DE3706976A1 - Mikrobielle umwandlung von anthracyclinonen in das entsprechende 13-(s)-dihydro-13-0-ss-glucopyranosid - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue Anthracyclinonglucoside, nämlich 13-O-β-D-Glucoside von natürlichen und synthetischen Anthracyclinonen, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen.

Die neuen Anthracyclinonglucoside, welche im folgenden als Glucosid S (I) und FCE 24512 (II) bezeichnet werden, die gegenüber Bakterien und/oder Tumoren, wie Mäuse- bzw. Ratten-F-388-Leukämie, wirksam sind, besitzen die allgemeine Formel:

entsprechend 13-(S)-Dihydro-13-O-(β-D-glucopyranosyl)-daunomycinon (I) und seinem 4-Demethoxy-Analogen (II).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch eine neue blockierte Mutante des Spezies Streptomyces peucetius, die als Stamm M-99-FCE bezeichnet wird (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen am 5. September 1985 unter der Hinterlegungsnummer DSM 3464 und bei der American Type Culture Collection am 15. Oktober 1985 unter der Hinterlegungsnummer ATCC 53293) hergestellt. Dieser Mikroorganismus ist durch seine Fähigkeit charakterisiert, die funktionelle 13-Ketongruppe von Daunomycinon (III) oder von seinem 4-Demethoxy-Analogen (IV) unter Bildung der entsprechenden 13-(S)-Dihydroderivate (V und VI) stereoselektiv zu reduzieren und diese Derivate regioselektiv zu glucosidieren. Die entsprechenden 13-O-β-D-Glucoside (I) und (II) akkumulieren sich in den Fermentationsbrühen an.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Anthracyclinglucosids, wobei das Verfahren die Züchtung unter aeroben Bedingungen von Streptomyces peucetius-Stamm M-99-FCE (DSM 3464, ATCC 53293) in einem wäßrigen Nährmedium, welches ein assimilierbare Stickstoffquelle, eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und gegebenenfalls Mineralsalze und entweder Daunomycinon oder 4-Demethoxydaunomycinon während einer ausreichenden Zeit, daß das erfindungsgemäße Anthracyclinglucosid gebildet wird, und die Gewinnung des Anthracyclinglucosids aus dem Kulturmedium umfaßt.

Die Substrate für die erfindungsgemäßen mikrobiellen Bioumwandlungen sind Daunomycinon (III), welches durch Fermentation von Streptomyces peucetius erhalten wird und welches in der US-Patentschrift 40 12 284 beschrieben wird, und 4-Demethoxydaunomycinon (IV), ein synthetisches Anthracyclinon, welches in der US-Patentschrift 40 46 878 beschrieben wird. Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden Schema 1 erläutert:

Schema 1

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin pharmazeutische Zubereitungen, in denen die neuen Verbindungen (I) und (II), vermischt mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger, vorliegen. Eine therapeutisch wirksame Menge des Glucosids S (I) oder FCE 24512 kann mit einem Verdünnungsmittel oder Träger vermischt werden. Eine therapeutisch wirksame Menge von Glucosid S (I) oder FCE 24512 wird dem Patienten verabreicht, wenn diese Verbindungen verwendet werden, beispielsweise als Antibiotikum oder als Antitumormittel.

1. Der Mikroorganismus

Insbesondere wird ein neuer Mikroorganismus, eine blockierte Mutante von Streptomyces peucetius, die als Stamm M-99-FCE bezeichnet wird, beschrieben. Mutanten, welche durch ihre Fähigkeit charakterisiert sind, die 13-Ketonfunktion von Daunomycinon (III) und seinem 4-Demethoxy- Analogen (IV) stereoselektiv zu reduzieren und sie regioselektiv zu glucosidieren, wodurch eine Akkumulation von Glucosid S (I) und FCE 24512 (II) erhalten wird, können durch Mutation verschiedener Arten von Bakterien einschließlich Streptomyces erhalten werden.

Streptomyces peucetius, subsp. vinaceus, NRRL 15344, DSM 2597 wurde unter Verwendung von Nitrosoguanidin unter Bildung eines neuen Labormikroorganismus, welcher als Stamm M-99-FCE bezeichnet wird und der die Verbindungen (III) bzw. (IV) in Glucosid S (I) und FCE 24512 (II) "via" die Zwischenprodukte (V) und (VI) überführt, mutiert. Diese Mutante von S. peucetius var. vinaceus wird als Stamm M-99-FCE bezeichnet.

Die Morphologie des Mutanten M-99-FCE ist von der des Grundstamms S. peucetius var. vinaceus (DSM 2597, NRRL 15344) nicht unterscheidbar, wohingegen beide Kulturen sich in ihren kulturellen und biochemischen Eigenschaften klar unterscheiden. In der Tat bildet die Mutante M-99-FCE keine Pigmente auf festen und flüssigen Medien im Gegensatz zum Grundstamm S. peucetius var. vinaceus, welcher stattdessen rotviolette Pigmente bildet. Außerdem kann der Mutantenstamm M-99-FCE stereoselektiv die Verbindungen (III) und (IV) "via" die Zwischenprodukte (V) bzw. (VI) in das Glucosid S und FCE 24512 überführen, wohingegen die Grundkultur diese Bioumwandlungen nicht durchführt. Diese Eigenschaften des Mutanten M-99-FCE bewirken, daß die Mutante äußerst nützlich ist, wie es in der vorliegenden Anmeldung beschrieben wird.

2. Bioumwandlungsverfahren

Die erfindungsgemäßen Bioumwandlungsverfahren können in einer wachsenden Kultur des Stammes M-99-FCE unter Zugabe der Verbindungen (III) und (IV) als Substrate zu der Kultur während ihrer Inkubationszeit durchgeführt werden. Die Verbindungen (III) und (IV) können nach der Solubilisierung in einem nichtionischen Solubilisierungsmittel und Emulgiermittel, wie Chromophor EL (BASF), und nach Verdünnung mit sterilem destilliertem Wasser zugegeben werden. Der bevorzugte, jedoch nicht einschränkende Bereich der Konzentrationen der Verbindung (III) und (IV) in der Kultur beträgt von 50 bis 200 mg/l, bevorzugt 100 mg/l.

Die Kultur wird in einem Nährmedium gezüchtet, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Dextrine, Melassen und ähnliche. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Maisquellwasser, Hefeextrakt, Pepton, trockene Hefe von der Brauerei, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Casein, Fischmehl, Schlempen bzw. lösliche Rückstände von Destillationsanlagen, Fleischextrakt, Ammoniumsalze, Nitrate und ähnliche. Gemische aus diesen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen werden bevorzugt verwendet.

Spurenmetalle, wie beispielsweise Zink, Magnesium, Kobalt, Eisen und ähnliche, müssen nicht notwendigerweise zu den Fermentationsmedien hinzugegeben werden, da Leitungswasser und nichtgereinigte Bestandteile als Bestandteile der Medien vor ihrer Sterilisation verwendet werden. Das gleiche gilt für Phosphate.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Kultur Streptomyces peucetius-Stamm M-99-FCE (DSM 3464, ATCC 53293) in einem Kulturmedium, welches eine assimilierbare Stickstoffquelle, eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und gegebenenfalls Mineralsalze enthält und im wesentlichen von anderen Mikroorganismen frei ist.

Die Bioumwandlungsverfahren können im Bereich von etwa 24 Stunden bis etwa 8 Tagen, bevorzugt etwa 3 bis 8 Tagen, liegen. Im allgemeinen findet während der ersten 24 Stunden die stereoselektive Reduktion von (III) und (IV) statt, wobei man die entsprechenden 13-(S)-Dihydroderivate (V) und (VI) erhält, welche anschließend zu dem Glucosid S (I) und FCE 24512 (II) glucosidiert werden.

Die Inkubationstemperatur während der Umwandlungsverfahren kann im Bereich von etwa 25 bis etwa 37°C liegen und liegt bevorzugt bei etwa 28°C.

Die Bioumwandlungen können in Reaktoren verschiedener Größen und Kapazitäten bei belüfteten sterilen Bedingungen durchgeführt werden, wobei die flüssigen Kulturbrühen geschüttelt oder gerührt werden.

3. Analytische Bewertung

Das Fortschreiten der mikrobiellen Umwandlungsreaktion wird verfolgt, indem man Proben der Fermentation bei verschiedenen Zeitintervallen entnimmt und diese in einem Gemisch aus Acetonitril : Wasser (80 : 20) unter starkem Rühren mit Glasperlen extrahiert.

Die Suspension wird dann durch Papier filtriert, und nach geeigneter Konzentrierung wird das Filtrat der Dünnschichtchromatographie (TLC) für die qualitative Bewertung unterworfen, wobei als Eluierungsmittel ein Gemisch aus Chloroform : Toluol : Methanol, 7 : 3 : 3, (ausgedrückt durch das Volumen) verwendet wird.

Eine quantitative Bestimmung des Ausgangsmaterials, des Zwischenprodukts und der Endprodukte kann gemäß TLC erfolgen, indem man das oben beschriebene Eluierungssystem verwendet, die entsprechenden rotgefärbten Zonen abkratzt und mit Methanol eluiert und die letzte spektrophotometrischen Ablesung bei 496 nm für Glucosid S (V) und bei 482 nm für FCE 24512 (VI) durchführt.

4. Isolierverfahren

Nach den mikrobiellen Bioumwandlungen werden hauptsächlich die Verbindungen (I), (II), (V) und (VI) in den Mycelien gefunden, welche von den Fermentationsbrühen durch Filtration bei pH 6 mit Hilfe von Diatomeenerde abfiltriert werden.

Der Kuchen wird mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Acetonitril, Dioxan, Methanol und anderen niedrigen Alkoholen, extrahiert. Bevorzugt werden Aceton und Methanol verwendet. Die Extrakte werden gesammelt und bei verringertem Druck konzentriert.

Die Verbindungen (V) und (VI) können aus den wäßrigen Konzentraten oder den gefilterten Brühen durch Extraktion mit mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Dichlormethan oder Chloroform, gewonnen werden, während das Glucosid S (I) und FCE 24512 (II) aus wäßrigen Konzentraten oder gefilterten Brühen durch Extraktion bei pH 5 mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon und n-Butanol, gewonnen werden können. n-Butanol wird bevorzugt verwendet.

Die Verbindungen (I) und (II) in den filtrierten Brühen und in den wäßrigen Konzentraten können ebenfalls an einem hydrophoben vernetzten poylmeren Divinylbenzol-Harz, wie an Amberlite ER 180, XAD 4 (Rohm und Haas Co., Inc.) adsorbiert werden. Bevorzugt wird Amberlite ER 180 verwendet. Das adsorbierte Glucosid S und FCE 24512 werden leicht mit wäßrigen niedrigen Alkoholen eluiert, bevorzugt wird 50%iges Ethanol in Wasser verwendet (ausgedrückt durch das Gewicht).

5. Reinigungsverfahren

Die Reinigung der Verbindungen (V) und (VI), die aus organischen Extrakten erhalten werden, kann durch Silicagel- Säulenchromatographie unter Verwendung eines Chloroform : Methanol-Toluol-Gemisches, 7 : 3 : 3, (ausgedrückt durch das Volumen) als Eluierungsmittel erfolgen. Die Konzentrierung der ausgewählten Fraktionen ergibt reines (V) und (VI) in kristallinen Formen.

Für die Reinigung des Glucosids S und FCE 24512 werden die rohen Konzentrate und filtrierten Brühen, deren pH-Wert auf 6 eingestellt ist, durch eine Säule aus Amberlite-ER-180- Harz geleitet. Nach dem Waschen mit Wasser erfolgt die Eluierung mit einem Wasser-Ethanol-Gradientengemisch von 10 bis 100 Vol.-% Ethanol, und das Eluat wird in Fraktionen gesammelt.

Die ausgewählten Fraktionen, die dünnschichtchromatographisch geprüft werden, werden vereinigt und bei verringertem Druck zu einem wäßrigen Konzentrat konzentriert. Damit man reines Glucosid S und FCE 24512 erhält, wird der pH- Wert der rohen Konzentrate auf 5 eingestellt und dann wird an einer Säule mit Umkehrphase chromatographiert.

Die Eluierung erfolgt mit einem linearen Gradienten, beginnend mit einem 20%igen Methanol-Wasser-Gemisch bis zu reinem Methanol. Nach der TLC-Analyse werden die reinen Fraktionen gesammelt, bei verringertem Druck auf ein geringes Volumen in Anwesenheit eines niedrigen Alkohols konzentriert. Bevorzugt wird n-Propanol verwendet. Durch Zugabe eines Überschusses an n-Hexan erhält man das reine Glucosid S (I) und reines FCE 24512 (II).

Alternativ können rohes (I) und (II) in organischen Extrakten durch Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Chloroform-Methanol-Wasser-Gemisches, 150 : 42 : 6, (ausgedrückt durch das Volumen) als Eluierungsmittel gereinigt werden.

6. Chemische und physikalische Eigenschaften

13-(S)-Dihydrodaunomycinon (V), welches als rote kristalline Nadeln erhalten wird, und 4-Demethoxy-13-(S)-dihydrodaunomycinon (VI), das als orange kristalline Nadeln erhalten wird, sind in Dioxan, Dichlormethan, Chloroform, Aceton, Ethylacetat löslich, etwas löslich in niedrigen Alkoholen und Benzol, unlöslich in Wasser und n-Hexan. Die wesentlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften der Verbindungen (V) und (VI) sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Das Glucosid S (I), welches in Form feiner roter kristalliner Nadeln erhalten wird, ist in Wasser, niedrigen Alkoholen und polaren organischen Lösungsmitteln löslich, etwas löslich in Aceton, Ethylacetat, kaum löslich in Chloroform, Benzol und n-Hexan.

FCE 24512 (II), welches als orange kristalline Nadeln erhalten wird, ist in Dimethylsulfoxid, N,N-Dimethylformamid löslich, etwas löslich in niedrigen Alkoholen und Wasser, kaum löslich in Chloroform, Benzol und n-Hexan.

Die wesentlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften des Glucosids S (I) und FCE 24512 (II) sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Glucosid S (I): ¹H NMR-Spektrum (200 Mhz, DMSO d₆, 40°C): 1,27 (d, J = 6,2 Hz, 3 H CH₃-14), 1,83 (dd, J = 4,0 14,0 Hz, 1 H, H-8ax), 2,14 (dd, J = 1,0, 14,0 Hz, 1 H, H-8eq), 2,91 (m, 2 H, CH₂-10), 3,00 (m, 1 H, H-2′), 3,63 (q, J = 6,2 Hz, 1 H, H-13), 3,98 (s, 3 H OCH₃-4), 4,28 (d, J = 7,3 Hz, 1 H, H-1′), 5,02 (dd, J = 1,0, 4,0 Hz, 1 H, H-7), 7,6-7,9 (m, 3 H, H-1, H-2, H-3), 13,32 (s, 1 H CH-11) und 13,96 (s, 1 H, OH-6).

¹³C NMR-Spektrum (50 MHz, DMSO d₆): 186,2, 186,1 (C-5, C- 12); 160,6 (C-4); 155,9 (C-6); 155,1 (C-11); 138,1 (C-6a); 136,0 (C-2); 134,8, 134,6 (C-12a, C-10a); 119,9 (C-4a); 119,5 (C-3); 118,8 (C-1); 110,3 (C-5a); 110,2 (C-11a); 105,2 (C-1′); 82,8 (C-13); 76,4, 76,8 (C-3′, C-5′); 73,9 (C-2′); 72,4 (C-9); 70,0 (C-4′); 61,1 (C-6′); 60,8 (C-7); 56,5 (OCH₃-4); 33,3 (C-8); 32,0 (C-10) und 16,2 p. p. m. (C-14).

FCE 24512 (II): ¹H-NMR-Spektrum (200 MHz, DMSO-d₆, 45°C): 1,26 (d, J = 6,2 Hz, 3 H, CH₃-14), 1,82 (dd, J = 4,7, 14,2 Hz, 1 H, H-8ax), 2,14 (dd, J = ≦ωτ1, 14,7 Hz, 1 H, H-8-eq), 2,88 (m, 2 H, CH₂+10), 3,00 (dd, J = 7,5, 7,5 Hz, 1 H, H-2′), 3,65 (q, J = 6,2 Hz, 1 H, H-13), 4,30 (d, J = 7,5, 1 H, H-1′), 4,97 (dd, J = 1, 4,7 Hz, 1 H, H-7), 7,96 (m, 2 H, H-2, H-3), 8,26 (m, 2 H, H-1, H-4) und 13,37 (bs, 2 H, OH-6, OH-11).

7. Strukturbestimmung

Die Struktur und die absolute Konfiguration an chiralen C-13-Zentren der Verbindungen (V) und (VI) wurden nach Vergleich ihrer 9,13-O-Isopropylidenderivate mit Proben von 13-(S)-Dihydro-9,13-O-isopropylidendaunomycinon und 4-Demethoxy- 13-(S)-dihydro-9,13-O-isopropylidendaunomycinon, welche unter Verwendung der entsprechenden Aglycone als Ausgangsmaterialien (erhalten durch saure Hydrolyse von 13-(S)-Dihydrodaunorubicin und 4-Demethoxy-13-(S)-Dihydrodaunorubicin, wie von S. Penco, G. Cassinelli et al. in Gazzetta Chimica Italiana 115, 195, 1985 beschrieben) hergestellt wurden, bestimmt.

Eine Verbindung mit einer Strukturformel entsprechend der von (V), der aber die stereospezifische Zuordnung für das chirale C-13-Zentrum fehlt, wurde kürzlich in der US-Patentschrift 36 86 103 beschrieben.

Die Struktur, die dem Glucosid S und FCE 24512 entsprechend 13-(S)-Dihydro-13-O-(β-D-glucopyranosyl)-daunomycinon (I) und seinem 4-Demethoxy-Analogen (II) zugeordnet wurde, wurde wie in Schema 2 bestimmt.

Schema 2

Die saure Methanolyse von (I) und (II) ergibt die 13-(S)- Dihydroaglycone (V) bzw. (VI) und Methyl-α-D-glucopyranosid (VII), welche alle durch direkten Vergleich mit authentischen Proben identifiziert wurden.

Die enzymatische Inkubation von (I) und (II) mit β-D-Glucosidase bestätigt die Anwesenheit eines Molekülteils von β-D-Glucose (VIII), gebunden an 13-(S)-Dihydroaglycone (V) und (VI).

Die Stellung und die β-Konfiguration der glucosidischen Bindung in dem Glucosid S (I) und FCE 24512 (II) wurde ebenfalls aufgrund der ¹H- und ¹³C-NMR-Spektra zugeordnet.

8. Biologische Aktivität

Die antibakterielle Aktivität der neuen Glucoside (I) und (II) wurde "in vitro" unter Verwendung eines Standardglasverdünnungsverfahrens zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) für einige Mikroorganismen bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben und zeigen, daß FCE 24512 (II) eine signifikante Aktivität gegen grampositive Bakterien aufweist.

Tabelle 3

Antibakterielle Aktivität von Glucosid S (I) und FCE 24512 (II)

Bei einer "in vitro"-Prüfung eines Kolonieinhibierungstests an Hela-Zellen, die den Arzneimitteln während 24 Stunden ausgesetzt waren, zeigen das Glucosid S und FCE 24512 cytotoxische Aktivität, wobei ihr ID₅₀ 1,9 bzw. 1,15 µg/ml beträgt.

Das Glucosid S (I) ist gegenüber ascitischer P-388-Leukämie in Mäusen aktiv, was aus Tabelle 4 hervorgeht. CDF-1-Mäuse werden intraperitoneal (i. p.) mit 10⁶ Zellen/Maus transplantiert. Die Behandlung mit dem Glucosid S (I) erfolgt i. p. 24 Stunden danach.

Tabelle 4

Antitumoraktivität von Glucosid S (I) gegenüber P-388-Leukämie

Bei den gleichen Versuchsbedingungen zeigt FC 24512 eine vergleichsweise Aktivität gegenüber P-388-Leukämie in Mäusen bei einer optimalen Dosis von 25 mg/kg mit einem T/C% = 167 und 0/10 toxischen Todesfällen.

Die folgenden Beispiele erläutern die erfindungsgemäßen Verfahren und Produkte.

Beispiel 1

Eine Kultur von Streptomyces peucetius, Stamm M-99-FCE (DSM 3464), wurde während 14 Tagen bei 28°C auf Agarschrägplatten mit dem folgenden Erhaltungsmedium gezüchtet: Saccharose, 2%; Maisquellwasser, 1%; KH₂PO₄, 0,4%; CaCO₃, 0,4%; (NH₄)₂SO₄, 0,2%; Agar, 2%; Leitungswasser bis zu 100 ml; pH 6,4; die Sterilisierung erfolgt durch Erhitzen in einem Autoklaven bei 115°C während 20 min.

Das Mycelium der so gezüchteten Kultur wird gesammelt und erneut in 3 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. Nach mäßiger Homogenisierung mit Glasschichten wird diese Suspension zum Inokulieren in 300 ml Erlenmeyer-Kolben verwendet, welche 60 ml des folgenden flüssigen Impfmediums enthalten: Saccharose, 3,6%; Maisquellwasser, 2,4%; CaCO₃, 0,9%; (NH₄)₂SO₄, 0,24%; Leitungswasser bis zu 100 ml; pH 6,7; die Sterilisierung erfolgt in einem Autoklaven bei 115°C während 20 min.

Die inokulierten Kolben werden während 2 Tagen bei einer Temperatur von 28°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung, die mit 250 Upm betrieben wird und Kreise im Durchmesser von 7 cm beschreibt, geschüttelt. 1,5 ml der oben beschriebenen gezüchteten Kultur werden zum Inokulieren in 300 ml Erlenmeyer-Kolben, welche 50 ml des folgenden Umwandlungsmediums enthalten, verwendet: Glucose, 6%; trockene Brauereihefe, 3%; NaCl, 0,2%; KH₂PO₄, 0,1%; CaCO₃, 0,3%; MgSO₄, 0,01%; FeSO₄ · 7 H₂O, 0,001%; ZnSO₄ · 7 H₂O, 0,001%; CuSO₄ · 5 H₂O, 0,001%; Leitungswasser bis zu 100 ml; pH 6,8; die Sterilisierung erfolgte in einem Autoklaven bei 115°C während 20 min. Die Glucoselösung wird getrennt bei 110°C während 20 min sterilisiert und zu dem jeweiligen Kolben mit einer geeigneten Konzentration gegeben. Die Kolben werden so bei 28°C bei den Bedingungen, wie sie für die Impfphase beschrieben wurden, ca. 65 h inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird Daunomycinon (III), gelöst in einem Gemisch aus Chromophor EL (BASF) und sterilem destilliertem Wasser, zu jedem Kolben bis zu einer Endkonzentration von 100 mcg/ml zugegeben. Die geschüttelten Kolben werden weiter 24 h inkubiert, wobei man eine 70%ige Umwandlung von (III) in sein 13-(S-)-Dihydroderivat (V) erhält.

Beispiel 2

Wird eine Kultur von S. peucetius, Stamm M-99-FCE, wie in Beispiel 1 gezüchtet und wird Daunomycinon (III) bis zu einer Endkonzentration von 100 mcg/ml zugegeben und wird die Bioumwandlung bei den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, während einer Zeit von 3 Tagen durchgeführt, so stellt man fest, daß 60% von (III) in Glucosid S (I) und 30% in das 13-(S)-Dihydroderivat (V) überführt wurden.

Beispiel 3

Eine Kultur von S. peucetius, Stamm M-99-FCE, wird in einem festen Medium, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Die Mycelienmatte von drei Schrägkulturen wird gesammelt und in 20 ml sterilem destilliertem Wasser gesammelt. Die nach mäßiger Homogenisierung mit Glasschichten erhaltene Suspension wird in einem 2-l-Kolben mit rundem Boden und Ablenkblechen, welcher 50 ml des in Beispiel 1 beschriebenen Impfmediums enthält, inokuliert. Der Kolben wird während 28 h auf einer Rotationsschüttelvorrichtung, die mit 120 Upm betrieben wird und einen Kreis mit einem Durchmesser von 7 cm beschreibt, bei einer Temperatur von 28°C inkubiert. Das gesamte Impfmaterial wird dann zur Inokulation in einer 10-l-Glasfermentationsvorrichtung verwendet, welche 7,5 l des in Beispiel 1 beschriebenen Bioumwandlungsmediums enthält. Man sterilisiert in einem Autoklaven bei 120°C während 30 min. Die Glucoselösung wird getrennt sterilisiert und in einer geeigneten Konzentration zu der sterilisierten Fermentationsvorrichtung gegeben.

Die Kultur kann bei 28°C und Rühren bei 230 Upm und bei Lüftung mit einem Luftstrom von 0,7 l/l Medium/min wachsen. Nach 65 h wird Daunomycinon (III) bei den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen und der dort gegebenen Konzentration zugegeben. Die Kultur wird dann weitere 24 h fortgeführt, wobei man eine 60%ige Umwandlung von (III) in sein 13-(S)-Dihydroderivat (V) erhält.

Beispiel 4

Eine Kultur von S. peucetius, Stamm M-99-FCE, wird auf einem festen Medium, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Unter Verwendung der Mycelienmatte von drei Schrägkulturen wird eine Fermentation in einem 10-l-Maßstab, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt. Nach 65 h wird Daunomycinon (III), wie in Beispiel 1 beschrieben, zugegeben, und die Bioumwandlung wird während 70 h durchgeführt. Man stellt fest, daß zu diesem Zeitpunkt 60% von (III) in das Glucosid S (I) und 32% in 13-(S)-Dihydroderivat (V) umgewandelt sind.

Beispiel 5

Eine Kultur von dem S. peucetius-Stamm M-99-FCE wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, wobei der einzige Unterschied darin besteht, daß 4-Demethoxydaunomycinon (IV) in einer Suspension von Cromofor EL (BASF) und sterilem destilliertem Wasser bis zu einer Endkonzentration von 100 mcg/ml gegeben wird. Die Kultur wird dann weitere 30 h fortgeführt, wobei man eine 60%ige Umwandlung von IV in sein 13-(S)-Dihydroderivat (VI) erhält.

Beispiel 6

Eine Kultur von dem S. peucetius-Stamm M-99-FCE wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, und nach Zugabe von 4-Demethoxydaunomycinon (IV), wie in Beispiel 5 beschrieben, erfolgt die Bioumwandlung während einer Zeit von 4 Tagen. Es wurde festgestellt, daß zu diesem Zeitpunkt 50% von (IV) in sein 13-(S)-Dihydroderivat (VI) und 25% in FCE 24512 (II) umgewandelt worden sind.

Beispiel 7

Eine Kultur von dem S. peucetius-Stamm M-99-FCE wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, wobei man die Mycelienmatte von drei Schrägkulturen als Ausgangsmaterial verwendet und die Fermentierung in einem 10-l-Maßstab, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchführt. Nach der Zugabe von (IV), wie in Beispiel 5 beschrieben, erfolgt die Bioumwandlung während einer Zeit von 30 h, wobei man eine 50%ige Umwandlung von (IV) in sein 13-(S)-Dihydroderivat (VI) erhält.

Beispiel 8

Eine Kultur von dem S. peucetius-Stamm M-99-FCE wird, wie in Beispiel 7 beschrieben, gezüchtet, wobei der einzige Unterschied der ist, daß die Bioumwandlung während einer Zeit von 4 Tagen durchgeführt wird. Es wurde festgestellt, daß zu diesem Zeitpunkt 40% von (IV) in sein 13-(S)-Dihydroderivat (VI) und 20% in FCE 24512 (II) umgewandelt worden sind.

Beispiel 9

Die gesamte Kultur (8 l), welche gemäß Beispiel 3 erhalten wurde, wird bei einem pH-Wert von 6 unter Verwendung von Diatomeenerde (3%, w/v) als Filterhilfsmittel filtriert. Der nasse Filterkuchen wird mit Aceton (2 l) extrahiert. Nach der Filtration werden zwei zusätzliche Extraktionen (mit 1,5 bzw. 1 l) durchgeführt, um eine vollständige Gewinnung der roten Pigmente sicherzustellen. Die vereinigten Extrakte werden bei verringertem Druck auf ein geringes Volumen (400 ml) konzentriert, dann mit einer 9 : 1-(v/v)- Dichlormethan-Methanol-Mischung extrahiert. Der organische Extrakt wird konzentriert und der Rückstand wird, gelöst in Chloroform, an einer Silicagelsäule chromatographiert. Es wird ein Chloroform-Methanol-Toluol-Gemisch, 7 : 3 : 3, (ausgedrückt durch das Volumen) als Eluierungsmittel verwendet, und das sich schneller bewegende Daunomycinon (III) wird von seinem 13-(S)-Dihydroderivat (V) abgetrennt. Eine Konzentrierung der ausgewählten Fraktionen ergibt reines (III) [0,3 g] und (V) [0,45 g; Fp. 230 bis 232°C].

Beispiel 10

Die gesamte Kultur (8 l), erhalten gemäß Beispiel 4, wird nach Zugabe von Diatomeenerde (3% w/v) bei pH 6 filtriert. Der nasse Filterkuchen wird mit Methanol (2 l) extrahiert, und nach der Filtration werden zwei zusätzliche Extraktionen (mit 1,5 bzw. 1 l) durchgeführt, um eine vollständige Gewinnung der roten Pigmente sicherzustellen. Die Extrakte werden bei verringertem Druck auf ein geringes Volumen (600 ml) konzentriert, mit dem Kulturfiltrat vereinigt und an einer Säule (2,3 × 27 cm), die mit dem Harz Amberlite ER 180® (200 ml) gefüllt ist, adsorbiert. Nachdem die anfängliche wäßrige Waschlösung verworfen wird, erfolgt die Eluierung mit einem Wasser-Ethanol-Gradientengemisch von 10 bis 100% Ethanol (Gesamtvolumen 2000 ml). Ausgewählte Fraktionen, die gemäß TLC geprüft werden, werden gesammelt und bei verringertem Druck konzentriert, wobei man ein wäßriges Konzentrat (20 ml) erhält, welches rohes Glucosid S (I) enthält, und wobei man eine wäßrige Suspension (40 ml) von 13-(S)-Dihydrodaunomycinon (V) mit geringen Mengen an Daunomycinon (III) erhält, welches gemäß dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren abgetrennt wird, wobei man reines (V) [0,25 g] und (III) [0,03 g] erhält.

Beispiel 11

Ein wäßriges Konzentrat (600 ml), erhalten aus einem methanolischen Mycelextrakt (wie in Beispiel 10 beschrieben), wird mit dem Kulturfiltrat vereinigt, der pH wird auf 5 eingestellt und dann wird nacheinander mit Dichlormethan und n-Butanol extrahiert. Die Konzentrierung des Dichlormethanextrakts, welcher (V) und geringe Mengen an (III) enthält, und die anschließende chromatographische Trennung, wie in Beispiel 9 beschrieben, ergibt reines (V) [0,24 g] und (III) [0,03 g]. Der Butanolextrakt wird bei verringertem Druck konzentriert, und durch Zugabe eines Überschusses an n-Hexan wird rohes Glucosid S (I, 0,55 g) als rotes Pulver erhalten, welches durch Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt wird. Nach der Eluierung mit einem Chloroform : Methanol-Wasser-Gemisch, 150 : 42 : 6 (ausgedrückt durch das Volumen) werden die ausgewählten Fraktionen konzentriert, wobei man das reine Glucosid S (I, 0,45 g) als rotes Pulver (Fp. 175 bis 176°C) erhält.

Beispiel 12

Eine wäßrige Lösung (20 ml) des rohen Glucosids S (I), erhalten gemäß Beispiel 11, deren pH mit Chlorwasserstoffsäure auf 5 eingestellt wurde, wird an einer Lichroprep-RP-8-Säule (310 × 25 mm, Teilchengröße 40 bis 63 µm, E. Merck) chromatographiert. Die Eluierung erfolgt mit einem linearen Gradienten unter Verwendung eines 1 : 4-Methanol-Wasser-Gemisches bis zu reinem Methanol.

Nach der TLC-Analyse werden die reinen Fraktionen gesammelt und bei verringertem Druck auf ein geringes Volumen in Anwesenheit von n-Propanol konzentriert. Durch Zugabe eines Überschusses an n-Hexan wird das reine Glucosid S (I) (450 mg) als rotes kristallines Pulver (Fp. 175 bis 176°C) erhalten.

Beispiel 13

Die gesamte Kultur (8 l), erhalten gemäß Beispiel 7, wird, wie in Beispiel 9 beschrieben, filtriert und extrahiert. 4-Demethoxydaunomycinon (IV) wird von seinem 13-(S)-Dihydroderivat (VI) durch Silicagel-Chromatographie, wie in Beispiel 9 beschrieben, abgetrennt. Eine Konzentrierung der ausgewählten Fraktionen ergibt reines (IV) [0,35 g] und (VI) [0,36 g, Fp. 240 bis 241°C].

Beispiel 14

Die gesamte Kultur (8 l), erhalten gemäß Beispiel 8, wird, wie in Beispiel 10 beschrieben, filtriert, extrahiert und aufgearbeitet, wobei man ein rohes Gemisch aus 4-Demethoxydaunomycinon (IV) und seinem 13-(S)-Dihydroderivat (VI) und ein rohes wäßriges Konzentrat aus FCE 24512 (II) erhält. Die Trennung und Reinigung durch Silicagel-Chromatographie erfolgt wie in Beispiel 9. Man erhält reines (IV) [0,32 g] und (VI) [0,31 g].

Beispiel 15

Ein wäßriges Konzentrat (600 ml), erhalten aus einem methanolischen Myceliumextrakt (wie in Zeilen 1 bis 5 von Beispiel 10 beschrieben), wird mit dem Filtrat einer Kultur aus S. peucetius-Stamm M-99-FCE, gezüchtet wie in Beispiel 1 beschrieben, vereinigt und nach der Zugabe von 4-Demethoxydaunomycinon, wie in Beispiel 5 beschrieben, aufgearbeitet, wie in Beispiel 11 beschrieben, wobei man reines (IV) [0,31 g] und (VI) [0,3 g] und FCE 24512 (0,15 g) erhält.

Beispiel 16

Eine wäßrige Lösung (20 ml) des rohen FCE 24512, erhalten gemäß den Beispielen 14 und 15, wird an einer Lichroprep- RP-8-Säule, wie in Beispiel 12 beschrieben, chromatographiert. Reines FCE 24512 (0,16 g) wird als orangenfarbige kristalline Nadeln (Fp. 175 bis 176°C) erhalten.

Beispiel 17

Eine methanolische Lösung (10 ml) des Glucosids S (50 mg), erhalten gemäß Beispiel 12, wird während 16 h am Rückfluß in Anwesenheit eines stark sauren kationischen Austauscherharzes (Dowex 50 W × 2, 100 bis 200 mesh - entsprechend einem Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,149 bis 0,074 mm), welches zuvor mit Methanol gewaschen worden war, erhitzt. Das Reaktionsgemisch, verdünnt mit Methanol, wird filtriert, und das Harz wird auf dem Filter mit Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden auf ein geringes Volumen bei verringertem Druck konzentriert, mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert. Nach dem Waschen mit Wasser wird die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und auf ein geringes Volumen konzentriert. Nach der Zugabe von n-Hexan erhält man eine rote kristalline Verbindung (20 mg), welche als 13-(S)-Dihydrodaunomycinon (V) durch Vergleich mit einer authentischen Probe identifiziert wurde. Der in der gefriergetrockneten wäßrigen Phase vorhandene Bestandteil wird als Methyl-α-D-glucopyranosid (VII) nach Vergleich mit einer authentischen Probe identifiziert.

Beispiel 18

Eine Lösung von Glucosid S (I, 0,20 g) in Wasser (500 ml) wird mit β-D-Glucosidase (Sigma Chem. Corp.; Typ I G 4511, 100 Einheiten in 12 ml 0,15 M Acetatpuffer bei pH 5) behandelt und während 4 h bei 37°C inkubiert. Aus dem Ethylacetatextrakt erhält man 13-(S)-Dihydrodaunomycinon (V) [0,01 g], während in der wäßrigen Phase die Anwesenheit von D-Glucose (VIII) durch chromatographischen Vergleich mit einer authentischen Probe bestätigt wurde.

Beispiel 19

FCE 24512 (II, 50 mg), erhalten gemäß Beispiel 16, wird der sauren Methanolyse, wie in Beispiel 17 beschrieben, unterworfen, wobei man das Aglycon (20 mg) erhält, welches durch Vergleich mit authentischen Proben als 4-Demethoxy- 13-(S)-dihydrodaunomycinon (VI) und Methyl-α-D-glucopyranosid (VII) identifiziert wurde.

Beispiel 20

FCE 24512 (II, 20 mg) wird enzymatisch, wie in Beispiel 18 beschrieben, hydrolysiert, wobei man das Aglycon (VI, 10 mg) und D-Glucose (VIII) erhält, die durch Vergleich mit authentischen Proben identifiziert wurden.

Claims (19)

1. Anthracyclinglucosid der allgemeinen Formel: worin R ein Wasserstoffatom oder eine Methoxygruppe bedeutet.

2. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 13-(S)-Dihydro- 13-O-(β-D-glucopyranosyl)-daunomycinon.

3. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 13-(S)-Dihydro- 13-O-(β-D-glucopyranosyl)-4-demethoxydaunomycinon.

4. Verfahren zur Herstellung eines Anthracyclinglucosids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man unter aeroben Bedingungen den Streptomyces peucetius- Stamm M-99-FCE (DSM 3464, ATCC 53293) in einem wäßrigen Medium, welches eine assimilierbare Stickstoffquelle, eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und Mineralsalze und entweder Daunomycinon oder 4-Demethoxydaunomycinon enthält, während einer Zeit züchtet, die ausreicht, ein Anthracyclinglucosid nach Anspruch 1 zu ergeben, und das Anthracyclinglucosid aus dem Kulturmedium gewinnt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Streptomyces peucetius-Stamm M-99-FCE (DSM 3464, ATCC 53293) während 3 bis 8 Tagen bei einer Temperatur von 25 bis 37°C gezüchtet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur etwa 28°C beträgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Anthracyclinglucosid gewonnen wird, indem man die gesamte Kultur bei pH 6 an Diatomeenerde filtriert, den nassen Filterkuchen mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel erschöpfend extrahiert, die so erhaltenen Extrakte bei verringertem Druck konzentriert, die konzentrierten Extrakte mit der gefilterten Brühe vereinigt und das Anthracyclinglucosid aus dem entstehenden wäßrigen Konzentrat entweder (i) bei einem pH-Wert 5 mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel oder (ii) durch Durchleiten des Konzentrats durch ein hydrophobes vernetztes polymeres Divinylbenzol-Harz extrahiert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel Aceton, Acetonitril, Dioxan oder einen C₁-C₄-Alkohol verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser unmischbares Lösungsmittel Methylisobutylketon oder n-Butanol verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Anthracyclinglucosid gemäß dem Verfahren (ii) extrahiert wird, indem man das Konzentrat, dessen pH-Wert auf 6 eingestellt ist, durch das Harz leitet, mit Wasser wäscht, das Anthracyclinglucosid aus dem Harz mit einem Wasser-Ethanol-Gradientengemisch von 10 bis 100 Vol.-% Ethanol eluiert, die gesammelten Fraktionen bei verringertem Druck auf ein geringes Volumen konzentriert, den pH-Wert des Konzentrats mit Chlorwasserstoffsäure auf 5 einstellt, das Konzentrat bei einem pH- Wert von 5 unter Verwendung eines linearen Gradienten, ausgehend von einem 1 : 4-Methanol-Wasser-Gemisch bis zu reinem Methanol, als Eluierungsmittel chromatographiert, die gesammelten Fraktionen bei verringertem Druck in Anwesenheit von n-Butanol auf ein geringes Volumen eindampft und das reine Glucosid durch Zugabe eines Überschusses an n-Hexan und anschließender Filtration gewinnt.

11. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Anthracyclinglucosid nach Anspruch 1 im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger enthält.

12. Kultur aus einem Streptomyces peucetius-Stamm M-99-FCE (DSM 3464, ATCC 53293) in einem Kulturmedium, welches eine assimilierbare Stickstoffquelle, eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und gegebenenfalls Mineralsalze enthält und im wesentlichen von anderen Mikroorganismen frei ist.

13. Streptomyces peucetius-Stamm M-99-FCE (DSM 3464, ATCC 53293).

14. Anthracyclinglucosid nach Anspruch 1 für die Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des Menschen- oder Tierkörpers durch Chirurgie oder Therapie oder für die Diagnose an einem Menschen- oder Tierkörper.

15. Glucosid nach Anspruch 14 für die Verwendung als Antibiotikum.

16. Glucosid nach Anspruch 14 für die Verwendung als Antitumormittel.

17. Verfahren zur Herstellung eines Anthracyclinglucosids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren, wie in den Beispielen 10, 11 und 12 zusammen oder in den Beispielen 15 und 16 zusammen oder in den Beispielen 8, 14 und 16 zusammen beschrieben, durchgeführt wird.

18. Verbindung der allgemeinen Formel: worin R ein Wasserstoffatom oder eine Methoxygruppe bedeutet.

19. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man unter aeroben Bedingungen Streptomyces peucetius-Stamm M-99-FCE (DSM 3464, ATCC 53293) in einem wäßrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Stickstoffquelle, eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und gegebenenfalls Mineralsalze und entweder Daunomycinon oder 4-Demethoxydaunomycinon während einer ausreichenden Zeit kultiviert, um eine Verbindung nach Anspruch 18 zu bilden, und die Verbindung aus dem Kulturmedium gewinnt.