NO320096B1 - Fremgangsmate ved biotransformasjonen av kolkikonforbindelser til de tilsvarende 3-glykosylderivater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører biotransformasjonen, ut-ført ved hjelp av Bacillus megaterium, av kolkisinoide forbindelser til de respektive 3-0-glykosylderivater. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forbindelser som er glykosylert utelukkende ved C-3 i den aromatiske ring A, utgående fra de nevnte kolkikonforbindelser, i høyt utbytte og renhet.

Forbindelsene som erholdes ved hjelp av den bioteknologiske prosess ifølge oppfinnelsen, spesielt tiokolkikoson {3-0-glykosyltiokolkikon, dvs. med henvisning til formel (I), Ri= -OCH3 og R2= -SCH3) er aktive prinsipp av bemerkelses-verdi farmakologisk viktighet, hovedsakelig for fremstilling av nye antitumomedikamenter.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Store anstrengelser er blitt gjort for å oppnå sterkt spesifikke glykosyderinger av forbindelser med den generelle formel (I) og beslektede kolkisinoide forbindelser, enten ved hjelp av kjemiske reaksjoner eller ved biotransformasjon.

Den kjemiske rute består i sekvenser av komplekse, ikke spesifikke reaksjoner som, idet de innbefatter ikke-selektivt forskjellige molekylseter, fører til en blanding av glykosyderte derivater, av hvilke noen er inaktive. Derfor er utbyttet av omdannelsen til det effektive produkt, som er spesifikt glykosydert ved C-3 i den aromatiske ring, meget lavt.

Den biologiske metode vedrører hovedsakelig biotransformasjonen av kolkisinoide forbindelser (som er indirekte beslektet med kolkikonforbindelser), så som kolkisin og tio-kolkisin, ved dyrkning av Sentella Asiatika, til mono-glykosyderte derivater ved C-2 og C-3 i den aromatiske ring; en slik transformasjon er derfor ikke helt selektiv og gir dårlig utbytte og produktivitet (Solet, J.M., et al., Phytochemistry 33, 4, 817-820, 1993).

Andre anstrengelser for å biotransformere kolkisinoide forbindelser ga simpelthen demetyleringer av metoksygruppene som er bundet til den aromatiske ring (ved C-2 og ved C-3), i hvert fall alltid karakterisert ved begrensede utbytter og produktivitet og ved en dårlig regioselektivitet.

Således forsøkte Hufford CD. et al. (J. Pharm, Sc, 68,

10, 1239-1242, 1979), under anvendelse av Streptomyces gri-sens og/eller Streptomyces speetabilis, og Beilet P. et al., (GB-923421, 1959), under anvendelse av forskjellige stammer av Streptomyces og andre stammer av bakterier og fungus å transformere kolkisin og dets derivater til de tilsvarende 3-demetylerte derivater. Resultatene av disse kjente metoder bekrefter det som er fastslått ovenfor i forbindelse med ikke-selektiviteten av de mikrobielle enzy-mer som er involvert, for eksempel ved C-2, C-3 eller C-10

i det alkaloide molekyl. Videre er produktivitetsnivåene av nevnte katalytiske systemer heller dårlige pga. de lave omdannelsesutbytter, de reduserte substratkonsentrasjoner som kan anvendes, og den hyppige nedbrytning av tropolonringen.

I den senere tid har Poulev et al. (J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33-38, 1995) oppnådd spesifikk demetylering ved å anven-de bakterielle mikroorganismer, men fremdeles med ganske dårlig utbytte og produktivitet.

Enzymaktiviteten fra mikroorganismer som ligner de som er nevnt ovenfor (Streptomycer, Bacillius, etc), er blitt anvendt for biotransformasjon av andre forbindelser, så som maytansinoider (US pat. 4 361 650: Izawa, M., et al., J. Antibiotics, 34, 12, 1587-1590, 1981). I dette tilfellet består også den katalyserte reaksjon utelukkende i en demetylering, karakterisert ved lavt omdannelsesutbytte og lav produktivitet.

Glykosyltransferaseaktivitetene av a-amylase fra Bacillus msgaterium-stammer er blitt beskrevet (Brumm., P.J., et al., Starch, 43, 8, 319-323, 1991), hvor akseptorspesifisi-teten (utelukkende glukose eller glukosider) er spesielt høy. Cyclodekstrin-glukosyl-transferaser, fremstilt ved hjelp av den samme mikrobielle kilde, katalyserer en a-1,4-transglukosylering av rubusosid (13-0-p-D-glukosylsteviol-JS-D-glukosylester), utgående fra stivelse. Også i denne bioomdannelse er akseptoren i transferase-reaksjonen substratets glukosidfraksjon (Darise, M., et al., Agric. Bioel. Chem., 48, 10, 2483-2488, 1984). Cyclodekstrin-glykosyl-transferaser ble tidligere anvendt for å fremstille cyclodekstrinene G6 og G8 fra stivelse (Kitaha-ta, S., Okada, S., Agric. Biol. Chem., 38, 12, 2413-2417, 1974).

Disse eksempler påviser høy substratspesifisitet av glykosyltransferaseaktivitetene uttrykt ved Bacillus megaterium, som involverer bare glykosylakseptorer, og gjør det derfor ikke mulig å hente noen reaksjoner på sekundære metabolit-ter med en forskjellig, kompleks molekylstruktur, så som kolkikoner. I virkeligheten er ingen eksempler på anvendelse av nevnte mikroorganismer for enzymomdannelsen av kolkikonforbindelser til 3-glykosylderivater kjent.

Nå er det blitt funnet at stammer av Bacillus megaterium, som er i stand til å vokse i nærvær av høye konsentrasjoner av kolkikon (Ri= -OCH3, R2= -OCH3) , 3-demetyl-kolkikon, og respektive tioderivater, har en overmåte høy, meget spesifikk biotransformasjonsaktivitet i nevnte substrater til derivater glykosydert utelukkende ved C-3 på den aromatiske ring. En slik transformasjon finner sted på meget kort tid og karakteriseres ved overraskende høyt utbytte.

Derfor vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte ved fremstilling av 3-O-glykosylkolkikonforbindelser med formel (I):

hvori Ri er en glykosydrest, spesielt en O-glykosydrest, R2 er Ci-C6-alkoksy eller Ci-Cc-tioalkyl, hvilken fremgangsmåte omfatter biotransformasjon av forbindelser hvori Ri er OH eller metoksy, og spesielt hvor Ri er en O-glykosydtest, ved hjelp av Bacillus megaterium.

Bacillus megaterium er en grampositiv sporedannende bakte-rie med en cellediameter på mer enn 1,0 pm; den vokser ae-robisk på et antall kulturmedier; er katalasepositiv; hy-drolyserer gelatin. Stammer av Bacillus megaterium som kan anvendes ifølge oppfinnelsen, viste seg å være i stand til å vokse tilfredsstillende og å holde seg levende også ved høye konsentrasjoner av kolkikon, tiokolkikon (Ri= -OCH3, R2= -SCH3) og respektive 3-demetylderivater (over 2 g/l), som påvist ved å undersøke veksten og ved mikroskopisk analyse. Kongeneriske stammer, så som Bacillus cereus, viser vekstvanskeligheter allerede ved konsentrasjoner av substratet på 1 g/l (absorbsjoner på 10-15% av kontrollen).

Den høye selektivitet og effektivitet av biotransformasjonen er overraskende og uvanlig, i det utbyttenivåene varierer fra 70 % til 95 %.

Videre er mikroorganismene som anvendes i bioomdannelsen, i stand til å opprettholde permanent den katalytiske aktivitet, til og med i gjentatte fermenteringstrinn, og de gir derfor spesifikk bioomdannelse i "fed-batch" og kontinuerlige prosesser. Derfor tilveiebringer denne metode høy produktivitet og reproduserbarhet.

Den markante reaksjonsregioselektivitet sikrer, i tillegg til de bemerkelsesverdige produksjonsutbytter, høy kvalitet og renhet i det resulterende produkt, og tilveiebringer således produktet med 100 % renhet, med en enkel nedstrøms-prosess.

Ytterligere viktige fordeler er at rensetrinnet ikke må fo-retas så ofte, og gjenvinnelsen av produktet er høyt, prosessen er økonomisk, og anvendelsen er trygg.

De operative sekvenser som er anvendelige i prosessen iføl-ge oppfinnelsen, omfatter: A) - Valg av kulturer av Bacillus megaterium som er i stand til å vokse i nærvær av høye konsentrasjoner av kolkikonsubstrat, utgående fra naturlige kilder eller fra oppsamlede stammer. B) - Valg av isolatene fra A), for å undersøke den katalytiske transformasjonsaktivitet til de tilsvarende 3-0-glykosylderivater ved hjelp av bioomdannelsesundersø-kelser på de spesifikke substrater, administrert i gradvis økende konsentrasjoner. C) - Mikrobiologisk karakterisering av stammene valgt i B). D) - Gradvis økning i biotransformasjonsutbytte, ved hjelp av et målspesifikt utvalg av den bakterielle popula-sjon fra B). E) - Studie og optimalisering av de kritiske fermentasjons-parametere for å optimalisere biotransformasjonen. F) - Studie og optimalisering av metodene for å bevare høyproduktivitetskulturene for å sikre stabile, homo-gene inokulater for produktive anvendelser i industri-ell skala. G) - Oppskalering av prosessen i fermenteringsbeholder i "baten", "fed-batch" og kontinuerlige prosesser. H) - Opparbeidelse og optimalisering av metodene for ned-strømsprosesser og for utvinnelse av produktet.

Spesifikt kan mikroorganismene som er anvendelige i foreliggende oppfinnelse, velges utgående fra oppsamlede kulturer erholdt fra bakteriedeponeringssenteret eller fra jord-prøver av forskjellig opprinnelse, eller fra forhånds-utvalgte industrielle stammer, ved selektiv gjenvinnelse på forskjellige agarmedier inneholdene en organisk nitrogenkilde {peptoner, gjærekstrakter, kjøttekstrakter, asparagin etc), en kabonkilde (glyserin, stivelse, maltose, glukose etc) med pH 5 til 8, fortrinnsvis 6-7. Inkubasjonstempera-turen varierer fra 20°C til 45°C, fortrinnsvis 28°C til 40°C.

Kulturens evne til å vokse i nærvær av toksiske konsentrasjoner av kolkikonsubstratet som skal transformeres, vurderes ved hjelp av teknikker for numerisk fortynning og parallell utsåing i skåler, på forskjellige agarholdige substrater, en del av hvilke tidligere er blitt tilsatt kolkikonforbindelsen (for eksempel 3-demetyltiokolkikon) i konsentrasjoner fra 0,1 til 3 g/l (for å hemme veksten av størstedelen av mikroorganismene).

Koloniene som er i stand til å vokse under de beskrevne tilstander, flyttes sterilt og anbringes på forskjellige agarholdige medier, for å bekrefte deres renhet, vekst og homogenitet.

Kulturmediene som anvendes for omdannelsen av kulturen, er vanligvis mikrobiologiske substrater, inneholdene organiske nitrogenkilder (peptoner, gjærekstrakter, trypton, kjøtt-ekstrakter etc), en karbonkilde {glukose, maltose, glyserin etc.)/ ved pH 5 til 8, fortrinnsvis 6-7. Inkuba-sjons temper a tur en varierer fra 20°C til 45°C, fortrinnsvis 28°C til 40°C.

De utvalgte mikroorganismer undersøkes deretter med hensyn til vekstevnen i kulturer under vann, i nærvær av kolkikonforbindelser, og evnen til å omdanne sistnevnte til de tilsvarende 3-glykosylderivater.

Nevnte undersøkelser ble utført i 100 ml kolber inneholdene 20 ml flytende medium, med forskjellige mediumformulerin-ger, omfattende en eller flere organiske nitrogrenkilder (gjærekstrakter, peptoner, trypton, kaseinhydrolysater, kjøttekstrakt, "corn-steep"-væske etc), en eller flere karbonkilder {glykose, glyserol, stivelse, sakkarose etc), uorganiske fosfor- og nitrogenkiIder og uorganiske salter av forskjellige ioner {K<*>, Na<*>, Mg<+>\ Ca<++>, Fe<++>, Mn<++> etc): Kulturprøvene kan eventuelt utsettes for mutagene behandlinger, ved hjelp av konvensjonelle mutageneseteknikker (bestrålning med OV-stråler etc.) for å indusere mutanter med en spesifikk bioomdannelsesaktivitet som kan vurderes med den samme prosedyre som ovenfor.

Kulturprøver fra hver bioomdannelsesundersøkeIse ble analy-sert for å vurdere produksjonen av 3-glykosylderivater, ved hjelp av TLC og HPLC-analyser.

Den utvalgte mikroorganismes evne til å transformere kolki-konsubstrater til de respektive 3-glykosylderivater ble be-kreftet ved hjelp av bioomdannelsesundersøkelser i kolber, i en 300 ml skala, i de samme kulturløsninger som ble anvendt i utvelgelsestrinnet.

Mikroorganismene som ga en positiv respons, ble anvendt i tester for å optimalisere bioomdannelsen, i forskjellige kulturbuljonger, i en 300 ml skala. De hovedsakelige kultur- og fermenteringsparametere som ble studert, er: organiske nitrogenkilder, karbonkilder, mineralsalter, temperatur, omrøring/lufttilførsel, pH, inkuberingstid, inokulum-forhold, subkulturtrinn, tid og form for tilsetning av substratet som skulle transformeres. De valgte bakterielle mikroorganismer, som var i stand til å bevirke biotransformasjonen ifølge foreliggende oppfinnelse, kan vokse på både faste og flytende kultursubstrater, inneholdene en eller flere organiske nitrogenkilder, fortrinnsvis gjær-ekstrakt, kjøttekstrakt, pepton, tryptron, kaseinhydrolysater, "com-step"-væske etc. Karbonkilder som er nyttige for veksten og biotransformasjonen, er glukose, fruktose, sakkarose, glyserol, maltekstrakt etc, fortrinnsvis glukose, fruktose og glyserin. Kulturmediet inneholder ytterligere uorganiske fosforkilder og salter av K<+>, Na<*>, Mg<++>, NH4+ etc.

De valgte mikroorganismer kan vokse ved temperaturer fra

20°C til 45°C, fortrinnsvis fra 28°C til 40°C, ved pH mellom 5 og 8, fortrinnsvis 6-7. Under de samme betingelser er de aktuelle mikroorganismer i stand til å transformere kolki-konforbindelsene til de tilsvarende 3-glykosylderivater. Nevnte transformasjoner opptrer i undervannskulturer, i kolber inkubert på en roterende ristemaskin, med omrøring fra 150 til 250 rpm.

På grunn av den spesielle kinetikken i vedkommende bio-trans f orma sjon, som er beslektet med den mikrobiologiske vekt, er de optimale betingelser med hensyn til biotransformasjonen de samme betingelser som er optimale for veksten. Derfor er kulturmedier som er nyttige for å fremme en god mikrobiologisk vekst, så som de som er basert på de organiske og uorganiske komponenter angitt ovenfor, også nyttige for en god biotransformasjonsaktivitet i det berørte substrat. Sistnevnte tilsettes til kulturen i det utgående fermenteringstrinn eller i oppdelte alikvoter begynnende fra begynnelsen av fermenteringen.

Biotransformasjonen ifølge oppfinnelsen er basert på en en-zymomdannelse som begynner under den eksponentielle vekst-fase og fortsetter med en parallell progresjon med vekstens progresjon; de maksimale nivåer av omdannelsen til 3-glykosylderivat (meget høy: opp til 95 %) oppnås innen de første 48-72 timer, avhengig av tilsetningstiden av substratet. Regioselektiviteten av biotransformasjonen er ab-solutt: intet nærvær av 2-glykosylderivater er noensinne blitt påvist i kulturprøvene. De resulterende produkter er utelukkende ekstracellulære.

Substratet som skal omdannes, kan tilsettes i aceton- eller alkoholoppløsning, i alkohol/vannblandinger, i dioksan etc. Biotransformasjonen ifølge oppfinnelsen kan oppskaleres til fermenternivå, i det man holder kulturbetingelsene uforand-ret, spesielt hva angår kulturmediet, temperaturen og pro-sesstidene. For å oppnå god vekst er adekvate nivåer for omrøring- lufttilførsel viktig, spesielt er lufttilførsels-nivåer på 1-2 liter luft pr. liter kultur pr. minutt (vvm), fortrinnsvis på 1,5-2 vvm, påkrevd.

Produktene som fremkommer ved bioomdannelsen, ekstraheres fra kulturbuljongen etter separasjon av biomassen fra væs-kefraksjonen ved sentrifugering og utvinnelse av supernatanten, eller mikrofiltrering og utvinnelse av permeatet. Kulturen kan behandles med alkohol, i lys av optimal utvinnelse av produktet.

Rensingen og utvinneIsen av bioomdannelsesproduktet kan ut-føres under anvendelse av kromatografiske teknikker for separasjon på absorbsjonsharpikser og utvasking med alkoholer, fortrinnsvis med metanol. Hydroksymetanolløsningene inneholdende produktet kan ytterligere renses ved ekstrahe-ring med lipofile organiske løsningsmidler, fortrinnsvis med metylenklorid. Etter ytterligere behandlinger med blandinger med alkoholer og organiske løsningsmidler kan produktet oppnås i ren tilstand fra de resulterende alkohol-oppløsninger ved krystallisering. Glukose kan erstattes med andre sukkerarter så som fruktose eller galaktose, uten å forårsake tap av glykosyltrasferaseaktiviteten.

Følgende eksempler beskriver oppfinnelsen mer detaljert.

Eksempel 1

Alikvoter av kulturer av Bacillus megaterium isolert fra landbruksjord, suspenderes på nytt i 20 ml sterilt saltvann og utsettes for en skalafortynning til en 1:10.000.000 for-tynningsfaktor. Suspensjonene ved de forskjellige fortyn-ninger utsås på skåler og LB-Agar-kulturmedium og på LB-Agar tilsatt henholdsvis tiokolkikon eller 3-demetyltiokolkikon, til en sluttkonsentrasjon på 2 g/l {se tabell). Kulturene inkuberes ved +28°C i 3-4 dager, i mørket. Koloniene som vokser på det selektive medium, tilsatt kolkikonforbindelsen, isoleres og renses ved hjelp av utsåing på ikke-selektivt medium; nevnte prøver inkuberes som ovenfor, men i kortere tid (24t).

Deretter overføres kulturene til det samme Agarmedium, i et prøverør, og inkuberes som ovenfor i 24t.

Alikvoter av kulturene, utvalgt som beskrevet, anvendes for å inokulere 100 ml Erlenmeyerkolber inneholdende 20 ml kulturmedium ST (tabell), tilsatt tiokolkikon eller 3-demetyltiokolkikon, til en 0,4 mg/ml sluttkonsentrasjon. De nevnte kulturer inkuberes over natten ved 28°C, på en rotasjons-ristemaskin ved 200 rpm.

Transformasjonen av kolkikonsubstratet undersøkes ved analyse av alikvoter av kulturbuljongene, tatt hver 3-4 time, ved hjelp av TLC på kiselgel, med et elueringsmiddelsystem av aceton:etylacetat:vann 5:4:1.

Etter 4 dagers inkubering utsås alikvoter av kulturene som viste en tydelig katalytisk aktivitet overfor 3-glykosylderivatet, på skåler, ved hjelp av en skalafortynning som beskrevet ovenfor, for fremstilling av nye inokulater i prøverør. Biotransformasjonsundersøkelsen i kolben gjentas under de samme betingelser som ovenfor, med under anvendelse av markant høyere sluttkonsentrasjon av tiokolkikon og 3-demetyltiokolkikon (1 mg/ml). De mest aktive enkelt-kulturer (substratomdannelse lik eller høyere enn 70 %) anvendes for fremstilling av inokulater i frosne kryorør.

Eksempel 2

Prosedyren beskrevet i eksempel 1 gjentas, utgående fra Bacillus megaterium-kulturer, avledet fra følgende kollek-sjonsstammer (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Branschweig, Tyskland):

Kulturene valgt som i eksempel 1 og tilsatt tiokolkikon {1 mg/ml) inkuberes i 4 dager i en flytende kultur: TLC-analysen påviser den inntrådte transformasjon av substratet til tiokolkikoson, med omdannelsesutbytter varierende fra 30 til 70 %.

Eksempel 3

Alikvoter av kulturprøver i prøverør utvalgt som beskrevet i ovennevnte eksempel, anvendes for å inokulere 100 ml Erlenmeyerkolber inneholdende 20 ml buljong ST.

Buljongkulturene inkuberes ved +30°C, på en rotasjonsriste-maskin ved 200 rpm, over natten. Etter inkubasjonen tilsettes til kulturene en steril glyseroloppløsning til en 20 % sluttkonsentrasjon. Kulturene fylles deretter i 2 ml kryo-rør og senkes umiddelbart ned i flytende nitrogen.

Etter noen dager tines 10 % av kulturene hurtig ved 37°C. Alikvoter av hvert kryorør anvendes for å inokulere 100 ml Erlenmeyerkolber inneholdende 20 ml medium ST, som deretter inkuberes ved +28°C, over natten (pre-kultur), ved 200 rpm. Etter inkubasjonen overføres 2 ml av hver pre-kultur sterilt til 20 ml friskt medium ST, tilsettes 3-demetyltiokolkikon til en sluttkonsentrasjon på 1 g/l. Biotransformasjonen utføres og undersøkes under betingelsene beskrevet i eksempel 1. Analysen bekrefter at transformasjonen av substratet til 3-glykosylderivatet skjedde i de kvantitative utbytter beskrevet ovenfor (70 % og høyere), og beviste således de frosne kulturers katalytiske stabilitet. Parallelle kontroller av buljongkulturene, utsådd på LB Agar umiddelbart etter opptining, bekrefter de frosne kulturers levedyktighet, homogenitet og renhet.

Eksempel 4

Alikvoter av kulturer i kryorør anvendes etter opptining for å inokulere 100 ml Erlenmeyerkolber inneholdende 50 ml av medium ST (pre-kultur). Etter inkubering over natten ved 30°C, 250 rpm, overføres 5 ml av pre-kulturen til 50 ml av det samme medium tilsatt 3-demetyltiokolkikon til en sluttkonsentrasjon på 1 g/l. Kulturene inkuberes i 4 dager under de samme betingelser som beskrevet ovenfor.

Hver 4. time tas prøver for å vurdere vekstnivået (ved å måle absorbsjonen ved 600 nm), tiokolkikosonproduksjonen (TLC og HPLC), steriliteten (på LB Agar) og for mikroskopisk morfologisk undersøkelse.

TLC-analysen utføres som beskrevet i eksempel 1. For HPLC-analysen tilsettes til 1 ml-fraksjoner av kulturbuljongene 9 ml metanol og sentrifugeres ved 13.000 rpm i 2 minutter. Innholdet i 3-glykosylderivatet i supernatanten analyseres ved reversfase-HPLC, med isokratisk eluering ved hjelp av elueringsmiddelsystemet vann:acetonitril 80:20.

HPLC-analysen viser at etter 72-96 timer er bioomdannelsen av substratet til tiokolkison i alt vesentlig fullstendig.

Sluttutbyttene av 3-glukosylderivåtet, erholdt ved bioomdannelsen, varierer fra 70 til 85 %.

Eksempel 5

Prosedyren beskrevet i eksempel 4 gjentas, men 3-demetyltiokolkikon tilsettes til kulturene i to fraksjoner: 0,25 g/l ved begynnelsen og 0,74 g/l etter 24 timer.

Veksten og produksjonsresponsene i kulturene er de samme som ble oppnådd i eksempel 4, med tiokolkisonutbytter på ca. 90 %.

Eksempel 6

En liter ST-buljong i Erlenmeyerkolber (inokulum) inokule-res med en kryorørkultur. Kolbene inkuberes over natten ved + 30°C 250 rpm. Inokulatet overføres sterilt til en 14 1 fermenter inneholdende 9 1 steril buljong STL. 3-demetyltiokolkikon tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 1 g/l {25 % ved begynnelsen, resten etter 20 timer). Fermentasjo-nen utføres i det man holder passende nivåer av omrø-ring/lufttilførsel (røringen opp til 900 rpm; lufttilfør-selen 1 til 1,5 vvm, avhengig av kulturveksten).

Hver annen time tas det prøver fra kulturbuljongene, og de utsettes for følgende analyse:

Optisk tetthet (OD) ved 600 nm,

Sterilitets- og renhetsanalyse av stammen (på LB

Agar);

Mikroskopisk morfologi {gramstamme);

Analyse av tiokolkikoson innholdet ved TLC og HPLC,

som beskrevet i eksempel 1, henholdsvis 4.

Etter ca. 48 timers fermentering er transformasjonen av substratet til tiokolkison nesten fullstendig. Sluttutbytte er ca. 85 %.

Eksempel 7

Prosedyren beskrevet i eksempel 6 gjentas, men etter 48 timers fermentering isoleres bare 90 % av kulturbuljongen for å ekstrahere produktet (fraksjon 1). De gjenværende 10 % tilsettes sterilt til fermenteringsbeholderen med 9 1 friskt sterilt medium ST inneholdende 10 g 3-demetyltiokolkikon. Fermenteringen utføres som beskrevet i eksempel 6. Etter 48 timer oppsamles 9 liter kulturbuljong og ekstraheres (fraksjon 2). Det gjenværende volum av kulturbuljong tilsettes sterilt, ytterligere 9 ml sterilt friskt medium ST inneholdende friskt 3-demetyltiokolkikon (10 g). Fermenteringen utføres som ovenfor. Etter 48 timer oppsamles kulturmediet fullstendig og ekstraheres (fraksjon 3). Biotransformasjonsaktiviteten av stammen forble stabil for alle tre kjøringer, med omdannelsesutbytter på ca. 80 %.

Eksempel

Den avsluttende kulturbuljong fra fermenteringen (totalt volum: ca. 27 1) konsentreres under vakuum til et bløtt re-siduum og tas opp med etanol.

Etter separering ved filtrering, konsentreres vann-etanol-fraksjonen til vann under vakuum og renses ved gjentatte ekstraksjoner med metylenklorid. De vandige fraksjoner konsentreres og, etter justering av pH til 10 med natriumhyd-roksid, ekstraheres de med klormetylen-etanol blandinger.

De sammenslåtte organiske faser konsentreres under vakuum. Den resulterende suspensjon tilsettes etanol, konsentreres og får stå for å krystallisere. En andre krystallisasjon med etanol utføres etter ytterligere oppløsningstrinn av det faste stoff i klormetylen/etanolblandinger.

Claims (16)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av 3-0-glykosylkolkikonforbindelser med formel (I): hvori Ri er en glykosydrest, R2 er Ci-C6-alkoksy eller Ci-C6-tioalkyl, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter biotransformasjon av forbindelser hvori Ri er OH eller metoksy, ved hjelp av Bacillus megaterium.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles forbindelser med formel (I) i hvilke Ri er en 0-glykosydrest.

3. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-2, karakterisert ved at Bacillus megaterium-stammene er valgt med hensyn til sin evne å vokse i nærvær av høye konsentrasjoner av kolkikonsubstrat som skal transformeres.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte konsentrasjoner varierer fra 0,1 til 3 g/l.

5. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-4, karakterisert ved at Bacillus megaterium dyrkes i et fast eller flytende medium.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte medium omfatter minst én organisk nitrogenkilde.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte organiske nitrogenkilde velges fra gruppen bestående av kjøttekstrakt, pepton, trypton, kaseinhydrolysater, "corn-steep"-væske.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at mediet omfatter minst én karbonkilde.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte karbonkilde velges fra gruppen bestående glukose, fruktose, glyserol.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte medium omfatter minst én kilde av uorganiske salter av K<+>, Na<+>, Mg<++>, NH«<+.>

11. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-10, karakterisert ved at den utføres ved en pH som ligger innenfor intervallet fra 5 til 8.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte pH ligger innenfor intervallet fra 6 til 7.

13. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-12, karakterisert ved at den utføres ved en temperatur som ligger innenfor intervallet fra 20°C til 45°C.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at temperaturen ligger innenfor intervallet fra 28°C til 40°C.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at temperaturen ligger innenfor intervallet fra 28°C til 40°C.

15. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-14, karakterisert ved at den utføres ved et maksimalt lufttilførselsnivå fra 1 til 2 liter luft pr. liter kultur pr. minutt (vvm) .

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte lufttilfør-selsnivå ligger innenfor intervallet fra 1,5 til 2 vvm.