DE2152039C3 - Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellmasse - Google Patents

Description

Kein besonders gutes Wachstum;

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel- rötliche, kleine Kolonien,

lung von Bakterienzellmasse durch Züchten eines _i5 Physiologische Eigenschaften

methanolassimilierenden Bakteriums in einem metha- , ,., , . \\i„„ur,„_m w

nolhaltigen Nährmedium. ^L Wachstumstemperatur· gutes Wachstum he,

Bisher sind Mikroorganismen bekannt, die unter Temperaturen von 25 bis 35-C, Wachstum bei

Verwendung von Methanol als einzieer Kohlenstoff- _Ί Temperaturen von 20 bis 40 C möglich

quelle bis zu einem gewissen Grad wachsen können. _ao " ^%oich: gutes Wachstum im ph-Bere.ch

Es sind jedoch bisher keine methanolassimilierenden ™⁶'⁵..^bJ? *'^l)< ^{Wachstum im} P^H-^{Bereich Vün 6}

Bakterien bekannt, die in einem methanolhaltigen „ °^ls/ möglich,

Nährmedium ein ausgezeichnetes Wachstum zeigen. J- Reduktion von Nitraten: positiv;

Aufsähe der Erfindung war es daher, ein neues ⁴· ^Katalasc: positiv;

Verfahren zur Herstellung von Bakterienzelima^e ,5 ⁵" ^VerwerlunS ^von St.ckstoffquellen: Jeder der

durch Züchten von Bakterienstämmen in einem me- vorgenannten vier Stamme kann Ammomum-

thanolhaltigen Nährmedium zur Verfügung zu stellen, ^sa!ze; ^Nltralc· Harnstoff und Am.nosauren ver-

bei dem Bakterienzellmasse mit cuten Ausbeuten , werten,

hergestellt werden kann. Diese Aufgabe wird durch ⁶· Verwertung von Kohlenstoffquellen: Jeder der

die Erfindung gelöst. 30 vorgenannten vier Stamme kann N ethanol, GIu-

Geeenstand der Erfindung ist somit rin Verfahren cosc Glycerin Essigsaure und Äthanol verwerzur Hersiellune von Rakterienzelimnsse durch übli- ΪΑΛΪΓΑ ^V°1 ?ΤΓr oTlT ches Züchten von Bakterien in einem methanolhalti- ^A]^CC _U 21612. ATCC 2161, und ATCC21614, gen Nährmedium und Abtrennen der gezüchteten jedoch nicht von dem Stamm ATCC 21611 verBakterien aus diesem, das dadurch _Sekennzeichnet 35 ^w*^rtet "^A^T^TItcTi^a
ist, daß man als Bakterien die Stämme Protamino- Stammen ATCC 21611 und ATCC 2 6 4, jebacter ruber var. machidanus ATCC 21611, ATCC I^ "'ΐ'Τ ^Stammen.^ATCi? 21612 und 21612, ATCC 21613 oder ATCC 21614 einsetzt. ^{ATCC 21},⁶¹³ verwertet werden. Citronensäure

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eclingt ^{kann von keincm} der vorgenann cn v,er Stamme

es. Baketrienzellmasse oder Komponenten νοί Bak- 40 ^^crwcrtet _A *"^dc";,?,^xal.^sa"^re. ^ka.ⁿ? ^{von d}f^m

terienzellen, wie Proteine und Carotinoide, die als Stamm ATCC 216 3 jedoch nicht von den

Arzneimittel oder Nahrunesmittel dienen können, in ^S*^™" ,^{ATCC 21611}' f^{TCC 216}

großem Maßstab und mit guten Ausbeuten herzustel- ^ATCC ^¹⁶¹⁴ verwertet werden,

len. Als Hauplkohlcnstoffquclle dient im erfindungs- Das zur Züchtung der vorgenannten Stämme ver-

gemäßen Verfahren das billig erhältliche Methanol. 45 wendete Nährmedium hat die folgende Zusammen-

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß die setzung:

vorgenannten, zur Art Protaminobacter ruber gehö- Methanol (nicht sterilisiert) 20 ml

renden, methanolassimilierenden Baktcricnstamme in j^ji ^q 3 0 c

einem Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthal- k-u'do³ η'ς ^

tcnuen Nahrmedium ausgezeichnet wachsen. 50 ^ HPO 1 3 e

Die mikrobiolopischen Eigenschaften der Stämme Me'SO -7HO 10ε

Protaminobacter ruber var. machidanus ATCC F^nSwh in™,

21611, ATCC 21612, ATCC 21613 und ATCC CaCI 10 mg

21614, die alle aus Bodenproben isoliert wurden, CaCÖ 20 0 mc

sind nachstehend zusammengestellt: 55 Maisquell wasser''.'.'.'.'.'. '. .'.'.'.'."'. '. ' '. O^ g

MorpholoGie Destilliertes Wasser 1000 ml

pH 7,0

A. Mikroskopische Beobachtungen Das Agarmedium wird durch Zusatz von

(Methanolhaltiges synthetisches Agarmedium) 20 g Agar/Liter hergestellt.

1. Form: gewöhnlich einzelne oder paarige Stab- Die Identifizierung der vier vorgenannten Stämme chen, manchmal werden verzweigte Zellen fest- mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften gestellt; wurde gemäß Bergcy's Manual of Determinative

2. Größe: 0,5 bis 0,8 auf 2 bis 3 μ; Bacteriology, 7. Auflage, vorgenommen, und es

3. Gramfärbung: negativ; 65 wurde festgestellt, daß die vier Stämme anscheinend

4. Beweglichkeit: ja; zur Gattung Protaminobacter gehören. Unter den Ar-

5. Begcißcliing: eine polar angeordnete Geißel; ten der Gattung Protaminobacter haben die vorge-

6. Sporen: keine. nannten vier Stämme fast die gleichen Eigenschaften

2

wie die zur Art Protaminobactcr ruber gehörenden Stämme. Da jedoch die erfindungsgemäß eingesetzten Stämme keine Zitronensäure verwerten können und auf Methanol ausgezeichnet wachsen, wurden sie als Variante von Protaminobacter ruber bestimmt a und als Protaminobacter ruber var. machidanus bezeichnet.

Wie bereits erwähnt, können die vorgenannten vier Stämme auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle wachsen. Diese Stämme können ferner auf einem Bouillon-Agar-Medium wachsen, das kein Methanol enthält.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Stämme sind ferner dadurch charakterisiert,~daß sie, wenn dem Nährmedium während des Züchtens das Methanol nach und nach zugesetzt wird, eine Ausbeute von bis 50 g Zellmasse/Liter, ausgedrückt als Trockengewicht, ergeben. Es ist eine neue Feststellung, die bisher von anderen Methanolassimilierenden Bakterien nicht bekannt ist, daß die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Stämme auf Methanol als Hauptkohlenstoffquelle in so vorzüglicher Weise wachsen.

Die Züchtung der Bakterien wird im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von vorzugsweise 20 bis 40-C durchgeführt. Das verwendete Nährmedium enthält als Kohlenstoffquelle geeignete Mengen von Methanol, organische oder anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Harnstoff, Ammoniak. Ammoniumchlorid und Nitrat, oder natürliche, stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt und Penton, als Stickstoflquelle, Phosphate, wie Kaliumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat, verschiedene anorganische Salze, wie Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisen(II)-sulfat. Zinksulfat und Calciumchlorid, und Wuchsstoffaktoren. Die vorgenannten vier Stämme benötigen für ihr Wachstum keinen besonderen Zusatz von Vitaminen. Durch den Zusatz von natürlichen, organischen Substanzen, wie Hefeextrakt, Fleischextrakt und Maisquellwasser, wird jedoch die Ausbeute an BakterienzeHmasse erhöht. Der pH-Wert des Nährmcdiums wird während des Züchtens vorzugsweise innerhalb eines Bereiches gehalten, in dem der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm wachsen kann, d.h. innerhalb eines pH-Bereiches von 6 bis 9, da der pH-Wert des Nährmcdiums während des Züchtens beträchtlich erniedrigt wird.

Eine große Ausbeute an Baktericnzellmasse kann dadurch erhalten werden, daß man dem flüssigen Nührmedium während des Züchtens das Methanol nach und nach in solchen Mengen zusetzt, die das Wachstum des betreffenden Stammes nicht hemmen. Auf diese Weise läßt sich die Ausbeute an Baktericnzellmasse beträchtlich erhöhen. Das Methanol kann dem Nährmedium während des Züchtens kontinuierlich oder diskontinuierlich zugesetzt werden, wobei jedoch die Methanolkonzentration im Nährmedium auf einem Wert gehalten werden muß, bei dem das Wachstum der erfindungsgemäß eingesetzten Stämme nicht gehemmt wird. Obwohl die Art der Methanolzugabe vom eingesetzten Bakterienstamm, der Zusammensetzung des Nährmediums und ver- 6g schiedenen anderen Züchtungsbedingurigen abhängt, wird das Methanol vorzugsweise kontinuierlich oder diskontinuierlich so zugegeben, daß die Methanol-

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konzentration im Nährmedium nach der Zugabe unterhalb von 6,0" 1, (V, V) gehalten wird. So kann z. B. das Methanol dem Nährmedium kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,2 bis etwa 1,0 ⁰O (V/V) pro Stunde zugesetzt werden, nachdem der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm 1 Stunde in einem Nährmedium gezüchtet wurde, dem anfänglich etwa 0,1 bis 6,0 (VV) Methanol zugesetzt worden war.

Nach beendeter Züchtung wird die Gärmaisciic zentrifugiert und die erhaltene Zellmasse mit Wasser gewaschen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Es wir J ein Nährmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:

Methanol (nicht sterilisiert) 20 ml

NH₄NO, t.n ,i

KH₁PO₄ l.Oiz

Na₀HPO₄ 2.6i

MaSO -7H..0 1.0 c

FeSO₄'-7 H..Ö 20 mc

CaCl., ...." 10 mc

MnSO₄ · 4 HX) 5 mg

Maisquellwasser 0,5 c

Destilliertes Wasser 1000 m\

pH 7.0

In Teströhrchen werden jeweils 10 ml dieses Nährmediums gegeben. Die Teströhrchen werden mit den in der Tabelle I aufgeführten Stämmen in üblicher Weise beimpft. Die Stämme wurden zuvor in einem Agar-Schrägröhrchen gezüchtet, das einen synthetischen, methanolhaltigen Nährboden enthielt. Die Züchtung in dem flüssigen Nährmedium wird 2 Tage bei 30" C durchgeführt. Die erhaltenen Mengen an Bakterienzellmasse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt:

Tabelle 1

	21611	Bakterienzellmasse,
Eingesetzter Stamm		ausgedrückt in g Trocken
	21612	masse Liter
Protaminobacter ruber
ATCC 8457 . .	21613	1,5
Protaminobactcr ruber
var. machidanus ATCC	21614	5,6
Protaminobacter ruber
var. machidanus ATCC	7,3
Protaminobactcr ruber
var. machidanus ATCC	6,0
Protaminobacter ruber
var. machidanus ATCC	5,4

Es wird ein Nährmedium mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

Beispiel 2

NH₁NO., .
KR₁PO₄' ..
Na₀HPO,

5,0 g 1,0g 2,6 g

FeSO₄-7 H₂O 20 mg

CaCl.,
MnSÖ. ·4Η.,Ο

10 mg 5 mg 3,0 g

Maisquellwasser

CaCO., 20 g

Destilliertes Wasser 1000 ml

pH 7,0

Jeweils 20 ml dieses Nührmediums werden in 250 ml fassende Erlenmeyer-Kolben gegeben. Die Kolben werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, mit den in der nachstehenden Tabellen aufgeführten Stämmen beimpft. Das Nährmedium wird am Beimpfungszeitpunkt mit einer Methanolmenge versetzt, die 2 "/o (V/V), bezogen auf das Ausgangsvolumen, entspricht. Am 2. Tag wird das Nährmedium mit einer 1 ⁿ/o (V/V) und am 3.Tag mit einer 2" η (V/V) entsprechenden Methanolmenge versetzt. Die Züchtung wird 5 Tage unter Schütteln bei 30^ C durchgeführt. Die gesamte zugesetzte Mcthanolmenge entspricht also 5 Volumprozent. Die auf diese Weise erhaltenen Mengen an Zellmasse sind in der Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II	Uakterienzellmasse,
	g Trocken-
Hingesetzter Stamm	mavic' Liter
Protaminobacter ruber	10.3
var. machidanus ATCC 21611
Protaminobacter ruber	11.5
var. machidanus ATCC 21612
Protaminobacter ruber	12.2
var. machidanus ATCC 21613
Protaminobacter ruber	9.4
var. machidanus ATCC 21614

Beispiel 3

Die Stämme Protaminobacter ruber var. machidanus ATCC 21611 und ATCC 21613 werden in 5 1 fassende Glasfcrmcnter eingeimpft, die jeweils 31 eines Nährmediums folgender Zusammensetzung enthalten:

Methanol (nicht sterilisiert)

KH..PO

Na₀HPO₁

(NH,).,SO₄

FcSO.~-7H.,O

10 ml
1.0 g
2.6 g
5.0 g

50 ma

CaCI., 50 mg

MnSO₄-4H₀O !"mg

Maisquellwasser ^g

Leitungswasser 1 ilOO ml

pH 7,0

Das Züchten wird unter Rühren und unter Belüftung bei 30- C durchgeführt. Während des Züchtens wird das Nährmcdium mit wäßriger Ammoniaklösung versetzt, um das durch das Wachstum des betreffenden Stammes bedingte Absinken des pH-Werics zu verhindern und den pH-Wert auf diese Weise zwischen 6 und 8 zu halten. Wenn der pH-Wert des Nährmediums mit vollständigem Verbrauch des Me-

thanols ansteigt, wird das Nährmedium mit so viel Methanol versetzt, daß dessen Konzentration 1 ".. (V/V) beträgt. Nach 40stündigem Züchten und anschließendem Aufarbeiten werden bei einer Gesamtzugabe von Methanol von 20 Volumprozer.' bei Ver-

wendung von Protaminobacier ruber var. machidanus ATCC 21611 41g Bakterientrockenmasse pro Liter erhalten. Im Falfe der Verwendung von Protaminobacter ruber var. machidanus ATCC 21613 werden 38 g Bakterientrockcnmasse/Lite;· bei einer

?-5 Gesamtzugabe von 17 Volumprozent Methanol erhalten.

Beispiel 4

Die Züchtung wird gemäß Beispiel 3 durchgeführt.

mit der Ausnahme, daß das Methanol dem Nährmedium K) Stunden nach dem Animpfen mit einer Geschwindigkeit von 0.5 bis 0,7"'« (V/V) pro Stunde kontinuierlich zugesetzt, das Züchten bei 35 C durchgeführt und der pH-Wert des Nährmediums auf

0.7 gehalten wurde. Nach 45stündigcr Züchtung werden bei einer Gesamtzugabc von 22 Volumprozent Methanol bei Verwendung von Protaminobacter ruber var. maciiidanus ATCC 21611 50 g Liter und bei Verwendung von Protaminobacter ruber vai. machi-

drnus ATCC 21613 .46 g/Liter Baktcrientrockenmasse erhalten.

Claims (1)

1 2

ρ _h B. Agar-Knionien

Patentanspruch: (Methanolhaltiges synthetisches Agarmedium,

Verfahren zur Herstellung von Bakterienzell- 4 Tage, 30'C)

masse durch übliches Züchten von Bakterien in _{L Form}. _krej_sförmig (Durchmesser: 1 bis 2 mm);

einem methanolhaltigen Nährmedium und Abtren- 5 7 Oberfläche: glatt;

nen der gezüchteten Bakterien aus diesem, da- 3' R_ancj. vollständig·

durch gekennzeichnet, daß man als 4 Erhebung· eben· '

Bakterien die Stämme Protaminobacter ruber ₅' _Schimmer: glänzend bis matt;

var. machidanus ATCC 21611, ATCC 21612, ϊ ρ "h' Rosa

ATCC21613oderATCC21614einsetz«. _le ' " _{c Agar}._Kolorlien

(Bouillon-Agar-Medium)