vorstehend in Verbindung mit der Nichtselektivität der einbezogenen mikrobiellen Enzyme, beispielsweise am C-2, C-3 oder C-10 des Alkaloidmoleküls, angegeben wurde. Darüber hinaus sind die Produktivitätsanteile der katalytischen Systeme aufgrund der niedrigen Umwandlungsausbeuten, der verminderten Substratkonzentrationen, die angewendet werden können, und des häufigen Abbaus von dem Tropolonring eher schlecht.
Vor kurzem haben Poulev et al. (J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33–38, 1995) die spezifische Demethylierung durch Anwendung von bakteriellen Mikroorganismen erhalten, jedoch immer noch mit schlechten Ausbeuten und schlechter Produktivität.
Die Enzymaktivität von Mikroorganismen, die ähnlich zu den vorstehend erwähnten sind (Streptomyces, Bacillus, usw.), wurde auf die Biotransformation von anderen Verbindun gen, wie Maytansinoiden (US-Patent 4 361 650: Izawa, M. et al., J. Antibiotics, 34, 12, 1587–1590, 1981), angewendet. In diesem Fall bestand auch die katalysierte Reaktion ausschließlich in einer Demethylierung, die sich durch niedrige Umwandlungsausbeuten und Produktivität auszeichnet.
Glycosyltransferaseaktivitäten von α-Amylase von Ba cillus megaterium-Stämmen wurde beschrieben (Brumm P.J., et al., Starch, 43, 8, 319–323, 1991), wobei die Akzeptorspezifität (ausschließlich Glucose oder Glucoside) besonders hoch ist. Cyclodextrin-Glucosyltransferasen, die durch die gleiche mikrobielle Quelle hergestellt wurden, katalysieren eine α-1,4-Transglucosylierung von Rubusosoid (13-O-β-D-Glucosylsteviol-β-D-glucosylester), ausgehend von Stärke. Auch in dieser Biotransformation ist der Akzeptor für die Transferasereaktion die Substratglucidfraktion (Darise, M., et al., Agric. Bioel. Chem., 48, 10, 2483–2488, 1984). Cyclodextrin-Glycosyl-Transferasen wurden früher für die Herstellung von Cyclodextrinen G6 und G8 aus Stärke verwendet (Kitahata, S., Okada, S., Agric. Biol. Chem., 38, 12, 2413–2417, 1974).
Diese Beispiele zeigen die hohe Substratspezifität der durch Bacillus megaterium exprimierten Glycosyltransferaseaktivitäten, welche nur Glucosylakzeptoren einbeziehen, wodurch es nicht möglich ist, irgendwelche Reaktionen an sekundären Metaboliten mit einer anderen, komplizierten Molekülstruktur, wie Colchicone, zu erwarten. Tatsächlich sind keine Beispiele für die Verwendung der Mikroorganismen für die Enzymumwandlung von Colchiconverbindungen zu 3-Glycosylderivaten bekannt.
Es wurde nun gefunden, dass Stämme von Bacillus mega terium, die in der Lage sind, in Gegenwart von hohen Konzentrationen an Colchicon (R₁ = -OCH₃, R₂ = -OCH₃) 3-Demethylcolchicon und den entsprechenden Thioderivaten zu wachsen, eine sehr hohe, sehr spezifische Biotransformationsaktivität der Substrate zu ausschließlich am C-3 des aromatischen Rings glycosydierten Derivaten aufweisen. Solche Transformation findet in sehr kurzen Zeiträumen statt und zeichnet sich durch überraschend hohe Ausbeuten aus.
Deshalb betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 3-O-Glycosylcolchiconverbindungen der Formel (I):
worin R¹ einen Glycosidrest, insbesondere einen O-Glucosidrest, darstellt, R² C₁-C₆-Alkoxy oder C₁-C₆-Thioalkyl darstellt, das die Biotransformation von Verbindungen, worin R₁ OH oder Methoxy darstellt, mit Hilfe von Bacillus megaterium umfasst.
Bacillus megaterium ist ein gram-positives, Sporen erzeugendes Bakterium mit einem Zellendurchmesser von mehr als 1,0 μm, das aerob auf einer Vielzahl von Kulturmedien wächst; Katalase-positiv; hydrolysiert Gelatine. Es hat sich erwiesen, dass Stämme von Bacillus megaterium, die erfindungsgemäß verwendet werden können, befriedigend wachsen können und auch bei hohen Konzentrationen von Colchicon, Thiocolchicon (R₁ = -OCH₃, R₂ = -SCH₃) bzw. 3-Demethylderivaten (oberhalb 2 g/l) lebensfähig gehalten werden können, wie durch die Prüfung des Wachstums und Mikroskopanalyse verdeutlicht wurde. Stammverwandte Spezies, wie Bacillus cereus, zeigen schon bei Substratkonzentrationen von 1 g/l Schwierigkeiten beim Wachsen (Absorptionen von 10–15 % in der Kontrolle).
Die hohe Selektivität und Effizienz der Biotransformation ist überraschend und ungewöhnlich, da die Ausbeuteanteile im Bereich von 70 % bis 95 % liegen.
Darüber hinaus sind die bei der Biokonversion verwendeten Mikroorganismen in der Lage, die katalytische Aktivität auch bei wiederholten Fermentationsschritten permanent zu halten, wodurch die spezifische Biokonversion in chargenweise und kontinuierlich gespeisten Verfahren bereitgestellt wird. Deshalb liefert dieses Verfahren einen hohen Grad an Produktivität und Reproduzierbarkeit.
Die ausgeprägte Regioselektivität der Reaktion gewährleistet zusätzlich zu den bemerkenswerten Herstellungsausbeuten eine hohe Qualität und Reinheit des erhaltenen Produkts, wodurch dasselbe in einer 100 %igen Reinheit in einer einfachen Stromabwärtsverarbeitung bereitgestellt wird.
Weiterhin sind wichtige Vorteile das verminderte Auftreten des Schritts zur Reinigung und Wiedergewinnung des Produkts, die Ökonomie des Verfahrens und die Erschwinglichkeit und Sicherheit der Verwendung.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Arbeitsfolgen umfassen:

A) – Auswahl von Kulturen von Bacillus megaterium, die in Gegenwart von hohen Konzentrationen von Colchiconsubstrat wachsen können, ausgehend von natürlichen Quellen oder von Stämmen aus Sammlungen.
B) – Auswahl von Isolaten von A), um die katalytische Transformations-Aktivität zu den entsprechenden 3-O-Glycosylderivaten mit Hilfe von Biokonversionsassays an den spezifischen Substraten, die in allmählich ansteigenden Konzentrationen verabreicht werden, zu bewerten.
C) – Mikrobiologische Charakterisierung der in B) ausgewählten Stämme.
D) – Allmähliche Erhöhung der Biotransformationsausbeute mit Hilfe einer zielspezifischen Auswahl der bakteriellen Population von B).
E) – Untersuchung und Optimierung der kritischen Fermentationsparameter, um die Biotransformation zu optimieren.
F) – Untersuchung und Optimierung der Verfahren für die Konservierung der stark produktiven Kulturen, um stabile, homogene Inokula für produktive Anwendungen im industriellen Maßstab zu garantieren.
G) – Maßstabvergrößerung des Verfahrens im Fermenter, im Chargen-, chargenweise und kontinuierlich zugeführten Verfahren.
H) – Aufarbeitung und Optimierung der Verfahren für das Stromabwärtsverarbeiten und für die Gewinnung des Produkts.

Insbesondere können die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Mikroorganismen, ausgehend von Sammlungskulturen, die von Stammhinterlegungszentren erhalten werden, oder von Bodenproben verschiedenen Ursprungs, oder von vorausgewählten industriellen Stämmen, durch selektive Gewinnung auf verschiedenen Agarmedien, die eine organische Stickstoffquelle (Peptone, Hefeextrakte, Fleischextrakte, Asparagin, usw.), eine Kohlenstoffquelle (Glycerin, Stärke, Maltose, Glucose, usw.), mit pH 5 bis 8, vorzugsweise 6–7, enthalten, ausgewählt werden. Die Inkubationstemperatur liegt im Bereich von 20° bis 45°C, vorzugsweise 28° bis 40°C.
Die Fähigkeit der Kultur, in Gegenwart von toxischen Konzentrationen des zu transformierenden colchiconischen Substrats zu wachsen, wird durch Techniken bewertet, wie skalare Verdünnung und paralleles Plattieren auf verschiedenen Agarsubstraten, wobei ein Teil davon vorher mit der colchiconischen Verbindung (beispielsweise 3-Demethylthiocolchicon) in Konzentrationen von 0,1 bis 3 g/l versetzt wurde (um das Wachstum des Hauptteils der Mikroorganismen zu inhibieren).
Die Kolonien, die in den beschriebenen Bedingungen wachsen können, werden im Sterilen abgezogen und auf verschiedenen Agarmedien angeordnet, um deren Reinheit und die Homogenität des Wachstums zu verifizieren.
Die für die Konservierung der Kultur verwendeten Kulturmedien sind typischerweise mikrobiologische Substrate, die organische Stickstoffquellen (Peptone, Hefeextrakte, Trypton, Fleischextrakte, usw.), eine Kohlenstoffquelle (Glucose, Maltose, Glycerin, usw.), bei pH 5 bis 8, vorzugsweise 6–7, enthalten. Die Inkubationstemperatur liegt im Bereich von 20° bis 45°C, vorzugsweise 28° bis 40°C.
Die ausgewählten Mikroorganismen werden dann auf die Fähigkeit des Wachsens in Tauchkultur bzw. submerser Kultur, in Gegenwart von colchiconischen Verbindungen, und des Transformierens der Letzteren in die entsprechenden 3-Glycosylderivate bewertet.
Die Assays wurden in 100 ml-Kolben, die 20 ml flüssiges Medium enthalten, mit verschiedenen Mediumformulierungen, umfassend eine oder mehrere organische Stickstoffquellen (Hefeextrakte, Peptone, Trypton, Caseinhydrolysate, Fleischextrakt, Maisquellwasser, usw.), eine oder mehrere Kohlenstoffquellen (Glucose, Glycerin, Stärke, Saccharose, usw.), anorganische Phosphor- und Stickstoffquellen und anorganische Salze von verschiedenen Ionen (K⁺, Na⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Fe⁺⁺, Mn⁺⁺, usw.) ausgeführt.
Die Kulturproben können gegebenenfalls mutagenen Behandlungen mit Hilfe der herkömmlichen Mutagenesetechniken (Bestrahlung mit UV-Strahlen, usw.) unterzogen werden, um Mutanten mit einer spezifischen Biokonversionsaktivität, die mit dem gleichen Verfahren, wie vorstehend, bewertet werden können, einzuführen.
Kulturproben von jedem Biokonversionsassay wurden analysiert, um die Herstellung von 3-Glycosylderivaten mit Hilfe von DC- und HPLC-Analyse zu bewerten.
Die Fähigkeit des ausgewählten Mikroorganismus zum Transformieren von Colchiconsubstraten in die entsprechenden 3-Glycosylderivate wurde mit Hilfe von Biokonversionsassays in Kolben in einer Größe von 300 ml in den gleichen Kulturbrühen, wie in dem Auswahlschritt verwendet, bestätigt.
Die Mikroorganismen, die eine positive Reaktion ergaben, wurden in Tests für die Optimierung der Biokonversion in verschiedenen Kulturbrühen in einem 300 ml-Maßstab verwendet. Die Hauptkultur- und Fermentationsparameter, die untersucht wurden, sind: organische Stickstoffquellen, Kohlenstoffquellen, Mineralsalze, Temperatur, Rühren-Belüftung, pH-Wert, Inkubationszeit, Inokulumverhältnis, Subkulturschritte, Zeit und Form der Zugabe von dem zu überführenden Substrat. Die ausgewählten bakteriellen Mikroorganismen, die Biotransformation der vorliegenden Erfindung bewirken können, können auf sowohl festen als auch flüssigen Kultursubstraten, die eine oder mehrere organische Stickstoffquellen enthalten, vorzugsweise Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Trypton, Caseinhydrolysate, Maisquellwasser, usw., wachsen. Für das Wachstum und die Biotransformation verwendbare Kohlenstoffquellen sind Glucose, Fructose, Saccharose, Glycerin, Maisextrakt, usw., vorzugsweise Glucose, Fructose und Glycerin. Das Kulturmedium enthält darüber hinaus anorganische Phosphorquellen und Salze von K⁺, Na⁺, Mg⁺⁺, NH₄ ⁺, usw.
Die ausgewählten Mikroorganismen können bei Temperaturen von 20° bis 45°C, vorzugsweise 28° bis 40°C, bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8, vorzugsweise 6–7, wachsen. Unter den gleichen Bedingungen können die betrachteten Mikroorganismen die colchiconischen Verbindungen in die entsprechenden 3-Glycosylderivate transformieren. Die Transformationen finden in Tauchkultur, in Kolben, die an einem Rotationsschüttler inkubiert wurden, unter Rühren bei 150 bis 250 U/min statt.
Aufgrund der besonderen, die Biotransformation betreffenden Kinetik, die mit dem mikrobiellen Wachstum in Bezug steht, sind die optimalen Bedingungen für die Zwecke der Biotransformation die gleichen Bedingungen, die das Optimum für das Wachstum sind. Deshalb sind für das Fördern eines guten mikrobiellen Wachstums verwendbare Kulurmedien, wie jene, die auf den vorstehend angeführten organischen und anorganischen Komponenten basieren, auch für eine gute Aktivität der Biotransformation des betreffenden Substrats verwendbar. Das Letztere wird zu der Kultur in dem Ausgangsfermentationsschritt gegeben, oder in fraktionellen aliquoten Mengen, ausgehend von dem Beginn der Fermentation.
Die erfindungsgemäße Biotransformation basiert auf einer Enzymumwandlung, die während der Exponentialwachstumsphase beginnt und sich mit einem Parallelwachstum zu jenem des Wachstums fortsetzt, wobei die maximalen Anteile der Um wandlung zu 3-Glycosylderivat (sehr hoch: bis zu 95 %) innerhalb der ersten 48–72 Stunden in Abhängigkeit von der Zugabezeit des Substrats erreicht werden. Die Regioselektivität der Biotransformation ist absolut: kein Vorliegen von 2-Glycosylderivaten wurde in den Kulturproben gezeigt. Die erhaltenen Produkte sind ausschließlich extrazellulär.
Das zu transformierende Substrat kann in Aceton oder Alkohollösung, in Alkohol-Wasser-Gemischen, in Dioxan, usw. zugesetzt werden. Die erfindungsgemäße Biotransformation wird auf Fermenterniveau maßstabsgetreu erhöht, unter Halten der Kultur bei unveränderten Bedingungen, insbesondere, insofern das Kulturmedium, die Temperatur und Verarbeitungszeiten betroffen sind. Um gutes Wachstum zu erhalten, sind ein hinreichender Grad von Rühren-Belüftung wichtig; insbesondere sind Belüftungsanteile von 1–2 Litern Luft pro Liter Kultur pro Minute (VVM), vorzugsweise sind 1,5–2 VVM, erforderlich.
Die sich aus der Biokonversion ergebenden Produkte werden aus den Kulturbrühen nach Abtrennung der Biomasse aus der flüssigen Fraktion durch Zentrifugierung und Wiedergewinnung des Überstandes oder Mikrofiltration und Gewinnung des Permeats extrahiert. Die Kultur kann im Hinblick auf eine optimale Gewinnung des Produkts mit Alkoholen behandelt werden.
Die Reinigung und die Gewinnung der Biotransformationsprodukte kann unter Anwendung von chromatographischen Techniken für die Trennung an Absorptionsharzen und Elution mit Alkoholen, vorzugsweise mit Methanol, ausgeführt werden. Die Hydromethanollösungen, die das Produkt enthalten, können weiter durch Extraktion mit lipophilen organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise mit Methylenchlorid, gereinigt werden. Nach weiteren Behandlungen mit Gemischen von Alkoholen und organischen Lösungsmitteln kann das Produkt in dem reinen Zustand aus den erhaltenen Alkohollösungen durch Kristallisation erhalten werden. Glucose kann durch andere Zucker, wie Fructose oder Galactose, ohne Verursachen des Verlusts der Glycosyltransferaseaktivität ersetzt werden.
Die nachstehenden Beispiele offenbaren die Erfindung weiterhin genauer.
BEISPIEL 1
Aliquote Mengen der Kulturen von Bacillus megaterium, isoliert aus landwirtschaftlichem Boden, werden in 20 ml steriler Salzlösung resuspendiert und einer maßstabsmäßigen Verdünnung auf einen 1:10 000 000 Verdünnungsfaktor unterzogen. Die Suspensionen bei verschiedenen Verdünnungen werden auf LB-Agarkulturmedium bzw. auf LB-Agar, versetzt mit Thiocolchicon oder 3-Demethylthiocolchicon, zu einer Endkonzentration von 2 g/l (siehe Tabelle) auf Platten angeordnet. Die Kulturen werden bei +28°C für 3–4 Tage im Dunkeln inkubiert. Die auf dem selektiven Medium gewachsenen Kolonien, die mit der Colchiconverbindung versetzt werden, werden isoliert und mit Hilfe des Auftragens auf Platten auf nichtselektives Medium gereinigt, wobei die Proben wie vorstehend, jedoch für eine kürzere Zeit (24 Stunden) inkubiert werden.
Anschließend werden die Kulturen zu dem gleichen Agarmedium in ein Teströhrchen überführt und wie vorstehend für 24 Stunden inkubiert.
Aliquote Mengen der Kulturen, ausgewählt wie beschrieben, werden verwendet, um 100 ml-Erlenmeyer-Kolben, die 20 ml Kulturmedium ST (Tabelle), versetzt mit Thiocolchicon oder 3-Demethylthiocolchicon zu einer 0,4 mg/ml Endkonzentration, enthalten, zu inokulieren. Die Kulturen werden über Nacht bei 28°C an einem Rotationsschüttler bei 200 U/min inkubiert.
Die Transformation von dem Colchiconsubstrat wird durch Analyse der aliquoten Mengen von Kulturbrühen, die alle 3–4 Stunden genommen wurden, durch DC an Kieselgel, mit einem Aceton:Essigsäureethylester:Wasser 5:4:1 Elutionsmittelsystem, überprüft.
Nach 4 Tagen Inkubation werden aliquote Mengen der Kulturen, die eine klare katalytische Aktivität zum 3-Glycosylderivat zeigten, auf Platten mit Hilfe einer skalaren Verdünnung, wie vorstehend beschrieben, für die Herstellung von neuen Inokula in Teströhrchen gewonnen. Das Biotransformationsassay in dem Kolben wird unter den gleichen, wie vorstehenden Bedingungen wiederholt, jedoch unter Verwendung von deutlich höheren Endkonzentrationen von Thiocolchicon und 3-Demethylthiocolchicon (1 mg/ml). Die aktivsten Einzelkulturen (Substratumwandlung, gleich oder höher als 70 %) werden für die Herstellung von Inokula in gefrorenen Cryoröhrchen verwendet.
Formulierung der Kulturmedien Tabelle
BEISPIEL 2
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, ausgehend von Bacillus megaterium-Kulturen, die sich von den nachstehenden Sammlungsstämmen ableiten (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Deutschland):

DSM 90

DSM 322

DSM 333

DSM 1667

DSM 1670

DSM 1671.
Die wie in Beispiel 1 ausgewählten und mit Thiocolchicon (1 mg/ml) versetzten Kulturen werden 4 Tage in Flüssigkultur inkubiert: Die DC-Analyse weist die stattgefundene Transformation des Substrats in Thiocolchicoson nach, wobei die Umwandlungsausbeuten von 30 bis 70 % variieren.
BEISPIEL 3
Aliquote Mengen von Kulturproben in Teströhrchen bzw. Reagenzgläsern, ausgewählt wie in dem vorstehenden Beispiel beschrieben, werden verwendet, um 100 ml-Erlenmeyer-Kolben, die 20 ml Brühe ST enthalten, zu inokulieren.
Die Kulturbrühen werden bei +30°C an einem Rotationsschüttler bei 200 U/min über Nacht inkubiert. Nach Inkubation werden die Kulturen mit einer sterilen Glycerinlösung zu einer 20 %igen Endkonzentration gegeben. Die Kulturen werden dann in 2 ml-Cryoröhrchen dispergiert und sofort in flüssigen Stickstoff getaucht.
Nach einigen Tagen werden 10 % der Kulturen bei 37°C schnell aufgetaut. Aliquote Mengen von jedem Cryoröhrchen werden verwendet, um 100 ml-Erlenmeyer-Kolben, die 20 ml Medium ST enthalten, zu inokulieren, welche anschließend bei +28°C über Nacht (Vorkultur) bei 200 U/min inkubiert werden. Nach Inkubation werden 2 ml von jeder Vorkultur steril in 20 ml frisches Medium ST überführt, mit 3-Demethylthiocolchicon zu einer 1 g/l Endkonzentration versetzt. Die Biotransformation wird ausgeführt und in den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen überprüft. Die Analyse bestätigte, dass die Transformation von dem Substrat in das 3-Glycosylderivat in dem quantitativen Bezug, der vorstehend beschrieben wurde (70 % und höher), stattfand, wodurch die gefrorenen Kulturen die katalytischen Stabilität aufzeigen.
Parallele Kontrollen der Kulturbrühen, die auf LB-Agar, unmittelbar nach Auftauen, plattiert wurden, bestätigen die Lebensfähigkeit, Homogenität und Reinheit der gefrorenen Kulturen.
BEISPIEL 4
Aliquote Mengen von Kulturproben in Cryoröhrchen werden nach dem Auftauen zum Inokulieren von 300 ml-Erlenmeyer-Kolben, die 50 ml Medium ST (Vorkultur) enthalten, verwendet. Nach Inkubation über Nacht bei 30°C, 250 U/min, werden 5 ml Vorkultur in 50 ml des gleichen Mediums, das mit 3-Demethylthiocolchicon zu einer 1 g/l Endkonzentration versetzt wurde, überführt. Die Kulturen werden 4 Tage unter den gleichen, wie vorstehend beschriebenen Bedingungen inkubiert.
Alle 4 Stunden werden Proben genommen, um das Wachstumsniveau (Messen der Absorption bei 600 nm), die Thiocolchicosonherstellung (DC und HPLC), die Sterilität (auf LB Agar) und die morphologische Mikroskopprüfung, zu bewerten.
DC-Analyse wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, ausgeführt. Für die HPLC-Analyse werden 1 ml-Fraktionen von Kulturbrühen mit 9 ml Methanol versetzt und bei 13 000 U/min für 2 Minuten zentrifugiert. Der Gehalt an 3-Glycosylderivat des Überstands wird durch Umkehrphasen-HPLC, mit isokratischer Elution, mit Hilfe von dem Wasser:Acetonitril-80:20-Elutionsmittelsystem, analysiert.
Die HPLC-Analyse zeigte, dass nach 72–96 Stunden die Biokonversion von Substrat zu Thiocolchison im Wesentlichen vollständig ist.
Die Endausbeuten für das 3-Glucosyl-Derivat, das durch Biokonversion erhalten wurde, liegt im Bereich von 70 bis 85 %.
BEISPIEL 5
Das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren wird wiederholt, jedoch wird 3-Demethylthiocolchicon zu den Kulturen in zwei Fraktionen: 0,25 g/l am Beginn und 0,74 g/l nach 24 Stunden gegeben.
Die Wachstums- und Herstellungsreaktionen der Kulturen sind ähnlich zu jenen, die in Beispiel 4 mit Thiocolchisonausbeuten von etwa 90 % erhalten werden.
BEISPIEL 6
Ein Liter von ST-Brühe in Erlenmeyer-Kolben (Inokulum) wird mit einer Cryorohrkultur inokuliert. Die Kolben werden über Nacht bei 30°C, 250 U/min, inkubiert. Das Inokulum wird steril zu einem 14 Liter-Fermenter, der 9 l sterile Brühe STL enthält, überführt. 3-Demethylthiocolchicon wird zu 1 g/l Endkonzentration (25 % am Beginn, der Rest nach 20 Stunden) gegeben. Die Fermentation wird unter Halten eines geeigneten Grads an Rühren-Belüftung (Rühren bis zu 900 U/min; Belüftung 1 bis 1,5 VVM, in Abhängigkeit vom Kulturwachstum), ausgeführt.
Alle 2 Stunden werden Proben aus den Kulturbrühen genommen und der nachstehenden Analyse unterzogen:

– optische Dichte (OD) bei 600 nm;
– Sterilitäts- und Reinheitsanalyse des Stamms (auf LB Agar);
– Mikroskopmorphologie (Ggram-Färbung);
– Analyse des Thiocolchicosongehalts durch DC und HPLC, wie in Beispielen 1 bzw. 4 beschrieben.

Nach 48 Stunden Fermentation ist die Transformation von dem Substrat in Thiocolchison fast beendet. Die Endausbeute ist etwa 85 %.
BEISPIEL 7
Das in Beispiel 6 beschriebene Verfahren wird wiederholt, jedoch nach 48 Stunden Fermentation werden nur 90 % der Kulturbrühen gewonnen, um das Produkt (Fraktion 1) zu extra hieren. Die restlichen 10 % werden steril in den Fermenter mit 9 l frischem, sterilem Medium ST, das 10 g 3-Demethylthiocolchicon enthält, gegeben. Die Fermentation wird, wie in Beispiel 6 beschrieben, ausgeführt. Nach 48 Stunden werden 9 l Kulturbrühe gesammelt und extrahiert (Fraktion 2). Das Restvolumen der Kulturbrühen wird steril mit 9 weiteren Litern sterilem, frischem Medium ST, das frisches 3-Demethylthiocolchicon (10 g) enthält, versetzt. Die Fermentation wird wie vorstehend ausgeführt. Nach 48 Stunden wird die Kulturbrühe vollständig gesammelt und extrahiert (Fraktion 3). Die Biotransformationsaktivität des Stamms bleibt für die gesamten drei Durchläufe mit Umwandlungsausbeuten von etwa 80 % stabil.
BEISPIEL 8
Die Endkulturbrühe von der Fermentation (Gesamtvolumen: etwa 27 l) wird unter Vakuum zu einem weichen Rückstand aufkonzentriert und in Ethanol aufgenommen.
Nach Abtrennung durch Filtration wird die Wasser-Ethanol-Fraktion zu Wasser unter Vakuum aufkonzentriert und durch wiederholte Extraktionen mit Methylenchlorid gereinigt. Die wässrigen Fraktionen werden aufkonzentriert und nach Einstellen auf pH 10 mit Natriumhydroxid mit Chlormethylen-Ethanol-Gemischen extrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen werden unter Vakuum aufkonzentriert. Die erhaltene Suspension wird mit Ethanol versetzt, aufkonzentriert und kristallisieren lassen. Eine zweite Kristallisation mit Ethanol wird nach weiteren Wiederauflösungsschritten des Feststoffs in Chlormethylen-Ethanol-Gemischen ausgeführt.

Claims

Verfahren zur Herstellung von 3-O-Glycosylcolchicon-Verbindungen der Formel (I):
worin R¹ einen Glycosidrest darstellt, R² C₁-C₆-Alkoxy oder C₁-C₆-Thioalkyl darstellt, das die Biotransformation von Verbindungen, worin R₁ OH oder Methoxy darstellt, mit Hilfe von Bacillus megaterium umfasst.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I), worin R₁ einen O-Glucosidrest darstellt.
Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 2, wobei die Stämme von Bacillus megaterium aufgrund ihrer Fähigkeit, in Gegenwart von hohen Konzentrationen des zu transformierenden Colchicon-Substrats zu wachsen, ausgewählt werden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 3 g/l vorliegen.
Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, wobei Bacillus megaterium in einem festen oder flüssigen Medium gezüchtet wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Medium mindestens eine organische Stickstoffquelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die organische Stickstoffquelle aus der Gruppe, bestehend aus Fleischextrakt, Pepton, Trypton, Kaseinhydrolysaten, Maisquellwasser, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Medium mindestens eine Kohlenstoffquelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Kohlenstoffquelle aus der Gruppe, bestehend aus Glucose, Fructose, Glycerin, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Medium mindestens eine Quelle von anorganischen Salzen von K⁺, Na⁺, Mg⁺⁺, NH₄ ⁺ umfasst.
Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 10, das bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 8 ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der pH-Wert im Bereich von 6 bis 7 liegt.
Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 12, das bei einer Temperatur im Bereich von 20° bis 45°C ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Temperatur im Bereich von 28° bis 40°C liegt.
Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 14, das bei einer maximalen Belüftungsmenge von 1 bis 2 Litern Luft pro Liter Kultur pro Minute (vvm) ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Menge bei 1,5 bis 2 vvm liegt.