CN112010924A

CN112010924A - 新型诺西肽糖基化衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112010924A
Application number: CN202010921312.1A
Authority: CN
Inventors: 吴旭日; 赵玲; 刘世强; 徐允聪; 陈依军
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2040-09-04
Also published as: CN112010924B

Abstract

本发明公开了新型诺西肽糖基化衍生物及其制备方法和应用；具体来说公开一种诺西肽糖基化衍生物W01及制备方法、应用；与诺西肽相比，该衍生物的水溶性显著改善，同时具有超强的抑菌或杀菌活性，展现出被开发成新型抗耐药菌抗生素的巨大前景。此外，本发明还公开了以诺西肽为底物，NDP‑葡萄糖为糖供体，采用NDP‑葡萄糖依赖糖基转移酶选择性合成该糖基化衍生物的绿色方法。

Description

新型诺西肽糖基化衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于天然产物结构修饰和生物催化技术领域，具体涉及一种新型诺西肽糖基化衍生物W01及其制备方法和应用。利用UDP-葡萄糖依赖的糖基转移酶催化诺西肽定点糖基化修饰制备获得衍生物，该衍生物具有超强的抑菌或杀菌活性，有望被开发成一种新型抗生素。

背景技术

在我国，抗菌药物已成为临床用量最大的一类药物，约占临床用药比例的30％。随着抗生素的滥用和细菌获得性保护能力的增强，多种临床耐药菌株尤其是多重耐药菌和泛耐药菌不断出现或爆发，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素肺炎链球(PRSP)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、多重耐药性结核杆菌(MDRMT)、产NDM-1(I型新德里金属细菌β-内酰胺酶)耐药细菌(YongD,et al.Antimicrob.Agents Chemother.,2009,53:5046-5054)，给临床抗感染治疗带来极大的困难和恐慌，并已对人类健康造成了严重威胁。

由于靶点机制新颖、化学结构独特和超强的抗菌活性，硫肽类化合物已成为新型抗多重耐药菌抗生素的重要来源之一。在已发现的硫肽类抗菌化合物中，由活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)、抗生素链霉菌(Streptomyces antibioticus)和青灰色链霉素(Streptomycesglaucogriseus)产生的诺西肽在极低浓度下(ng/mL)即能杀死革兰氏阳性细菌，包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素的肺炎链球菌、耐万古霉素的肠球菌以及多重耐药菌等(Haste N M,et al.J Antibiot.,2012,65:593-598；Wang S,etal.Curr.Opin.Chem.Biol.,2013,17:626-634)，但是水溶性差一直是限制其成药开发的关键因素之一，长期以来仅被作为动物饲料的抗生素添加剂使用。诺西肽的化学结构复杂，含有5个噻唑环、1个吲哚环、1个吡啶环、2个大环以及1个脱氢丙氨酸侧链(Benazet F,etal.Experientia,1980,36:414-416)，难以采用化学方法结构改造提高水溶性。此外，脱氢丙氨酸侧链与诺西肽的杀菌活性密切相关，这进一步增加了化学法结构改造的难度(Baumann S.et al.J.Am.Chem.Soc.2008,130:5664-5666)。

糖基化修饰是增加天然产物水溶性的重要手段之一。与化学方法相比，酶法糖基化修饰具有反应条件温和、区域选择性好以及绿色环保等优点，倍受学术界和工业界关注。目前糖基转移酶已被广泛应用于改善药物分子水溶性，提高成药性(Wei W,etal.Mol.Plant,2015,9:1412-1424)以及甜味剂口味改进和增加甜度等方面(Danieli B,etal.Helv.Chim.Acta,1997,80:1153-1160)。根据糖基供体和催化机制不同，糖基转移酶可分为NDP-糖(如NDP-葡萄糖、NDP-半乳糖、NDP-麦芽糖、NDP-葡萄糖醛酸等)依赖的LeloirGTs和非NDP-糖(可溶性淀粉、蔗糖或糊精等)依赖的Non-Leloir GTs两种类型(Breton C,et al.Curr.Opin.Struct.Biol.,1999,9:563-571)。

诺西肽结构中含有3个羟基，分别为核心吡啶环羟基、3位苏氨酸上的羟基以及6位谷氨酸上的羟基，均可作为糖基化修饰的位点，但核心吡啶环和3位苏氨酸是诺西肽结合作用靶点(L11蛋白和23S rRNA)发挥抑菌或杀菌活性的重要药效团，糖基化修饰可能会造成其失活(Baumann S.et al.J.Am.Chem.Soc.2008,130:5664-5666)。因此，6位谷氨酸羟基成为诺西肽糖基化修饰的首选位点。本发明首次采用Streptomyces antibioticus的UDP-葡萄糖依赖的糖基转移酶OleD及其突变体和Stevia rebaudiana的UDP-葡萄糖依赖糖基转移酶UGT76G1定点糖基化修饰6位谷氨酸上羟基，制备获得新型糖基化诺西肽衍生物，其水溶性显著改善，且具有超强的抑菌或杀菌活性，有望被开发成一种新型抗生素。

发明内容

本发明公开了一种新型的诺西肽糖基化衍生物W01，该类衍生物属于首次报道。与诺西肽相比，该糖基化衍生物的水溶性显著改善，且同样具有超强抑菌或杀菌活性。此外，本发明还公开了该诺西肽糖基化衍生物W01的绿色生物合成新方法。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案具体如下：

一种诺西肽糖基化衍生物W01，其特征在于具有下式(I)结构：

结构中的R代表α-或β-糖苷键连接的葡萄糖。

所述葡萄糖为α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖。本发明优选的诺西肽糖基化衍生物W01化合物结构具体如下：

R为β-糖苷键连接的吡喃葡萄糖；

一种诺西肽糖基化衍生物W01的制备方法，以NDP-葡萄糖为活性糖供体，采用糖基转移酶OleD、与OleD氨基酸序列的同源性大于或等于80％的酶或蛋白质、及糖基转移酶UGT76G1定点糖基化修饰诺西肽6位谷氨酸上的羟基制备得到诺西肽糖基化衍生物W01，所述糖基转移酶OleD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。进一步地，所述与OleD氨基酸序列同源性大于或等于80％的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-6所示。糖基转移酶UGT76G1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7。

在诺西肽糖基化衍生物W01的制备过程中，反应的pH为6.0-11.0，优选9.0；反应温度为15-50℃，优选35℃；诺西肽和UDP-葡萄糖的摩尔浓度比值为1:0.5-1:20，优选1：10；反应时间为1-24小时，优选12小时。

与诺西肽相比，25℃条件下，诺西肽糖基化衍生物W01在pH 2.0-7.0范围内均能稳定存在，且水溶性显著改善，pH 6.0时提高了20倍以上。

诺西肽糖基化衍生物W01的体外活性测定显示，该衍生物对耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素中介耐药粪肠球菌和粪肠球菌、屎肠球菌均具有超强的杀菌活性，MIC₅₀分别是0.0625～0.125μg/mL、0.0625～0.25μg/mL、0.0625～0.5μg/mL、0.0625～0.5μg/mL、0.03125～0.25μg/mL。

综合水溶性、稳定性和体外杀菌活性结果可知，本发明制备的诺西肽糖基化衍生物W01有望作为一种新结构化合物，开发拥有独立知识产权的新型抗耐药菌抗生素。此外，本发明还公开了利用UDP-葡萄糖依赖糖基转移酶定点糖基化以合成诺西肽糖基化衍生物W01的生物催化方法。

本发明具有如下优点：

1)本发明公开的诺西肽糖基化衍生物W01结构全新。与诺西肽相比，该衍生物的水溶性显著改善，且具有超强的抑制或杀革兰氏阳性细菌的活性，有望被开发成新型抗耐药菌抗生素。

2)本发明公开的采用糖基转移酶定点糖基化修饰诺西肽，制备糖基化衍生物的方法绿色环保，且未见文献报道。

综上所述，本发明公开的诺西肽糖基化衍生物W01及其制备工艺潜在应用价值巨大。

附图说明

图1为OleD及其同源蛋白合成诺西肽糖基化衍生物W01的HPLC分析。

图2为UGT76G1合成诺西肽糖基化衍生物W01的HPLC分析。

图3为糖基化诺西肽的¹H-NMR图谱。

图4为糖基化诺西肽的¹³C-NMR图谱。

图5为糖基化诺西肽的COSY图谱。

图6为糖基化诺西肽的HSQC图谱。

图7为糖基化诺西肽的HMBC图谱。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但本发明的范围不受此实施例限制。

实施例1糖基转移酶OleD及其突变体的重组表达

OleD一种是来源自链霉菌Streptomyces antibioticus的UDP-葡萄糖依赖的糖基转移酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)，其同源蛋白GT-1和GT-2是基于OleD结构和催化机理突变多个关键氨基酸残基所获得；同源蛋白GT-1和GT-2是基于多重序列比对、N-端或C端延长、关键氨基酸残基突变和UDP-葡萄糖或底物结合相关部位的motif重组所获得。GT-1(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示)、GT-2(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示)、GT-3(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)、GT-4(氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示)、GT-5(氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)。。

上述OleD以及同源蛋白的编码基因均委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，并利用pET22b(+)构建表达质粒pET22b-oled、pET22b-gt1、pET22b-gt2、pET22b-gt3、pET22b-gt4、pET22b-gt5。将上述重组表达质粒分别转入E.coli BL21得到6种工程菌株，分别命名为E.coli-pOleD、E.coli-pGT-1、E.coli-pGT-2、E.coli-pGT-3、E.coli-pGT-4和E.coli-pGT-5。

将上述6株E.coli工程菌分别接种至50mL的LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃、220rpm振摇过夜培养获得相应种子液。将种子液按1％接种量转接至100mL的LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，37℃振摇培养至OD₆₀₀＝0.8±0.1时，加入诱导剂IPTG使其终浓度为0.4mM，在20℃条件下，诱导培养16小时，即实现糖基转移酶的异源表达。SDS-PAGE分析结果显示，糖基转移酶OleD、GT-1、GT-2、GT-3、GT-4、GT-5均能可溶性表达，含量分别占总可溶蛋白的20％、20％、22％、21％、19％和20％。

表1 OleD及其突变体信息

实施例2糖基转移酶UGT76G1的重组表达

UGT76G1是来源自甜叶菊Stevia rebaudiana的一种UDP-葡萄糖依赖的糖基转移酶(氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)，其编码基因均委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，并利用pET22b(+)构建表达质粒pET22b-76g1，导入E.coli BL21得工程菌株E.coli-p76g1。诱导表达条件同OleD，SDS-PAGE的分析结果显示，UGT76G1含量占总可溶蛋白的15％。

实施例3诺西肽糖基化衍生物W01的分析方法

(1)HPLC分析条件如下：

色谱柱：YMC-Pack ODS-A(150mm×4.6mm，5μm)；流动相A：超纯水(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈(含0.1％甲酸)；进样量：5μL；柱温：30℃；检测波长：232nm；流速：1.0mL/min；梯度洗脱：10％B-95％B，25min。在上述HPLC分析条件下，诺西肽的保留时间为11.9min，诺西肽糖基化衍生物W01产物为7.9min(如图1所示)。

(2)制备高效液相色谱的纯条件如下：

色谱柱：Waters C18 OBD Prep Column(150mm×30mm，5μm)；流动相A：超纯水(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈(含0.1％甲酸)；分析时间：进样量：100μL；柱温：35℃；检测波长：232nm；流速：0.8mL/min；梯度洗脱：10％B-95％B，25min。

收集合并产物纯度大于95％的洗脱液，减压除去乙腈，然后冷冻干燥获得高纯度诺西肽糖基化衍生物W01，用于结构鉴定。其中：诺西肽糖基化衍生物W01的质谱分析和核磁数据如下:ESI-MS,m/z＝1382.2[M-H]-；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)：δ＝1.72(3H,d,J＝5.8Hz),5.50(3H,d,J＝6.4Hz),5.76(1H,brs),6.46(1H,q,J＝5.8Hz),6.51(1H,brs),7.12(1H,d,J＝5.8Hz),7.28(1H,m),8.17(1H,s),8.29(1H,s),8.62(3H,s)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)：δ＝182.06，169.91，168.89，168.34，166.29，165.16，165.16，164.29，163.61，160.15，159.91，159.83，159.01，152.85，150.12，149.89，149.59，148.95，147.79，143.77，138.38，138.38，133.89，133.69，130.87，129.59，129.59，129.32，129.32，127.83，126.79，126.66，125.62，125.13，124.99，123.51，120.84，102.56，99.89，77.35，76.83，73.04，69.83，69.72，69.72，67.27，60.74，48.81，45.08，29.66，18.84，13.74，13.74。

实施例4糖基转移酶OleD及其突变体生物合成诺西肽糖基化衍生物W01

鉴于糖基转移酶在大肠杆菌中表达的经济性、简便性和高效性，故本发明优选大肠杆菌表达系统对诺西肽的糖基化修饰进行说明，但不限制本发明的应用范围。

1mL反应体系中包括底物诺西肽(0.82mM)，UDP-葡萄糖(4.10mM)，Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.0)，糖基转移酶粗酶液700μL(6-9mg/ml)，20％DMSO与1％的吐温80作为助溶剂，25℃振摇反应24小时。反应结束后，加入两倍体积甲醇处理，离心过滤获得的滤液进行HPLC分析。OleD、GT-1、GT-2、GT-3、GT-4和GT-5诺西肽糖基化衍生物W01的产率分别是2.21％、5.43％、4.10％、1.78％、2.36％和10.98％。

实施例5糖基转移酶UGT76G1催化合成诺西肽糖基化衍生物W01

1mL反应体系中包括底物诺西肽(0.82mM)，UDP-葡萄糖(4.10mM)，Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.0)，糖基转移酶粗酶液700μL(6-9mg/ml)，20％DMSO与1％的吐温80作为助溶剂，25℃振摇反应24小时。反应结束后，加入两倍体积甲醇处理，离心过滤获得的滤液进行HPLC分析。UGT76G1催化合成诺西肽糖基化衍生物W01的产率是4.49％。

实施例6糖基转移酶糖基供体考察

从实施例4和5可知，糖基转移酶GT-5合成诺西肽糖基化衍生物W01的效率最高，故选择GT-5为代表对象进行相关条件考察。

采用常用的NDP-葡萄糖进行糖基供体考察，1mL反应体系中包括底物诺西肽(0.82mM)，NDP-葡萄糖(4.10mM)，Tris-HCl缓冲液(50mM)，反应pH值为7.0，糖基转移酶GT-5粗酶液700μL(8.6mg/ml)，20％DMSO与1％的吐温80作为助溶剂，25℃振摇反应24小时。反应结束后，进行HPLC分析，结果显示，ADP-葡萄糖、GDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖作为供体时的诺西肽糖基化衍生物W01的产率分别是0.82％、1.26％、0.92％和10.98％。

实施例7反应pH值考察

考察最佳反应pH值，5mL反应体系中包括底物诺西肽(0.82mM)，UDP-葡萄糖(4.10mM)，Tris-HCl缓冲液(50mM)，反应pH值为6.0～11.0，糖基转移酶GT-5粗酶液3.5mL(8.6mg/ml)，20％DMSO与1％的吐温80作为助溶剂，25℃振摇反应24小时。反应结束后，进行HPLC分析，结果显示，pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0和pH 11.0的诺西肽糖基化衍生物W01的产率分别是1.22％、3.41％、6.60％、10.98％和2.55％。由此可见，GT-5催化诺西肽糖基化制备衍生物W01的最佳pH为9.0。

实施例8最佳反应温度考察

5mL反应体系中包括底物诺西肽(0.82mM)，UDP-葡萄糖(4.10mM)，Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 9.0)，糖基转移酶GT-5粗酶液3.5mL，20％DMSO与1％的吐温80作为助溶剂，分别于15～50℃振摇反应24小时。反应结束后，进行HPLC分析，结果显示，20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的诺西肽糖基化衍生物W01的产率分别是3.25％、10.98％、14.52％、16.81％、9.82％、6.51％和2.10％。由此可见，GT-5催化诺西肽糖基化制备衍生物W01的最佳反应温度为35.0℃。

实施例9最佳UDP-葡萄糖用量考察

5mL反应体系中包括底物诺西肽(0.82mM)，UDP-葡萄糖0.41～16.40mM，Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 9.0)，糖基转移酶GT-5粗酶液3.5mL，20％DMSO与1％的吐温80作为助溶剂，于35℃振摇反应24小时。反应结束后，进行HPLC分析，结果如表2所示，底物与糖基供体UDP-葡萄糖的最佳摩尔浓度比值为1:10。

表2 UDP-葡萄糖用量对诺西肽糖基化衍生物W01产率的影响

实施例10酶用量考察

1mL反应体系中包括底物诺西肽(0.82mM)，UDP-葡萄糖8.20mM，Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 9.0)，糖基转移酶GT-5粗酶液分别为300～700μL(8.6mg/mL)，35℃振摇反应24小时。反应结束后，进行HPLC分析，结果显示，300μL、400μL、500μL、600μL、700μL的GT-5酶液的诺西肽糖基化衍生物W01产率分别是15.74％、20.66％、24.88％、25.05％和24.12％。

实施例11反应时间考察

10mL反应体系中包括底物诺西肽(0.82mM)，UDP-葡萄糖8.20mM，Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 9.0)，糖基转移酶GT-5粗酶液为600μL，分别添加20％DMSO与1％的吐温80作为助溶剂，分别于35℃振摇反应1～24小时。每个反应时间点取样0.5mL，加入2倍体积甲醇处理，离心所得滤液进行HPLC分析，结果见表3。

表3反应时间对诺西肽糖基化衍生物W01产率的影响

实施例12诺西肽糖基化衍生物W01的制备

为制备衍生物W01，GT-5催化诺西肽糖基化的反应体系放至0.5L。在优选反应条件下反应结束后，加入2倍体积乙酸乙酯萃取，收集合并乙酸乙酯相并用无水硫酸钠除水。所得乙酸乙酯相减压旋蒸，析出固体用DMSO溶解后进行制备高效液相色谱分离纯化，液相程序参加实施例3。最终，获得纯度为98.5％的黄色诺西肽糖基化衍生物W01固体21.8mg。

实施例13诺西肽糖基化衍生物W01的水溶性

诺西肽糖基化衍生物W01和诺西肽纯品分别溶解于不同pH值(2.0-7.0)的水溶液中，室温放置24小时后，12000g离心30min，上清液进行HPLC分析以测定溶解度。结果见表4，与诺西肽相比，诺西肽糖基化衍生物W01的水溶性显著增加，最大溶解度提高了21倍以上。此外，诺西肽糖基化衍生物W01室温条件下24小时无任何降解，稳定性较好。

表4诺西肽糖基化衍生物W01的溶解度

实施例14诺西肽糖基化衍生物W01的杀菌活性

选取致病菌50株，包括耐甲氧西林表皮葡萄球菌10株(MRSE)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌10株(MRSA)、万古霉素中介耐药粪肠球菌10株、粪肠球菌10株、屎肠球菌10株。上述菌株为中国药科大学微生物教研室保藏菌株。

采用平板稀释法分别制备含诺西肽和诺西肽糖基化衍生物W01的平板，平板中药的浓度分别为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0156、0.0078、0.0039μg/mL。将试验菌悬液接种至上述含药平板，倒置于35℃培养16小时，取出观察结果，记录生长状况，具体MIC₅₀值见表5，诺西肽糖基化衍生物W01对MRSE、MRSA、万古霉素中介耐药粪肠球菌、粪肠球菌和屎肠球菌展现出了超强的杀菌活性。

表5诺西肽糖基化衍生物W01的MIC₅₀值

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 新型诺西肽糖基化衍生物及其制备方法和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 415

<212> PRT

<213> OleD氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Met Thr Thr Gln Thr Thr Pro Ala His Ile Ala Met Phe Ser Ile Ala

1 5 10 15

Ala His Gly His Val Asn Pro Ser Leu Glu Val Ile Arg Glu Leu Val

20 25 30

Ala Arg Gly His Arg Val Thr Tyr Ala Ile Pro Pro Val Phe Ala Asp

35 40 45

Lys Val Ala Ala Thr Gly Ala Arg Pro Val Leu Tyr His Ser Thr Leu

50 55 60

Pro Gly Pro Asp Ala Asp Pro Glu Ala Trp Gly Ser Thr Leu Leu Asp

65 70 75 80

Asn Val Glu Pro Phe Leu Asn Asp Ala Ile Gln Ala Leu Pro Gln Leu

85 90 95

Ala Asp Ala Tyr Ala Asp Asp Ile Pro Asp Leu Val Leu His Asp Ile

100 105 110

Thr Ser Tyr Pro Ala Arg Val Leu Ala Arg Arg Trp Gly Val Pro Ala

115 120 125

Val Ser Leu Ser Pro Asn Leu Val Ala Trp Lys Gly Tyr Glu Glu Glu

130 135 140

Val Ala Glu Pro Met Trp Arg Glu Pro Arg Gln Thr Glu Arg Gly Arg

145 150 155 160

Ala Tyr Tyr Ala Arg Phe Glu Ala Trp Leu Lys Glu Asn Gly Ile Thr

165 170 175

Glu His Pro Asp Thr Phe Ala Ser His Pro Pro Arg Ser Leu Val Leu

180 185 190

Ile Pro Lys Ala Leu Gln Pro His Ala Asp Arg Val Asp Glu Asp Val

195 200 205

Tyr Thr Phe Val Gly Ala Cys Gln Gly Asp Arg Ala Glu Glu Gly Gly

210 215 220

Trp Gln Arg Pro Ala Gly Ala Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gly

225 230 235 240

Ser Ala Phe Thr Lys Gln Pro Ala Phe Tyr Arg Glu Cys Val Arg Ala

245 250 255

Phe Gly Asn Leu Pro Gly Trp His Leu Val Leu Gln Ile Gly Arg Lys

260 265 270

Val Thr Pro Ala Glu Leu Gly Glu Leu Pro Asp Asn Val Glu Val His

275 280 285

Asp Trp Val Pro Gln Leu Ala Ile Leu Arg Gln Ala Asp Leu Phe Val

290 295 300

Thr His Ala Gly Ala Gly Gly Ser Gln Glu Gly Leu Ala Thr Ala Thr

305 310 315 320

Pro Met Ile Ala Val Pro Gln Ala Val Asp Gln Phe Gly Asn Ala Asp

325 330 335

Met Leu Gln Gly Leu Gly Val Ala Arg Lys Leu Ala Thr Glu Glu Ala

340 345 350

Thr Ala Asp Leu Leu Arg Glu Thr Ala Leu Ala Leu Val Asp Asp Pro

355 360 365

Glu Val Ala Arg Arg Leu Arg Arg Ile Gln Ala Glu Met Ala Gln Glu

370 375 380

Gly Gly Thr Arg Arg Ala Ala Asp Leu Ile Glu Ala Glu Leu Pro Ala

385 390 395 400

Arg His Glu Arg Gln Glu Pro Val Gly Asp Arg Pro Asn Gly Gly

405 410 415

<210> 2

<211> 415

<212> PRT

<213> GT-1氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Met Thr Thr Gln Thr Thr Pro Ala His Ile Ala Met Phe Ser Ile Ala

1 5 10 15

Ala His Gly His Val Asn Pro Ser Leu Glu Val Ile Arg Glu Leu Val

20 25 30

Ala Arg Gly His Arg Val Thr Tyr Ala Ile Pro Pro Val Phe Ala Asp

35 40 45

Lys Val Ala Ala Thr Gly Ala Arg Pro Val Leu Tyr His Ser Thr Leu

50 55 60

Pro Gly Thr Asp Ala Asp Pro Glu Ala Trp Gly Ser Thr Leu Leu Asp

65 70 75 80

Asn Val Glu Pro Phe Leu Asn Asp Ala Ile Gln Ala Leu Pro Gln Leu

85 90 95

Ala Asp Ala Tyr Ala Asp Asp Ile Pro Asp Leu Val Leu His Asp Ile

100 105 110

Thr Ser Tyr Pro Ala Arg Val Leu Ala Arg Arg Trp Gly Val Pro Ala

115 120 125

Val Ser Leu Phe Pro Asn Leu Val Ala Trp Lys Gly Tyr Glu Glu Glu

130 135 140

Val Ala Glu Pro Met Trp Arg Glu Pro Arg Gln Thr Glu Arg Gly Arg

145 150 155 160

Ala Tyr Tyr Ala Arg Phe Glu Ala Trp Leu Lys Glu Asn Gly Ile Thr

165 170 175

Glu His Pro Asp Thr Phe Ala Ser His Pro Pro Arg Ser Leu Val Leu

180 185 190

Ile Pro Lys Ala Leu Gln Pro His Ala Asp Arg Val Asp Glu Asp Val

195 200 205

Tyr Thr Phe Val Gly Ala Cys Gln Gly Asp Arg Ala Glu Glu Gly Gly

210 215 220

Trp Gln Arg Pro Ala Gly Ala Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gly

225 230 235 240

Ser Val Phe Thr Lys Gln Pro Ala Phe Tyr Arg Glu Cys Val Arg Ala

245 250 255

Phe Gly Asn Leu Pro Gly Trp His Leu Val Leu Gln Ile Gly Arg Lys

260 265 270

Val Thr Pro Ala Glu Leu Gly Glu Leu Pro Asp Asn Val Glu Val His

275 280 285

Asp Trp Val Pro Gln Leu Ala Ile Leu Arg Gln Ala Asp Leu Phe Val

290 295 300

Thr His Ala Gly Ala Gly Gly Ser Gln Glu Gly Leu Ala Thr Ala Thr

305 310 315 320

Pro Met Ile Ala Val Pro Gln Ala Val Asp Gln Phe Gly Asn Ala Asp

325 330 335

Met Leu Gln Gly Leu Gly Val Ala Arg Lys Leu Ala Thr Glu Glu Ala

340 345 350

Thr Ala Asp Leu Leu Arg Glu Thr Ala Leu Ala Leu Val Asp Asp Pro

355 360 365

Glu Val Ala Arg Arg Leu Arg Arg Ile Gln Ala Glu Met Ala Gln Glu

370 375 380

Gly Gly Thr Arg Arg Ala Ala Asp Leu Ile Glu Ala Glu Leu Pro Ala

385 390 395 400

Arg His Glu Arg Gln Glu Pro Val Gly Asp Arg Pro Asn Gly Gly

405 410 415

<210> 3

<211> 415

<212> PRT

<213> GT-2氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

Met Thr Thr Gln Thr Thr Pro Ala His Ile Ala Met Phe Ser Ile Ala

1 5 10 15

Ala His Gly His Val Asn Pro Ser Leu Glu Val Ile Arg Glu Leu Val

20 25 30

Ala Arg Gly His Arg Val Thr Tyr Ala Ile Pro Pro Val Phe Ala Asp

35 40 45

Lys Val Ala Ala Thr Gly Ala Arg Pro Val Leu Tyr His Ser Thr Leu

50 55 60

Pro Gly Pro Asp Ala Asp Pro Glu Ala Trp Gly Ser Thr Leu Leu Asp

65 70 75 80

Asn Val Glu Pro Phe Leu Asn Asp Ala Ile Gln Ala Leu Pro Gln Leu

85 90 95

Ala Asp Ala Tyr Ala Asp Asp Ile Pro Asp Leu Val Leu His Asp Ile

100 105 110

Thr Ser Tyr Pro Ala Arg Val Leu Ala Arg Arg Trp Gly Val Pro Ala

115 120 125

Val Ser Leu Ser Pro Asn Leu Val Ala Trp Lys Gly Tyr Glu Glu Glu

130 135 140

Val Ala Glu Pro Met Trp Arg Glu Pro Arg Gln Thr Glu Arg Gly Arg

145 150 155 160

Ala Tyr Tyr Ala Arg Phe Glu Ala Trp Leu Lys Glu Asn Gly Ile Thr

165 170 175

Glu His Pro Asp Thr Phe Ala Ser His Pro Pro Arg Ser Leu Val Leu

180 185 190

Ile Pro Lys Ala Leu Gln Pro His Ala Asp Arg Val Asp Glu Asp Val

195 200 205

Tyr Thr Phe Val Gly Ala Cys Gln Gly Asp Arg Ala Glu Glu Gly Gly

210 215 220

Trp Gln Arg Pro Ala Gly Ala Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gly

225 230 235 240

Ser Ala Phe Thr Lys Gln Pro Ala Phe Tyr Arg Glu Cys Val Arg Ala

245 250 255

Phe Gly Asn Leu Pro Gly Trp His Leu Val Leu Gln Ile Gly Arg Lys

260 265 270

Val Thr Pro Ala Glu Leu Gly Glu Leu Pro Asp Asn Val Glu Val His

275 280 285

Asp Trp Val Pro Gln Leu Asp Ile Leu Thr Lys Ala Ser Ala Phe Ile

290 295 300

Thr His Ala Gly Met Gly Ser Thr Met Glu Ala Leu Ser Asn Ala Val

305 310 315 320

Pro Met Ile Ala Val Pro Gln Ala Val Asp Gln Phe Gly Asn Ala Asp

325 330 335

Met Leu Gln Gly Leu Gly Val Ala Arg Lys Leu Ala Thr Glu Glu Ala

340 345 350

Thr Ala Asp Leu Leu Arg Glu Thr Ala Leu Ala Leu Val Asp Asp Pro

355 360 365

Glu Val Ala Arg Arg Leu Arg Arg Ile Gln Ala Glu Met Ala Gln Glu

370 375 380

Gly Gly Thr Arg Arg Ala Ala Asp Leu Ile Glu Ala Glu Leu Pro Ala

385 390 395 400

Arg His Glu Arg Gln Glu Pro Val Gly Asp Arg Pro Asn Gly Gly

405 410 415

<210> 4

<211> 420

<212> PRT

<213> GT-3氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

Met Thr Ser Glu His Arg Ser Ala Ser Val Thr Pro Ala His Ile Ala

1 5 10 15

Met Phe Ser Ile Ala Ala His Gly His Val Asn Pro Ser Leu Glu Val

20 25 30

Ile Arg Glu Leu Val Ala Arg Gly His Arg Val Thr Tyr Ala Ile Pro

35 40 45

Pro Val Phe Ala Asp Lys Val Ala Ala Thr Gly Ala Arg Pro Val Leu

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Asp Gln Glu Ser Ala Met Gly Leu Phe Leu Asn Asp Ala Ile Gln

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Gly Tyr Glu Glu Glu Val Ala Glu Pro Met Trp Arg Glu Pro Arg Gln

145 150 155 160

Thr Glu Arg Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Arg Phe Glu Ala Trp Leu Lys

165 170 175

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180 185 190

Arg Ser Leu Val Leu Ile Pro Lys Ala Leu Gln Pro His Ala Asp Arg

195 200 205

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210 215 220

Ala Glu Glu Gly Gly Trp Gln Arg Pro Ala Gly Ala Glu Lys Val Val

225 230 235 240

Leu Val Ser Leu Gly Ser Ala Phe Thr Lys Gln Pro Ala Phe Tyr Arg

245 250 255

Glu Cys Val Arg Ala Phe Gly Asn Leu Pro Gly Trp His Leu Val Leu

260 265 270

Gln Ile Gly Arg Lys Val Thr Pro Ala Glu Leu Gly Glu Leu Pro Asp

275 280 285

Asn Val Glu Val His Asp Trp Val Pro Gln Leu Asp Ile Leu Thr Lys

290 295 300

Ala Ser Ala Phe Ile Thr His Ala Gly Met Gly Ser Thr Met Glu Ala

305 310 315 320

Leu Ser Asn Ala Val Pro Met Ile Ala Val Pro Gln Ala Val Asp Gln

325 330 335

Phe Gly Asn Ala Asp Met Leu Gln Gly Leu Gly Val Ala Arg Lys Leu

340 345 350

Ala Thr Glu Glu Ala Thr Ala Asp Leu Leu Arg Glu Thr Ala Leu Ala

355 360 365

Leu Val Asp Asp Pro Glu Val Ala Arg Arg Leu Arg Arg Ile Gln Ala

370 375 380

Glu Met Ala Gln Glu Gly Gly Thr Arg Arg Ala Ala Asp Leu Ile Glu

385 390 395 400

Ala Glu Leu Pro Ala Arg His Glu Arg Gln Glu Pro Val Gly Asp Arg

405 410 415

Pro Asn Gly Gly

420

<210> 5

<211> 403

<212> PRT

<213> GT-4氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

Met Thr Thr Gln Thr Thr Pro Ala His Ile Ala Met Phe Ser Ile Ala

1 5 10 15

Ala His Gly His Val Asn Pro Ser Leu Glu Val Ile Arg Glu Leu Val

20 25 30

Ala Arg Gly His Arg Val Thr Tyr Ala Ile Pro Pro Val Phe Ala Asp

35 40 45

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65 70 75 80

Ala Met Gly Leu Phe Leu Asn Asp Ala Ile Gln Ala Leu Pro Gln Leu

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100 105 110

Thr Ser Tyr Pro Ala Arg Val Leu Ala Arg Arg Trp Gly Val Pro Ala

115 120 125

Val Ser Leu Ser Pro Asn Leu Val Ala Trp Lys Gly Tyr Glu Glu Glu

130 135 140

Val Ala Glu Pro Met Trp Arg Glu Pro Arg Gln Thr Glu Arg Gly Arg

145 150 155 160

Ala Tyr Tyr Ala Arg Phe Glu Ala Trp Leu Lys Glu Asn Gly Ile Thr

165 170 175

Glu His Pro Asp Thr Phe Ala Ser His Pro Pro Arg Ser Leu Val Leu

180 185 190

Ile Pro Lys Ala Leu Gln Pro His Ala Asp Arg Val Asp Glu Asp Val

195 200 205

Tyr Thr Phe Val Gly Ala Cys Gln Gly Asp Arg Ala Glu Glu Gly Gly

210 215 220

Trp Gln Arg Pro Ala Gly Ala Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gly

225 230 235 240

Ser Ala Phe Thr Lys Gln Pro Ala Phe Tyr Arg Glu Cys Val Arg Ala

245 250 255

Phe Gly Asn Leu Pro Gly Trp His Leu Val Leu Gln Ile Gly Arg Lys

260 265 270

Val Thr Pro Ala Glu Leu Gly Glu Leu Pro Asp Asn Val Glu Val His

275 280 285

Asp Trp Val Pro Gln Leu Asp Ile Leu Thr Lys Ala Ser Ala Phe Ile

290 295 300

Thr His Ala Gly Met Gly Ser Thr Met Glu Ala Leu Ser Asn Ala Val

305 310 315 320

Pro Met Ile Ala Val Pro Gln Ala Val Asp Gln Phe Gly Asn Ala Asp

325 330 335

Met Leu Gln Gly Leu Gly Val Ala Arg Lys Leu Ala Thr Glu Glu Ala

340 345 350

Thr Ala Asp Leu Leu Arg Glu Thr Ala Leu Ala Leu Val Asp Asp Pro

355 360 365

Glu Val Ala Arg Arg Leu Arg Arg Ile Gln Ala Glu Met Ala Gln Glu

370 375 380

Gly Gly Thr Arg Arg Ala Ala Asp Leu Ile Glu Ala Glu Leu Pro Ala

385 390 395 400

Arg His Gly

<210> 6

<211> 408

<212> PRT

<213> GT-5氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

Met Thr Ser Glu His Arg Ser Ala Ser Val Thr Pro Ala His Ile Ala

1 5 10 15

Met Phe Ser Ile Ala Ala His Gly His Val Asn Pro Ser Leu Glu Val

20 25 30

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100 105 110

Val Leu His Asp Ile Thr Ser Tyr Pro Ala Arg Val Leu Ala Arg Arg

115 120 125

Trp Gly Val Pro Ala Val Ser Leu Ser Pro Asn Leu Val Ala Trp Lys

130 135 140

Gly Tyr Glu Glu Glu Val Ala Glu Pro Met Trp Arg Glu Pro Arg Gln

145 150 155 160

Thr Glu Arg Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Arg Phe Glu Ala Trp Leu Lys

165 170 175

Glu Asn Gly Ile Thr Glu His Pro Asp Thr Phe Ala Ser His Pro Pro

180 185 190

Arg Ser Leu Val Leu Ile Pro Lys Ala Leu Gln Pro His Ala Asp Arg

195 200 205

Val Asp Glu Asp Val Tyr Thr Phe Val Gly Ala Cys Gln Gly Asp Arg

210 215 220

Ala Glu Glu Gly Gly Trp Gln Arg Pro Ala Gly Ala Glu Lys Val Val

225 230 235 240

Leu Val Ser Leu Gly Ser Ala Phe Thr Lys Gln Pro Ala Phe Tyr Arg

245 250 255

Glu Cys Val Arg Ala Phe Gly Asn Leu Pro Gly Trp His Leu Val Leu

260 265 270

Gln Ile Gly Arg Lys Val Thr Pro Ala Glu Leu Gly Glu Leu Pro Pro

275 280 285

Asn Val Glu Val His Gln Trp Val Pro Gln Leu Asp Ile Leu Thr Lys

290 295 300

Ala Ser Ala Phe Ile Thr His Ala Gly Met Gly Ser Thr Met Glu Ala

305 310 315 320

Leu Ser Asn Ala Val Pro Met Ile Ala Val Pro Gln Ala Val Asp Gln

325 330 335

Phe Gly Asn Ala Asp Met Leu Gln Gly Leu Gly Val Ala Arg Lys Leu

340 345 350

Ala Thr Glu Glu Ala Thr Ala Asp Leu Leu Arg Glu Thr Ala Leu Ala

355 360 365

Leu Val Asp Asp Pro Glu Val Ala Arg Arg Leu Arg Arg Ile Gln Ala

370 375 380

Glu Met Ala Gln Glu Gly Gly Thr Arg Arg Ala Ala Asp Leu Ile Glu

385 390 395 400

Ala Glu Leu Pro Ala Arg His Gly

405

<210> 7

<211> 460

<212> PRT

<213> UGT76G1氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile

1 5 10 15

Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu

20 25 30

Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr

35 40 45

Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg

50 55 60

Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro

65 70 75 80

Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His

85 90 95

Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser

100 105 110

Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr

115 120 125

Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu

130 135 140

Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln

145 150 155 160

Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu

165 170 175

Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser

180 185 190

Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile

195 200 205

Lys Gln Thr Arg Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu

210 215 220

Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro

225 230 235 240

Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser

245 250 255

Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro

260 265 270

Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp

275 280 285

Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln

290 295 300

Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp

305 310 315 320

Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val

325 330 335

Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala

340 345 350

Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu

355 360 365

Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn

370 375 380

Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn

385 390 395 400

Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val

405 410 415

Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln

420 425 430

Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu

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<210> 8

<211> 1248

<212> DNA

<213> OleD核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

atgaccaccc agaccactcc cgcccacatc gccatgttct ccatcgccgc ccacggccat 60

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cactccaccc tgcccggccc cgacgccgac ccggaggcat ggggaagcac cctgctggac 240

aacgtcgaac cgttcctgaa cgacgcgatc caggcgctcc cgcagctcgc cgatgcctac 300

gccgacgaca tccccgatct cgtcctgcac gacatcacct cctacccggc ccgcgtcctg 360

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tacgaggagg aggtcgccga gccgatgtgg cgcgaacccc ggcagaccga gcgcggacgg 480

gcctactacg cccggttcga ggcatggctg aaggagaacg ggatcaccga gcacccggac 540

acgttcgcca gtcatccgcc gcgctccctg gtgctcatcc cgaaggcgct ccagccgcac 600

gccgaccggg tggacgaaga cgtgtacacc ttcgtcggcg cctgccaggg agaccgcgcc 660

gaggaaggcg gctggcagcg gcccgccggc gcggagaagg tcgtcctggt gtcgctcggc 720

tcggcgttca ccaagcagcc cgccttctac cgggagtgcg tgcgcgcctt cgggaacctg 780

cccggctggc acctcgtcct ccagatcggc cggaaggtga cccccgccga actgggggag 840

ctgccggaca acgtggaggt gcacgactgg gtgccgcagc tcgcgatcct gcgccaggcc 900

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cccatgatcg ccgtaccgca ggccgtcgac cagttcggca acgccgacat gctccaaggg 1020

ctcggcgtcg cccggaagct ggcgaccgag gaggccaccg ccgacctgct ccgcgagacc 1080

gccctcgctc tggtggacga cccggaggtc gcgcgccggc tccggcggat ccaggcggag 1140

atggcccagg agggcggcac ccggcgggcg gccgacctca tcgaggccga actgcccgcg 1200

cgccacgagc ggcaggagcc ggtgggcgac cgacccaacg gtgggtga 1248

<210> 9

<211> 1248

<212> DNA

<213> GT-1核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 9

atgaccaccc agaccactcc cgcccacatc gccatgttct ccatcgccgc ccacggccat 60

gtgaacccca gcctggaggt gatccgtgaa ctcgtcgccc gcggccaccg ggtcacgtac 120

gccattccgc ccgtcttcgc cgacaaggtg gccgccaccg gcgcccggcc cgtcctctac 180

cactccaccc tgcccggcac cgacgccgac ccggaggcat ggggaagcac cctgctggac 240

aacgtcgaac cgttcctgaa cgacgcgatc caggcgctcc cgcagctcgc cgatgcctac 300

gccgacgaca tccccgatct cgtcctgcac gacatcacct cctacccggc ccgcgtcctg 360

gcccgccgct ggggcgtccc ggcggtctcc ctctttccga acctcgtcgc ctggaagggt 420

tacgaggagg aggtcgccga gccgatgtgg cgcgaacccc ggcagaccga gcgcggacgg 480

gcctactacg cccggttcga ggcatggctg aaggagaacg ggatcaccga gcacccggac 540

acgttcgcca gtcatccgcc gcgctccctg gtgctcatcc cgaaggcgct ccagccgcac 600

gccgaccggg tggacgaaga cgtgtacacc ttcgtcggcg cctgccaggg agaccgcgcc 660

gaggaaggcg gctggcagcg gcccgccggc gcggagaagg tcgtcctggt gtcgctcggc 720

tcggttttca ccaagcagcc cgccttctac cgggagtgcg tgcgcgcctt cgggaacctg 780

cccggctggc acctcgtcct ccagatcggc cggaaggtga cccccgccga actgggggag 840

ctgccggaca acgtggaggt gcacgactgg gtgccgcagc tcgcgatcct gcgccaggcc 900

gatctgttcg tcacccacgc gggcgccggc ggcagccagg aggggctggc caccgcgacg 960

cccatgatcg ccgtaccgca ggccgtcgac cagttcggca acgccgacat gctccaaggg 1020

ctcggcgtcg cccggaagct ggcgaccgag gaggccaccg ccgacctgct ccgcgagacc 1080

gccctcgctc tggtggacga cccggaggtc gcgcgccggc tccggcggat ccaggcggag 1140

atggcccagg agggcggcac ccggcgggcg gccgacctca tcgaggccga actgcccgcg 1200

cgccacgagc ggcaggagcc ggtgggcgac cgacccaacg gtgggtga 1248

<210> 10

<211> 1248

<212> DNA

<213> GT-2核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 10

atgaccaccc agaccacgcc ggcccatatc gcgatgttca gcatcgccgc ccatggccat 60

gtgaatccga gtctggaagt gatccgtgaa ctggttgccc gtggccatcg cgtgacctat 120

gcgatcccgc cggtgttcgc cgataaagtt gccgccaccg gtgcccgtcc ggttctgtac 180

cacagtacgc tgccgggtcc agatgccgac ccagaagcgt ggggcagtac gctgctggat 240

aacgttgaac cgttcctcaa cgacgcgatc caagcgctgc cacagctggc ggatgcgtat 300

gcggatgaca tcccagatct ggttctccac gatatcacca gctatccagc gcgtgttctg 360

gcgcgtcgct ggggtgttcc agccgttagt ctgagtccga acctcgttgc gtggaaaggc 420

tatgaggaag aagtggcgga accgatgtgg cgcgaaccgc gtcagacgga acgtggtcgc 480

gcctattatg cgcgctttga ggcgtggctg aaagagaatg gcatcacgga acacccggat 540

acctttgcca gccatccacc acgcagtctg gttctgatcc caaaagcgct gcaaccgcat 600

gccgatcgcg tggatgagga cgtgtacacc tttgtgggtg cgtgccaagg tgaccgtgcg 660

gaagaaggtg gttggcaacg tccggcgggt gccgaaaagg ttgttctggt tagtctgggc 720

agcgccttca ccaaacagcc agccttttac cgcgaatgcg tgcgcgcctt cggtaatctg 780

ccgggctggc atctggttct gcaaatcggc cgcaaagtga ccccagcgga actgggtgaa 840

ctgccagata acgtggaggt gcatgactgg gttccgcagc tggatattct gaccaaagcg 900

agcgcgttca tcacgcatgc cggtatgggc agcaccatgg aagcgctgag caatgccgtt 960

ccgatgatcg cggttccgca agccgtggat caattcggca atgcggatat gctgcaaggt 1020

ctgggtgttg cgcgcaaact ggcgacggaa gaggccacgg ccgatctgct gcgtgaaacc 1080

gcgctggcgc tggtggatga tccggaagtt gcccgccgtc tgcgtcgtat tcaagccgag 1140

atggcgcaag aaggtggtac ccgtcgcgcc gccgatctga ttgaagccga actgccagcg 1200

cgccatgaac gccaagaacc agttggtgac cgcccgaatg gcggttaa 1248

<210> 11

<211> 1263

<212> DNA

<213> GT-3核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 11

atgaccagtg agcatcgtag tgccagcgtt accccagcgc atatcgcgat gttcagcatc 60

gcggcccatg gccatgtgaa cccgagtctg gaggtgatcc gtgaactggt tgcgcgcggt 120

catcgtgtta cgtacgcgat cccgccggtg tttgccgata aagttgcggc caccggtgcg 180

cgtccagttc tgtatcacag cacgctgcca aagccaagca acccggaaga aagttggccg 240

gaggatcaag aaagcgcgat gggtctgttc ctcaatgacg cgattcaagc gctgccacag 300

ctggcggatg cctatgccga tgatatcccg gatctggttc tgcacgacat cacgagctat 360

ccagcccgtg ttctggcccg tcgttggggt gttccagccg ttagtctgag tccaaatctg 420

gtggcgtgga aaggctatga ggaagaagtt gccgagccga tgtggcgcga accgcgtcag 480

acggaacgtg gtcgcgcgta ttatgcgcgc ttcgaagcgt ggctgaaaga aaacggcatc 540

accgagcatc cggatacctt cgccagccac ccaccacgta gcctcgttct catcccgaaa 600

gccctccagc cgcatgccga tcgcgttgat gaggacgtgt acacctttgt gggtgcgtgc 660

caaggtgacc gtgcggaaga aggtggttgg caacgtccgg cgggtgccga aaaggttgtt 720

ctggttagtc tgggcagcgc cttcaccaaa cagccagcct tttaccgcga atgcgtgcgc 780

gccttcggta atctgccggg ctggcatctg gttctgcaaa tcggccgcaa agtgacccca 840

gcggaactgg gtgaactgcc agataacgtg gaggtgcatg actgggttcc gcagctggat 900

attctgacca aagcgagcgc gttcatcacg catgccggta tgggcagcac catggaagcg 960

ctgagcaatg ccgttccgat gatcgcggtt ccgcaagccg tggatcaatt cggcaatgcg 1020

gatatgctgc aaggtctggg tgttgcgcgc aaactggcga cggaagaggc cacggccgat 1080

ctgctgcgtg aaaccgcgct ggcgctggtg gatgatccgg aagttgcccg ccgtctgcgt 1140

cgtattcaag ccgagatggc gcaagaaggt ggtacccgtc gcgccgccga tctgattgaa 1200

gccgaactgc cagcgcgcca tgaacgccaa gaaccagttg gtgaccgccc gaatggcggt 1260

taa 1263

<210> 12

<211> 1212

<212> DNA

<213> GT-4核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 12

atgaccaccc agaccacccc agcgcatatc gcgatgttca gcatcgcggc ccatggccat 60

gtgaacccga gtctggaggt gatccgtgaa ctggttgcgc gcggtcatcg tgttacgtac 120

gcgatcccgc cggtgtttgc cgataaagtt gcggccaccg gtgcgcgtcc agttctgtat 180

cacagcacgc tgccaaagcc aagcaacccg gaagaaagtt ggccggagga tcaagaaagc 240

gcgatgggtc tgttcctcaa tgacgcgatt caagcgctgc cacagctggc ggatgcctat 300

gccgatgata tcccggatct ggttctgcac gacatcacga gctatccagc ccgtgttctg 360

gcccgtcgtt ggggtgttcc agccgttagt ctgagtccaa atctggtggc gtggaaaggc 420

tatgaggaag aagttgccga gccgatgtgg cgcgaaccgc gtcagacgga acgtggtcgc 480

gcgtattatg cgcgcttcga agcgtggctg aaagaaaacg gcatcaccga gcatccggat 540

accttcgcca gccacccacc acgtagcctc gttctcatcc cgaaagccct ccagccgcat 600

gccgatcgcg ttgatgagga cgtgtacacc tttgtgggtg cgtgccaagg tgaccgtgcg 660

gaagaaggtg gttggcaacg tccggcgggt gccgaaaagg ttgttctggt tagtctgggc 720

agcgccttca ccaaacagcc agccttttac cgcgaatgcg tgcgcgcctt cggtaatctg 780

ccgggctggc atctggttct gcaaatcggc cgcaaagtga ccccagcgga actgggtgaa 840

ctgccagata acgtggaggt gcatgactgg gttccgcagc tggatattct gaccaaagcg 900

agcgcgttca tcacgcatgc cggtatgggc agcaccatgg aagcgctgag caatgccgtt 960

ccgatgatcg cggttccgca agccgtggat caattcggca atgcggatat gctgcaaggt 1020

ctgggtgttg cgcgcaaact ggcgacggaa gaggccacgg ccgatctgct gcgtgaaacc 1080

gcgctggcgc tggtggatga tccggaagtt gcccgccgtc tgcgtcgtat tcaagccgag 1140

atggcgcaag aaggtggtac ccgtcgcgcc gccgatctga ttgaagccga actgccagcg 1200

cgccatggtt aa 1212

<210> 13

<211> 1227

<212> DNA

<213> GT-5核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 13

atgaccagtg agcatcgtag tgccagcgtt accccggcac atatcgccat gtttagcatc 60

gccgcacacg gtcacgtgaa tccgagcctg gaagttattc gcgaactggt ggcacgtggc 120

caccgtgtta cctacgccat tccgcctgtt ttcgccgata aagttgccgc aaccggtgca 180

cgtccggtgc tgtaccatag caccctgccg aaaccgagta atccggaaga aagctggccg 240

gaagatcagg aaagcgccat gggcctgttt ctgaatgacg ccattcaggc actgccgcag 300

ttagccgatg cctacgccga tgatatccct gatctggtgc tgcacgatat caccagttat 360

ccggcacgtg ttctggcacg tcgctggggt gtgcctgccg tgagcctgag cccgaatctg 420

gtggcctgga aaggctacga agaagaagtt gccgagccga tgtggcgtga accgcgtcag 480

acagaacgtg gtcgcgccta ctatgcccgc ttcgaagcct ggctgaaaga gaacggcatc 540

accgaacatc cggatacctt cgcaagccat ccgccgcgca gtctggttct gatcccgaaa 600

gccctgcagc cgcatgccga tcgtgtggat gaggacgttt acaccttcgt tggcgcctgt 660

cagggtgatc gtgccgaaga aggtggctgg cagcgccctg caggtgcaga gaaagtggtg 720

ctggtgagcc tgggcagtgc ctttaccaag cagccggcat tctatcgcga atgtgtgcgt 780

gcctttggca acctgccggg ctggcacctg gttctgcaga tcggccgtaa agtgaccccg 840

gccgaactgg gtgaactgcc gcctaatgtg gaagtgcatc agtgggttcc gcagctggat 900

atcctgacca aagccagtgc cttcatcacc catgcaggta tgggcagcac aatggaagcc 960

ctgagtaatg ccgttccgat gatcgccgtt ccgcaggccg tggaccagtt tggcaacgca 1020

gatatgctgc agggtctggg cgtggcacgt aaactggcca ccgaagaagc aaccgcagat 1080

ctgctgcgtg agaccgccct ggccctggtt gacgatccgg aagttgcccg tcgcctgcgt 1140

cgtattcagg ccgaaatggc acaggaaggt ggcacccgtc gtgcagccga tctgattgag 1200

gccgaactgc cggcccgtca tggctaa 1227

<210> 14

<211> 1383

<212> DNA

<213> UGT76G1核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 14

atggaaaata aaaccgaaac caccgtccgt cgccgtcgtc gtatcattct gttcccggtc 60

ccgttccaag gtcacatcaa cccgattctg cagctggcca acgtgctgta tagcaaaggt 120

ttctctatca ccatcttcca tacgaacttc aacaaaccga aaacctctaa ctacccgcac 180

tttacgttcc gttttattct ggataacgac ccgcaggatg aacgcatcag taatctgccg 240

acccatggtc cgctggcggg tatgcgtatt ccgattatca acgaacacgg cgcagatgaa 300

ctgcgtcgcg aactggaact gctgatgctg gcctctgaag aagatgaaga agttagttgc 360

ctgatcaccg acgcactgtg gtattttgcc cagagtgttg cagattccct gaacctgcgt 420

cgcctggtcc tgatgacgag ctctctgttc aattttcatg cccacgtttc cctgccgcag 480

ttcgatgaac tgggttatct ggacccggat gacaaaaccc gcctggaaga acaagcttca 540

ggctttccga tgctgaaagt caaagatatt aaaagtgcgt actccaactg gcagattctg 600

aaagaaatcc tgggtaaaat gatcaaacaa acccgtgcaa gttccggcgt catctggaat 660

tccttcaaag aactggaaga atcagaactg gaaacggtga ttcgcgaaat cccggctccg 720

tcttttctga ttccgctgcc gaaacatctg accgcgtcat cgagctctct gctggatcac 780

gaccgtacgg tgtttcagtg gctggatcag caaccgccga gttccgtgct gtacgttagc 840

ttcggtagca cctctgaagt ggatgaaaaa gactttctgg aaatcgctcg tggcctggtt 900

gattcaaaac aatcgttcct gtgggtggtt cgcccgggtt ttgtgaaagg cagcacgtgg 960

gttgaaccgc tgccggatgg cttcctgggt gaacgtggtc gcattgtcaa atgggtgccg 1020

cagcaagaag tgctggcaca tggtgctatc ggcgcgtttt ggacccactc aggttggaac 1080

tcgacgctgg aaagcgtttg tgaaggtgtc ccgatgattt tctcggattt tggcctggac 1140

cagccgctga atgcacgtta tatgagcgat gttctgaaag tcggtgtgta cctggaaaac 1200

ggttgggaac gcggcgaaat tgcgaatgcc atccgtcgcg ttatggtcga tgaagaaggc 1260

gaatatatcc gtcagaatgc tcgcgtcctg aaacaaaaag cggacgttag tctgatgaaa 1320

ggcggttcat cgtacgaatc cctggaatca ctggtctcct acatttcttc tctgggctcg 1380

taa 1383

Claims

1.一种诺西肽糖基化衍生物W01，其特征在于：其结构为式(I)所示：

结构中的R为α-或β-糖苷键连接的葡萄糖。

2.根据权利要求1所述的诺西肽糖基化衍生物W01，其特征在于：所述葡萄糖为α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖。

3.根据权利要求1或2所述诺西肽糖基化衍生物W01的制备方法，其特征在于：以NDP-葡萄糖为糖供体，使用UDP-葡萄糖依赖糖基转移酶催化诺西肽定点糖基化修饰，制备获得诺西肽糖基化衍生物W01。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的UDP-葡萄糖依赖糖基转移酶包括：OleD、与OleD氨基酸序列一致性大于或等于80％的突变体的酶或蛋白质、糖基转移酶UGT76G1；所示所述糖基转移酶OleD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述UGT76G1序列如SEQ ID NO:7。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-6所示。

6.根据权利要求3-5任意一项所述的方法，其特征在于反应的pH为6.0-11.0，反应温度为15-50℃，诺西肽和UDP-葡萄糖的摩尔浓度比值为1:0.5-1:20，反应时间为1-24小时。

7.根据权利要求1或2所述一种诺西肽糖基化衍生物W01制备抑制或杀死革兰氏阳性细菌药物中应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：所述的革兰氏阳性细菌为抗生素敏感细菌或耐药菌株。