DE2554530B1

DE2554530B1 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von l-serin

Info

Publication number: DE2554530B1
Application number: DE19752554530
Authority: DE
Inventors: Fritz Prof Dr 3301 Stockheim Sahm Hermann Dr 3340 Wolfenbuttel Keune Walter Hartmut Dipl-Biol 3300 Braunschweig Wagner
Original assignee: Gesellschaft fur biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig
Priority date: 1975-12-04
Filing date: 1975-12-04
Publication date: 1977-08-11
Also published as: FR2333859A1; JPS52105287A; JPS5737320B2; CH611337A5; US4060455A; GB1530940A; FR2333859B1; DE2554530C2; DE2554530A1

Description

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L-Serin ist eine bekannte Aminosäure, die als Nahrungsmittelzusatz, in der Arzneimittel- und Kosmetik-Industrie verwendet wird. L-Serin ist auch Ausgangssubstanz zur Herstellung anderer wertvoller Verbindungen wie beispielsweise Methylserin. L-Serin kann für die Herstellung synthetischer Fasern Bedeutung erlangen, da optisch aktives Serin neben L-Alanin und Glycin Hauptbestandteil der Naturseide ist.

Nach bekannten Verfahren wird L-Serin dadurch gewonnen, daß DL-Serin synthetisch hergestellt und dann zur Gewinnung von L-Serin in die entsprechenden optischen Isomeren getrennt wird.

Die japanische Patentschrift 17 728/67 betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von L-Serin, welchem zusätzlich zur Kohlenstoff- und Energiequelle DL-Glycerinsäure zugesetzt wird.

Aus der DT-PS 19 16 421 ist ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von L-Serin bekannt, welches Kohlenhydrate oder Kohlenwasserstoffe als Substrate einsetzt. Die in diesem Verfahren verwendeten Mikroorganismen benötigen Isoleucin zum Wachstum.

Es ist auch ein Verfahren bekannt, bei dem Glycin, im Stoffwechesl eine Vorstufe von Serin, mikrobiell zu L-Serin umgesetzt wird (J, Agric. Chem. Soc. Jap., 48 [2], 125-129, 1974). Als Kohlenstoff- und Energiequelle wird nach diesem mikrobiellen Verfahren bevorzugt Glukose verwendet.

Dem Verfahren der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der Verwendung einer teuren und fermentationstechnisch ungünstigen Kohlenstoff- und Energiequelle der bekannten Verfahren zu vermeiden und L-Serin mikrobiologisch auf Methanolbasis und unter Zugabe der preiswerten Serinvorstufe Glycin zu erzeugen. Erst die Kombination dieser Stoffe führt zur Lösung der Aufgabe der Erfindung in Verbindung mit den neuen Mikroorganismen.

Es wurde nun ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß in einem mit Luft oder (^-angereicherter Luft begastem Reaktor bei einer Reaktionstemperatur von 20 -40° C mit dem fakultativ Methanol verwertenden Bakterium Pseudomonas sp. DSM 672 oder mit Mutanten dieses Baktierums, bei denen der Serin-Abbau geblockt ist, unter Verwendung anorganischer Nährstoffe eine Submerskultur erzeugt wird, wobei zunächst die Vermehrung des Bakteriums bei einer Methanol-Konzentration von 0,1 -1,0 Vol.-% als Kohlenstoff- und Energiequelle und bei einem pH-Wert von 6,5-8,0 durchgeführt wird, und zur Produktion des L-Serins durch die erhaltenen Bakterien sodann die Methanol-Konzentration auf einen konstanten Wert zwischen 0,5-2,0 Vol.-%, die Anfangs-Glycin-Konzentration auf einen Wert von 0,5—2,0 Gew.-% und der pH-Wert auf 8,0-9,0 eingestellt werden, die Zellmasse aus dem Kulturfiltrat abgetrennt und schließlich das L-Serin in bekannter Weise aus dem Kulturfiltrat isoliert wird.

Es wurde weiter ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Mutante der Stamm DSM 673 eingesetzt wird.

Ferner wurde ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Rührung des Reaktors mechanisch erfolgt und daß eine Reaktortemperatur von 28 - 33° C eingestellt wird.

Es wurde außerdem ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das Kulturfiltrat teilweise in den Reaktor zurückgeführt wird.

Weiter wurde ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Vermehrung des Bakteriums oder der Mutanten kontinuierlich in einem ersten Reaktor erfolgt und diese in einen zweiten Reaktor überführt und dort unter den Bedingungen der Produktion behandelt wird. Es wurde noch ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die L-Serin-Produktion durch das Bakterium unter Zusatz von oberflächenaktiven Stoffen oder die Zellwand beeinflussenden Substanzen zwecks Erhöhung der Permeabilität erfolgt, vorzugsweise unter Zusatz von Lauryl-Sulfat. Ferner wurde ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als

N-Quelle Harnstoff und/ode. NH₄- bzw. NO₃-Salze eingesetzt werden.

Für das Verfahren der Erfindung zur Herstellung von L-Serin wird der Methanol verwertende Mikroorganismus Pseudomonas sp. DSM 672, der aus einer Bodenprobe isoliert wurde, oder die Mutante DSM 673 eingesetzt.

Das Bakterium Pseudomonas sp. DSM 672 ist bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen mit der Nummer DSM 672 und die Mutante mit der Nummer DSM 673 hinterlegt. Das Bakterium DSM 672 ist durch folgende Eigenschaften charakterisiert:

1. Zellmorphologie:
Stäbchen in Grenzen
beweglich, mit einer polaren Geißel

2. Kolonienmorphologie:

kräftig rosa, rund und glatt, etwa 0,5 - 2 mm
Durchmesser nach 3-4 Tagen

3. Stammeigenschaft:

gram-negativ, Zelltrockenmasse kräftig rosa

4. Physiologie:

streng aerob, Methanol-Dehydrogenase positiv,
Hydroxypyruvat-Reduktase positiv,
Hexosephosphat-Synthetase negativ

5. Wachstumseigenschaften:

Min. Opt.

Max.

Temperatur (⁰C)	(V/V)	5-10	28-33	37
pH	6,0	7-8	9,0
Methanolkonz. (%)	0,2	0,5-1,5	4,0

Pseudomonas sp. DSM 672 kann auf Methanol und auf bestimmten organischen Säuren wie Succinat, Pyruvat und Malat als Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen, dagegen nicht auf Methan, Methylamin, Äthanol, Acetat oder Glukose.

Das Verfahren der Erfindung kann auch mit Mutanten des Pseudomonas sp. DSM 672 Stammes durchgeführt werden, die sich vom Wildtyp dadurch unterscheiden, daß sie auf Succinat als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle nicht mehr ohne Zugabe von Glycin wachsen können. Solche Mutanten lassen sich mit Hilfe chemischer und physikalischer Methoden gewinnen. Diese besitzen auch die L-Serin-Ansammlungsfähigkeit des Ausgangsstammes. Zu den Maßnahmen, mit denen die genannten Mutanten erzeugt werden können, gehören beispielsweise Röntgen- und Ultraviolettstrahlen, Behandlungen mit Stickstoff-Senfgasen oder organischen Peroxiden.

Das Verfahren der Erfindung wird durch folgende Beispiele beschrieben:

Beispiel 1

Eine Agar-Schrägröhrchen-Kultur von Pseudomonas sp. DSM 672 auf definiertem Medium wird in ein flüssiges Medium von 100 ml/Kolben überführt, welches vorher 20 min bei 120⁰C sterilisiert und dann aseptisch mit 1% Methanol versetzt wurde.
Das Medium enthält folgende Nährstoffe: KH₂PO₄,

S 0,30 g; Na₂HPO₄, 0,45 g; (NH₄J₂SO₄, 0,20 g; MgSO₄ · 7 H₂O, 0,04 g; CaCl₂ · 2 H₂O₁ 2,0 mg; FeSO₄ 7H₂O₁ 1,0 mg; MnSO₄ · H₂O, 0,5 mg; (NH₄J₂Mo₇O₂₄ · 7 H₂O, 0,1 mg und 1 ml Methanol ad 100 ml destilliertem Wasser. Diese Kultur wird bei 3O⁰C

ίο auf einer Rotationsschüttelmaschine aerob 40 Stunden inkubiert. 1% dieser gewaschenen Kultur dient als Inokulum für eine Flüssigkultur gleicher Zusammensetzung des Mediums und gleichen Inkubationsbedingungen außer der Inkubationszeit. Während der Inkubation

is werden in Abständen von 15 — 20 Stunden insgesamt zweimal weitere 1% Methanol zugegeben. Vor jeder Zugabe wird der pH-Wert der Submerskultur mit 1 n-NaOH auf 7,0 eingestellt. Nach 45-60 Stunden Vermehrungsphase wird der pH-Wert auf 8,5 mit 1 n-NaOH korrigiert, nochmals 2% (V/V) Methanol und gleichzeitig 2% (G/V) Glycin zugegeben. Nach weiteren 30-50 Stunden werden 4 g/l L-Serin im Nährmedium nachgewiesen.

2s Beispiel 2

Ein Reaktor, gefüllt mit 101 Nährlösung gleicher Zusammensetzung wie im Beispiel 1 wird 10 Min. bei 121°C sterilisiert, auf 30⁰C abgekühlt, aseptisch mit 0,5% (V/V) Methanol versetzt und mit 200 ml Inokulum von Pseudomonas sp. DSM 672 hergestellt wie im Beispiel 1, beimpft Die Submerskultur wird bei 30⁰C und unter Einsatz eines Blatt-Rührers mit einer Belüftungsrate von 600 l/h/Gesamtansatz gezüchtet. In der ersten Phase der Züchtung wird die Methanol-Konzentration auf 0,5 Vol.-% automatisch konstant gehalten, außerdem wird automatisch mit einer pH-Regulierstation durch Zusatz einer 12vol.-%igen Ammoniaklösung ein pH-Wert von 7,0 aufrechterhalten. Nach 40-60 Stunden wird der pH-Wert auf 8,5 eingestellt und bis zum Abbruch des Züchtungsprozesses auf diesem Wert konstant gehalten. Gleichzeitig wird die Methanolkonzentration auf 2% erhöht und auf diesem Wert konstant gehalten. Gleichzeitig werden zu diesem Zeitpunkt 2% Glycin zugegeben und die Belüftungsrate auf 200 l/h/Gesamtansatz gesenkt. Nach 80-100 Stunden Prozeßdauer beträgt die L-Serinkonzentration in der Nährlösung 5 — 6 g/l.

Beispiel 3

Das Verfahren wird gemäß Beispiel 2 durchgeführt,

jedoch die Mutante DSM 673 des Pseudomonas sp.

DSM 672 Stammes eingesetzt Die Ausbeute an L-Serin im Nährmedium beträgt unter den praktisch gleichen Prozeßbedingungen 8—10 g/l.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin, dadurch gekennzeichnet, daß in einem mit Luft oder (Vangereicherter Luft begasten Reaktor bei einer Reaktionstemperatur von 20-40⁰C mit dem fakultativ Methanol verwertenden Bakterium Pseudomonas sp. DSM 672 oder mit Mutanten dieses Bakteriums, bei denen der ₎₀ Serin-Abbau geblockt ist, unter Verwendung anorganischer Nährstoffe eine Submerskukur erzeugt wird, wobei zunächst die Vermehrung des Bakteriums bei einer Methanol-Konzentration von 0,1 -1,0 Vol.-% als Kohlenstoff- und Energiequelle und bei einem pH-Wert von 6,5-8,0 durchgeführt wird, und zur Produktion des L-Serins durch die erhaltenen Bakterien sodann die Methanol-Konzentration auf einen konstanten Wert zwischen 0,5 — 2,0 VoI.-%, die Anfangs-Glycin-Konzentration auf einen Wert von 0,5-2,0 Gew.-% und der pH-Wert auf 8,0-9,0 eingestellt werden, die Zellmasse aus dem Kulturfiltrat abgetrennt und schließlich das L-Serin in bekannter Weise aus dem Kulturfiltrat isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante den Stamm DSM 673 einsetzt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rührung des Reaktors mechanisch erfolgt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 —3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Reaktortemperatur von 28 - 33° C eingestellt wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 —4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturfiltrat teilweise in den Reaktor zurückgeführt wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 —5, dadurch gekennzeichnet, daß die Vermehrung des Bakteriums oder der Mutanten kontinuierlich in einem ersten Reaktor erfolgt und diese in einen zweiten Reaktor überführt und dort unter den Bedingungen der Produktion behandelt wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 — 6, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Serin-Produktion durch das Bakterium unter Zusatz von oberflächenaktiven Stoffen oder die Zellwand beeinflussenden Substanzen zwecks Erhöhung der Permeabilität erfolgt, vorzugsweise unter Zusatz von Lauryl-Sulfat.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 — 7, dadurch gekennzeichnet, daß als N-Quelle Harnstoff und/oder NH4- bzw. NCVSalze eingesetzt werden.