KR101347335B1 - 신규 나르보마이신 유도체 화합물, 상기 화합물을 포함하는 항균용 조성물 및 상기 화합물의 생산 방법 - Google Patents

신규 나르보마이신 유도체 화합물, 상기 화합물을 포함하는 항균용 조성물 및 상기 화합물의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 나르보마이신 유도체 화합물, 상기 화합물을 포함하는 항균용 조성물 및 상기 화합물의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생산 방법을 통하여 생체 내 조합 생합성의 방법으로 나르보마이신에 있어서 다양한 당 부분을 포함하는 나르보마이신 유도체를 합성할 수 있고, 특히 신규하고 항균 활성이 우수한 다양한 나르보마이신 유도체를 합성할 수 있다.

Description

신규 나르보마이신 유도체 화합물, 상기 화합물을 포함하는 항균용 조성물 및 상기 화합물의 생산 방법{Novel narbomycin derivatives compounds, antibacterial composition comprising the same and manufacturing method of the same}
본 발명은 신규 나르보마이신 유도체 화합물, 상기 화합물을 포함하는 항균용 조성물 및 상기 화합물의 생산 방법에 관한 것이다.
감염성 세균들이 대부분의 항생제에 대한 내성을 획득하게 되면서, 기존 항생제에 대하여 내성을 갖는 세균이나 곰팡이, 바이러스, 암세포 등을 치료하기 위해, 새로운 종류의 항생제를 얻으려는 노력이 계속되고 있다. 이를 위하여 이제까지는 주로 자연계에 존재하는 미생물을 탐색하여 새로운 항생물질을 만들어내는 균주를 찾았으나, 이러한 신규 항생물질 탐색과정은 그에 들어가는 시간, 노력 및 비용이 엄청나고, 약리작용 및 독성시험까지 완료되어야만 하나의 사용 가능한 항생물질로 인정받을 수 있기 때문에 무척 까다롭고 힘든 작업이다. 따라서 많은 제약회사, 대학 및 연구소에서 기존의 방법과는 다른 돌파구를 기대하고 있다.
그에 따라, 항생물질을 만들어내는 균주의 유전자를 조작하여 새로운 구조의 다양한 생리활성물질을 얻어내려는 방법이 시도되고 있다. 이러한 방법은 주로 폴리케타이드(polyketide) 계열 항생물질의 구조변형에 도입되고 있으며, 다양한 생합성 유전자의 조합을 통하여 다양한 구조를 생성할 수 있으므로 이를 조합 생합성(combinatorial biosynthesis)이라 부른다. 이러한 방법은 기존의 화학 합성법 또는 효소 합성법에 비해 탐색과정에서의 시간과 비용이 절약됨은 물론, 기존 항생제의 구조와 활성과의 관계 등을 응용하여 설계하기 때문에 생물학적 활성을 예상할 수 있어, 많은 시간과 비용을 절감할 수 있다.
폴리케타이드 계열의 화합물은 미생물로부터 생산되는 복잡한 구조의 화합물로서, 현재까지 약 10,000가지 이상의 화합물이 알려져 있다. 폴리케타이드 계열의 화합물은 폴리케타이드 신타아제(polyketide synthase, PKS)라고 하는 다기능 단백질 복합체(multifunctional protein complex)에 의해 생합성된다. 이러한 PKS 복합체는 연속적인 축합반응에 관여하는 여러 개의 모듈(한 번의 축합반응을 책임지는 촉매 도메인들의 묶음)로 구성되어 있다. 모듈(module)을 구성하는 촉매 도메인(catalytic domain)들의 구성에 따라 폴리케타이드의 구조가 일대일로 대응하여 생합성되므로 PKS 유전자의 변형에 의해 폴리케타이드의 구조를 변형시킬 수 있다.
한편, 마크롤라이드는 폴리케타이드 마크로락톤 환과 그에 부착된 하나 또는 그 이상의 데옥시당으로 구성된다. 상기 마크롤라이드는 스태필로코커스 및 엔테로코커스와 같은 그람-양성 박테리아에 대해 주로 항균 활성을 나타낸다. 마크롤라이드 중에서 데옥시당 부분(moiety)이 표적 분자와 특이적으로 접촉함으로써 분자의 생물학적 활성에 크게 영향을 미치기 때문에, 데옥시 당 부분의 구조가 중요하고, 따라서, 상기 언급한 PKS 유전자 변형에 의한 폴리케타이드 구조 변형 외에도 글리코실화와 같은 후-PKS 테일러링 단계(post-PKS tailoring step)가 반드시 필요하다. 마크롤라이드 계열 항생물질 저항성 병원체의 출현으로 인하여 신규 마크롤라이드 유도체를 발견하기 위한 연구가 계속되고 있다. 기존에는 화학적 및 효소적 합성을 이용한 연구가 많이 진행되어왔으나, 데옥시 당 부분의 화학적 수식 또는 뉴클레오티드-활성화되는 데옥시 당의 시험관 내 효소적 합성이 쉽지 않은 문제가 있다.
나르보마이신은 스트렙토마이세스 베네주엘래에서 형성되는 마크롤라이드 계열 물질로서, PikC에 의하여 네오-, 노바-, 및 피크로마이신으로 전환된다(도 1). 나르보마이신은 스태필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 피오제네스, 코리네박테리움 디프테리애, 그람-양성 코커스의 에리트로마이신-저항성 균주 등에 대한 우수한 활성을 가지는 것으로 보고되어 왔다. 천연 나르보마이신은 당 부분으로서 데옥시당 D-데소사민을 포함한다. 스트렙토마이세스 베네주엘래의 글리코실트랜스퍼라아제인 DesVII 및 그의 보조 상대인 DevVIII가 나르보마이신의 아글리콘(비당(非糖) 성분)인 나르보놀라이드로 TDP-데옥시 당을 전이시키고, 여섯 개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame) desI 내지 desⅥ은 데소사민 생합성에 관여하는 것으로 추정된다. 상기 단백질을 이용하여 시험관 내 및 생체 내에서 나르보마이신 유도체의 글리코실다양화를 유발할 수 있는 것으로 생각되었으나, 생체 내 조합 생합성의 방법으로 나르보마이신에 있어서 다양한 당 부분을 포함하는 나르보마이신 유도체를 합성하여 그의 항균 활성을 보고한 예는 없다.
이러한 배경에서, 본 발명자들은 다양한 당 생합성 관련 단백질의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 카세트를 제작하여 나르보놀라이드를 축적하는 스트렙토마이세스 베네주엘래에서 이종 발현시킴으로써 다양하고 신규한 나르보마이신 유도체를 생산할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 스트렙토마이세스 속 미생물로서, desVIII, desVII, desIII, desIV, desI, desII, desV, desVI, oleL, oleU, oleV, eryBII, urdR 및 oleW로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질의 조합 중 desVIII, desVII, desIII 및 desIV 단백질을 포함하는 단백질의 조합을 코딩하는 핵산이 도입된, 나르보마이신 유도체 생산 재조합 미생물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 desVIII-desVII-desIII-desIV, desVIII-desVII-desIII-desIV-oleL-oleU, desVIII-desVII-desIII-desIV-desI-desII, desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR 또는 desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU 의 단백질의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배양된 세포 또는 배양액으로부터 나르보마이신 유도체를 회수하는 단계를 포함하는 나르보마이신 유도체의 제조방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 나르보마이신 유도체 화합물, 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하고자 한다.
Figure 112011028161453-pat00001
상기 식에서 R은
Figure 112011028161453-pat00002
,
Figure 112011028161453-pat00003
,
Figure 112011028161453-pat00004
또는
Figure 112011028161453-pat00005
이다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항균용 조성물을 제공하고자 한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 스트렙토마이세스 속 미생물로서, desVIII, desVII, desIII, desIV, desI, desII, desV, desVI, oleL, oleU, oleV, eryBII, urdR 및 oleW로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질의 조합 중 desVIII, desVII, desIII 및 desIV 단백질을 포함하는 단백질의 조합을 코딩하는 핵산이 도입된, 나르보마이신 유도체 생산 재조합 미생물을 제공한다. 상기 단백질의 조합은 desVIII-desVII-desIII-desIV, desVIII-desVII-desIII-desIV-oleL-oleU, desVIII-desVII-desIII-desIV-desI-desII, desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR 또는 desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU 의 단백질의 조합일 수 있다.
본 발명에서 스트렙토마이세스 속 미생물은, 내재적으로 나르보마이신을 생합성할 수 있는 스트렙토마이세스 속 미생물을 의미한다. 상기 내재적으로 나르보마이신을 생합성할 수 있는 미생물이란, 내재적으로 나르보마이신 생합성에 필요한 모든 효소를 발현하는 미생물을 의미한다. 상기 "내재적"이란 야생형 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 활성을 의미한다. 본 발명에서 나르보마이신은 마크롤라이드 계열 물질로서, 도 1에 도시된 바와 같은 구조를 가진다.
본 발명의 스트렙토마이세스 속 미생물은 스트렙토마이세스 베네주엘래일 수 있으나, 이에 한정되지 않고 나르보마이신을 생산할 수 있는 모든 스트렙토마이세스 속 미생물을 포함한다. 스트렙토마이세스 베네주엘래는 유전자 조작이 쉽고 상대적으로 빠른 성장 속도 (doubling time, ca . 1 h)를 가지므로, 대사물질 생산을 위하여 필요한 배양 기간이 짧다. 상기 미생물은 단일 폴리케타이드 신타아제 (PKS) 및 다수의 PKS 후 수식 효소들 (데소사민 당의 생합성 및 전이에 연관된 des 클러스터에 의한 글리코실화 및 PikC P450 모노옥시게나아제에 의한 히드록실화)의 작용을 통하여 12- 및 14-원환 마크롤라이드, 메티마이신 및 피크로마이신을 모두 생산할 수 있다(도 1). 본 발명의 구체적 실시예에서, 스트렙토마이세스 베네주엘 래 ATCC 15439를 사용할 수 있다.
바람직하게는, 상기 스트렙토마이세스 속 미생물은, 내재적으로 나르보마이신을 생합성할 수 있는 스트렙토마이세스 속 미생물에서 나르보마이신의 당 부분인 D-데소사민을 생합성 및 전이시키는 단백질을 코딩하는 유전자 클러스터가 게놈으로부터 결실된 것일 수 있다. 나르보마이신의 당 부분을 생합성 및 전이시키는 단백질을 코딩하는 유전자 클러스터가 게놈으로부터 결실된 스트렙토마이세스 속 미생물은 나르보마이신의 아글리콘(비당(非糖) 성분)인 나르보놀라이드를 축적하게 된다. 상기 유전자 클러스터는 D-데소사민을 생합성 및 전이시키는데 필요한 단백질군을 코딩하는 유전자 클러스터(GenBank: AF079762.1)로서 desVIII-desVII-desIII-desIV-desI-desII-desV-desVI(서열번호 1)로 구성될 수 있다. 상기 미생물은 게놈으로부터 서열번호 1의 염기서열로 구성된 유전자 클러스터가 결실된 것일 수 있다.
게놈상에서 목적한 유전자만의 특이적 결실은 당 분야에서 확립된 방법을 통하여 수행할 수 있으며, 방법은 특별히 제한되지 않으며, 상동 재조합(homologous recombination)법을 사용할 수도 있다. 목적한 단백질의 N 말단과 C 말단을 코딩하는 핵산 사이에 선별마커를 포함하는 벡터로 스트렙토마이세스 속 균주를 형질전환시켜 게놈과 벡터 사이에 재조합을 유도할 수 있다. 사용되는 선별마커(selection marker)는 특별히 제한되지 않고, 약물 내성, 영양 요구성, 세포독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다.
바람직하게는 스트렙토마이세스 베네주엘래 YJ003을 사용할 수 있다. 상기 균주는 본 발명의 실시예에 기재된 방법에 의하여 제조할 수 있다.
본 발명은 나르보마이신 유도체 생산 경로에서 상기 단백질들이 수행하는 기능을 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 밝혀내었다. 또한, 상기 단백질의 다양하고 신규한 조합을 발현하는 재조합 미생물을 제조함으로써 변형된 당 부분을 가지는 신규 나르보마이신 유도체를 생합성하였고, 그들의 항균 활성도 평가하였다.
본 발명의 나르보마이신 유도체 생산에 필요한 단백질 서열정보는 GenBank: AF079762.1, AF055579.2, U77454.1, AF269227.1에서 확인할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 DesIII는 글루코오스-1-포스페이트를 기질로 하는 Nucleotidylyl transferase(NT)기능을 가지는 단백질로서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 DesIV는 4,6-데히드라타아제(4,6-dehydratase, 4,6-DH) 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 DesI은 아미노트랜스퍼라아제(aminotrasferase, AT) 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 DesII는 데아미나아제(deaminase, DA) 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 DesV는 아미노트랜스퍼라아제(aminotransferase, AT) 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 DesVI는 N-메틸트랜스퍼라아제(N-methyltransferase, N-MT) 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 7의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 OleL은 에피머라아제(epimerase, EP) 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 OleU는 4-케토리덕타아제(4-ketoreductase, 4-KR) 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 OleV는 2,3-데히드라타아제(2,3-dehydratase, 2,3-DH) 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 10의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 EryBII는 3-케토리덕타아제(3-ketoreductase, 3-KR) 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 11의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 UrdR은 4-케토리덕타아제(4-ketoreductase, 4-KR) 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 12의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 OleW는 3-케토리덕타아제(3-ketoreductase, 3-KR) 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 13의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 DesVIII는 DesVII의 보조 상대 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 14의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 DesVII은 글리코실트랜스퍼라아제 기능을 하는 단백질로서, 서열번호 15의 아미노산 서열을 가진다.
상기 단백질의 조합을 코딩하는 핵산을 도입하는 것은, 해당 핵산을 염색체상에 추가 도입할 수도 있고, 해당 핵산을 벡터 상에 자가 프로모터 또는 강화된 별개의 프로모터와 함께 도입할 수도 있다. 바람직하게는, 발현벡터를 사용해서 스트렙토마이세스 속 미생물을 형질전환시킬 수 있다. 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 재조합 미생물을 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법 등이 있다.
본 발명의 구체적 실시예에서, 재조합 미생물 YJ003/pDDSS(글리코실트랜스퍼라아제 유전자 desVIII/desVII와 함께 D-데소사민 [DDSS] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV-desI-desII-desV-desVI)을 발현하는 플라스미드), YJ003/pDQNV(desVIII/desVII와 함께 D-퀴노보오스 [DQNV] 생합성 유전자 조합(desIII - desIV)을 발현하는 플라스미드), 및 YJ003/pODDC(desVIII/desVII와 함께 3'-O-데메틸-D-찰코오스 [ODDC] 생합성 유전자 조합(desIII - desIV - desI - desII)을 발현하는 플라스미드)는 나르보마이신, D-퀴노보오실-나르보놀라이드(DQNVNB), 및 3'-O-데메틸-D-찰코오실-나르보놀라이드(ODDCNB) 을 각각 생산하였다 (도 2 내지 도 4). 그러나, 재조합 YJ003/pLRHM2(desVIII/desVII와 함께 L-람노오스 [LRHM] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV-oleL-oleU)을 발현하는 플라스미드)의 발효로부터 2개의 유도체인 L-람노오실-나르보놀라이드(LRHMNB) 및 DQNVNB가 동시에 생산되었다(도 3 및 도 4). 상기 균주에서의 DQNVNB의 동시 생산은 스트렙토마이세스 베네주엘래 경로와 독립적인 4-케토리덕타아제(SvRed)에 의해서 LRHM의 생합성 중간체인 4-케토-6-데옥시-D-글루코오스가 DQNV로 환원되었기 때문이다(도 2). 재조합 YJ003/pDDGT2(desVIII/desVII와 함께 D-디지톡소오스 [DDGT] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR)을 발현하는 플라스미드)는 D-디지톡소오실-나르보놀라이드(DDGTNB) 및 D-보이비노오실-나르보놀라이드(DBVNNB)를 생산하였고, 재조합 YJ003/pLOLV2(desVIII/desVII와 함께 L-올리보오스 [LOLV] 및 L-디지톡소오스 [LDGT] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU)을 발현하는 플라스미드)는 L-올리보오실-나르보놀라이드(LOLVNB), L-디지톡소오실-나르보놀라이드(LDGTNB), 및 DBVNNB를 생산하였다 (도 3 및 도 4). 두 균주에서 DBVNNB를 생산한 것은 천연 스트렙토마이세스 베네주엘래 3-케토리덕타아제가 D-디지톡소오스, L-올리보오스 및 L-디지톡소오스의 중간체로서 2,6-다이데옥시-3,4-다이케토-D-글루코오스를 인식하고, 다른 동정되지 않은 스트렙토마이세스 베네주엘래 4-케토리덕타아제에 의한 4-케토환원과 조합하여, C3에서 환원시켜 D-보이비노오스를 생산한 것으로 생각된다. YJ003/pLOLV2 에서 LOLVNB 및 LDGTNB가 동시에 생산된 것은 OleU 4-케토리덕타아제가 C-3 에서 C-4로의 토오토메리화(tautomerization) 때문에 형성된 TDP-4-케토-LOLV 및 TDP-4-케토-LDGT상에 작용하여 LOLV 및 LDGT를 각각 합성한 것으로 생각된다(도 2).
본 발명의 구체적 실시예에서 제조한 상기 재조합 미생물 중에서, pDDGT2(desVIII/desVII와 함께 D-디지톡소오스 [DDGT] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR)을 발현하는 플라스미드)가 도입된 재조합 미생물 및 pLOLV2(desVIII/desVII와 함께 L-올리보오스 [LOLV] 및 L-디지톡소오스 [LDGT] 생합성 유전자 조합(desIII - desIV - oleV - oleW - oleL - oleU)을 발현하는 플라스미드)가 도입된 재조합 미생물을 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2011년 3월 10일자로 각각 기탁번호 KFCC11507P, KFCC11508P로 기탁하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 desVIII-desVII-desIII-desIV, desVIII-desVII-desIII-desIV-oleL-oleU, desVIII-desVII-desIII-desIV-desI-desII, desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR 또는 desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU 의 단백질의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 "발현 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물로서, 이러한 유전자 작제물을 제조하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있다. 본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터의 종류는 원핵세포의 각종 숙주세포에서 목적하는 유전자를 발현하고, 목적하는 단백질을 생산하는 기능을 하면 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 발현 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자, 종결코돈 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA, 오퍼레이터 서열, 목적하는 유전자의 5측 및 3측의 비해독영역, 선별 마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 개시 코돈 및 종결코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일부로 간주될 수 있으며, 유전자 작제물이 도입되었을 때 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
본 발명의 구체적 실시예에서, desVIII-desVII-desIII-desIV의 단백질 조합을 코딩하는 핵산은 서열번호 16, desVIII-desVII-desIII-desIV-oleL-oleU의 단백질 조합을 코딩하는 핵산은 서열번호 17, desVIII-desVII-desIII-desIV-desI-desII의 단백질 조합을 코딩하는 핵산은 서열번호 18, desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR의 단백질 조합을 코딩하는 핵산은 서열번호 19, desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU 의 단백질 조합을 코딩하는 핵산은 서열번호 20일 수 있다.
또한, 본 발명의 구체적 실시예에서, pDQNV(desVIII-desVII-desIII-desIV의 단백질 조합을 코딩하는 서열번호 16의 핵산을 포함하는 발현벡터)는 도 7의 개열지도, pLRHM2(desVIII-desVII-desIII-desIV-oleL-oleU의 단백질 조합을 코딩하는 서열번호 17의 핵산을 포함하는 발현벡터)는 도 8의 개열지도, pODDC(desVIII-desVII-desIII-desIV-desI-desII의 단백질 조합을 코딩하는 서열번호 18의 핵산을 포함하는 발현벡터)는 도 9의 개열지도, pDDGT2(desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR의 단백질 조합을 코딩하는 서열번호 19의 핵산을 포함하는 발현벡터)는 도 10의 개열지도, pLOLV2(desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU의 단백질 조합을 코딩하는 서열번호 20의 핵산을 포함하는 발현벡터)는 도 11의 개열지도, pDDSS(desVIII-desVII-desIII-desIV-desI-desII-desV-desVI의 단백질 조합을 코딩하는 서열번호 1의 핵산을 포함하는 발현벡터)는 도 12의 개열지도를 가질 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배양된 세포 또는 배양액으로부터 나르보마이신 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 나르보마이신 유도체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 신규 나르보마이신 유도체를 생산하기 위한 미생물 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양할 수 있다. 미생물의 영양원으로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 영양원을 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 종래 스트렙토마이세스 속 박테리아의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용할 수 있다. 예를 들어, 말로닉산(malonic acid), 에탄올, 메치오닌(methionine), 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지에서 이루어지는 것이 바람직하다. 이때, 상기 탄소원은 전분, 포도당, 옥수수기름, 글리세롤, 말토스, 만노스 및 이노시톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하며, 전분, 포도당 및 옥수수기름인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 질소원은 면실밀, 옥수수 침지액, 옥수수 침지분, 대두분, 펩톤 및 효모엑기스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하며, 면실밀 및 옥수수침지액인 것이 가장 바람직하다. 종균배양액을 상기 배양 배지를 포함한 발효조에 식균하여 배양하였다. 배양방법으로는 호기적 조건에서는 진탕배양 혹은 정치배양이 가능하다. 배양온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하기는 하나, 보통 20-37℃에서 배양하는 것이 적당하며, 바람직하게는 26-30℃에서 배양할 수 있다. 또한, 배양기간 역시 당업계에서 사용되는 공지의 기간 동안 배양할 수 있으며, 필요에 따라 기간이 조정될 수 있다. 바람직하게 진탕배양, 정치배양의 경우 모두 4일 내지 7일간 배양할 수 있다.
배양된 세포 또는 배양액으로부터 나르보마이신 유도체를 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 수행할 수 있다. 상기 나르보마이신 유도체 회수 방법에는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 나르보마이신 유도체 화합물, 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 상기 화학식 1로 표시되는 나르보마이신 유도체 중 R이
Figure 112011028161453-pat00006
인 경우는 D-보이비노오실-나르보놀라이드(DBVNNB), R이
Figure 112011028161453-pat00007
인 경우는 D-디지톡소오실-나르보놀라이드 (DDGTNB), R이
Figure 112011028161453-pat00008
인 경우는 L-올리보오실-나르보놀라이드 (LOLVNB), R이
Figure 112011028161453-pat00009
인 경우는 L-디지톡소오실-나르보놀라이드 (LDGTNB)이다.
핵자기공명 스펙트럼을 이용하여 동정한 결과, 상기 화학식 1의 화합물은 신규 나르보마이신 유도체임을 확인하였다.
본 발명의 화합물은 용매화물 또는 전구약물(pro-drug) 형태일 수 있는데, 이는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 용매화물은 바람직하게는 수화물 및 에탄올화물을 포함한다.
본 발명에서의 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 화합물의 상대적으로 무독성인 무기 및 유기 산 부가염일 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1의 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 포함한다.
산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 석신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약제학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 염으로는 하이드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 하이드로브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 합성할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 방법을 사용하여 재조합 미생물로부터 생산할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다. 본 발명에서 "항균용 조성물"이란, 미생물의 생존 및/또는 증식을 억제하는 작용을 하는 조성물을 의미한다. 상기 조성물은 에리트로마이신-감수성 균주 및 에리트로마이신-저항성 균주에 대하여 항균 활성을 가지는 것일 수 있고, 구체적으로는, E. 파에시움 ATCC 19434, E. 파에시움 P00558, S. 아우레우스 ATCC 25923 및 S. 아우레우스 P00740로 구성된 군으로부터 선택된 미생물에 대하여 항균 활성을 가질 수 있다. 또한, 상기 조성물은 상기 미생물에 의하여 발생하는 감염성 질환을 치료할 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서의 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 대상 조성물 또는 성분을 하나의 기관, 또는 신체의 부분으로부터 다른 기관, 또는 신체의 부분으로의 운반 또는 수송하는 것에 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 제약상 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 지칭하며, 본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아린산 마그네슘 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제, 시럽제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 미생물 감염성 질환의 치료방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 이용하여 에리트로마이신-감수성 균주, 에리트로마이신-저항성 균주를 포함하는 미생물의 생존 및/또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명에서의 용어 "치료"란, 질환의 발병을 억제하거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, 특히 약리학적 활성 물질에 의해 야기되는 동물, 특히 포유류, 및 더욱 특별히 인간에서의 국소적 또는 전신적인 효과를 가리킨다.
본 발명의 구체적 실시예에서, DQNVNB는 S. 아우레우스 P00740의 성장을 저해하는 데에 있어서는 나르보마이신보다 효과적이었다. LOLVNB는 S. 아우레우스 ATCC 25923에 대하여 선택적 활성을 나타내었는 바, LOLVNB의 3'-가로방향(equatorial)-히드록실기가 항균 활성에 긍정적 영향을 미친다는 것을 의미한다. LRHMNB는 강력한 활성 (1.25 - 2.50 μM)을 나타내었다. ODDCNB의 항균 활성(2.5 - 5.0 μM)은 나르보마이신 (10 - 20 μM) 및 DQNVNB (≤ 10 μM) 보다 우수하였다. DBVNNB (≤ 10 μM) 는 E. 파에시움 ATCC 19434, P00558, 및 S. 아우레우스 ATCC 25923에 대하여 높은 항균 활성을 나타내었는 바, 이는 DBVNNB의 4'-세로방향(axial)-히드록실기가 MIC를 감소시킨다는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 국부, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 등으로 투여될 수 있고, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 질병 종류 및 중증도, 연령, 성별, 투여방법, 표적 세포, 발현 정도 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 생산 방법을 통하여 생체 내 조합 생합성의 방법으로 나르보마이신에 있어서 다양한 당 부분을 포함하는 나르보마이신 유도체를 합성할 수 있고, 특히 신규하고 항균 활성이 우수한 다양한 나르보마이신 유도체를 합성할 수 있다.
도 1은 스트렙토마이세스 베네주엘래로부터 나르보마이신이 생합성되는 경로 및 나르보마이신의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 방법에 의하여 변형된 당 부분을 포함하는 나르보마이신 유도체가 생합성되는 경로를 나타낸다. 상기 생합성에 관여하는 단백질의 기능을 괄호안에 표시하였다. NT, 뉴클레오티딜릴 트랜스퍼라아제; 4,6-DH, 4,6-데하이드라타아제; 2,3-DH, 2,3-데하이드라타아제; AT, 아미노트랜스퍼라아제; DA, 데아미나아제; EP, 에피머라아제; 4-KR, 4-케토리덕타아제; N-MT, N-메틸트랜스퍼라아제; 3-KR, 3-케토리덕타아제; SvRed, 스트렙토마이세스 베네주엘래 경로 독립적인 리덕타아제.
도 3은 나르보마이신 및 그의 유도체의 구조를 나타낸다.
도 4는 스트렙토마이세스 베네주엘래 균주의 배양액으로부터의 HPLC-ESI-MS 크로마토그램을 나타낸다. (A) YJ003/pDDSS로부터 검출된 나르보마이신 ([M + H]+ = 510). (B) YJ003/pDQNV로부터 검출된 DQNVNB ([M + NH4]+ = 516). (C) YJ003/pLRHM2로부터 검출된 LRHMNB ([M + NH4]+ = 516) 및 DQNVNB ([M + NH4]+ = 516). (D) YJ003/pODDC로부터 검출된 ODDCNB ([M + NH4]+ = 500). (E) YJ003/pDDGT2로부터 검출된 DBVNNB ([M + NH4]+ = 500) 및 DDGTNB ([M + NH4]+ = 500). (F) YJ003/pLOLV2로부터 검출된 DBVNNB ([M + NH4]+ = 500), LOLVNB ([M + NH4]+ = 500), 및 LDGTNB ([M + NH4]+ = 500).
도 5는 나르보마이신의 당 부분의 NOE(Nuclear Overhauser effect) 상관관계를 나타낸다.
도 6은 des 클러스터가 결실된 스트렙토마이세스 베네주엘래 결실 돌연변이체를 제조하기 위한 유전자 구조체의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 7은 pDQNV(desVIII-desVII-desIII-desIV의 단백질 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터)의 개열지도이다.
도 8은 pLRHM2(desVIII-desVII-desIII-desIV-oleL-oleU의 단백질 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터)의 개열지도이다.
도 9는 pODDC(desVIII-desVII-desIII-desIV-desI-desII의 단백질 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터)의 개열지도이다.
도 10은 pDDGT2(desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR의 단백질 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터)의 개열지도이다.
도 11은 pLOLV2(desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU의 단백질 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터)의 개열지도이다.
도 12는 pDDSS(desVIII-desVII-desIII-desIV-desI-desII-desV-desVI의 단백질 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터)의 개열지도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
박테리아 균주, 배양 조건, 및 유전자 조작
스트렙토마이세스 베네주엘래의 원형질체 제조 및 형질전환은 Kieser, T. et al.의 방법에 따라 수행하였다(Kieser, T. et al., 2000, Practical Streptomyces genetics. John Innes Centre, Norwich, United Kingdom). 스트렙토마이세스 베네주엘래의 형질전환체는 티오스트렙톤으로 보충된 R2YE 아가 플레이트에서 선택하였다. 스트렙토마이세스 베네주엘래 재조합 균주는 SPA 아가(효모 추출물 1 g, 소고기 추출물 1 g, 트립토오스 2 g, 글루코오스 10 g, 미량의 황산철, 및 아가 15 g/리터) 상에서 증식시켰다. 스트렙토마이세스 베네주엘래 ATCC 15439, 스트렙토마이세스 안티비오티커스 ATCC 11891, 및 사카로폴리스포라 에리트래아 NRRL 2338 를 이용하여 게놈 DNA를 획득하였다.
대장균(E. coli) DH5α 및 플라스미드 Litmus28 (New England Biolabs)을 이용하여 일반적인 서브클로닝을 하였다. 구성 ermE * 프로모터 (Schmitt-John, T. et al., 1992. Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:493-498) 및 티오스트렙톤 저항성 마커를 포함하는 고효율(high-copy-number) 대장균-스트렙토마이세스 셔틀 벡터 pSE34 (Yoon, Y. J. et al., 2002. Chem. Biol. 9:203-214)를 이용하여 데옥시당 및 그들의 부착물의 생합성에 연관된 유전자를 발현시켰다.
des 클러스터-결실 돌연변이체의 제조
복제 플라스미드-매개 상동 재조합(replicative plasmid-mediated homologous recombination) 방법(Xue et al., PNAS USA, 95:12111, 1998)을 통하여, 데소사민 생합성이 결실된 스트렙토마이세스 베네주엘래 결실 돌연변이체(YJ003)를 제조하였다.
플라스미드는 카나마이신 내성 유전자, aphⅡ(Ward et al., Mol. Gen. Genet., 203:468, 1986)를 가지고 있으며, 전체 des 클러스터 대신에 상기 des 클러스터의 업스트림(upstream)과 다운스트림(downstream) 양측면에 위치한 DNA 단편 (flanking DNA fragment)을 가지도록 제조하였다(도 6). 유전자 교체를 위한 구조체(construct)는 원형질체 형질전환(protoplast transformation)을 통해 스트렙토 마이세스 베네주엘래로 삽입된 pKC1139(Bierman, M. et al., Gene, 116:43-9, 1992)를 사용하여 제조하였다. 스트렙토마이세스 베네주엘래 ATCC 15439를 상기 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환하였다. 각 형질전환체로부터 얻어진 포자는 카나마이신 선별 아가 플레이트에서 배양하고, 사이클(cycle)은 재조합 가능성을 증대시키기 위하여 3번 반복하였다. 카나마이신-저항성 및 아프라마이신-민감성 표현형을 얻기 위해 목표 유전자를 aphⅡ로 교체한 이중교차(crossover)를 선별 및 스크린하고, 돌연변이 유전자형을 게놈 DNA 서던 블럿 혼성화로 확인하였다.
des 결실 플라스미드(pYJ003)를 제조하기 위하여, SphⅠ으로 자른 스트렙토마이세스 베네주엘래 게놈 DNA를 주형(template)으로 하고, 사용한 5'-des 클러스터 측면에 위치한 부분을 가진 1kb HindⅢ-PstⅠ단편은 서열번호 21 및 22를 프라이머로 사용하고, 3'-des 클러스터 측면에 위치한 부분을 가진 1kb KpnⅠ-EcoRⅠ단편은 서열번호 23 및 24를 프라이머로 사용하여, PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 반응성분은 주형 DNA 100ng, 각 프라이머 30pmol, pfu DNA polymerase 2.5unit, 각 dNTP 2mM, Tris-HCl 20mM, (NH4)2SO4 10mM, KCl 10mM, Triton X-100 1%, BSA 1mg/ml, MgSO4 20mM 및 DMSO 10%로, 이들을 섞어서 총 부피가 50㎕가 되도록 하였다.
서열번호 21 (forward): 5'-GGCAAGCTTAGCGGGGCGACTGGCGTGCCCACT-3'
서열번호 22 (reverse): 5'-GGTCTGCAGTCACCGTGGGTTCTGCCATCTCTT-3'
서열번호 23 (forward): 5'-GCTGGTACCGGATGTTCCCTCCGGGCCACCGTC-3'
서열번호 24 (reverse): 5'-TGAGAATTCCCTCGCCGTCCTGCCCGCGCTTGG-3'
발현 플라스미드 및 스트렙토마이세스 베네주엘래 재조합 균주의 제조
복수의 데옥시당 생합성 유전자를 포함하는 DNA 절편을 특이적인 데옥시올리고뉴클레오티드 프라이머 및 주형 DNA를 이용하여 PCR로 증폭하였다 (표 1). PCR은 제조자의 추천 조건 하에서 Pfu 폴리머라아제 (Fermentas)를 이용하여 수행하였다.
프라이머 서열(5'-3') 제한효소 DNA 기원
(GenBank accession No.)
desVIII - VII F TTAATTAAGATATCACCGGCAAGGAAGGACACGACGCC (서열번호 25) PacI-EcoRV Streptomyces venezuelae ATCC 15439
(GenBank AF079762.1)
desVIII - VII R TCTAGACATATGGCGCAGATACAGGGGTGAGGCCTG (서열번호 26) NdeI-XbaI
desI - II F TTAATTAAACTAGTATCGATGACGGTGGCCCGGAGGG (서열번호 27) PacI-SpeI-ClaI Streptomyces venezuelae ATCC 15439
(GenBank AF079762.1)
desI - II R TCTAGATGCGGGTCAGCGCAGGAAGCCGCG (서열번호 28) XbaI
desIII - IV F TTAATTAAACTAGTTAACTCGCCACGCCGACCGTT (서열번호 29) PacI-SpeI Streptomyces venezuelae ATCC 15439
(GenBank AF079762.1)
desIII - IV R TCTAGAGAGCTCCTCGTAGGCGGCCTT (서열번호 30) XbaI
desV F TTAATTAAACTAGTCAGGTCTCCTTCGCGGACGGCCTC (서열번호 31) PacI-SpeI Streptomyces venezuelae ATCC 15439
(GenBank AF079762.1)
desV R TCTAGAACCTGACTAGGCCTGGTCGACCCG (서열번호 32) XbaI
desVI F TTAATTAAACTAGTCCCCAGGCCTCACCCCTGTATCTG (서열번호 33) PacI-SpeI Streptomyces venezuelae ATCC 15439
(GenBank AF079762.1)
desVI R TCTAGAGAATTCGCTCAGGCGGGGACGCCGACGAAG (서열번호 34) XbaI-EcoRI
oleL F TTAATTAAACTAGTATCGATATCGCTCCGAGCCCGAAGGGA (서열번호 35) PacI/ SpeI/ClaI Streptomyces antibioticus ATCC 11891
(GenBank AF055579.2)
oleL R TCTAGAGCCGGCCAGTACGAGGGCCTT (서열번호 36) XbaI
oleU F TTAATTAAACTAGTGTACCGCGACAACCGC (서열번호 37) PacI/ SpeI S. antibioticus ATCC 11891
(GenBank AF055579.2)
oleU R TCTAGAGAAGAGGGCCAGGTCGTGCACGC (서열번호 38) XbaI
oleV F TTAATTAAACTAGTATCGATGGGAATCGCGGAAGCG (서열번호 39) PacI/SpeI/ClaI S. antibioticus ATCC 11891
(GenBank AF055579.2)
oleV R TCTAGAATCAGCTCAGGGCCTGGATGC (서열번호 40) XbaI
eryBII F TTAATTAAACTAGTGGTCGTCGGCATCTGCG (서열번호 41) PacI/SpeI Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338
(GenBank U77454.1)
eryBII R TCTAGACTCGGTTCCTCTTGTGCTCACTGC (서열번호 42) XbaI
urdR F TTAATTAAACTAGTACAGAGATCCAGGACGACGCA (서열번호 43) PacI/ SpeI pYJ146
urdR R TCTAGATCAGATACGGACGGCGGAGGT (서열번호 44) XbaI
oleW F TTAATTAAACTAGTAAGGGAACCCCATGCCCTCCC (서열번호 45) PacI/SpeI S. antibioticus ATCC 11891
(GenBank AF055579.2)
oleW R TCTAGAATCAGCACCAGCGCACCCGCGCCA (서열번호 46) XbaI
pYJ146는 Hong, J. S. et al., 2004. FEMS Microbiol. Lett. 238:291-299에 기재되어 있음.
상기 다양한 데옥시당을 가지는 나르보놀라이드의 글리코실화에 연관되는 유전자들을 복제형 플라스미드 pSE34에 클로닝하였다. 다양한 유전자를 포함하는 플라스미드를 효율적으로 제작하기 위하여 하나의 유전자를 포함하는 PacI/XbaI 절편을 타 유전자를 포함하는 PacI/SpeI-절단되는 Litmus28에 연결하였다. 상기 절차는 나르보놀라이드가 글리코실화 나르보놀라이드로 전환되는데 필요한 모든 유전자들이 Litmus28 내에서 조합되고 PacI/XbaI로 절단되는 pSE34내로 이동될 때까지 회귀적으로 반복되었다. 조합된 유전자 배열을 표 2에 요약하였다.
플라스미드 유전자 조합 생산물
pDDSS desIII - desIV - desI - desII - desV - desVI 나르보마이신
pDQNV desIII - desIV DQNVNB
pLRHM2 desIII - desIV - oleL - oleU DQNVNB
LRHMNB
pODDC desIII - desIV - desI - desII ODDCNB
pDDGT2 desIII - desIV - oleV - eryBII - urdR DDGTNB
DBVNNB
pLOLV2 desIII - desIV - oleV - oleW - oleL - oleU LOLVNB
LDGTNB
DBVNNB
pDDSS를 제작하기 위하여, DesVII/DesVIII 글리코실트랜스퍼라아제/보조 단백질 쌍 및 TDP-D-데소사민 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 Litmus28에 순차적으로 클로닝하여 pDDSS_lit28를 제조하였다. pDDSS_lit28의 삽입 DNA를 PacI/XbaI 로 절단하고 pSE34에 연결하여 pDDSS를 제조하였다.
pDQNV를 제작하기 위하여, ClaI/EcoRI-절단되는 pDDSS_lit28를 Klenow 절편을 이용하여 둔단으로 만들고 연결하여 desVIII - desVII - desIII - desIV를 포함하는 PacI/XbaI 절편을 pSE34로 클로닝하였다.
다양한 데옥시당의 생합성 및 그들의 전이를 명령하는 다수의 플라스미드(pLRHM2, pODDC, pDDGT2, 및 pLOLV2)를 제작하기 위하여, 다양한 당 유전자 카세트를 포함하는 ClaI/XbaI 절편을 독립적으로 ClaI/XbaI-절단하는 pDDSS_lit28로 클로닝하였다. 제조된 플라스미드의 PacI/XbaI 절편을 pSE34로 각각 클로닝하고, 해당 플라스미드를 스트렙토마이세스 베네주엘래 결실 돌연변이체(YJ003)에 도입하였다. 구체적으로, pDDSS(글리코실트랜스퍼라아제 유전자 desVIII/desVII와 함께 D-데소사민 [DDSS] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV-desI-desII-desV-desVI)을 발현하는 플라스미드)를 도입하여 재조합 미생물 YJ003/pDDSS를 제조(나르보마이신 생산); pDQNV(desVIII/desVII와 함께 D-퀴노보오스 [DQNV] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV)을 발현하는 플라스미드)를 도입하여 재조합 미생물 YJ003/pDQNV를 제조(D-퀴노보오실-나르보놀라이드(DQNVNB) 생산); pODDC(desVIII/desVII와 함께 3'-O-데메틸-D-찰코오스 [ODDC] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV-desI-desII)을 발현하는 플라스미드)를 도입하여 재조합 미생물 YJ003/pODDC를 제조(3'-O-데메틸-D-찰코오실-나르보놀라이드(ODDCNB) 생산); pLRHM2(desVIII/desVII와 함께 L-람노오스 [LRHM] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV-oleL-oleU)을 발현하는 플라스미드를 도입하여 재조합 미생물 YJ003/pLRHM2를 제조(L-람노오실-나르보놀라이드(LRHMNB) 및 DQNVNB 생산); pDDGT2(desVIII/desVII와 함께 D-디지톡소오스 [DDGT] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR)을 발현하는 플라스미드를 도입하여 재조합 미생물 YJ003/pDDGT2를 제조(D-디지톡소오실-나르보놀라이드(DDGTNB) 및 D-보이비노오실-나르보놀라이드(DBVNNB) 생산); pLOLV2(desVIII/desVII와 함께 L-올리보오스 [LOLV] 및 L-디지톡소오스 [LDGT] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU)을 발현하는 플라스미드를 도입하여 재조합 미생물 YJ003/pLOLV2를 제조(L-올리보오실-나르보놀라이드(LOLVNB), L-디지톡소오실-나르보놀라이드(LDGTNB), 및 DBVNNB 생산)하였다.
제조한 상기 재조합 미생물 중에서, pDDGT2(desVIII/desVII와 함께 D-디지톡소오스 [DDGT] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR)을 발현하는 플라스미드)가 도입된 재조합 미생물 및 pLOLV2(desVIII/desVII와 함께 L-올리보오스 [LOLV] 및 L-디지톡소오스 [LDGT] 생합성 유전자 조합(desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU)을 발현하는 플라스미드)가 도입된 재조합 미생물을 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2011년 3월 10일자로 각각 기탁번호 KFCC11507P, KFCC11508P로 기탁하였다.
HPLC - ESI - MS 분석 of 나르보마이신 및 그의 글리코실화 유도체
스트렙토마이세스 베네주엘래 배양물에서 생산된 마크롤라이드를 SPE를 이용하여 추출하여 대사물질을 고성능액체크로마토그래피-전자분무이온화-질량분석기 (high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry, HPLC-ESI-MS)로 분석하였다. 각 배양물을 원심분리하였다(10분동안, 5,000 x g). 5 ml 메탄올 및 5 ml 물로 미리 처리된 OASIS HLB (Waters, Milford, MA) SPE 칼럼으로 상등액을 통과시켰다. 칼럼을 5 ml 20% (vol/vol) 메탄올로 세척하고 ca . 30 초동안 공기건조시켰다. 칼럼을 1 ml 0.5% (vol/vol) 메탄올 아세트산으로 3회 용출하였다. 분석 HPLC-ESI-MS를 양이온 모드에서 Waters Nova-Pak C18 칼럼 (150 x 3.9 mm, 5μm)을 사용하여 Waters/Micromass Quattro micro/MS 인터페이스에서 수행하였다. 분석대상물질을 250 μl/분 유속에서 5 mM (wt/vol) 암모늄 아세테이트의 농도 구배를 이용하여 -0.05% (vol/vol) 아세트산 수용액(용액 A) 및 동일한 추가 농도를 가지는 80% (vol/vol) 아세토니트릴 (ACN) (용액 B) 으로서 25분 동안 20 내지 70% 용액 B, 15분 동안 용액 B 90%까지, 9분 동안 90% 용액 B 유지, 및 11분 동안 칼럼 재-평형을 위하여 용액 B 20%까지 - 용출하였다. 다양한 발현 플라스미드를 함유하는 6개의 스트렙토마이세스 베네주엘래 재조합 미생물의 SPE 추출물의 HPLC-ESI-MS 분석 결과, 나르보마이신 및 나르보마이신의 7개의 글리코실화 유도체를 검출하였다(도 4).
나르보마이신 및 그의 글리코실화 유도체의 추출, 분리 및 확인
크로마토그래피 분리를 제조용 Spherisorb S5 ODS2 (Waters, 250 x 20 mm, 5 μm) 또는 반-제조용 Watchers 120 ODS-BP (250 x 10 mm, 5 μm, Daiso, Osaka, Japan) 칼럼 상에서 역상 HPLC를 이용하여 수행하였다. 1H, 상관 분광법 (COSY), 이종핵간 다중 결합 상관 (HMBC), 이종핵 단일 양자 상관 (HSQC), 및 핵 오버하우저 효과 분광법 (NOESY) NMR 스펙트럼을 Varian INOVA 500 분광계 (Varian, Inc., Palo Alto, CA)를 이용하여 500 MHz 에서 기록하였다. 13C NMR 스펙트럼을 동일한 기계 상에서 125 MHz 에서 기록하였다. 각각의 용매 피크와 관련하여 화학적 시프트가 보고되었다 (CDCl3에 대하여 δH 7.27 및 δc 77.0; CD3OD에 대하여 δH 3.30 및 δc 49.0).
나르보마이신-생산 균주 스트렙토마이세스 베네주엘래 YJ003/pDDSS의 전체 배양액 (0.5 L)을 원심 분리하고, 상등액 층을 에틸 아세테이트(Et2OAc)를 이용하여 용매-용매 분배되도록 하였다. 획득된 추출물을 증발시킨 결과 생성된 갈색 잔여물을 구배 용출을 이용하는 제조용 HPLC를 이용하여 분별하였다. 분석대상물질을 0.1% 수성 아세트산 (용액 C) 및 아세토니트릴-아세트산 (99.9:0.1, v/v) (용액 D)의 농도 구배를 이용하여 0부터 15 분까지 용액 D 15%까지, 53 분에서 용액 D 35%까지, 58 분에서 용액 D 60%까지, 63 - 73 분 동안 다시 15% 용액 D로 5 ml/분의 유속으로 용출하였다. 나르보마이신 포함 분획을 이동상으로서 3 ml/분 30% 수성 CAN을 이용하는 반-제조용 HPLC를 사용하여 더욱 정제하여 비정질의 흰색 고체인 순수한 화합물을 생산하였다(0.67 mg; 머무름 시간(Rt), 37.6 분; 화학식; ESI-MS [M + H]+ 510; NMR 데이타는 하기 표 3).
Figure 112011028161453-pat00010
D-퀴노보오실-나르보놀라이드(DQNVNB)-생산 균주 YJ003/pDQNV의 전체 배양액 (1.0 L)을 유사하게 처리하여 갈색의 물질을 획득하였다. 상기 잔여물을 구배 용출 (30 분까지 30% 수성 ACN, 40 - 80 분 동안 50% 수성 ACN, 및 81 - 90 분 동안 다시 30% 수성 ACN)을 이용하는 반-제조용 HPLC를 이용하여 2 ml/분의 유속으로 분별하였다. DQNVNB 포함 분획을 이동상으로서 2 ml/분 30% 수성 ACN을 이용하는 반-제조용 HPLC를 사용하여 더욱 정제하여 비정질의 흰색 고체인 순수한 화합물을 생산하였다(4.25 mg; 머무름 시간(Rt), 25.8 분; 화학식; ESI-MS [M + NH4]+ 516; NMR 데이타는 하기 표 4).
Figure 112011028161453-pat00011
L-람노오실-나르보놀라이드(LRHMNB)-생산 균주 YJ003/pLRHM2의 전체 배양액 (0.5 L)으로부터 획득한 잔여물을 구배 용출 (55 분까지 35% 수성 ACN, 55 - 65 분 동안 60% 수성 ACN, 및 70 - 80 분 동안 다시 35% 수성 ACN)을 이용하는 제조용 HPLC 를 이용하여 6 ml/분의 유속으로 분별하였다. LRHMNB 포함 분획을 이동상으로서 30% 수성 ACN을 이용하는 반-제조용 HPLC를 사용하여 정제하여 순수한 화합물을 생산하였다(0.54 mg; 머무름 시간(Rt), 25.2 분; 화학식; ESI-MS [M + NH4]+ 516; NMR 데이타는 하기 표 5).
Figure 112011028161453-pat00012
a: HSQC 및 HMBC 스펙트럼에 기초한 수치
3'-O-데메틸-D-찰코오실-나르보놀라이드(ODDCNB)-생산 균주 YJ003/pODDC의 전체 배양액 (1.0 L)을 동일한 방식으로 처리하였다. 잔여물을 이동상으로서 45% 수성 ACN을 5 ml/분의 유속으로 이용하는 제조용 HPLC 를 이용하여 분별하였다. ODDCNB 포함 분획을 이동상으로서 30% 수성 ACN을 2 ml/분의 유속으로 이용하는 반-제조용 HPLC를 사용하여 정제하여 순수한 화합물을 생산하였다(2.44 mg; 머무름 시간(Rt), 29.6 분; 화학식; ESI-MS [M + NH4]+ 500; NMR 데이타는 하기 표 6).
Figure 112011028161453-pat00013
D-디지톡소오실-나르보놀라이드(DDGTNB) 및 D-보이비노오실-나르보놀라이드 (DBVNNB)-생산 균주 YJ003/pDDGT2의 전체 배양액 (14.6 L)을 유사하게 처리하고 최종 잔여물을 구배 용출 (45 분까지 40% 수성 ACN, 50 - 60 분 동안 45% 수성 ACN, 및 65 - 75 분 동안 다시 40% 수성 ACN)을 이용하는 제조용 HPLC 를 이용하여 6 ml/분의 유속으로 분별하였다. DBVNNB 및 DDGTNB 포함 분획을 35% 수성 ACN을 2 ml/분의 유속으로 이용하는 반-제조용 HPLC 칼럼에 각각 통과시켜 순수한 DBVNNB (9.16 mg; 머무름 시간(Rt), 29.3 분; 화학식; ESI-MS [M + NH4]+ 500; NMR 데이타는 하기 표 7) 및 DDGTNB (4.18 mg; 머무름 시간(Rt), 31.2 분; 화학식; ESI-MS [M + NH4]+ 500; NMR 데이타는 하기 표 8)를 각각 생산하였다.
Figure 112011028161453-pat00014
Figure 112011028161453-pat00015
a: HSQC 및 HMBC 스펙트럼에 기초한 수치
L-올리보오실-나르보놀라이드(LOLVNB) 및 L-디지톡소오실-나르보놀라이드 (LDGTNB)-생산 균주 YJ003/pLOLV2의 전체 배양액 (2.5 L)으로부터 획득한 잔여물을 구배 용출 (30 분까지 30% 수성 ACN, 40 - 80 분 동안 40% 수성 ACN, 및 81 - 90 분 동안 다시 30% 수성 ACN)을 이용하는 반-제조용 HPLC 를 이용하여 2 ml/분의 유속으로 분별하였다. LOLVNB 포함 분획을 이동상으로서 35% 수성 ACN을 2 ml/분의 유속으로 이용하는 반-제조용 HPLC 칼럼에 통과시켜 순수한 화합물(0.55 mg; 머무름 시간(Rt), 28.7 분; 화학식; ESI-MS [M + NH4]+ 500; NMR 데이타는 하기 표 9)을 생산하였다.
Figure 112011028161453-pat00016
a: HSQC 및 HMBC 스펙트럼에 기초한 수치
LOLVNB 및 LDGTNB-생산 균주 YJ003/pLOLV2의 전체 배양액 (21.6 L)을 이전의균주와 동일하게 처리하여 생산된 잔여물을 구배 용출 (50 분까지 38% 수성 ACN, 55 - 75 분 동안 42% 수성 ACN, 및 76 - 85 분 동안 다시 38% 수성 ACN)을 이용하는 제조용 HPLC 를 이용하여 6 ml/분의 유속으로 분별하였다. LDGTNB 포함 분획을 이동상으로서 35% 수성 ACN을 2 ml/분의 유속으로 이용하는 반-제조용 HPLC 칼럼에 통과시켜 순수한 화합물(1.81 mg; 머무름 시간(Rt), 31.0 분; 화학식; ESI-MS [M + NH4]+ 500; NMR 데이타는 하기 표 10)을 생산하였다.
Figure 112011028161453-pat00017
a: HSQC 및 HMBC 스펙트럼에 기초한 수치
나르보마이신 및 그의 유도체 구조 규명
분리된 대사물질들의 구조를 NMR 분광법 (1H, 13C, COSY, HSQC, 및 HMBC)을 이용하여 추론하였다. DQNVNB의 13C NMR 데이타를 통하여 나르보마이신과 같은 14-원 마크롤라이드 글리코시드에서 확인할 수 있는 26 탄소의 존재를 확인하였다. COSY, HSQC, 및 HMBC 스펙트럼을 포함하는 2D NMR 데이타의 해석 결과, DQNVNB의 전체 구조를 구상할 수 있었다. 1H NMR 스펙트럼을 통하여 7개의 메틸기 (δH 1.35/ H3-16, 1.30/ H3-6', 1.30/H3-17, 1.10/H3-19, 1.08/H3-20, 0.98/H3-18, 및 0.89/H3-15), 2개의 메틸렌기 (δH 1.48, 1.19/H2-7 및 1.61, 1.52/H2-14), 5개의 메타인(methine) 양성자 (δH 3.82/H-2, 2.89/H-4, 2.81/H-8, 2.72/H-12, 및 1.80/H-6), 7개의 산소 공급된 메타인 양성자 (δH 4.94/H-13, 4.34/H-1', 4.16/H-5, 3.46/H-3', 3.34/H-5', 3.33/H-2', 및 3.16/H-4'), 및 2개의 올레핀 양성자 (δH 6.65/H-11 및 6.05/H-10)에 대한 신호를 확인하였다. COSY 스펙트럼을 통하여 아노머 양성자 (δH 4.34/H-1') 내지 H-6' (δH 1.30)로부터의 6-데옥시헥소오스에 대한 것을 포함하는 5개의 스핀 시스템을 확인하였다. 6-데옥시헥소오스 당의 존재는 13C NMR 및 HSQC 스펙트럼을 통하여 δc 103.1/C-1'에서의 아노머 탄소와 함께 4개의 산소 공급된 탄소 (δc 76.9/C-3', 75.5/C-4', 74.7/C-2', 72.0/C-5') 및 δc 17.8/C-6' 에서의 메틸 신호를 검출함으로써 재차 확인하였다. HMBC 스펙트럼에서, 아노머 양성자 (δH 4.34/H-1')는 탄소 C-5 (δc 78.8)와 연관되어 있었고, 이는 당이 C-5에 부착된 것을 의미한다. 더욱이, 각각의 탄소와 메틸 양성자의 주요 HMBC 상관관계는 그들의 위치를 확인시켜 주었다.
글리코실화의 메커니즘이 알려진 것이라면(입체화학이 반전 또는 보존), 당의 입체배치는 아노머 양성자의 커플링 상수로부터 결정될 수 있다. 글리코실트랜스퍼라아제 DesVII는 활성화된 당의 아노머 탄소에서의 입체화학을 반전시킴으로써 당을 전이시킨다. 따라서, 아노머 양성자에 대한 큰 커플링 상수(ca . 7 Hz)를 가지는 글리코시드는 4C1 입체구조에서 가로방향의(equatorial) β-글리코시드 연결된 D-당을 포함하는 것을 의미하고, 작은 커플링 상수 (< 5 Hz)는 세로방향의(axial) α-글리코시드 결합을 가지는 1C4 입체구조를 가지는 L-당을 의미한다. 올바른 입체구조 (4C1)는 H-1' 및 H-5' 사이의 NOE 크로스 피크를 통하여 재차 확인될 수 있다. 그 결과, 당이 4C1 입체구조를 가지는 D-퀴노보오스로 확인되었다. 아노머 양성자의 큰 커플링 상수 (J 1' ,2' = 7.0 Hz)를 통하여 세로 방향 위치를 확인하였고, 따라서, Klyne의 법칙에 따라 β-글리코시드 연결된 D-당으로 확인되었다. 큰 커플링 상수(J 2' ,3' = 9.0 Hz, J 3' ,4' = 9.0 Hz, 및 J 4' ,5' = 9.0 Hz)는 H-2', H-3', H-4', 및 H-5' 양성자가 세로 방향으로 위치한다는 것을 의미한다. 더욱이, H-1' 및 H-5' 사이의 NOE 상관관계(도 5)가 4C1 입체구조를 뒷받침한다.
ODDCNB의 1D 및 2D NMR 데이타는 DQNVNB와 유사하였다. 이는 상기 물질 역시 나르보마이신 유도체라는 것을 의미한다. 유일한 차이점은 당에서 추가적인 메틸렌기의 존재이고, 이는 다이데옥시헥소오스임을 의미한다. COSY 스펙트럼에서, 양성자 H-1' (δH 4.31)는 H-3' (δH 3.70)에 커플링된 H-2' (δH 3.25)에 커플링되어 있음을 확인하였다. 양성자 H-3'는 메틸렌 H-4' 양성자 (δH 1.95 및 1.42)에 커플링되었고, 차례로 H3-6' 양성자(δH 1.25)에 커플링된 H-5' 양성자 (δH 3.62)에 커플링되어 있음을 확인하였다. 이는 4,6-다이데옥시헥소오스 부분의 존재를 의미한다. 커플링 상수에 의하면, 양성자 H-2', H-3', 및 H-5'는 세로 방향인 것으로 확인되었다. 이는 당이 3-O 데메틸-찰코오스임을 의미한다. 큰 커플링 상수 (J 1' ,2' = 7.5 Hz)는 일반적으로 4C1 입체구조에서 D-당에 대하여 β-글리코시드 결합을 의미한다. 이것은 H-1' 및 H-5' 사이의 NOE 크로스 피크(도 5)에 의하여 뒷받침된다. 이러한 방법으로, 상기 획득된 1D 및 2D NMR 데이타는, 당 부분이 C-5에 부착된 3-O-데메틸-D-찰코오스임을 나타낸다.
DBVNNB의 NMR 데이타는 ODDCNB와 유사하였다. 이는 다이데옥시헥소오스 당을 포함하는 나르보마이신 유도체의 존재를 의미한다. COSY 스펙트럼에서, 아노머 양성자 H-1' (δH 4.81, dd, J = 8, 4.5 Hz)는 H-3' (δH 4.11)에 커플링된 메틸렌 양성자 (H2-2': δH 1.78/1.80)에 커플링되어 있음을 확인하였다. 양성자 H-3' H-4' (δH 3.26)에 커플링되었고, 또한 차례로 H3-6' 양성자(δH 1.24)에 커플링된 H-5' (δH 4.05)에 커플링되어 있음을 확인하였다. 이는 당 부분이 2,6-다이데옥시헥소오스임을 의미한다. 아노머 양성자의 큰 커플링 상수(δH 4.81, dd, J 1' ,2' = 8.0, 4.5 Hz)는 가로방향의 β-글리코시드 결합을 의미하고 따라서, 4C1 입체구조에 있어서 입체화학이 D-당으로 결정되었다. H-3' (J = 3 Hz) 및 H-4' (brs)의 작은 커플링 상수는 상기 두 양성자가 모두 가로방향으로 위치하고 각각의 히드록실기가 세로방향이라는 것을 의미한다. 따라서, 당은 D-보이비노오스로 확인되었고 상기 데이터는 공지된 보고에 잘 부합하였다. 또한, 4C1 입체구조는 H-1' 및 H-5' 사이의 NOE 크로스 피크(도 5)를 통하여 확인되었다.
DDGTNB의 NMR 데이타는 당 양성자의 커플링 상수에서의 차이를 제외하고는 DBVNNB와 유사하였다. NMR 데이터에 기초하여 다이데옥시당은 D-디지톡소오스로 확인되었고, 아노머 양성자의 큰 커플링 상수(J 1' ,2' = 9.5 Hz)는 세로방향의 양성자를 가지는 β-글리코시드 연결된 D 당을 나타낸다. 1H NMR 스펙트럼은 e,a 및 e,e 커플링에 일반적인 H-3' 의 작은 커플링 상수 (δH 4.11, m, J = 3 Hz)를 통하여 3'-OH기의 세로방향을 확증해주었고, 따라서, 디지톡소오스 및 올리보오스 당을 구별하기 위하여 유용하였다. 이축 커플링 (J 4' ,5' = 9.5 Hz)이 H-4' 및 H-5'사이에서 관찰되었는 바, 이는 가로방향의 5'-CH3 및 4'-OH를 의미한다. 디지톡소오스 당의 4C1 입체구조 (D-당에 일반적인)는 H-1' 및 H-5' 사이의 NOE 상관관계를 이용하여 확인하였다(도 5).
LOLVNB의 NMR 데이타는 H-3' (δH 3.90, ddd, J =12.0, 9.0, 5.0 Hz)에 대한 커플링 상수 및 스플릿 패턴에서의 주요 변화를 제외하고는 DDGTNB와 유사하였다. 커플링 상수 J 3' ,2' ax = 12.0 Hz 및 J 3' ,4' = 9.0 Hz는 H-3' 양성자가 세로방향으로 위치하는 반면 3'-OH가 가로방향으로 위치한다는 것을 의미한다. 따라서, DDGTNB에서 디지톡소오스인 것과 달리, 당 부분이 올리보오스로 확인되었다. 당의 입체배치는 아노머 양성자의 커플링 상수(J = 3 Hz) 및 NOE 크로스 피크(도 5)를 통하여 L-올리보오스로 결정되었다.
LDGTNB의 1H NMR 스펙트럼은 당 부분의 화학적 시프트에 있어서의 약간의 차이를 제외하고는 DDGTNB와 유사하였다. 가장 현저한 차이는 아노머 양성자 신호 (δH 5.03, brs, J 1' ,2' = 3 Hz)이고, 이는 DDGTNB (δH 4.84, J 1' ,2' = 9.5 Hz)에서와 달리, 세로방향의 글리코시드 연결의 존재를 의미한다. 1D 및 2D NMR 데이타는 LDGTNB의 구조를 뒷받침하였다. 또한, 1H NMR 스펙트럼은 커플링 상수 (J 3' ,4' = 3.0 Hz 및 J 4',5' = 10.0 Hz)를 통하여, 가로방향의 H-3' 및 세로방향의 H-4' 및 H-5'를 확인하여, 디지톡소오스 당으로 확인하였다. NOESY 스펙트럼에서, DDGTNB에서 관찰된 H-1' 및 H-5' 사이의 NOE 상관관계 대신에, H-2'ax (δH 1.91, dt, J = 15.0, 3.5 Hz) 및 H-4' (δH 3.15, dd, J = 10.0, 3.0 Hz) 양성자 사이의 상관관계가 관찰되었다(도 5). 따라서, H-1'부터 C-5까지의 HMBC 크로스 피크에 의하여 측정된 바와 같이 당을 C-5 (δC 78.5)에 부착된 L-디지톡소오스로 확인하였다. 상기 데이타는 L-디지톡소오스에 대하여 보고된 데이터에 잘 부합되었다.
HPLC-ESI-MS 및 1D (1H 및 13C) 및 2D (COSY, HMBC, HSQC, 및 NOESY) NMR 데이터를 통하여 나르보마이신 및 LRHMNB를 확인하였다. 상기 화합물에 있어서 당의 입체배치(configuration) 및 입체구조(conformation)를 커플링 상수 및 NOE 크로스 피크를 통하여 결정하였다.
임상적 균주의 분리 및 항균제 감수성 측정
에리트로마이신-저항성 균주 E. 파에시움 P00558 및 S. 아우레우스 P00740를 대한민국 대구에 소재한 3차 대학병원에서 분리하였다. 상기 분리물을 속 및 종 동정 및 항균제 감수성 측정을 위하여 MicroScan WalkAway 96 시스템 (Dade Behring, West Sacramento, CA)를 이용하여 처리하였다. MicroScan 그람 양성 MIC/콤보 (PC1A) 패널 (Dade Behring), 그람 음성 MIC/ 콤보 (NC44) 패널 (Dade Behring), 및 그람 음성 구분점(breakpoint) 콤보 (NBC39) 패널 (Dade Behring)을 이용하여 항균제 감수성 및 E. 파에시움 및 S. 아우레우스의 종 레벨을 각각 동정하였다. 시험을 위한 접종물 현탁액을 동일한 깨끗한 18- 내지 24-시간-계대배양 플레이트를 이용하여 같은 날에 처리하였다. 미량희석 항균제 감수성 시험을 위하여 Prompt Inoculation 시스템-D (Dade Behring)를 이용하여 접종물을 표준화하였다. 모든 항균제 감수성 시험은 최신 Clinical and Laboratory Standards Institute 방법에 따라 수행하였다. 품질 관리는 S. 아우레우스 ATCC 25923를 이용하여 관찰하였다.
항균 활성 어세이
에리트로마이신-감수성 균주 E. 파에시움 ATCC 19434 및 S. 아우레우스 ATCC 25923 및 에리트로마이신-저항성 균주 E. 파에시움 P00558 및 S. 아우레우스 P00740를 이용하여 중성의 데옥시당을 포함하는 나르보마이신 및 그의 유도체의 항균 활성을 측정하였다. 에리트로마이신을 대조군으로서 사용하였다. 박테리아 세포 (2 x 107 /ml)를 LB 또는 Mueller-Hinton 배지에 접종하고 96-웰 미세적정 플레이트로 0.1 ml/웰씩 나누었다. MIC를 National Committee for Clinical Laboratory Standards에 따른 항생제의 연속 2배 희석을 이용하여 측정하였다. 37 ℃에서 접종 24시간 후, 시험 개체의 성장을 방해하는 최소 항생제 농도를 MIC로서 결정하였다. 성장은 미세적정 ELISA Reader (Molecular Devices Emax, CA) 를 이용하여 620 nm에서의 흡광도를 관찰함으로써 어세이하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
물질
 MIC (μM)
ATCC
19434		 P00558 ATCC
25923		 P00740
나르보마이신 10 10 10 20
DQNVNB 10 10 10 <10
LRHMNB 2.5 2.5 <2.5 1.25
ODDCNB 5 5 2.5 5
DBVNNB <10 10 10 20
DDGTNB 10 <20 <20 20
LOLVNB 10 20 5 10
LDGTNB 10 20 10 20
에리트로마이신 10 >20 10 >40
D-데소사민 포함 나르보마이신은 에리트로마이신-감수성 균주에 대하여 에리트로마이신 (10 μM) 과 유사한 항균 활성을 나타내었다. 반면 에리트로마이신-저항성 균주에 대하여는 에리트로마이신 (> 20 μM)보다 더 높은 활성 (10 - 20 μM)이 관찰되었다. DQNVNB는 E. 파에시움 ATCC 19434, E. 파에시움 P00558, 및 S. 아우레우스 ATCC 25923에 대하여 개선된 활성을 나타내지 않았지만, S. 아우레우스 P00740의 성장을 저해하는 데에 있어서는 나르보마이신보다 효과적이었다. LOLVNB는 S. 아우레우스 ATCC 25923에 대하여 선택적 활성을 나타내었다. 본 실험예에서, LRHMNB는 강력한 활성 (1.25 - 2.50 μM)을 나타내었다. ODDCNB 역시 모든 균주에 대하여 유의적인 활성 (2.5 - 5.0 μM)을 나타내었다. LRHMNB 의 시험관 내 항균 활성(1.25 - 2.50 μM) 을 LOLVNB 의 그것(5 - 20 μM)과 비교한 결과, LRHMNB의 2'-히드록실기의 구조-활성 정보를 확인하였고, 이는 항균 활성의 가장 중요한 결정 요인일 수 있다. ODDCNB의 항균 활성(2.5 - 5.0 μM)은 나르보마이신 (10 - 20 μM) 및 DQNVNB (≤ 10 μM) 보다 우수하였다. 이는 나르보마이신의 3'-다이메틸아미노 기가 3'-히드록실기로 교체된 것 및 DQNVNB에 있는 4'-히드록실기가 없는 것이 ODDCNB의 항균 활성을 개선시킨 것임을 확인하였다. S. 아우레우스 ATCC 25923 및 P00740에 대한 LOLVNB (5 - 10 μM) 및 LDGTNB (10 - 20 μM)의 MIC를 비교한 결과, LOLVNB의 3'-가로방향(equatorial)-히드록실기가 항균 활성에 긍정적 영향을 미친다는 것을 의미한다. DBVNNB (≤ 10 μM) 는 E. 파에시움 ATCC 19434, P00558, 및 S. 아우레우 스 ATCC 25923에 대하여 DDGTNB (< 20 μM) 보다 더 높은 항균 활성을 나타내었는 바, 이는 DBVNNB의 4'-세로방향(axial)-히드록실기가 MIC를 감소시킨다는 것을 의미한다.
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Claims (16)

  1. desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR 또는 desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU 의 단백질의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR의 단백질 조합을 코딩하는 핵산은 서열번호 19; 또는 desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU 의 단백질 조합을 코딩하는 핵산은 서열번호 20인, 발현 벡터.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR의 단백질의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터는 도 10의 개열지도로 표시되고; 또는 desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU 의 단백질의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터는 도 11의 개열지도로 표시되는 것인, 발현 벡터.
  6. 내재적으로 나르보마이신을 생합성하는 스트렙토마이세스 속 미생물에서 나르보마이신의 당 부분인 D-데소사민을 생합성 및 전이시키는 단백질을 코딩하는 유전자 클러스터를 게놈으로부터 결실시킨 스트렙토마이세스 속 미생물로서, desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-eryBII-urdR 또는 desVIII-desVII-desIII-desIV-oleV-oleW-oleL-oleU 의 단백질의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1항의 발현 벡터가 도입된, 하기 화학식 1로 표시되는 나르보마이신 유도체 생산 재조합 미생물:
    [화학식 1]
    Figure 112013109746713-pat00050

    상기 식에서 R은
    Figure 112013109746713-pat00051
    ,
    Figure 112013109746713-pat00052
    ,
    Figure 112013109746713-pat00053
    또는
    Figure 112013109746713-pat00054
    이다.
  7. 제6항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 속 미생물은 스트렙토마이세스 베네주엘래인, 재조합 미생물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 유전자 클러스터는 desVIII-desVII-desIII-desIV-desI-desII-desV-desVI인, 재조합 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 desVIII-desVII-desIII-desIV-desI-desII-desV-desVI는 서열번호 1의 서열을 갖는 것인, 재조합 미생물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 서열번호 19 또는 서열번호 20의 핵산서열을 포함하는 발현 벡터가 도입된 것인, 재조합 미생물.
  11. 제6항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 기탁번호 KFCC11507P 또는 KFCC11508P로 기탁된 것인, 재조합 미생물.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
    배양된 세포 또는 배양액으로부터 하기 화학식 1의 나르보마이신 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 나르보마이신 유도체의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure 112013109746713-pat00045

    상기 식에서 R은
    Figure 112013109746713-pat00046
    ,
    Figure 112013109746713-pat00047
    ,
    Figure 112013109746713-pat00048
    또는
    Figure 112013109746713-pat00049
    이다.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
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