CN113186102A - 一种新型的细菌裂解的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型的裂解细菌的方法，通过向待裂解表达目的重组蛋白的细菌培养液中加入溶菌酶、表面活性剂、核酸酶，混匀，裂解5min～2h，离心，收集上清液，得到重组蛋白；所述的表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基葡糖苷、烷基葡萄糖酰胺中的一种或几种的混合物。本发明能够取代使用超声破碎仪的传统机械破碎方式，低成本、高效率地获得细菌裂解液，最终回收目的重组蛋白。

Description

一种新型的细菌裂解的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型的细菌裂解的方法。
背景技术
在生物技术产业中，大肠杆菌表达系统是外源基因表达蛋白的首选工程菌，也是目前最为广泛应用的经典的原核表达系统，具有遗传背景清晰、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖速度快、蛋白获得率高、成本较低等优点。根据2018年数据，由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中，大肠杆菌表达系统来源的药物占比高达26％，这表明大肠杆菌表达系统在基于蛋白的生物药物生产中应用广泛。
大肠杆菌表达系统通常分为两种途径进行重组蛋白的表达，第一种胞外表达，也称分泌表达，但外源重组蛋白的局限性较高，分泌效率和蛋白产量有限；第二种是胞内表达，也是外源重组蛋白在大肠杆菌中最主要的表达形式，重组蛋白产量通常可以占总生物质的30％。但大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，细胞壁由肽聚糖、脂蛋白、脂多糖等组成，强度较高。细胞壁的特殊结构导致大肠杆菌必须进行细胞破碎后才能进行相应的分离及纯化。
现有的主流型细胞破碎方法可分为机械法和非机械法两大类，前者包括匀浆化、超声波和压力破碎等方法，后者包括生物酶法和化学渗透法等。前者在破碎过程中易造成蛋白活性降低，蛋白结构受到破坏，进而影响重组蛋白产量；生物酶法通过酶降解法破坏细胞壁组分，实验条件温和，破碎效率较高，不影响重组蛋白活性，但碎菌成本较高；化学渗透法可增大细胞壁的通透性，诱使细胞破碎，但操作过程繁琐，重组蛋白获得率较低。在上述方法中，细菌细胞完全破碎也意味着细胞内部基因组DNA被释放。较大分子量的基因组DNA不仅引起细菌破碎液粘度升高，增加生产处理的难度，同时残留的DNA也会影响后续重组蛋白的分离纯化处理。
因此，开发一种新型的细菌裂解的方法，在提高破碎效率的同时，减少蛋白活性的损失，降低生产成本，对提取大肠杆菌内的重组蛋白产物的工艺改进具有重要意义。
发明内容
技术问题：本发明要解决的技术问题是提供一种新型的细菌裂解的方法，不使用机械破碎，不需要从细胞培养基中取出细菌或浓缩细菌，从而有效简化细菌细胞的破碎程序，提高细菌细胞内重组蛋白的获得率与纯度。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种新型的细菌裂解的方法，向待裂解表达目的重组蛋白的细菌培养液中加入溶菌酶，混匀，反应5min～2h；再加入表面活性剂，混匀，反应5min～2h；再加入核酸酶，混匀，反应5min～2h，离心，收集上清液，得到含有目的重组蛋白的混合物，再通过进一步纯化，可以得到目的重组蛋白；
所述的表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基葡糖苷、烷基葡萄糖酰胺中的一种或几种的混合物，优选烷基葡糖苷、烷基葡萄糖酰胺中的一种或两种的混合物。本发明选择烷基葡糖苷作为新型破碎用表面活性剂，该试剂具有以下显著优点：1.该试剂使用纯天然原料生产，具有可再生、无污染的特点；2.该试剂为可生物降解试剂，对环境友好，不会造成环境污染；3.该试剂价格低廉，便于该方法大批量应用及普及；4.相比于其他试剂，该试剂破碎效果极佳，综合效果达到或超过繁琐而昂贵的超声破碎法。
溶菌酶对N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4 位碳原子间的β-1.4糖苷键具有破坏作用，将细菌细胞壁的主要成分肽聚糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。同时借助表面活性剂的增溶作用，细菌细胞壁与细胞膜上的磷脂被包裹于亲水基团和疏水基团在溶液中形成的微团之中，增加细胞的通透性，促进细胞溶解。而使用核酸酶降解DNA 也是除去细胞DNA残留的常用方法，核酸酶通过水解DNA形成小片段或寡核苷酸，显著降低细菌细胞裂解后的溶液粘度，缩短生产处理时间，提高重组蛋白产量与纯度。
进一步地，所述的溶菌酶为蛋清溶菌酶、T4溶菌酶、T7溶菌酶、λ溶菌酶、变溶菌素中的一种或几种的混合物，优选λ溶菌酶、T7溶菌酶、T4溶菌酶中一种或几种的混合物。
进一步地，所述的核酸酶为：脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II、微球菌核酸酶、超级核酸酶、磷酸二酯酶中的一种或几种的混合物，优选脱氧核糖核酸酶I。
进一步地，所述溶菌酶的加入量为20U/mL。
进一步地，所述表面活性剂的加入量为0.5g/100mL。
进一步地，所述核酸酶的加入量为0.5U/mL。
进一步地，所述的细菌培养液为大肠杆菌培养液。
本发明所述新型的细菌裂解的方法的具体步骤如下：
(1)取表达目的重组蛋白的细菌培养液，按照20U/mL加入T4溶菌酶，充分混合至少5min；
(2)再向细菌培养液中加入表面活性剂，所述表面活性剂为烷基葡糖苷，所述烷基葡糖苷的加入量为0.5g/100mL，充分混合至少5min；
(3)最后向细菌培养液中加入核酸酶，所述核酸酶为脱氧核糖核酸酶I，所述脱氧核糖核酸酶I的加入量为0.5U/mL，充分混合至少5min；
(4)离心，收集上清液，得到重组蛋白。
有益效果：本发明公开了一种新型的细菌裂解的方法，本发明将酶消化法和化学渗透法相结合，温和而高效地破碎大肠杆菌，提高了可溶性重组蛋白的获得率与保持其生物活性的可能性。本发明操作简单，细菌细胞破碎效率高，对重组蛋白活性影响较低，显著减少重组蛋白损失，便于后续产品的分离纯化，提高重组蛋白产量与纯度。
附图说明
图1为分别通过本发明方法与常规超声波方法进行破碎获得的含目的重组蛋白的细菌细胞总蛋白SDS-PAGE电泳图；泳道M：蛋白marker，泳道1：超声破碎方法所得上清，泳道2：新型破碎方法条件1所得上清，泳道3：新型破碎方法条件2所得上清，泳道4：新型破碎方法条件3所得上清。
图2为分别通过本发明方法与常规超声波方法进行破碎并经过分离纯化获得的目的重组蛋白SDS-PAGE电泳图。泳道M：蛋白marker，泳道1：模型蛋白 1#全菌，泳道2：超声破碎方法所得蛋白1#，泳道3：新型破碎方法所得蛋白1#，泳道4：模型蛋白2#全菌，泳道5：超声破碎方法所得蛋白2#，泳道6：新型破碎方法所得蛋白2#。
图3为使用高效液相色谱分析法检测分别通过本发明方法与常规超声波方法进行破碎并经过分离纯化获得的目的重组蛋白的纯度。A:超声破碎方法所得蛋白1#；B:新型破碎方法所得蛋白1#；C:超声破碎方法所得蛋白2#；D:新型破碎方法所得蛋白2#。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
(1)在诱导12小时后收获含目的重组蛋白的细菌培养液，将菌液均匀分成两份。每份菌液经历本发明方法或常规超声波方法进行处理。
(2)本发明方法：
a.在菌液中加入终浓度为20U/ml的T4溶菌酶，并以100rpm的转速充分混匀5分钟；
b.在菌液中加入终浓度为0.5g/100mL的烷基葡糖苷，并以100rpm的转速充分混匀5分钟；
c.在菌液中加入终浓度为0.5U/ml的脱氧核糖核酸酶I，并以100rpm的转速充分混匀30分钟；
d.使所述包含添加的细胞溶解酶、表面活性剂及核酸酶的所述细菌培养液经历除去大部分的细胞碎片的方法，收集细胞裂解上清液进行后续的分离纯化，最终获得目的重组蛋白。
常规超声波方法：
a.室温下将菌液进行离心，收集菌体并按照离心前菌液体积加入等体积的pH 值为7.4的1M磷酸盐缓冲液，使菌体充分均匀的悬浮。磷酸盐缓冲液配方：137 mM氯化钠,2.7mM氯化钾,10mM磷酸氢二钠,2mM磷酸二氢钾；
b.在冰浴中进行超声破碎(条件：功率60％，超声3s，间隔10s，总时间为 30min)；
c：将获得的超声破碎液进行离心，取上清液进行后续的分离纯化，最终获得目的重组蛋白。
(3)总蛋白检测：分别取上述上清液进行常规SDS-PAGE蛋白电泳，检测分别通过本发明方法与常规超声波方法进行破碎获得的含目的重组蛋白的细菌细胞总蛋白。
(4)分别取上述纯化后目的重组蛋白进行常规SDS-PAGE蛋白电泳，检测分别通过本发明方法与常规超声波方法进行破碎并经过分离纯化获得的目的重组蛋白。
(5)分别取上述纯化后目的重组蛋白进行，通过高效液相色谱分析检测分别通过本发明方法与常规超声波方法进行破碎并经过分离纯化获得的目的重组蛋白的纯度。
(6)通过BCA法检测分别通过本发明方法与常规超声波方法进行破碎并经过分离纯化获得的目的重组蛋白的浓度。
实验结果：
1.总蛋白SDS-PAGE蛋白电泳如图1所示，可知细菌使用本发明使用的方法进行破碎，各分子质量的蛋白含量均高于常规超声波方法，故本发明使用的方法的细菌细胞破碎效率优于常规超声波方法。
2.重组蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳如图2所示，可知细菌使用本发明使用的方法进行破碎，获得的重组蛋白纯度均基本等同于常规超声波方法，故本发明使用的方法的蛋白纯度基本等同于常规超声波方法。
3.重组蛋白的高效液相色谱分析结果如图3所示，可知细菌使用本发明使用的方法进行破碎，获得的重组蛋白纯度基本等同于常规超声波方法，故本发明使用的方法的蛋白纯度基本等同于常规超声波方法。
4.通过BCA法检测不同方法进行破碎所获得的重组蛋白浓度的数据如表1所示，可知细菌使用本发明使用的方法进行破碎，获得的重组蛋白浓度基本等同于常规超声波方法，故本发明使用的方法的细菌细胞破碎效率基本等同于常规超声波方法。
表1不同方法进行破碎所获得的重组蛋白浓度
Figure BDA0003012785670000061
综上所述，本发明提供的新型的细菌裂解的方法，大幅度简化了实验操作步骤，显著缩短了工作时间，提高了破碎大肠杆菌细菌细胞的工作效率。

Claims (10)

1.一种新型的细菌裂解的方法，其特征在于，向待裂解表达目的重组蛋白的细菌培养液中依次加入溶菌酶、表面活性剂、核酸酶，混匀，裂解5min～2h，离心，收集上清液，得到重组蛋白；
所述的表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基葡糖苷、烷基葡萄糖酰胺中的一种或几种的混合物。
2.根据权利要求1所述的新型的细菌裂解的方法，其特征在于，所述的溶菌酶为蛋清溶菌酶、T4溶菌酶、T7溶菌酶、λ溶菌酶、变溶菌素中的一种或几种的混合物。
3.根据权利要求1所述的新型的细菌裂解的方法，其特征在于，所述的核酸酶为：脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II、微球菌核酸酶、超级核酸酶、磷酸二酯酶中的一种或几种的混合物。
4.根据权利要求1所述的新型的细菌裂解的方法，其特征在于，所述溶菌酶的加入量为20U/mL。
5.根据权利要求1所述的新型的细菌裂解的方法，其特征在于，所述表面活性剂的加入量为0.5g/100mL。
6.根据权利要求1所述的新型的细菌裂解的方法，其特征在于，所述核酸酶的加入量为0.5U/mL。
7.根据权利要求1所述的新型的细菌裂解的方法，其特征在于，所述的细菌培养液为大肠杆菌培养液。
8.根据权利要求1所述的新型的细菌裂解的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取表达目的重组蛋白的细菌培养液，加入溶菌酶，充分混合至少5min；
(2)再向细菌培养液中加入表面活性剂，充分混合至少5min；
(3)最后向细菌培养液中加入核酸酶，充分混合至少5min；
(4)离心，收集上清液，得到重组蛋白。
9.根据权利要求8所述的新型的细菌裂解的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的溶菌酶为T4溶菌酶，步骤(2)中，所述表面活性剂为烷基葡糖苷，步骤(3)中，所述的核酸酶为脱氧核糖核酸酶I。
10.根据权利要求9所述的新型的细菌裂解的方法，其特征在于，所述T4溶菌酶的加入量为20U/mL，所述烷基葡糖苷的加入量为0.5g/100mL，所述脱氧核糖核酸酶I的加入量为0.5U/mL。
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