CZ295749B6 - Způsob výroby 3-O-glykosylkolchikonových sloučenin - Google Patents

Abstract

Biologická transformace kolchikonových sloučenin na odpovídající 3-O-glykosylové deriváty použitím kmenů Bacillus megaterium. Způsob se vyznačuje vysokou polohovou selektivitou a vysokou účinností konverze.

Description

Způsob výroby 3-O-glykosylkolchikonových sloučenin

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká biotransformace kolchicinoidních sloučenin na odpovídající 3-O-glykosylové deriváty prováděné pomocí vybraných mikrobiálních kmenů. Způsob podle předkládaného vynálezu poskytuje sloučeniny glykosylované výlučně v poloze C-3 aromatického kruhu A, přičemž se vychází z citovaných kolchikonových sloučenin, s vysokými výtěžky a čistotou.

Sloučeniny získané biotechnologickým způsobem podle vynálezu, zvláště thiokolchikoson (3-O-glukosylthiokolchikon, viz vzorec (I), Ri = -OCH₃ a R₂ = -SCH₃), jsou účinné látky s pozoruhodnými farmakologickými vlastnostmi, vhodné zvláště pro výrobu nových antitumorových léčiv.

Dosavadní stav techniky

Při získávání vysoce specifických glykosylací sloučenin obecného vzorce I a příbuzných kolchicinoidních sloučenin, jak pomocí chemických reakcí, tak i použitím biotransformací, bylo dosaženo mnoha úspěchů.

Chemický způsob se skládá z řad komplexních nespecifických reakcí, jejichž použitím dochází k neselektivním reakcím na různých místech molekuly, což vede ke směsi glykosylovaných derivátů, z nichž některé jsou neaktivní. Proto jsou výtěžky konverze vedoucí k účinnému produktu glykosylovanému specificky v poloze C-3 aromatického kruhu velmi nízké.

Biologický přístup se v podstatě týká biologické transformace kolchicinoidních sloučenin (které jsou nepřímo příbuzné s kolchikonovými sloučeninami), jako je kolchicin a thiokolchicin, kulturou Centella asiatica, na monoglykosylované deriváty v poloze C-2 a C-3 aromatického kruhu; tato transformace nemá proto vysokou selektivitu a poskytuje zhoršené výtěžky a produktivitu (Solet, J. M. a další, Phytochemistry 33, 4, 817 - 820, 1993).

Další pokusy o biotransformací kolchicinoidních sloučenin poskytovaly jednoduché demethylace methoxylových skupin navázaných na aromatickém kruhu (v polohách C-2 a C-3), ale byly vždy charakterizovány omezenými výtěžky a produktivitou a špatnou polohovou selektivitou.

Hufford, C. D. a další (J. Pharm. Se., 68, 10, 1239 - 1242, 1979) s kmenem Streptomyces griseus a/nebo Streptomyces spectabilis a Bellet, P. a další (GB-923421, 1959), s použitím odlišných kmenů Streptomyces a jiných druhů bakterií a hub se pokoušeli transformovat kolchicin a jeho deriváty na odpovídající 3-demethylované deriváty. Výsledky těchto známých metod potvrzují zjištění uváděná výše v souvislosti s neselektivitou použitých mikrobiálních enzymů, například v polohách C-2, C-3 nebo C-10 molekuly alkaloidu. Navíc jsou produktivity uvedených katalytických systémů spíše špatné v důsledku nízkých konverzních výtěžků, snížených použitelných koncentrací substrátu a časté degradace tropolonového kruhu.

V poslední době získali Poulev, a další (J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33 - 38, 1995) specifickou demethylaci použitím bakteriálních mikroorganizmů, ale stále ještě s nízkými výtěžky a produktivitou.

Enzymová aktivita poskytovaná mikroorganizmy podobnými výše uváděným druhům (Streptomyces, Bacillus atd.) byla použita pro biotransformace jiných sloučenin, jako jsou maytansinoidy (patent US 4 361 650: Izawa, M. a další, J. Antibiotics, 34, 12, 1587 - 1590, 1981). Také v tomto

-1 CZ 295749 B6 případě spočívá katalyzovaná reakce výlučně v demethylaci charakterizované nízkými konverzními výtěžky a produktivitou.

Glykosyltransferázové aktivity s vysokou specifícitou vůči akceptoru (výlučně glukóza nebo glukosidy) α-amylázy z kmenů Bacillus megaterium byly popisovány v Brumm, P. J. a další, Starch, 43, 8, 319 - 323, 1991. Cyklodextrin-glukosyltransferázy produkované stejným mikrobiálním zdrojem katalyzují a-l,4-transglukosylaci rubusosidu (13-O-p-D-glukosyl-steviol β-D-glukosylesteru), přičemž se vychází ze škrobu. Také při této biologické přeměně je akceptorem při transferázové reakci glucidová frakce substrátu (Darise, M. a další, Agric. Biol. Chem., 48, 10, 2483 - 2488, 1984). Cyklodextrin-glykosyltransferázy byly v minulosti používány pro výrobu cyklodextrinů G6 a G8 ze škrobu (Kitahata, S., Okada, S., Agric. Biol. Chem., 38, 12, 2413-2417, 1974).

Tyto příklady svědčí o vysoké substrátové specifičnosti glukosyltransferázových aktivit exprimovaných Bacillus megaterium, která zahrnuje pouze glukosylové akceptory, a proto znemožňuje možné reakce na sekundárních metabolitech s odlišnou, komplexní molekulární strukturou, jako jsou kolchikony. Ve skutečnosti nejsou známy žádné příklady použití uvedených mikroorganizmů pro enzymovou přeměnu kolchikonových sloučenin na 3-glykosylové deriváty.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že určité kmeny Bacillus megaterium schopné růst v přítomnosti vysokých koncentrací kolchikonu (Ri = -OCH₃, R₂ = -OCH₃), 3-demethylkolchikonu a popřípadě jejich thioderivátů mají neobyčejně vysokou, velmi specifickou biotransformační aktivitu vzhledem k uvedeným látkám, přičemž vznikají deriváty glykosylované výlučně v poloze C-3 aromatického kruhu. Taková transformace probíhá ve velmi krátké době a je charakterizována překvapivě vysokými výtěžky.

Vynález se proto týká způsobu výroby 3-O-glykosylkolchikonových sloučenin vzorce I:

kde Ri je glykosidový zbytek, zvláště O-glykosidový zbytek; R₂ je C_I-C₆alkoxy nebo Ci-Cethioalkyl, který zahrnuje biologickou přeměnu sloučenin, ve kterých R] je OH nebo methoxy, pomocí Bacillus megaterium.

Bacillus megaterium je grampozitivní sporulující bakterie, která má průměr buňky větší než 1,0 pm; roste aerobně na celé řadě kultivačních médií; je pozitivní na katalázu; a hydrolyzuje želatinu. Kmeny Bacillus megaterium, které mohou být podle předkládaného vynálezu použity, se ukázaly jako schopné růst a udržovat životaschopnost i při vysokých koncentracích kolchikonu, thiokolchikonu (Ri = -OCH₃, R₂ =-SCH₃) a odpovídajících 3-demethylových derivátů (přibližně 2 g/1), jak bylo prokázáno sledováním růstu a mikroskopickou analýzou.

-2CZ 295749 B6

Příbuzné druhy, jako je Bacillus cereus, prokazatelně nesnadno rostou již při koncentracích substrátu 1 g/1 (absorbance 10 až 15 % ve srovnání s kontrolou).

Vysoká selektivita a účinnost biologické přeměny je překvapující a neobvyklá, protože výtěžky se pohybují od 70 % do 95 %.

Navíc si mikroorganizmy používané při biologické přeměně zachovávají katalytickou aktivitu stále i při opakovaných krocích fermentace, a proto poskytují specifickou biologickou přeměnu ve vsádkových i kontinuálních procesech. Tento způsob tedy poskytuje vysokou produktivitu a vysokou míru reprodukovatelnosti.

Významná polohová selektivita reakce zajišťuje navíc k pozoruhodným výtěžkům při výrobě vysokou jakost a čistotu výsledného produktu, který je poskytován ve 100% čistotě pomocí jednoduchého zpracování.

Dalšími důležitými výhodami je snížená spotřeba čištění a izolace produktu, ekonomičnost způsobu a spolehlivost a bezpečnost použití.

Pořadí kroků použitelných při způsobu podle předkládaného vynálezu je následující:

A) - Selekce kultur Bacillus megaterium schopných růstu v přítomnosti vysokých koncen- trací kolchikonového substrátu, přičemž se vychází z přírodních zdrojů nebo z kmenů ve sbírkách.

B) - Selekce izolátů získaných v kroku (A) pro hodnocení katalytické aktivity transformace na odpovídající 3-O-glykosylové deriváty pomocí testů biologické přeměny na specifických substrátech používaných v postupně stoupajících koncentracích.

C) - Mikrobiologická charakterizace kmenů vybraných při selekci v kroku (B).

D) - Postupné zvyšování výtěžku biologické transformace pomocí cílově specifické selekce bakteriální populace získané v kroku (B).

E) - Studie a optimalizace kritických parametrů fermentace pro optimalizaci biologické transformace.

F) - Studie a optimalizace způsobů konzervace kultur s vysokou produktivitou pro zajištění stabilního homogenního inokula pro produkční použití v průmyslovém měřítku.

G) - Převedení procesu do většího měřítka ve fermentoru, při vsádkovém způsobu, vsádko- vém způsobu s doplňováním živin a kontinuálních způsobech.

H) - Vyvinutí a optimalizace způsobů pro další zpracování a izolaci produktu.

Mikroorganizmy použitelné v rámci předkládaného vynálezu mohou být vybrány z kultur uložených ve sbírkách získaných z různých sbírek mikroorganizmů nebo ze vzorků půdy různého původu nebo z průmyslových kmenů, u kterých byla již provedena selekce, selektivní izolací na různých agarových médiích s obsahem zdroje organického dusíku (peptony, kvasničné extrakty, masové extrakty, asparagin apod.), zdroje uhlíku (glycerol, škrob, maltóza, glukóza apod.) s pH 5 až 8, s výhodou 6 až 7. Teplotní rozmezí inkubace je od 20 do 45 °C, s výhodou 28 až 40 °C.

Schopnost kultury růst v přítomnosti toxických koncentrací kolchikonového substrátu určeného k transformaci se vyhodnocuje metodami skalárního ředění a vysévání v paralelním uspořádání, na různých substrátech s agarem, přičemž do některých z nich se předem přidá kolchikonová

-3 CZ 295749 B6 sloučenina (např. 3-demethylthiokolchikon) v koncentracích od 0,1 do 3 g/1 (aby došlo k inhibici růstu větší části mikroorganizmů).

Kolonie schopné růstu v popsaných podmínkách se sterilně odeberou a umístí na dalších médiích s agarem pro ověření jejich čistoty a homogenity růstu.

Kultivační média používaná pro konzervaci kultury jsou typické mikrobiologické substráty obsahující organické zdroje dusíku (peptony, kvasničné extrakty, tryptony, masové extrakty apod.) zdroj dusíku (glukóza, maltóza, glycerol apod.) s pH 5 až 8, s výhodou 6 až 7. Inkubace se provádí v teplotním rozmezí od 20 do 45 °C, s výhodou 28 až 40 °C.

Vybrané mikroorganizmy se potom testují na schopnost růstu v submerzní kultuře v přítomnosti kolchikonových sloučenin a na schopnost transformace těchto sloučenin na odpovídající 3-glykosylové deriváty.

Uvedené testy se prováděly ve lOOml baňkách obsahujících 20 ml kapalného média, s různým složením média, s obsahem jednoho nebo více organických zdrojů dusíku (kvasničné extrakty, peptony, trypton, kaseinové hydrolyzáty, masový extrakt, kukuřičný výtažek (corn steep) apod.), nebo jednoho nebo více zdrojů uhlíku (glukóza, glycerol, škrob, sacharóza apod.), zdrojů anorganického fosforu a dusíku a anorganických solí různých iontů (K⁺, Na⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Fe⁺⁺, Mn⁺⁺ atd.).

Na vzorky kultury se může popřípadě působit pro získání mutací běžnými způsoby mutageneze (ozáření UV paprsky apod.) pro indukci mutantů, které mají určitou biokonverzní aktivitu, kterou je možno hodnotit stejnými způsoby jak bylo uvedeno dříve.

Vzorky kultury z každého testu biologické konverze byly analyzovány pro vyhodnocení produkce 3-glykosylových derivátů pomocí analýzy TLC a HPLC.

Schopnost mikroorganizmů po selekci transformovat kolchikonové substráty na odpovídající 3-glykosylové deriváty byla potvrzena testy biologické konverze v baňkách v měřítku 300 ml ve stejných kultivačních půdách jako byly použity při kroku selekce.

Při testech na optimalizaci biologické konverze byly použity mikroorganizmy, které poskytovaly pozitivní odpověď, přičemž testy byly prováděny v různých kultivačních půdách v měřítku 300 ml. Byly studovány následující hlavní kultivační a fermentační parametry: organické zdroje dusíku, zdroje uhlíku, minerální soli, teplota, míchání-aerace, pH, doba inkubace, inokulační poměr, kroky subkultivace, čas a forma přidání transformovaného substrátu. Bakteriální mikroorganizmy po selekci schopné uskutečňovat biotransformace podle předkládaného vynálezu mohou růst jak na pevných, tak i kapalných kultivačních substrátech obsahujících jeden nebo více zdrojů organického dusíku, s výhodou kvasničný extrakt, masový extrakt, pepton, trypton, kaseinové hydrolyzáty, kapalný kukuřičný extrakt apod. Zdroje uhlíku použitelné pro růst a biologickou transformaci jsou glukóza, fruktóza, sacharóza, glycerol, sladový extrakt apod., s výhodou glukóza, fruktóza a glycerol. Kultivační médium navíc obsahuje anorganické zdroje fosforu a soli K⁺, Na⁺, Mg⁺⁺, NH/ atd.

Mikroorganizmy vybrané selekcí mohou růst při teplotách od 20 do 45 °C, s výhodou od 28 do 40 °C, při pH mezi 5 a 8, s výhodou 6 až 7. Za stejných podmínek jsou uvažované mikroorganizmy schopny transformovat kolchikonové sloučeniny na odpovídající 3-glykosylové deriváty. Tyto transformace probíhají v submerzní kultuře, v baňkách inkubovaných na rotační třepačce za míchání rychlosti od 150 do 250 ot/min.

V důsledku, konkrétní kinetiky průběhu uvažované biotransformační reakce, která souvisí s mikrobiálním růstem, jsou optimální podmínky pro účely biologické transformace stejné jako podmínky optimální pro růst. Proto jsou kultivační média použitelná pro dobrý růst mikro

-4CZ 295749 B6 organizmů, jako jsou média založená na výše uvedených organických a anorganických složkách, použitelná také pro dobrou aktivitu biologické transformace příslušného substrátu. Substrát se přidává do kultury na začátku kroku fermentace nebo v jednotlivých podílech postupně od začátku fermentace.

Biologická transformace podle předkládaného vynálezu je založena na enzymatické přeměně, která začíná v průběhu exponenciální fáze růstu a pokračuje paralelně s růstem; maximální míry přeměny na 3-glykosylový derivát (velmi vysoké; až do 95 %) se dosahuje během prvních 48 až 72 hodin, v závislosti na době přidávání substrátu. Polohová selektivita biologické transformace je absolutní: nikdy nebyla prokázána přítomnost 2-glykosylových derivátů ve vzorcích kultury. Získané produkty jsou výlučně extracelulámí.

Transformovaný substrát může být přidán jako roztok v acetonu nebo alkoholu, ve formě roztoků ve směsích alkohol-voda, dioxonu apod. Biologická transformace podle předkládaného vynálezu může být prováděna i v měřítku zvětšeném až do úrovně fermentoru při zachování nezměněných podmínek v kultuře, zvláště co se týče kultivačního média, teploty a doby zpracování. Pro získání dobrého růstu jsou důležité vhodné úrovně míchání - aerace, přičemž nutná je zvláště aerace 1 až 2 1 vzduchu na litr kultury za minutu (wm), s výhodou 1,5 až 2 wm.

Produkty získané biologickou přeměnou se z kultivačního média získávají po oddělení biomasy z kapalné frakce centrifugací a oddělením supematantu nebo mikrofiltrací a oddělením permeátu. Kulturu je možno pro dosažení optimálního oddělení produktu upravit přidáním alkoholů.

Čištění a izolace produktů biologické transformace mohou být prováděny chromatografíckými způsoby pro oddělování na absorpčních pryskyřicích a s eluci alkoholy, s výhodou methanolem. Roztoky methanolu ve vodě obsahující produkt mohou být dále čištěny extrakcí lipofílními organickými rozpouštědly, s výhodou methylenchloridem. Po dalším působení směsmi alkoholů a organických rozpouštědel může být produkt získán v čistém stavu ze získaných alkoholových roztoků krystalizací. Glukóza může být nahrazena jinými cukry, jako je fruktóza nebo galaktóza, aniž by došlo k úbytku glykosyltransferázové aktivity.

Následující příklady budou vynález podrobněji popisovat.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Alikvoty kultur Bacillus megaterium, izolované ze zemědělské půdy, se resuspendují ve 20 ml sterilního fyziologického roztoku a skalárně se ředí na faktor ředění 1:10 000 000. Suspenze při různých ředěních se vysejí na kultivační médium LB-agar a na LB-agar se popřípadě přidá thiokolchikon nebo 3-demethylthiokolchikon pro dosažení konečné koncentrace 2 g/1 (viz tabulka). Kultury se inkubují při +28 °C 3 až 4 dny v temnu. Kolonie rostoucí na selektivním médiu s přidanou kolchikonovou sloučeninou se izolují a čistí vysetím na neselektivní médium; uvedené vzorky se inkubují jako výše ale kratší dobu (24 h).

Potom se kultury převedou na stejné agarové médium ve zkumavce a inkubují se jako výše 24 hodin.

Alikvoty kultur pro výše popsané selekci se použijí pro inokulaci 100 ml Erlenmeyerových baněk obsahujících 20 ml kultivačního média ST (viz tabulka), do kterého byl přidán thiokolchikon nebo 3-demethylthiokolchikon na konečnou koncentraci na 0,4 mg/ml. Tyto kultury se inkubují přes noc při 28 °C, na rotační třepačce při 200 ot/min.

-5CZ 295749 B6

Transformace kolchikonového substrátu se testuje analýzou alikvotů kultivačních půd, které se odebírají každé 3 až 4 hodiny, pomocí TLC na silikagelu se systémem eluentu acetomethylacetát:voda 5:4:1.

Po 4 dnech inkubace se alikvoty kultur, které prokázaly dostatečnou katalytickou aktivitu vzhledem k 3-glykosylovému derivátu, izolují na plotnách pomocí skalárního ředění, jak bylo popsáno výše, pro přípravu nového inokula ve zkumavce. Test biologické transformace v baňce se opakuje za stejných podmínek jako výše, ale s použitím podstatně vyšších finálních koncentrací thiokolchikonu a 3-demethylthiokolchikonu (1 mg/ml). Jednotlivé kultury s nej vyšší aktivitou (konverze substrátu rovná nebo vyšší než 70 %) se použijí pro přípravu inokula ve zmrazených kryogenních zkumavkách.

Tabulka

Složení kultivačního média

1) LB-agar

Trypton 10 g/1

Kvasničný extrakt5 g/1

NaCl 10 g/1 agar-agar 15 g/1 pH 7

Sterilizace: 121 °Cx20min

2) Půda ST

Glukóza 20g/1

Glycerol 10g/1

Pepton 15g/1

Kvasničný extrakt 5g/1

NaCl 3g/1

NH4CI 3g/1

K₂HPO₄ 8g/1

KH₂PO₄ 3g/1

MgSO₄.7H₂O 0,5g/1 pH 7

Sterilizace: 121 °C x 20 min

Příklad 2

Opakuje se postup popsaný v příkladu 1 s tím rozdílem, že se vychází z kultur Bacillus megaterium pocházejících z následujících sbírkových kmenů (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Německo):

DSM

DSM DSM DSM

DSM DSM

322

333

1667

1670

1671

Kultury po selekci popsané v příkladu 1 a s přídavkem thiokolchikonu (1 mg/ml) se inkubují 4 dny v kapalné kultuře: analýza TLC detekuje probíhající transformaci substrátu na thiokolchikoson s konverzními výtěžky v rozmezí od 30 do 70 %.

Příklad 3

Alikvoty vzorků kultury ve zkumavce vybraných selekcí, jak bylo popsáno ve výše uvedeném příkladu, se použijí pro inokulaci 100 ml Erlenmeyerových baněk obsahujících 20 ml půdy ST.

Kultury v půdách se inkubují při +30 °C na rotační třepačce při 200 ot/min přes noc. Po inkubaci se do kultur přidá sterilní roztok glycerolu na konečnou koncentraci 20 %. Kultury se potom rozplní do 2 ml kryogenních zkumavek a ihned se ponoří do kapalného dusíku.

Po několika dnech se 10 % kultur rychle roztaví při 37 °C. Alikvoty každé kryogenní zkumavky se použijí pro inokulaci lOOml Erlenmeyerových baněk s obsahem 20 ml média ST, které se potom inkubují při +28 °C přes noc (předkultivace) při 200 ot/min. Po inkubaci se 2 ml každé předkultury převedou sterilně do 20 ml čerstvého média ST a přidá se 3-demethylthiokolchikonu na konečnou koncentraci 1 g/1. Biologická transformace se provádí a testuje za stejných podmínek jako byly popsány v příkladu 1. Analýza potvrdila, že transformace substrátu na 3glykosylový derivát probíhala za výše uvedených kvantitativních podmínek (70 % a vyšší), čímž byla prokázána katalytická stabilita zmrazených kultur.

Paralelní kontroly kultivačních půd vyseté na LB-agar bezprostředně po roztátí potvrzují životaschopnost, homogenitu a čistotu zmrazených kultur.

Příklad 4

Alikvoty kultur vkiyogenní zkumavce se použijí po roztátí pro inokulaci 300ml Erlenmeyerových baněk obsahujících 50 ml média ST (předkultura). Po inkubaci přes noc při 30 °C, 250 ot/min, se převede 5 ml předkultury do 50 ml stejného média s přidaným 3-demethylthiokolchikonem na konečnou koncentraci 1 g/1. Kultury se inkubují 4 dny za stejných podmínek jak bylo popsáno výše.

Každé 4 hodiny se odebírají vzorky pro vyhodnocení intenzity růstu (měření absorbance při 600 nm), produkce thiokolchikosonu (TLC a HPLC), sterility (na agaru LB) a pro mikroskopické vyšetření morfologie.

Analýza TLC se provádí jak bylo popsáno v příkladu 1. Pro analýzu HPLC se do 1 ml frakcí kultivačních půd přidá 9 ml methanolu a směs se centrifuguje při 13 000 ot/min 2 minuty. Obsah 3-glukosylového derivátu v supematantu se analyzuje HPLC s reverzní fází s izokratickou eluci systémem eluentu voda:acetonitril 80:20.

Analýza HPLC ukazuje, že po 72 až 96 hodinách je biologická konverze substrátu na thiokolchison v podstatě u konce.

Konečné výtěžky 3-glukosylového derivátu získaného biologickou přeměnou se pohybují od 70 do 85 %.

-7 CZ 295749 B6

Příklad 5

Opakuje se postup popsaný v příkladu 4 s tím rozdílem, že se 3-demethylthiokolchikon přidá do kultur ve dvou frakcích: 0,25 g/1 na začátku kultivace a 0,74 g/1 po 24 h.

Růst a produkce u kultur jsou podobné, jak bylo popsáno v příkladu 4, přičemž výtěžek thiokolchisonu je přibližně 90 %.

Příklad 6

1 půdy ST se v Erlenmeyerově baňce (inokulum) zaočkuje kulturou z kryogenní zkumavky. Baňky se inkubují přes noc při +30 °C, 250 ot/min. Inokulum se sterilně převede do 14 1 fermentoru obsahujícího 9 1 sterilní půdy STL. Přidá se 3-demethylthiokolchikon na konečnou koncentraci 1 g/1 (25 % na začátku, zbytek po 20 hodinách). Fermentace se provádí při udržování vhodných úrovní míchání - aerace (míchání do 900 ot/min; aerace 1 až 1,5 wm, v závislosti na růstu kultury).

Každé 2 hodiny se odebírají vzorky kultivačních půd, přičemž se provádějí následující analýzy:

- optická hustota (OD) při 600 nm,

- analýza sterility a čistoty kmene (na agaru LB),

- mikroskopická kontrola morfologie (Gramovo barvení), analýza obsahu thiokolchikosonu TLC a HPLC jak bylo popsáno v příkladech 1 a 4.

Po přibližně 48 h fermentace je transformace substrátu na thiolkolchison téměř u konce. Konečný výtěžek je přibližně 85 %.

Příklad 7

Opakuje se postup popsaný v příkladu 6, ale po 48 h fermentace se pro extrakci produktu oddělí pouze 90 % kultivační půdy (frakce 1). Ke zbytku 10 % ve fermentoru se sterilně přidá 9 1 čerstvého sterilního média ST obsahujícího 10 g 3-demethylthiokolchikonu. Fermentace se provádí podle popisu v příkladu 6. Po 48 h se oddělí a extrahuje 9 1 kultivační půdy (frakce 2). Do zbytkového objemu kultivačních půd se sterilně přidá ještě 9 1 sterilního čerstvého média ST obsahujícího čerstvý 3-demethylthiokolchikon (10 g). Fermentace se provádí jako výše. Po 48 h se půda úplně sklidí a extrahuje (frakce 3). Aktivita z hlediska biologické transformace zůstala u kmene stabilní pro všechny tři fermentace, přičemž výtěžky konverze byly přibližně 80 %.

Příklad 8

Konečná kultivační půda z fermentace (celkový objem přibližně 27 1) se ve vakuu zakoncentruje na měkký zbytek, který se převede do ethanolu. Po oddělení filtrací se frakce voda - ethanol zakoncentruje do vody ve vakuu a čistí se opakovanými extrakcemi methylenchloridem. Vodné frakce se koncentrují a po nastavení pH na 10 hydroxidem sodným se extrahují směsmi methylenchlorid - ethanol.

Spojené organické fáze se koncentrují ve vakuu. Do získané suspenze se přidá ethanol, zakoncentrujc se a ponechá se krystalizovat. Druhá krystalizace s ethanolem se provede po dalších krocích opětného ředění pevné látky ve směsích methylenchlorid - ethanol.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby 3-O-glykosylkolchikonových sloučenin vzorce I

   MeO r1

   O

   R2 kde R¹ je glykosidový zbytek, R² je skupina Ci-Cgalkoxy nebo Ci-Céthioalkyl, vyznačující se tím, že zahrnuje biologickou transformaci sloučenin, ve kterých Ri je OH nebo methoxy, prostřednictvím Bacillus megaterium.
2. 2. Způsob výroby sloučenin vzorce (I), vyznačující se tím, že skupina Ri je O-glukosidový zbytek.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že u kmenů Bacillus megaterium se provádí selekce na jejich schopnost růstu v přítomnosti vysokých koncentrací kolchikonového substrátu určeného k transformaci.
4. 4. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že uvedené rozmezí koncentrací je 0,1 až 3 g/1.
5. 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se Bacillus megaterium kultivuje v pevném nebo kapalném médiu.
6. 6. Způsob podle nároku 5,vyznačuj ící se tím, že uvedené médium obsahuje alespoň jeden zdroj organického dusíku.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že uvedený zdroj organického dusíku se volí ze skupiny masový extrakt, pepton, trypton, kaseinové hydrolyzáty a kapalný kukuřičný extrakt.
8. 8. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že médium obsahuje alespoň jeden zdroj uhlíku.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedený zdroj uhlíku se volí ze skupiny glukóza, fruktóza a glycerol.
10. 10. Způsob podle nároku 5, v y z n a č u j í c i se t í m, že uvedené médium obsahuje alespoň jeden zdroj anorganických solí K⁺, Na⁺, Mg⁺⁺, NH/.

    -9CZ 295749 B6
11. 11. Způsob podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že se provádí při pH v rozmezí od 5 do 8.
12. 12. Způsob podle nároku 11, vy z n a č uj í c í se t í m , že se použije rozmezí pH od 6 do 7.
13. 13. Způsob podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že se provádí v rozmezí teplot od 20 do 45 °C.
14. 14. Způsob podle nároku 13,vyznačující se tím, že se provádí v rozmezí teplot od 28 do 40 °C.
15. 15. Způsob podle některého z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že se provádí při maximální úrovni aerace od 1 do 2 1 vzduchu na litr kultury za minutu.
16. 16. Způsob podle nároku 15,vyznačující se tím, že se provádí při maximální úrovni aerace od 1,5 do 2 1 vzduchu na litr kultury za minutu.