PL190865B1 - Sposób otrzymywania związków 3-O-glikozylokolchikonowych - Google Patents
Sposób otrzymywania związków 3-O-glikozylokolchikonowychInfo
- Publication number
- PL190865B1 PL190865B1 PL339620A PL33962098A PL190865B1 PL 190865 B1 PL190865 B1 PL 190865B1 PL 339620 A PL339620 A PL 339620A PL 33962098 A PL33962098 A PL 33962098A PL 190865 B1 PL190865 B1 PL 190865B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- biotransformation
- compounds
- culture
- substrate
- bacillus megaterium
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 21
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims abstract description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 25
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 claims description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 9
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 7
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 6
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 5
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 5
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims description 5
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 claims description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 125000004191 (C1-C6) alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 125000004001 thioalkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003563 glycoside group Chemical group 0.000 abstract 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 8
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- LMBIHYWAZRMYEM-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanyl-5,6-dihydrobenzo[a]heptalene-7,9-dione Chemical compound C1CC(=O)C2=CC(=O)C(SC)=CC=C2C2=C1C=C(OC)C(OC)=C2OC LMBIHYWAZRMYEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 3
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 3
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VVPWAFWXRZAOAI-UHFFFAOYSA-N 1-chloroprop-1-en-2-ol Chemical compound CC(O)=CCl VVPWAFWXRZAOAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 2
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 125000002816 methylsulfanyl group Chemical group [H]C([H])([H])S[*] 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- -1 β-D-glucosyl ester Chemical class 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 244000146462 Centella asiatica Species 0.000 description 1
- 235000004032 Centella asiatica Nutrition 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187392 Streptomyces griseus Species 0.000 description 1
- 241000970875 Streptomyces spectabilis Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002031 ethanolic fraction Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 229940087061 glucosyl steviol Drugs 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- CMEGANPVAXDBPL-INIZCTEOSA-N n-[(7s)-1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(SC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC CMEGANPVAXDBPL-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Sposób otrzymywania zwiazków-3-O-glikozylokolchikonowych o wzorze (I): w którym R 1 oznacza reszt e glikozydow a, za s R 2 oznacza grup e C 1 -C 6 alkoksylow a lub C 1 -C 6 tioalkilow a, znamienny tym, ze poddaje si e biotransformacji zwi azki, w których R 1 oznacza OH lub grup e metoksylow a, przy udziale hodowli Bacillus megaterium. PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania związków 3-O-glikozylokolchikonowych. Wynalazek oparty jest na biotransformacji związków kolchicynoidowych w odpowiednie pochodne 3-O-glikozylowe, dokonywanej poprzez wybrane szczepy mikroorganizmów. Sposób według niniejszego wynalazku dostarcza z wysoką wydajnością i czystością związków glikozylowanych jedynie przy C-3 aromatycznego pierścienia A, począwszy od wspomnianych związków kolchikonowych.
Związki otrzymane w biotechnologicznym procesie sposobu według wynalazku, a zwłaszcza tiokolchikozon (3-O-glukozylotiokolchikon, tzn. w odniesieniu do wzoru (I), R1 = -OCH3, a R2 = -SCH3), są podstawowym źródłem o istotnym znaczeniu farmakologicznym, głównie do wytworzenia nowych środków przeciwnowotworowych.
Poczyniono szereg wysiłków w celu otrzymania wysoce specyficznych glikozylacji związków o ogólnym wzorze (I) i pokrewnych zwią zków kolchicynoidowych, zarówno na drodze reakcji chemicznych jak i biotransformacji.
Droga chemiczna składa się z sekwencji złożonych, niespecyficznych reakcji nieselektywnie angażujących odmienne miejsca molekularne i prowadzących do mieszaniny glikozylowanych pochodnych, z których niektóre są nieaktywne. A zatem, wydajność konwersji prowadzącej do efektywnego produktu specyficznie glikozylowanego przy C-3 pierścienia aromatycznego jest bardzo niska.
Podejście biologiczne zasadniczo dotyczy biotransformacji związków kolchicynoidowych (pośrednio związanych ze związkami kolchikonowymi), takich jak kolchicyna i tiokolchicyna przez hodowlę Centella asiatica w monoglikozylowane pochodne przy C-2 i C-3 pierścienia aromatycznego. Taka transformacja nie jest zatem wysoce selektywna i dostarcza niewystarczającej wydajności i produktywności (Solet, J.M., i wsp., Phytochemistry 33, 4, 817-820, 1993).
Inne próby biotransformacji związków kolchicynoidowych prowadziły do zwykłej demetylacji metoksy- grup związanych z pierścieniem aromatycznym (przy C-2 i przy C-3) poza tym, zawsze charakteryzowały się ograniczoną wydajnością i produktywnością oraz niską selektywnością co do miejsca.
Dlatego, Hufford C.D. i wsp., (J. Pharm. Sc. , 68, 10, 1239-1242, 1979), stosując Streptomyces griseus i/lub Streptomyces spectabilis, oraz Bellet P. i wsp.,(GB-923421, 1959), stosując różne szczepy Streptomyces oraz inne gatunki grzybów i bakterii, próbowali przekształcić kolchicynę i jej pochodne w odpowiednie 3-demetylowane pochodne. Wyniki tych znanych metod potwierdzają to co przytoczono powyżej w odniesieniu do braku selektywności pochodzących z mikroorganizmów enzymów działających przy na przykład C-2, C-3 lub C-10 cząsteczki alkaloidu. Co więcej, poziom produkcji przytoczonych systemów katalitycznych jest raczej niski ze względu na niską wydajność konwersji, niskie możliwe stężenie substratu i częstą degradację pierścienia tropolonowego.
Ostatnio, Poulev i wsp., (J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33-38, 2995) uzyskali specyficzną demetylację poprzez zastosowanie mikroorganizmów bakteryjnych, ale raczej wciąż o niskiej wydajności i produktywnoś ci.
Aktywność enzymatyczna mikroorganizmów zbliżonych do wspomnianych powyżej (Streptomyces, Bacillus, etc.) została zastosowana do biotransformacji innych związków, takich jak maytansioides (US pat. 4 361 650: Izawa, M., i wsp., J. Antibiotics, 34, 12, 1587-1590, 1981). W tym przypadku także na katalizowaną reakcję składa się wyłącznie demetylacja, charakteryzująca się niską wydajnością i produktywnością konwersji.
Opisano aktywność glikozylotransferazy dla α-amylazy ze szczepów Bacillus megaterium (Brumm., P.J., i wsp., Starch, 43, 8, 319-323, 1991), o szczególnie wysokiej specyficzności akceptora (wyłącznie glukoza lub glukozydy). Cyklodekstrynoglukozylo transferazy, produkowane przez to samo źródło mikrobiologiczne, katalizują a-1,4-transglukozylację rubozydu (β-D-glukozylowy ester 13-0-e-D-glukozylo-stewiolu), począwszy od skrobi. Również w tej biokonwersji akceptorem reakcji transferazy jest substratowa frakcja cukrowców (Darise, M., i wsp., Agric. Bioel. Chem., 48, 10, 2483-2488, 1984). Cyklodekstrynoglukozylo transferazy były wcześniej stosowane do przygotowania cyklodekstranów G6 i G8 ze skrobi (Kitahata, S., Okada,S., Agric. Biol. Chem., 38, 12, 2413-2417, 1974).
Te przykłady świadczą o wysokiej specyficzności substratowej glukozylotransferaz produkowanych przez Bacillus megaterium, która dotyczy jedynie akceptorów glukozydowych, i czyni tym samym niemożliwym oczekiwanie jakichkolwiek reakcji na metabolitach wtórnych posiadających odmienną, złożoną strukturę molekularną, takich jak kolchikony. Nieznane są faktycznie przykłady zastosowania wspomnianych mikroorganizmów w konwersji związków kolchikonowych do 3-glikozylopochodnych.
PL 190 865 B1
Obecnie stwierdzono, że szczepy Bacillus megaterium zdolne do wzrostu w obecności wysokich stężeń kolchikonu (R1 = -OCH3, R2 = -OCH3), 3-demetylokolchikonu i odpowiednich tiopochodnych, mają nadzwyczajnie wysoką, bardzo specyficzną aktywność biotransformacyjną wspomnianych substratów w glikozylowane pochodne jedynie przy C-3 pierścienia aromatycznego. Tego rodzaju transformacja trwa bardzo krótko i charakteryzuje się zaskakująco wysoką wydajnością.
A zatem, wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania związków 3-O-glikozylokolchikonowych o wzorze (I):
ο
Rj w którym R1 oznacza resztę glikozydową, zaś R2 oznacza grupę C1-C6 alkoksylową lub C1-C6 tioalkilową, polegający na tym, że poddaje się biotransformacji związki, w których R1 oznacza OH lub grupę, metoksylową przy udziale hodowli Bacillus megaterium. W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku, R1 oznacza resztą O-glukozydową.
W sposobie według wynalazku korzystnie wybrane są szczepy Bacillus megaterium; wyboru dokonuje się są pod kątem ich zdolności do wzrostu w obecności wysokich stężeń substratu kolchikonowego podlegającego transformacji. Wspomniane stężenia korzystnie wynoszą od 0,1 do 3 g/l.
W innym korzystnym rozwią zaniu wynalazku Bacillus megaterium może być hodowany na podłożu stałym lub płynnym. Wspomniane podłoże, korzystnie może zawierać przynajmniej jedno źródło organicznego azotu.
Bardziej korzystnie źródło organicznego azotu jest wybrane z grupy obejmującej wyciąg mięsny, pepton, trypton, hydrolizaty kazeinowe, namok kukurydziany.
W innym korzystnym rozwiązaniu podło ż e zawiera przynajmniej jedno źródło węgla. Wspomniane źródło węgla korzystnie jest wybierane z grupy obejmującej glukozę, fruktozę i glicerol.
Również korzystnie w podłożu powinno znajdować się przynajmniej jedno źródło nieorganicznych soli K+, Na+, Mg++, NH4 +.
Biotransformację w sposobie według wynalazku przeprowadza się korzystnie w pH obejmującym od 5 do 8, a jeszcze bardziej korzystnie w pH obejmuje od 6 do 7. Temperatura biotransformacji, korzystnie wynosi od 20° do 45°C, a jeszcze bardziej korzystnie od 28° do 40°C.
W kolejnym korzystnym rozwiązaniu, biotransformację przeprowadza się przy maksymalnym poziomie napowietrzenia od 1 do 2 litrów powietrza na litr hodowli na minutę (vvm), a jeszcze bardziej korzystnie, maksymalny poziom napowietrzenia wynosi od 1,5 do 2 (vvm).
Bacillus megaterium jest Gram-pozytywną, przetrwalnikującą bakterią, o średnicy komórki powyżej 1.0 μm, rosnącą w warunkach tlenowych w licznych podłożach hodowlanych, katalazopozytywną oraz hydrolizującą żelatynę. Szczepy Bacillus megaterium, które mogą być stosowane zgodnie z ideą wynalazku okazały się zdolne do wystarczającego wzrostu i utrzymywania żywotności również w wysokich stężeniach kolchikonu, tiokolchikonu (R1 = -OCH3, R2 = -SCH3) i odpowiednich 3-demetylopochodnych (powyżej 2 g/l), jak potwierdziło badanie wzrostu oraz analizy mikroskopowe. Gatunki pokrewne, takie jak Bacillus cereus, wykazują trudność we wzroście już w stężeniach substratu 1 g/l (absorbancja 10-25% kontroli).
Wysoka selektywność i wydajność biotransformacji jest zadziwiająca i niezwykła, jako że poziom produkcji był w zakresie od 70 do 95 %.
Co więcej, mikroorganizmy stosowane w biokonwersji zdolne są do stałego utrzymywania wysokiej aktywności katalitycznej, nawet w powtarzających się cyklach fermentacyjnych, dostarczając tym samym specyficznych biokonwersji w procesach ciągłych i jednoseryjnych. A zatem, sposób ten dostarcza wysokich poziomów produktywności i powtarzalności.
PL 190 865 B1
Wyraźna selektywność miejsca reakcji zapewnia, oprócz nadzwyczajnego poziomu produkcji, wysoką jakość i czystość końcowego produktu, tym samym dostarczając go w 100% czystości na drodze dalszej prostej obróbki.
Następnymi istotnymi korzyściami są: zredukowanie konieczności występowania etapu oczyszczania i odzyskiwania produktu, ekonomiczność procesu oraz bezpieczeństwo stosowania.
Sekwencje operacyjne stosowane w sposobie według wynalazku składają się z:
A) Selekcji hodowli Bacillus megaterium zdolnych do wzrostu w obecności wysokich stężeń substratów kolchikonowych, począwszy od źródeł naturalnych lub szczepów z kolekcji.
B) Selekcja izolatów z A), w celu określenia aktywności katalitycznej transformacji w odpowiednie pochodne 3-O-glukozylowe, na drodze testów biokonwersji ze specyficznymi substrata mi, podawanymi w stopniowo wzrastają cych stężeniach.
C) Mikrobiologiczna charakterystyka szczepów wyselekcjonowanych w etapie B)
D) Stopniowy wzrost wydajności biotranformacji, na drodze docelowo-specyficznej selekcji populacji bakteryjnej z etapu B).
E) Badanie i optymalizacja krytycznych parametrów fermentacji w celu optymalizacji biotransformacji.
F) Badanie i optymalizacja metod zachowania wysoce produktywnych hodowli w celu zagwarantowania stabilnego, jednorodnego inokulum do zastosowań produkcyjnych na skalę przemysłową.
G) Wyskalowanie procesu w fermentorze, w serii, serii jednokrotnej i procesach ciągłych.
H) Wypracowanie i optymalizacja metod dalszej obróbki i odzyskiwania produktu. Mikroorganizmy szczególnie przydatne w niniejszym wynalazku mogą być selekcjonowane począwszy od kolekcji hodowli otrzymanych z centrów depozytowych szczepów lub próbek gleby różnego pochodzenia, lub z pre-selekcjonowanych szczepów przemysłowych poprzez selektywne odzyskiwanie na różnych podłożach agarowych zawierających organiczne źródło azotu (pepton, ekstrakty drożdżowe, wywar mięsny, asparagina, itd.), źródło węgla (gliceryna, skrobia, maltoza, glukoza, itd.), o pH od 5 do 8, a korzystnie pomię dzy 6-7. Temperatura inkubacji waha się od 20° do 45°C, a korzystnie pomiędzy 28° - 40°C. Zdolność hodowli wzrastającej w obecności toksycznych stężeń substratu kolchikonowego do transformacji jest oceniana technikami wielokrotnego rozcieńczenia i równoległego wysiewania na różne podłoża agarowe, z których część ma wcześniej dodany związek kolchikonowy (np. 3-demetyltiokolchikon) w stężeniu od 0.1 do 3 g/l (w celu zahamowania wzrostu większej części mikroorganizmów).
Kolonie zdolne do wzrostu w opisanych warunkach są pobierane i umieszczane w sterylnych warunkach na różnych podłożach agarowych, w celu potwierdzenia ich czystości i jednorodności wzrostu.
Podłoże wzrostowe stosowane w celu zachowania hodowli są typowymi substratami mikrobiologicznymi, zawierającymi organiczne źródła azotu (pepton, ekstrakty drożdżowe, trypton, wyciąg mięsny, itd.), źródło węgla (glukoza, maltoza, gliceryna itd.) o pH od 5 do 8, a korzystnie pomiędzy 6 a 7. Temperatura inkubacji waha się od 20° do 45°C, korzystnie pomiędzy 28° - 40°C.
Wyselekcjonowane mikroorganizmy są następnie testowane na zdolność do wzrostu w płynnej hodowli w obecności związków kolchikonowych i transformowanie tych ostatnich do odpowiednich pochodnych 3-glikozylowych.
Wspomniane testy są przeprowadzane w 100 ml kolbach zawierających 20 ml płynnego podłoża o różnym składzie zawierającego jedno lub więcej organiczne źródło azotu (ekstrakty drożdżowe, pepton, trypton, hydrolizaty kazeinowe, wyciąg mięsny, brzeczka kukurydziana, itd.), jedno lub więcej źródło węgla (glukoza, glicerol, skrobia, sacharoza itd.), źródła nieorganicznego fosforu i azotu oraz sole nieorganiczne różnych jonów (K+, Na+, Mg++, Ca++, Fe++, Mn++, itd.).
Dodatkowo, próbki hodowli mogą zostać poddane procesom mutagenezy, drogą technik konwencjonalnych (naświetlanie promieniami UV itd.) w celu indukcji mutantów posiadających specyficzną aktywność biokonwersji, która może być określona za pomocą tej samej procedury jak powyżej.
Próbki hodowli z każdego testu biokonwersji, były analizowane dla oceny produkcji pochodnych 3-glykozylowych drogą analiz TLC (chromatografia cienkowarstwowa) i HPLC (wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa).
Zdolność wyselekcjonowanych mikroorganizmów do transformacji substratów kolchikonowych do odpowiednich pochodnych 3-glukozylowych była potwierdzana drogą testów biokonwersji w kolbach, w skali 300 ml, w tych samych bulionach odżywczych użytych na etapie selekcji.
PL 190 865 B1
Mikroorganizmy, które dały pozytywną odpowiedź były stosowane w testach optymalizacji biokonwersji, w różnych bulionach odżywczych, w 300 ml skali. Najważniejszymi badanymi parametrami wzrostu i fermentacji są: organiczne źródła azotu, źródła węgla, sole mineralne, temperatura, mieszanie-napowietrzanie, pH, czas inkubacji, proporcja inokulum, etapy subhodowli oraz czas i postać dodawanego substratu do transformacji. Wybrane mikroorganizmy bakteryjne, zdolne do wykonywania biotransformacji niniejszego wynalazku, mogą rosnąć zarówno w hodowli płynnej jak i stałej, zawierającej jedno lub więcej źródeł organicznego azotu, a najlepiej, ekstrakt drożdżowy, wyciąg mięsny, pepton, trypton, hydrolizaty kazeinowe, brzeczkę kukurydzianą itd. Źródłami węgla użytecznymi dla wzrostu i biotransformacji są: glukoza, fruktoza, sacharoza, glicerol, ekstrakt zbożowy, itd., najlepiej glukoza, fruktoza i gliceryna. Co więcej, podłoże wzrostowe zawiera nieorganiczne źródła fosforu i soli K+, Na+, Mg++, NH4+ itd.
Wybrane mikroorganizmy mogą rosnąć w temperaturze od 20° do 45°C, a korzystnie pomiędzy 28° a 40°C, w pH od 5 do 8, a najlepiej pomiędzy 6 a 7. W tych samych warunkach, rozważane mikroorganizmy są zdolne do transformacji związków kolchikonowych do odpowiednich 3-glikozylopochodnych. Wspomniana transformacja zachodzi w hodowli płynnej, w kolbach inkubowanych w inkubatorze rotacyjnym z wstrzą saniem od 150 do 250 rpm.
Zgodnie ze szczególną kinetyką rozważanej biotranformacji, która związana jest ze wzrostem mikroorganizmów, optymalne warunki dla celów biotransformacji są także warunkami optymalnymi dla wzrostu. A zatem, podłoże wzrostowe skutecznie sprzyjające dobremu wzrostowi mikroorganizmów, takie jak to oparte na wspomnianych powyżej składnikach organicznych i nieorganicznych, jest również przydatne dla dobrej aktywności biotransformacji rozważanego substratu. Ten ostatni jest dodawany do hodowli na początkowym etapie fermentacji lub w mniejszych ilościach począwszy od momentu rozpoczęcia fermentacji.
Biotransformacja wynalazku jest oparta na konwersji enzymatycznej, która zaczyna się podczas ekspotencjalnej fazy wzrostu i postępuje równolegle do wzrostu; maksymalny poziom konwersji do pochodnych 3-glikozylowych (bardzo wysoki: do 95%) jest osiągany w ciągu pierwszych 48-72 godzin, w zależności, od momentu dodania substratu. Selektywność miejsca biotransformacji jest całkowita nigdy nie stwierdzono w próbkach hodowli obecności pochodnych 2-glikozylowych. Powstające produkty są wyłącznie zewnątrzkomórkowe.
Substrat do transformacji może być podany w roztworze acetonu lub alkoholu, w mieszaninach wodno-alkoholowych, w dioksanie itd. Skala procesu biotransformacji według wynalazku może być powiększona i przebiegać w fermentorze, utrzymując niezmienne warunki fermentacji, w szczególności zaś jeśli rozważa się podłoże wzrostowe, temperaturę i czas obróbki. W celu otrzymania dobrego wzrostu, istotne są odpowiednie poziomy mieszania i napowietrzania, w szczególności, zaś wymagany jest poziom napowietrzania od 1 do 2 litrów powietrza na litr hodowli na minutę (vvm), a najlepiej 1,5-2 vvm.
Powstające w biokonwersji produkty są ekstrahowane z bulionów odżywczych po oddzieleniu biomasy od frakcji płynnej w drodze wirowania i odzyskiwania supernatantu, lub mikrofiltrację i odzyskanie przesączu. Hodowla może być potraktowana alkoholem, zważywszy na optymalne odzyskiwanie produktu.
Oczyszczanie i odzyskiwanie produktów biotransformacji może być wykonywane przy zastosowaniu technik chromatografii z separacją na podłożach absorpcyjnych i elucją alkoholami, a najlepiej metanolem. Wodno-metanolowe roztwory zawierające produkt mogą być dalej oczyszczane poprzez ekstrakcję lipofilowymi rozpuszczalnikami organicznymi, a najlepiej chlorkiem metylenu. Po kolejnym zastosowaniu mieszanin alkoholi i rozpuszczalników organicznych, produkt może być otrzymany w stanie czystym z powstają cych roztworów alkoholowych na drodze krystalizacji. Glukozę moż na zastąpić innymi cukrami, takimi jak fruktoza lub galaktoza, bez utraty aktywności glukozylotransferazy.
Następujące przykłady przedstawiają dalsze szczegóły wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Porcje hodowli Bacillus megaterium, wyizolowane z gleby uprawnej, są rozpuszczane w 20 ml sterylnej soli fizjologicznej i poddawane wielokrotnemu rozcieńczeniu ze współczynnikiem rozcieńczenia 1:10.000.000. Zawiesiny o różnym rozcieńczeniu są wysiewane na podłoże hodowlane LB-Agar lub LB-Agar z dodanym tiokolchikonem lub 3-demetylotiokolchikonem, do końcowego stężenia 2 g/l (patrz tabela). Hodowle są inkubowane w +28°C, przez 3-4 dni, w ciemności. Kolonie wyrosłe na podłożu selekcyjnym, z dodanym związkiem kolchicyny są izolowane i oczyszczane drogą wysiewania na podłoże nieselekcyjne, wspomniane próbki są inkubowane jak powyżej ale w krótszym czasie (24 godziny).
PL 190 865 B1
Następnie, hodowle są przenoszone na to samo podłoże agarozowe w probówce i inkubowane jak powyżej, przez 24 godziny.
Porcje hodowli, wyselekcjonowane jak opisano, są stosowane do inokulacji 100 ml kolb Erlenmeyera zawierających 20 ml podłoża hodowlanego ST (tabela), z dodanym tiokolchikonem lub 3-demetylotiokolchikon, do końcowego stężenia 0,4 mg/ml. Wspomniane hodowle są inkubowane przez noc w 28°C, w inkubatorze rotacyjnym przy 200 rpm.
Transformacja substratu kolchikonowego jest sprawdzana poprzez analizę próbek podłoża wzrostowego pobieranych co każde 3-4 godziny na drodze TLC w żelu silikonowym w układzie rozpuszczalników aceton:octan etylowy:woda 5:4:1.
Po 4-dniowej inkubacji porcje hodowli, które wykazały widoczną aktywność katalityczną w kierunku pochodnych 3-glikozylowych, są odzyskiwane na płytkach na drodze wielokrotnych rozcieńczeń, jak opisano powyżej, w celu przygotowania nowego inokulum w probówce. Test biotransformacji w kolbie jest powtarzany w tych samych warunkach jak powyż ej, ale stosują c znaczą co wyż sze koń cowe stężenia tiokolchikonu and 3-demetylotiokolchikonu (1 mg/ml). Najbardziej aktywne pojedyncze hodowle (konwersja substratu wyższa niż 70%) są stosowane do przygotowania zamrożonych inokula w probówkach do głębokiego zamrażania.
T a b e l a
Skład podłoży wzrostowych
| 1) LB-Agar | |
| T rypton | 10 g/l |
| Ekstrakt drożdżowy | 5 g/l |
| NaCl | 10 g/l |
| Agar Agar pH 7 Sterylizacja: 121oC x 20' | 15 g/l |
| 2) Bulion ST | |
| Glukoza | 20 g/l |
| Glicerol | 10 g/l |
| Pepton | 5 g/l |
| Ekstrakt drożdżowy | 5 g/l |
| NaCI | 3 g/l |
| NH4Cl | 3 g/l |
| K2HPO4 | 8 g/l |
| KH2PO4 | 3 g/l |
| MgPO4 7H2O pH 7 | 0,5 g/l |
| Sterylizacja: 121oC x 20' |
P r z y k ł a d 2
Procedura opisana w przykładzie 1 jest powtarzana, począwszy od hodowli Bacillus megaterium pochodzących od następujących szczepów z kolekcji (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Germany):
DSM 90
DSM 322
DSM 333
DSM 1667
DSM 1670
DSM 1671
PL 190 865 B1
Hodowle wybrane w przykładzie 1 i z dodanym tiokolchikonem (1 mg/ml) są inkubowane przez 4 dni w hodowli płynnej: analiza TLC wykrywa zaszłą transformację substratu w tiokolchikozon, z wydajnością wahającą się od 30 do 70%.
P r z y k ł a d 3.
Porcje próbek hodowli w probówkach, wybrane jak opisano w powyższym przykładzie, są używane do inokulacji 100 ml kolb Erlenmeyera zawierających 20 ml bulionu ST.
Hodowle w bulionie są inkubowane w +30°C przez noc, na inkubatorze rotacyjnym przy 200 rpm. Po inkubacji, do hodowli dodawany jest sterylny roztwór glicerolu do końcowego stężenia 20%. Hodowle są następnie rozlewane do 2 ml probówek do głębokiego zamrażania i natychmiast zanurzane w ciekł ym azocie.
Po kilku dniach, 10% hodowli jest szybko rozmrażana w 37°C. Porcje z każdej probówki są używane do inokulacji 100 ml kolb Erlenmeyera, zawierających 20 ml podłoża ST, które są następnie inkubowane +28°C przez noc, przy 200 rpm. Po inkubacji, 2 ml każdej prehodowli są sterylnie przenoszone do 20 ml świeżego podłoża ST, z dodanym 3-demetylotiokolchikonem do końcowego stężenia 1 g/l. Biotransformacja jest przeprowadzana i sprawdzana w warunkach opisanych w przykładzie 1. Analiza potwierdziła, że transformacja substratu do pochodnej 3-glikozylowej zachodziła w opisanych powyżej stosunkach ilościowych (70% i więcej), potwierdzając tym samym stabilność katalityczną zamrożonych kultur.
Równoległe kontrole hodowli w bulionie, wysiane na LB Agar natychmiast po rozmrożeniu, potwierdziły żywotność, homogennność i czystość zamrożonych kultur.
P r z y k ł a d 4.
Porcje hodowli z probówek do głębokiego zamrażania po rozmrożeniu są używane do inokulacji 300 ml kolb Erlenmeyera zawierających 50 ml podłoża ST (prehodowla). Po całonocnej inkubacji w 30°C, 250 rpm, 5 ml prehodowli jest przenoszone do 50 ml tego samego podło ża z dodanym 3-demethyltiokolchikonem do końcowego stężenia 1 g/l. Hodowle są inkubowane przez 4 dni w tych samych warunkach jak opisano powyżej.
Co każde 4 godziny pobierano próbki w celu oceny poziomu wzrostu (poprzez pomiar absorbacji przy 600 nm), produkcji tiokolchikozonu (TLC i HPLC), sterylności (na LB Agar), oraz do morfologicznej oceny w mikroskopie.
Analiza TLC jest wykonywana jak opisano w przykładzie 1.
W celu analizy HPLC do 1 ml frakcji hodowli w bulionie dodawane jest 9 ml metanolu i próbka jest następnie wirowana przy 13,000 rpm przez 2 minuty. Zawartość pochodnej 3-glukozyIowej w supernatancie jest analizowana poprzez HPLC z odwróconymi fazami, z izokratycznym wymywaniem z użyciem systemu rozpuszczalników woda:acetonitryl 80 : 20.
Analiza HPLC udowadnia, że po 72-96 godzinach biokonwersja substratu jest zasadniczo zakończona.
Końcowa wydajność produkcji pochodnej 3-glukozylowej, otrzymanej przez biokonwersję waha się od 70 do 85%.
P r z y k ł a d 5
Procedura opisana w przykładzie 4 jest powtarzana, ale 3-demetyltiokolchikon jest dodawany do hodowli w dwóch porcjach: 0,25 g/l na początku i 0,74 g/l po 24 godzinach.
Wzrost i produkcja hodowli jest podobna do otrzymanej w przykładzie 4, z wydajnością produkcji tiokolchizonu około 90%.
P r z y k ł a d 6
Jeden litr bulionu ST w kolbie Erlenmeyera (inoculum) jest zaszczepiany hodowlą z jednej probówki do głębokiego zamrażania. Kolby są inkubowane przez noc w +30°C, 250 rpm. Inoculum jest sterylnie przenoszony do 14-litrowego fermentatora zawierającego 9 l sterylnego bulionu STL. Dodawany jest 3-demetyltiokolchikon do końcowego stężenia 1 g/l (25% na początku, pozostała część po 20 godzinach). Fermentacja jest przeprowadzana utrzymując odpowiednie poziomy mieszanianapowietrzania (mieszając do 900 rpm), napowietrzania od 1 do 1,5 vvm, w zależności od wzrostu hodowli).
Co każde 2 godziny pobierano próbki i poddawano następującym analizom:
- gę stość optyczną (OD) przy 600 nm,
- sterylność i czystość szczepu (na podłożu LB agar),
- morfologia w mikroskopie (barwienie Grama),
PL 190 865 B1
- analiza zawartoś ci tiokolchikozonu, poprzez TLC i HPLC, jak opisano w przykł adzie 1 i 4, odpowiednio.
Po około 48 godzinach fermentacji, transformacja substratu do tiokolchizonu jest niemal zakończona. Końcowa wydajność wynosi około 85%.
P r z y k ł a d 7
Procedura opisana w przykładzie 6 jest powtarzana, ale po 48 godzinach fermentacji, jedynie 90% podłoża hodowlanego jest odzyskiwana do ekstrakcji produktu (frakcja 1). Do pozostałych 10% dodaje się sterylnie 9 l świeżego podłoża ST zawierającego 10 g 3-demetylotiokolchikonu. Fermentacja zachodzi jak opisano w przykładzie 6. Po 48 godzinach, 9 l podłoża hodowlanego jest zbierane i ekstrahowane (frakcja 2). Do pozostałej objętoś ci podłoża hodowlanego dodawane jest sterylnie 9 lub więcej litrów świeżego podłoża ST zawierającego świeży 3-demetylotiokolchikonu (10 g). Fermentacja jest przeprowadzana jak powyżej. Po 48 godzinach bulion odżywczy jest całkowicie zbierany i ekstrahowany (frakcja 3). Aktywność biotransformacyjna szczepu pozosta ła stabilna przez wszystkie trzy rundy, z wydajnością konwersji około 80%.
P r z y k ł a d 8
Końcowe podłoże hodowlane z fermentacji (całkowita objętość: około 27 l) jest zatężane pod próżnią do miękkiego osadu i przemywane etanolem.
Po oddzieleniu poprzez filtrację, frakcja wodno-etanolowa jest zatężana do wody, pod próżnią, i oczyszczana poprzez kolejne ekstrakcje chlorkiem metylenu. Frakcje wodne są zatężane i po doprowadzeniu wodorotlenkiem sodu pH do 10 ekstrahowane mieszaninami chlorometylen-etanol.
Połączone fazy organiczne są zatężane pod próżnią. Do końcowej zawiesiny dodawany jest etanol, zawiesina jest zatężana i pozostawiona do krystalizacji. Druga krystalizacja spod etanolu jest przeprowadzana po dalszych etapach rozpuszczania części stałej w mieszaninach chlorometylen-etanol.
Claims (16)
1. Sposób otrzymywania związków-3-O-glikozylokolchikonowych o wzorze (I):
w którym R1 oznacza resztę glikozydową, zaś R2 oznacza grupę C1-C6 alkoksylową lub C1-C6 tioalkilową, znamienny tym, że poddaje się biotransformacji związki, w których R1 oznacza OH lub grupę metoksylową, przy udziale hodowli Bacillus megaterium.
2. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że R1 jest resztą O-glukozydową.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szczepy Bacillus megaterium są wybrane pod kątem ich zdolności do wzrostu w obecności wysokich stężeń substratu kolchikonowego podlegającego transformacji.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wspomniane stężenia obejmują od 0,1 do 3 g/l.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że Bacillus megaterium jest hodowany na podłożu stałym lub płynnym.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że wspomniane podłoże zawiera przynajmniej jedno źródło organicznego azotu.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że źródło organicznego azotu jest wybrane z grupy obejmującej wyciąg mięsny, pepton, trypton, hydrolizaty kazeinowe, namok kukurydziany.
PL 190 865 B1
8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że podłoż e zawiera przynajmniej jedno źródło węgla.
9. Sposób według zastrz. 8, w którym wspomniane źródło węgla jest wybrane z grupy obejmującej glukozę, fruktozę i glicerol.
10. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że podłoże zawiera przynajmniej jedno źródło nieorganicznych soli K+, Na+, Mg++, NH4 +.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację przeprowadza się w pH obejmującym od 5 do 8.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że pH obejmuje od 6 do 7.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację przeprowadza się w temperaturze od 20° do 45°C.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że biotransformację przeprowadza się w temperaturze od 28° do 40°C.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację przeprowadza się przy maksymalnym poziomie napowietrzenia od 1 do 2 litrów powietrza na litr hodowli na minutę (vvm).
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że maksymalny poziom napowietrzenia obejmuje od 1,5 do 2 (vvm).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT97MI002255A IT1295272B1 (it) | 1997-10-03 | 1997-10-03 | Biotrasformazione di composti colchiconici nei corrispondenti 3- glicosilderivati |
| PCT/EP1998/006226 WO1999018229A1 (en) | 1997-10-03 | 1998-09-30 | A process for the biotransformation of colchicone compounds into the corresponding 3-glycosyl derivatives |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL339620A1 PL339620A1 (en) | 2001-01-02 |
| PL190865B1 true PL190865B1 (pl) | 2006-02-28 |
Family
ID=11377985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL339620A PL190865B1 (pl) | 1997-10-03 | 1998-09-30 | Sposób otrzymywania związków 3-O-glikozylokolchikonowych |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6372458B1 (pl) |
| EP (1) | EP1019521B1 (pl) |
| KR (1) | KR100536676B1 (pl) |
| CN (1) | CN1188527C (pl) |
| AT (1) | ATE328106T1 (pl) |
| AU (1) | AU745222B2 (pl) |
| CA (1) | CA2305046C (pl) |
| CZ (1) | CZ295749B6 (pl) |
| DE (1) | DE69834736T2 (pl) |
| DK (1) | DK1019521T3 (pl) |
| ES (1) | ES2264214T3 (pl) |
| HK (1) | HK1031896A1 (pl) |
| HU (1) | HU225686B1 (pl) |
| IL (1) | IL134566A (pl) |
| IT (1) | IT1295272B1 (pl) |
| NO (1) | NO320096B1 (pl) |
| PL (1) | PL190865B1 (pl) |
| PT (1) | PT1019521E (pl) |
| RU (1) | RU2218409C2 (pl) |
| SK (1) | SK285923B6 (pl) |
| WO (1) | WO1999018229A1 (pl) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040175782A1 (en) * | 2003-03-06 | 2004-09-09 | Tethys Research Llc | Biotransformation of compounds using non-prokaryotic microalgae |
| JP4580980B2 (ja) * | 2004-05-12 | 2010-11-17 | インデナ・ソチエタ・ペル・アチオニ | コルヒチノイド化合物のバイオトランスフォーメーション |
| KR20140014072A (ko) * | 2010-09-22 | 2014-02-05 | 엘리시안 라이프 사이언스이즈 프라이빗 리미티드 | 콜키시노이드 화합물의 미생물학적 생물전환 방법 |
| WO2015097567A1 (en) | 2013-12-23 | 2015-07-02 | Alkaloids Corporation | Process for the conversion of colchicinoids to their 3-glycosylated derivatives via their respective 3-demethyl analogues |
| CN105861601B (zh) * | 2016-04-29 | 2019-05-24 | 中国药科大学 | 一种生物转化制备二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(hmzg)的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1344157A (fr) * | 1959-05-22 | 1963-11-29 | Roussel Uclaf | Nouvelles colchicines et leur procédé d'obtention |
| JPS5233195B2 (pl) * | 1971-09-30 | 1977-08-26 | ||
| IT1285777B1 (it) * | 1996-10-07 | 1998-06-18 | Indena Spa | Processo di biotrasformazione di composti colchicinoidi nei corrispondenti 3-glicosilderivati |
-
1997
- 1997-10-03 IT IT97MI002255A patent/IT1295272B1/it active IP Right Grant
-
1998
- 1998-09-30 DK DK98952675T patent/DK1019521T3/da active
- 1998-09-30 CZ CZ20001196A patent/CZ295749B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-09-30 AT AT98952675T patent/ATE328106T1/de active
- 1998-09-30 PT PT98952675T patent/PT1019521E/pt unknown
- 1998-09-30 IL IL13456698A patent/IL134566A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-09-30 CA CA002305046A patent/CA2305046C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-30 SK SK483-2000A patent/SK285923B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-09-30 KR KR10-2000-7003216A patent/KR100536676B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-09-30 RU RU2000111512/13A patent/RU2218409C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-09-30 WO PCT/EP1998/006226 patent/WO1999018229A1/en active IP Right Grant
- 1998-09-30 ES ES98952675T patent/ES2264214T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-30 EP EP98952675A patent/EP1019521B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-30 AU AU10283/99A patent/AU745222B2/en not_active Ceased
- 1998-09-30 CN CNB988098180A patent/CN1188527C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-30 HU HU0004840A patent/HU225686B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-09-30 DE DE69834736T patent/DE69834736T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-30 PL PL339620A patent/PL190865B1/pl unknown
-
2000
- 2000-03-31 US US09/539,867 patent/US6372458B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-03 NO NO20001706A patent/NO320096B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-04-10 HK HK01102527A patent/HK1031896A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2252725C (en) | A process for the biotransformation of colchicinoid compounds into the corresponding 3-glycosyl derivatives | |
| Boeck et al. | NEW AZASTEROIDAL ANTIFUNGAL ANTIBIOTICS FROM GEOTRICHU FLAVO-BRUNNEUM I. DISCOVERY AND FERMENTATION STUDIES | |
| Yoshimoto et al. | New anthracycline metabolites from mutant strains of Streptomyces galilaeus MA144-M1 I. Isolation and characterization of various blocked mutants | |
| PL190865B1 (pl) | Sposób otrzymywania związków 3-O-glikozylokolchikonowych | |
| US8795986B2 (en) | Microbial method for the biotransformation of colchicinoid compounds | |
| US4522919A (en) | Method of producing antibacterial agents and bioconverting microorganism therefor | |
| JP4198883B2 (ja) | コルヒコン化合物を対応する３−グリコシル誘導体に生物学的に転換する方法 | |
| US4845037A (en) | Process for producing antibiotic LL-D42067α |