KR20010086006A

KR20010086006A - 반코레스마이신, 이의 제조방법 및 약제로서의 이의 용도

Info

Publication number: KR20010086006A
Application number: KR1020017005727A
Authority: KR
Inventors: 라마크리슈나니로기벤카타사트야; 바트라비가야난; 스리쿠마르에이얌마디치일산카라나라야난; 비자야쿠마르에라코테스와라사트야; 나케르샨틸랄다야람; 오크우타라비나약; 탄푸레라젠드라프라카쉬; 호프만코르둘라; 쿠르츠미하엘; 빈크요아힘; 자이베르트게르하르트; 르벨레도미니크; 아조디조세프
Original assignee: 로버트 흐라이탁, 미쉘 베스트; 아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 1998-11-09
Filing date: 1999-11-04
Publication date: 2001-09-07
Also published as: CZ20011593A3; EP1129208A1; US6387943B1; TR200101279T2; HU224610B1; PL195995B1; DE69903465T2; SI1129208T1; AU761782B2; HK1041026A1; BR9915161A; HUP0104213A2; KR100623405B1; PT1129208E; JP2002529477A; HK1041026B; DE69903465D1; PL347658A1; CN1325656C; UA70974C2

Abstract

본 발명은 미생물 HIL-006734(DSM 12216)을 배양하여 수득할 수 있는 반코레스마이신이라 불리는 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 반코레스마이신의 제조방법, 미생물 HIL-006734(DSM 12216), 반코레스마이신과 약제학적으로 허용되는 이의 염의 약제로서의 용도, 특히 항생제로서의 용도, 및 반코레스마이신과 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이기도 하다.

화학식 I

Description

반코레스마이신, 이의 제조방법 및 약제로서의 이의 용도 {Vancoresmycin, a process for its production and its use as a pharmaceutical}

본 발명은 미생물 HIL-006734(DSM 12216)를 배양하여 수득할 수 있는 반코레스마이신이라 불리는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염과 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 반코레스마이신의 제조방법, 미생물 HIL-006734(DSM 12216), 반코레스마이신과 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체의 약제, 특히 항생제로서의 용도 및 반코레스마이신 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이기도 하다.

메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(Methicillin resistant Staphylococcus aureus; MRSA) 감염은 외상 및 화상과 같은 몇가지 감염 상태에서 두드러진 것으로 공지되어 있다. 글리코펩타이드류에 속하는 반코마이신과 테이코플라닌이 MRSA 감염을 치료하는 데 임상적으로 사용되는 유일한 2가지 항생제이다. 그러나, 최근 반코마이신- 및 테이코플라닌-내성 균종의 출현으로 인해, 이러한 감염이 위협적이고 치명적인 것으로 보고되고 있다. 이에 따라, 이러한 반코마이신과 테이코플라닌 내성 균종에 대해 활성을 나타내는 구조적으로 상이한 그룹의 화합물에 대한 집중적인 연구가 시작되었다. 예를 들면, 초기에 사이클릭 티오펩타이드인 메틸설포마이신 I이 반코마이신- 및 테이코플라닌-내성 균종에 대해 활성을나타내는 항생제인 것으로 기재되어 있다(1996년 7월 11일자로 출원된 유럽 특허공보 제0818539호).

본 발명에 이르러, 반코레스마이신이라고 불리우는 신규한 화합물이 항생 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 모든 입체이성체 형태와 호변이성체 형태를 포함하는 화학식 I의 화합물인 반코레스마이신과 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체, 예를 들면, 에스테르, 에테르 및 명확한 화학적 등가물에 관한 것이다.

반코레스마이신은 분자식 C₇₁H₁₂₆N₂O₂₁(분자량 1343.80)로 나타내며 후술하는 물리화학적 특성과 스펙트럼 특성, 예를 들면, 표 2에 제시되어 있는¹H NMR 분광분석 데이타 및¹³C NMR 분광분석 데이타 중의 하나 이상에 의해 구조를 확인할 수 있다.

반코레스마이신은 반코마이신- 및 테이코플라닌-내성 균종에 대해 활성을 나타내는 신규한 항생제로서 기술할 수 있다. 지금까지 아미노 당으로 치환된 고도로 산소화된 알킬 장쇄를 갖는 아실 치환체를 3번 위치에 갖는 테트라암산 잔기를 갖는 신규한 구조의 반코레스마이신은 보고된 바 없다. 케미칼 앱스트랙트 문헌 조사(Chemical abstract literature search)에서 반코레스마이신이 신규한 화합물임이 입증되었다. 다른 어떠한 화합물도 반코레스마이신의 구조적 특성들을 나타내지 않는다.

반코레스마이신은 배양 번호 HIL-006734라고 언급되는 미생물(이하 HIL-006734라고 함)을 배양하여 수득할 수 있다. 반코레스마이신을 생산하는 데 사용되는 이러한 미생물은 인도 국립 공원(National Park, Borivli, Mumbai, India)으로부터 수집한 토양 샘플로부터 분리하였다. 미생물 HIL-006734는 악티노마이세탈레스 목, 아미콜라톱시스 속에 속하며, 1998년 6월 4일자로 독일 브라운슈바이크 소재 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; 독일 미생물 및 세포 배양물 수탁 기관)에 기탁되어 DSM 12216이라는 수탁 번호를 부여받았다.

따라서, 본 발명은 또한 호기성 조건하에 하나 이상의 탄소 공급원과 하나 이상의 질소 공급원 및 임의의 영양소 무기 염 및/또는 미량 원소를 함유하는 영양 배지 속에서 아미콜라톱시스 종 HIL-006734, 이의 돌연변이체 및 변이체로부터 반코레스마이신이라고 불리우는 신규한 화합물을 제조하여 당해 화합물을 분리하고 통상의 방법으로 정제하는 방법을 제공한다.

미생물 ST101170의 돌연변이체 및 변이체로 본 발명에 따르는 화합물을 합성할 수도 있다. 이러한 돌연변이체는 물리적 수단, 예를 들면, 자외선 또는 X선을 사용한 조사 또는 화학적 돌연변이원, 예를 들면, 에틸메틸란설포네이트(EMS), 2-하이드록시-4-메톡시-벤조페논(MOB) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG)에 의해 공지된 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명에 따르는 화합물을 제조할 수 있는 적합한 돌연변이체 및 변이체의 선별은 배양 브로스에 축적된 화합물의 생물학적 활성을, 예를 들면, 항균 작용을 시험하여 측정함으로써 확인할 수 있다.

영양 배지는 탄소 공급원, 질소 공급원 및 영양소 무기염을 함유하는 것이 바람직하다. 탄소 공급원은 예를 들면, 전분, 글루코스, 수크로스, 덱스트린, 프럭토스, 당밀, 글리세롤, 락토오스 또는 갈락토스, 바람직하게는 전분이다. 질소 공급원은 예를 들면, 대두 가루, 땅콩 가루, 효모 추출물, 소고기 추출물, 펩톤, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 젤라틴 또는 카사미온산, 바람직하게는 펩톤 및 효모 추출물이다. 영양소 무기염은 예를 들면, 인산수소나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 염화칼슘, 탄산칼슘, 질산칼륨, 황산암모늄 또는 황산마그네슘, 바람직하게는 탄산칼슘, 염화나트륨 및 황산마그네슘이다.

HIL-006734의 배양은 25 내지 35℃의 온도와 6.0 내지 8.0의 pH에서 수행할 수 있다. HIL-006734를 30℃(±1℃), pH 7.0에서 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항생제를 최적 수율로 수득하고자 하는 경우에는, HIL-006734를 60 내지 96시간 동안 배양하는 것이 바람직하다. 침지된 조건하에서, 예를 들면,진탕 플라스크 및 실험실용 발효조 속에서 68 내지 96시간 동안 발효시켜 배양을 수행하는 것이 특히 바람직하다. 발효 및 반코레스마이신 형성의 진행 과정은 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 그리고 공지된 미생물 한천 플레이트 확산 분석법에 의해 스타필로코커스 및 엔테로코커스 종에 대한 배양 브로스의 생활성을 측정함으로써 검지할 수 있다. 바람직한 배양균은, 문헌에 보고된 δ-락탐 항생제인 메티실린에 대한 내성 균종인 스타필로코커스 아우레우스 3066, 및 반코마이신에 내성인 엔테로코커스 파에시움(E. faecium VR-1)이다. 생성된 배양 브로스에서, 반코레스마이신은 배양 여액 뿐만 아니라 균사체에도 존재하며 공지된 분리 기법을 사용하여 분리시킬 수 있다. 따라서, 이는 pH 5 내지 8에서 수 불혼화성 용매, 예를 들면, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 부탄올로 추출하거나 pH 5 내지 8에서 중합체성 수지, 예를 들면, "디아이온(Diaion) HP-20^R"(제조원; Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japan), "엠버라이트(Amberlite) XAD^R"(제조원; Rohm and Hass Industries U.S.A.), 활성탄 또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 배양 여액으로부터 회수할 수 있다. 에틸 아세테이트로 추출하는 방법이 바람직하다. 또한, pH 5 내지 8에서 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, n-프로판올 또는 이소프로판올과 같은 수 혼화성 용매나 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 부탄올과 같은 수 불혼화성 용매를 사용한 추출에 의해 균사체로부터 활성 물질을 회수할 수도 있으며, 에틸 아세테이트로 추출하는 방법이 바람직하다. 추출물을 농축하고 동결건조하여 조악한 활성 물질을 수득한다.

본 발명의 항생제 반코레스마이신은 예를 들면, 표준상 크로마토그래피(고정상으로서 알루미나 또는 실리카겔 사용, 용출제로서 석유 에테르, 에틸 아세테이트, 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 클로로포름, 메탄올 또는 이들의 배합물 사용, NEt₃과 같은 아민의 첨가), 역상 크로마토그래피[고정상으로서 디메틸옥타데실실릴 실리카겔, 소위 RP-18 또는 디메틸옥틸실릴 실리카겔, 소위 RP-8과 같은 실리카겔 사용, 용출제로서 물, 완충액, 즉, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트(pH 2 내지 8) 및 유기 용매(예를 들면, 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 테트라하이드로푸란 또는 이들의 배합물) 사용], 메탄올, 클로로포름, 아세톤, 에틸 아세테이트 또는 이들의 배합물 중의^R세파덱스(Sephadex) LH-20(제조원; Pharmacia Chemical Industries, Sweden), TSKgel^R토요펄(Toyopearl) HW(제조원; TosoHass, Tosoh Corporation, Japan) 또는 물 중의^R세파덱스 G-10 및 G-25와 같은 수지를 사용한 겔 투과 크로마토그래피, 또는 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올, 테트라하이드로푸란, 아세톤, 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 석유 에테르, 벤젠 및 톨루엔과 같은 2개 이상의 용매로 이루어진 2상 용출제 시스템을 사용한 역류 크로마토그래피 기법 중의 어느 것을 사용한 분별에 의해 조악한 물질로부터 회수할 수 있다. 이러한 기법들은 반복하여 사용하거나 상이한 기법들을 조합하여 사용할 수 있다. 바람직한 방법은 역상 실리카겔(RP-18) 상에서의 크로마토그래피이다.

반코레스마이신 화합물을 에스테르 및 에테르와 같은 약제학적으로 허용되는 염 및 유도체와 그외의 명백한 화학적 등가물로 전환시킬 수 있으며, 이들은 모두 본 발명에 포함된다. 염 및 유도체는 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 표준 방법에 의해 제조할 수 있다. 나트륨염 및 칼륨염과 같은 염은 예를 들면, 반코레스마이신을 적당한 나트륨 또는 칼륨 염기로 처리하여 제조할 수 있다.

에스테르 및 에테르는 예를 들면, 문헌(참조; Advanced Organic Synthesis, 4th Edition, J. March, John Wiley & Sons., 1992)에 기재된 방법으로 제조할 수 있다.

당 잔기의 아미노 그룹은 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 표준 방법에 의해 예를 들면, 산 클로라이드를 사용하여 알킬화 또는 아세틸화시킬 수 있다.

화학적 등가물은 금속 이온, 예를 들면, La³⁺, Sm³⁺, Eu³⁺, Gd³⁺와 같은 전이 금속과의 안정한 착물일 수 있으며, 이는 테트라암산 유도체에서 전형적이며, 문헌(참조; K. Tanaka et al., Chem. Pharm. Bull. 1979, 27, 1901, K. Matsuo, Chem. Pharm. Bull. 1980, 28, 2494)에 기재된 방법으로 제조할 수 있다.

알킬 측쇄의 이중 결합은 예를 들면, 문헌(참조; P. N. Rylander, "Hydrogenation Methods", Academic Press, New York(1985), Chpt. 2)에 기재된 방법에 의해 환원되거나 문헌(참조; H. O. House in "Modern Synthetic Reactions", W. A. Benjymin, Inc., New York(1972), pp. 446-452)에 기재된 방법에 의해 하이드로할로겐화될 수 있다. 이중 결합을 문헌(참조; Chem. Rev. 1980, 80, 187)에기재된 바와 같이 OsO₄와 같은 시약과 반응시켜 하이드록실화 유도체를 제조할 수 있다.

또한, 예를 들면, 문헌(참조; Advanced Organic Synthesis, 4th Edition, J. March, John Wiley & Sons., 1992)에 기재된 바와 같이 MCPBA를 사용한 산화에 의해 이중 결합을 에폭사이드로 전환시킴으로써 유도체를 형성할 수 있다.

반코레스마이신은 항균 활성을 갖는다. 광범위한 세균에 대한 반코레스마이신의 최소 억제 농도가 하기 표 3에 제시되어 있다. 반코레스마이신과 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체를 그자체로, 서로 혼합하여 그리고 비경구 투여할 수 있는 약제학적 조성물 형태로 약제로서 동물, 바람직하게는 포유 동물, 특히 사람에게 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 반코레스마이신과 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체 및 항균 활성을 갖는 약제를 제조하기 위한 반코레스마이신과 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체의 용도에 관한 것이기도 하다. 추가로, 본 발명은 유효량의 반코레스마이신 및/또는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 이의 염 및/또는 유도체와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

반코레스마이신은 경구, 근육내, 정맥내 또는 다른 투여 경로로 투여할 수 있다. 반코레스마이신 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체를 다른 약제학적 활성 성분과 함께 함유하는 약제학적 조성물은 활성 화합물을 하나 이상의 약리학적으로 허용되는 보조제 및/또는 부형제, 예를 들면, 충전제, 유화제, 윤활제, 차향제(masking-flavour), 착색제 또는 완충 성분과 혼합하여 이들 혼합물을정제, 피복정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 유제, 비경구 투여에 적합한 현탁제 또는 액제와 같은 적합한 약제 형태로 전환시켜 제조할 수 있다.

언급할 수 있는 보조제 및/또는 부형제의 예는 트라가칸트, 락토오스, 활석, 한천-한천, 폴리글리콜, 에탄올 및 물이다. 물 중의 현탁제 또는 액제가 비경구 투여에 적합하고 바람직하다. 활성 성분을 비히클 또는 희석제를 포함시키지 않는 적합한 형태, 예를 들면, 캡슐제로서 투여할 수도 있다.

통상적으로, 특수 경우에 적합한 투여량 뿐만 아니라 생약 제형화 및 투여 방법은 치료하고자 하는 종과 각각의 장애 또는 질환의 상태에 따라 좌우되며, 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 최적화시킬 수 있다. 평균적으로, 체중이 약 75kg인 환자에 있어서 활성 화합물의 1일 투여량은 0.001mg 이상 10mg 이하, 바람직하게는 1.0mg 이하이다.

다음은 본 발명의 예시적인 실시예이지만, 이것이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1

토양으로부터의 배양 번호 HIL-006734의 분리

a) 영양소 분리 배지의 조성

옥수수 전분 : 10.0g

카제인 : 1.0g

펩톤 : 1.0g

소고기 추출물 : 1.0g

K₂HPO₄: 0.5g

한천 분말 : 13.0g

탈염수 : 1.0ℓ

pH : 7.5

b) 토양 평판 배양 및 분리

인도 뭄베이 보리블리 소재의 국립 공원에서 수거한 토양 10g을 250㎖ 용량의 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 속에서 멸균수 90㎖에 가하여 회전식 진탕기(220rpm)에서 2시간 동안 진탕시킨다. 상기 토양 현탁액을 10 내지 10^-5의 단계로 연속적으로 희석시킨다. 최종 희석 단계로부터, 현탁액 1㎖를 멸균 유리 페트리 플레이트(직경 15cm)의 중앙에 놓고, 이에 항진균제로서 암포테리신 B 25㎍/㎖를 보충한 상기 분리 배지 약 50㎖를 부어 45℃로 냉각시키고 플레이트를 철저하게 회전시킨다. 토양 현탁액과 배지의 혼합물을 침강시켜 28℃(±1℃)에서 7일간 배양한다. 페트리 플레이트를 주기적으로 관찰하여 성장하는 미생물들 중에서 HIL-006734(배양 번호 Y-9439786)를 분리한다.

실시예 2

배양 번호 HIL-006734의 보관

보관 배지의 조성

HIL-006734는 다음의 배지에서 보관한다:

맥아 추출물 : 10.0g

글루코스 : 4.0g

효모 추출물 : 4.0g

악티디올 : 0.05g

한천 분말 : 13.0g

탈염수 : 1ℓ

pH : 7.0 내지 7.5

성분들을 가열하여 완전히 용해시킨 후, 생성된 용액을 시험관에 분배하여 121℃에서 20분 동안 멸균시킨다. 시험관을 냉각시켜 경사진 위치에서 고화시킨다. HIL-006734의 성장에 따라 와이어 루프에 의해 한천 경사면에 줄무늬가 생기며, 성장이 양호한 것으로 관찰될 때까지 이를 28℃(±1℃)에서 배양한다. 잘 성장한 배양물을 +8℃의 냉장고에 저장한다.

글리세롤 작용 시드(seed)의 제조

배지의 조성

효모 추출물 : 4.0g

수용성 전분 : 15.0g

K₂HPO₄: 1.0g

MgSO₄×7H₂O : 0.5g

탈염수 : 1ℓ

pH : 7.0

상기한 배지를 300㎖ 용량의 에를렌마이어 플라스크 속에 100㎖의 양으로 분배하여 121℃에서 20분 동안 오토클레이브시킨다. 플라스크를 실온으로 냉각시켜 상기한 한천 경사면에 접종한다. 180rpm의 회전식 진탕기 상에서 28℃에서 5일간 배양한다. 이들 배양물 1.5㎖를 글리세롤(99%) 1.5㎖와 혼합하여 -20℃에서 저장한다.

실시예 3

진탕 플라스크에서의 배양 번호 HIL-006734의 발효

시드 배지의 조성

글루코스 : 15.0g

대두 가루 : 15.0g

옥수수 침지액 : 5.0g

CaCO₃: 2.0g

NaCl : 5.0g

탈염수 : 1ℓ

pH : 6.8 내지 7.0

옥수수 침지액을 함유하거나 함유하지 않는 배지를 사용할 수 있다.

상기한 배지를 500㎖ 용량의 에를렌마이어 플라스크 속에 100㎖의 양으로 분배하여 20분 동안 오토클레이브시킨다. 플라스크를 실온으로 냉각시키고 위에 언급한 잘 성장한 실시예 2의 배양물을 다량으로 각각의 플라스크에 접종하여 240rpm의 회전식 진탕기 상에서 27℃(±1℃)에서 72시간 동안 진탕시켜 시드 배양물을 수득한다.

생산 배지의 조성

글루코스 : 20.0g

대두 가루 : 10.0g

CaCO₃: 0.2g

CoCl₂·6H₂O : 0.001g

탈염수 : 1ℓ

pH : 6.8

또는

전분 : 10.0g

글루코스 : 10.0g

글리세롤(99%) : 10.0g

옥수수 침지액 : 2.5g

펩톤 : 5.0g

효모 추출물 : 2.0g

NaCl : 1.0g

CaCO₃: 3.0g

탈염수 : 1ℓ

pH : 7.2(멸균 전)

생산 배지를 500㎖ 용량의 에를렌마이어 플라스크 속에 100㎖의 양으로 분배하여 121℃에서 20분 동안 오토클레이브시킨다. 플라스크를 실온으로 냉각시키고 위에 언급한 시드 배양액(2% v/v)을 접종한다. 240rpm의 회전식 진탕기 상에서 27℃(±1℃)에서 48시간 동안 발효시킨다. 공지된 방법으로 웰 확산법을 사용하여 스타필로코커스 아우레우스 3066과 엔테로코커스 파에시움 VR-1에 대한 생활성을 시험함으로써 항생제의 생성도를 측정한다.

실시예 4

발효조에서의 배양 번호 HIL-006734의 배양

진탕 플라스크에서의 시드 배양물의 제조

실시예 3의 시드 배지를 1000㎖ 용량의 에를렌마이어 플라스크 속에 150㎖의 양으로 분배하여 121℃에서 20분 동안 오토클레이브시킨다. 실시예 3에 기재한 바와 같이 이들 플라스크 속에서 시드 배양물을 성장시킨다.

대량 발효

생산 배지의 조성

글루코스 : 20.0g

대두 가루 : 10.0g

CaCO₃: 0.2g

CoCl₂·6H₂O : 0.001g

탈염수 : 1ℓ

pH : 7.0

또는

전분 : 10.0g

글루코스 : 10.0g

글리세롤(99%) : 10.0g

옥수수 침지액 : 2.5g

펩톤 : 5.0g

효모 추출물 : 2.0g

NaCl : 1.0g

CaCO₃: 3.0g

탈염수 : 1ℓ

pH : 7.2(멸균 전)

22ℓ 용량의 발효조(2개의 발효조) 중의 생산 배지 20ℓ와 12ℓ 용량의 발효조(2개의 발효조) 중의 생산 배지 9ℓ를 소포제로서의^R데스모펜(Desmophen) 1㎖(/10ℓ 발효조)와 함께 동일 반응계 내에서 121℃에서 40분 동안 멸균시켜 27℃(±1℃)로 냉각시키고 상기한 시드 배양액 1.5ℓ(/22ℓ 발효조) 또는 0.75ℓ(/12ℓ 발효조)를 접종한다.

발효는 다음의 파라미터에서 수행한다 :

온도 : 27℃(±1℃)

교반 : 200rpm

에어레이션 : 15rpm/22ℓ 발효조

10rpm/12ℓ 발효조

수확 시간 : 64시간

항생제의 생성도는 스타필로코커스 아우레우스 3066과 엔테로코커스 파에시움 VR-1에 대한 생활성을 시험하여 HPLC 분석함으로써 측정한다. 배양 브로스의 최종 pH는 7.0 내지 7.5이다. 배양 브로스를 수확하여 원심분리시키고 항생제를 실시예 5 또는 6에 기재된 방법으로 배양 여액 및 균사체로부터 분리하여 정제한다.

실시예 5

반코레스마이신의 분리 및 정제

배양 브로스(60ℓ)를 수확하고 원심분리하여 균사체(2.5㎏)와 배양 여액(50ℓ, pH 7.3)을 분리시킨다. 균사체를 메탄올(2×20ℓ)로 추출하고, 활성 추출물을 모아 감압하에 농축시켜 조 물질 70g을 수득한다. 2N 염산을 사용하여 배양 여액(50ℓ, pH 7.3)의 pH를 5.5로 조절하고 디아이온^RHP-20(2.5ℓ)의 컬럼에 통과시킨다. 컬럼을 물(10ℓ)로 세척한 다음 메탄올:물(1:1) 15ℓ로 세척한다. 활성 화합물이 메탄올:물(3:1) 15ℓ와 메탄올 용출액 30ℓ에 존재하는 것으로 나타났다. 스타필로코커스 아우레우스 3066과 엔테로코커스 파에시움 VR-1에 대한 생검에 의해 정제도를 모니터링한다. 활성 용출액을 모아 농축시켜 조 물질 15g을 수득한다. 합한 조 물질을 메탄올 중의 세파덱스(Sephadex)^RLH-20 컬럼(2.5cm×90cm) 상에서 반복적으로 크로마토그래피한 다음 활성 분획을 모아 농축시킨다. 이를 메탄올 중의 도요펄(Toyopearl)^RTSK HW 40F 컬럼(6cm×35cm) 상에서 더욱 크로마토그래피한다. 활성 분획을 모아 감압하에서 농축시켜 반순수 물질 3g을 수득한다. 다음의 조건을 사용하는 예비 HPLC에 의해 최종으로 정제한다:

25mm×250mm 히버-리크로스퍼(Hiber-Lichrospher) RP-18(67.5:32.5 비율의 메탄올:인산염 완충액(0.01M, pH 6.5) 10μ를 용출제로서 사용함) 상에서 23㎖/분의 유량과 220nm의 검출 파장에서 예비 HPLC에 의해 반정제 물질을 최종적으로 정제한다.

활성 용출액을 모아 감압하에 농축시켜 용매를 제거한 다음 디아이온^RHP-20(50㎖) 컬럼에서 탈염시키고, 아세토니트릴:물(80:20)로 용출시켜 감압하에 농축시키고 이를 동결건조하여 순수한 화합물 70㎎을 수득한다.

실시예 6

반코레스마이신의 분리 및 정제

배양 브로스(200ℓ)를 수확하고 원심분리하여 균사체와 배양 여액을 분리시킨다. 균사체를 메탄올(30 내지 40ℓ)로 완전 추출하여 추출물을 1:10으로 농축시켜 무색 침전물을 수득한 다음 이를 여과하여 조 물질 30 내지 50g을 수득한다. 이들 물질을 HPLC로 더욱 정제한다.

1) 컬럼 : 프랙토겔(Fractogel) TSK-HW 40(4ℓ, 500×100mm)

용출제 : MeOH

유량 : 20㎖/분

검출 : 204nm 및 236nm

125분 후에 활성 분획이 용출된다. 모은 분획을 감압하에 농축시켜 동결건조시킨다.

2) 컬럼 : 실리카겔 60(제조원; Merck); 에리마테크(Erimatech)(300×20mm, 100㎖)

용출제 : A) CH₂CHl₂:MeOH 9:1, B) CH₂Cl₂:MeOH 3:1 + 1% NEt₃, C) MeOH

구배 : 분 A(%) B(%) C(%)

0 100 0 0

23 100 0 0

24 0 100 0

51 0 100 0

52 0 0 100

93 0 0 100

유량 : 25㎖/분

검출 : 236nm 및 288nm

32분 후에 반코레스마이신 함유 분획이 용출된다. 모은 분획을 감압하에 농축시켜 동결건조시킨다. 2가지 정제 컬럼의 수율은 50%이다.

반코레스마이신의 물리-화학적 특성과 스펙트럼 특성이 표 1과 2에 기재되어 있으며, 다양한 세균에 대한 최소 억제 농도(MIC)는 표 3에 열거되어 있다.

화학식 I

Claims

입체이성체형과 호변이성체형을 포함하는 화학식 I의 반코레스마이신과 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체.

화학식 I
미생물 아미콜라톱시스 속 HIL-006734(DSM 12216) 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 중의 하나를 호기성 조건하에 탄소 공급원과 질소 공급원을 함유하는 영양 배지에서 배양한 다음, 통상적인 방법으로 분리 및 정제하여 수득되는, 입체이성체형과 호변이성체형을 포함하는 화학식 C₇₁H₁₂₆N₂O₂₁의 화합물인 반코레스마이신과 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체.
미생물 아미콜라톱시스 속 HIL-006734(DSM 12216) 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 중의 하나를 호기성 조건하에 탄소 공급원과 질소 공급원을 함유하는 영양 배지에서 배양한 다음, 통상적인 방법으로 분리 및 정제함을 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따르는 반코레스마이신 또는 이의 염 또는 유도체의 제조방법.
제3항에 있어서, 반코레스마이신을 적절한 시약과 반응시켜 약제학적으로 허용되는 염 또는 유도체를 형성함을 추가로 포함하는 방법.
아미콜라톱시스 속 HIL-006734(DSM 12216) 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 중의 하나.
제1항 또는 제2항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 반코레스마이신 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체.
제1항 또는 제2항에 따르는 반코레스마이신 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체 유효량과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항생제로서 사용하기 위한 반코레스마이신 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체.