CN107304430B - 用于制备反式-4-羟基-l-脯氨酸的dna分子和方法 - Google Patents

用于制备反式-4-羟基-l-脯氨酸的dna分子和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于制备反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的DNA分子和方法。本发明公开的DNA分子，为将L‑脯氨酸‑4‑羟化酶编码基因(P4H基因)的密码子进行优化后的序列P4Hm进行二次优化而得到的DNA分子(P4HGP基因)，其序列为序列表中序列1；用于制备反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的方法，包括：将含有P4HGP基因并表达P4H的重组微生物置入含有L‑脯氨酸的初始物质的体系中进行反应，得到反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。实验证明，与P4Hm基因相比，利用P4HGP基因得到的反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸产量提高了19.7％，表明可以利用P4HGP基因生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。

Description

用于制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的DNA分子和方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中用于制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的DNA分子和方法。
背景技术
反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline，Hyp)是广泛存在于动物胶和骨胶原中的亚氨基酸，分子式如式1。
Figure BDA0000968607770000011
反式-4-羟基-L-脯氨酸可以作为胶原蛋白合成的增强剂而用于化妆品和医药产品。也可以作为许多组织(如皮肤、骨骼和消化道)的补充营养物而用于食品行业。此外，反式-4-羟基-L-脯氨酸带有手性分子，是合成药物时有用的手性元件。其有用的衍生品包括MK-1220(被认为是一个高活性的丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂)；聚胺-4-L-THOP(被用作非降解性丙烯酸骨结合剂)；N-乙酰THOP(奥沙西罗)，可以抑制炎症和减少肿胀，是有用的治疗骨关节炎等影响结缔组织疾病，奥沙西罗已经被确立为一种无毒副作用的治疗关节疾病的药物。
目前，国内生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的主要方法是生物提取法，利用动物蛋白来源如明胶、猪皮为原料，经酸、碱水解后提取反式-4-羟基-L-脯氨酸，该方法纯化步骤长，成本高，且废弃物污染严重。随着脯氨酸-4-羟化酶的开发和生物技术的发展，利用微生物生产反式-4-羟基-L-脯氨酸成为可能。
国外，Shibasaki等人于2000年发表文章称已构建可以工业化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的微生物，即在含有葡萄糖和L-脯氨酸的培养基中，用大肠杆菌表达反式-4-羟基-L-脯氨酸。但是利用天然序列含有过多稀有密码子而导致目的蛋白量低，密码子优化合成基因表达量较高但是在宿主细胞中的可溶性表达低，产生较多的包涵体，不利于其工业化应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的DNA分子，所述DNA分子为将L-脯氨酸-4-羟化酶编码基因(GenBank:D78338.1)的密码子进行优化得到的DNA分子，其名称为P4HGP基因。
上述P4HGP基因的序列为序列表中序列1，序列1为将序列3的第69位的c突变为g，第72位的g突变为c得到的序列。
为解决上述技术问题，本发明还提供了含有P4HGP基因的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)含有P4HGP基因的表达盒；
B2)含有P4HGP基因的重组载体；
B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有P4HGP基因的重组微生物；
B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；
B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有P4HGP基因的重组细胞系；
B9)含有B1)所述表达盒的重组细胞系。
上述生物材料中，B1)所述的含有P4HGP基因的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达P4HGP基因的DNA，该DNA不但可包括启动P4HGP基因转录的启动子，还可包括终止P4HGP基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的载体构建含有所述P4HGP基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
在本发明的一个实施例中，所述重组载体为向pYB1s载体的多克隆位点插入序列1所示的P4HGP基因得到的重组载体pYB1s-P4HGP；所述pYB1s载体为将载体pACYCDuet-1的含有复制子和链霉素抗性基因的DNA片段与pBAD/His B载体的含有pBAD启动子、酶切位点和终止子的DNA片段进行拼接得到的载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为大肠杆菌，如大肠杆菌BW25113。
上述生物材料中，所述重组微生物可为将含有P4HGP基因的重组载体导入大肠杆菌得到的表达L-脯氨酸-4-羟化酶的重组微生物。
在本发明的一个实施例中，所述重组微生物为将pYB1s-P4HGP导入大肠杆菌得到的重组菌。
上述生物材料中，所述重组细胞系不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供了反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备方法，所述方法包括：将所述重组微生物置入含有制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的初始物质的体系中进行反应，得到反式-4-羟基-L-脯氨酸。
上述方法中，所述制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的初始物质可为L-脯氨酸。
上述方法中，所述重组微生物在所述体系中的浓度可为30OD/mL，所述OD为在OD600(即在600nm下的吸光值)。
上述方法中，所述体系由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、100mM L-脯氨酸、4mM FeSO4和8mM维生素C，用HCl调pH至7.0。
上述方法中，所述反应可在30℃下进行。所述反应可进行12h。在进行所述反应时，将所述重组微生物置入所述体系中后可在非静止的环境中进行所述反应，如250rpm的环境中。
为解决上述技术问题，本发明还提供了用于制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的物质，所述物质由P4HGP基因或所述生物材料与用于制备反式-4-羟基-L-脯氨酸所需要的其他试剂组成。
上述物质中，所述用于制备反式-4-羟基-L-脯氨酸所需要的其他试剂可为所述制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的初始物质，如L-脯氨酸。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
M1、P4HGP基因在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
M2、P4HGP基因在制备用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的产品中的应用；
M3、所述生物材料在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
M4、所述生物材料在制备用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的产品中的应用；
M5、所述物质在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用。
实验证明，其名称为，将L-脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H基因)的密码子进行优化后得到的基因可以提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量：利用P4H基因得到极少量的反式-4-羟基-L-脯氨酸，利用将P4H基因按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化得到的P4Hm与P4HGP基因得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的量均远远高于利用P4H基因得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的量，利用P4Hm基因得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸平均为29mM，而利用P4HGP基因得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸平均达34.7mM，与pYB1s-P4H/BW25113和pYB1s-P4Hm/BW25113相比，pYB1s-P4HGP/BW25113反应产物中反式-4-羟基-L-脯氨酸的分别产量提高了378.6％和19.7％。表明，可以利用序列1所示的P4HGP基因生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
附图说明
图1为重组载体pYB1s-P4HGH图谱。
图2为pYB1s-P4HGP/BW25113与pYB1s-P4Hm/BW25113中目的蛋白的SDS-PAGE电泳分析结果。
图3为利用pYB1s-P4HGP/BW25113与pYB1s-P4Hm/BW25113生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大肠杆菌BW25113(Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kiri ll A Datsenko,Masaru Tomita,Barry LWanner,and Hirotada Mori 1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology(2006):1-11.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的5052自诱导培养基为无菌培养基，其配制方法如下：100mL A+2mLB+2mL C+200μL D+100μL E；
A为ZY溶液，ZY溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1％(质量百分比浓度)胰蛋白胨和0.5％(质量百分比浓度)酵母粉；
B为50×M溶液，50×M溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1.25MNa2HPO4，1.25M KH2PO4，2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；
C为50×5052溶液，50×5052溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：25％(质量百分比浓度)甘油，2.5％(质量百分比浓度)葡萄糖，10％(质量百分比浓度)L-阿拉伯糖；
D为1M MgSO4水溶液；
E为1000×微量元素溶液，1000×微量元素溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：50mM FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，2mM CoCl2，2mM NiCl2，2mMNa2Mo4，2mM Na2SeO3，2mM H3BO3。
实施例1、利用P4HGP基因生产反式-4-羟基-L-脯氨酸
本发明提供了一种可用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline，Hyp)的L-脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H基因，GenBank:D78338.1)的突变基因，将其命名为P4HGP基因，P4HGP基因与指孢囊菌(Dactylosporangium sp.)RH1的P4H基因均编码L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)(序列表中序列2)(Genebank:BAA20094.1)，P4HGP基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，P4HGP基因为将P4H基因根据大肠杆菌密码子的偏好性进行优化得到的基因。
1、重组载体与重组菌的制备
制备名称为pYB1s的载体：以P15ASal I_F:GTCGACGTGCGTCAGCAGAATATGTG和StrSph I_R:ACCTACCAAGGCAACGCTAT为引物，以载体pACYCDuet-1(Novagen公司)为模板扩增得到含有复制子和链霉素抗性基因的DNA片段，将该DNA片段命名为ori-aadA；利用引物araC-TrrnB_sphI_F:GCACATGCATGCAATGTGCCTGTCAAATG和araC-TrrnB_SalI_R:ATATACGCGTCGACGAAAGGCCCAGTCTTTC，从pBAD/His B(invitrogen公司,货号：V430-01)扩增得到含有pBAD启动子、酶切位点和终止子的DNA片段，将该DNA片段命名为araC-TrrnB。分别用SphI和SalI双酶切ori-aadA和araC-TrrnB，将ori-aadA双酶切得到的大片段和araC-TrrnB双酶切得到的大片段连接，得到重组载体pYB1s。
将重组载体pYB1s的BglⅡ和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子(即P4HGP基因)，得到重组载体pYB1s-P4HGP(图1)。重组载体pYB1s-P4HGP表达序列2所示的P4H。
将重组载体pYB1s的BglⅡ和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子(即P4Hm基因，P4Hm基因为将P4H基因根据大肠杆菌密码子的偏好性进行优化得到的基因，编码序列2所示的P4H)，得到重组载体pYB1s-P4Hm。重组载体pYB1s-P4Hm表达序列2所示的P4H。
将重组载体pYB1s的BglⅡ和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为P4H基因(GenBank:D78338.1)，得到重组载体pYB1s-P4H。重组载体pYB1s-P4H表达序列2所示的P4H。
将重组载体pYB1s-P4HGP导入大肠杆菌BW25113中，得到重组菌，将该重组菌命名为pYB1s-P4HGP/BW25113；将重组载体pYB1s-P4Hm导入大肠杆菌BW25113中，得到重组菌，将该重组菌命名为pYB1s-P4Hm/BW25113；将重组载体pYB1s-P4H导入大肠杆菌BW25113中，得到重组菌，将该重组菌命名为pYB1s-P4H/BW25113；将重组载体pYB1s导入大肠杆菌BW25113中，得到重组菌，将该重组菌命名为pYB1s/BW25113。
2、目的蛋白的检测
将步骤1的pYB1s-P4HGP/BW25113接种于LB培养基中，37℃，220rpm培养10h。按照1％的接种量接种于5052自诱导培养基中，于30℃，220rpm培养16h-20h。4℃，4200rpm离心10min，分别收集pYB1s-P4HGP/BW25113菌体。
按照上述方法，将pYB1s-P4HGP/BW25113分别替换为pYB1s-P4Hm/BW25113、pYB1s-P4H/BW25113和pYB1s/BW25113，其他步骤均不变，分别得到pYB1s-P4Hm/BW25113菌体、pYB1s-P4H/BW25113菌体与pYB1s/BW25113菌体。
对上述各菌体进行超声，破碎细胞，并将超声产物在10000×g下进行离心，将得到的上清液与沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，pYB1s/BW25113、pYB1s-P4H/BW25113、pYB1s-P4Hm/BW25113与pYB1s-P4HGP/BW25113结果如图2所示。结果显示，pYB1s/BW25113不表达P4H蛋白质，pYB1s-P4H/BW25113表达较少量的P4H蛋白质，pYB1s-P4Hm/BW25113与pYB1s-P4HGP/BW25113中有较多的P4H蛋白质的表达；在pYB1s-P4H/BW25113与pYB1s-P4Hm/BW25113的上清液和沉淀中均含有P4H蛋白质，pYB1s-P4HGP/BW25113的沉淀中的P4H蛋白质明显少于pYB1s-P4H/BW25113与pYB1s-P4Hm/BW25113沉淀中的P4H蛋白质。图2中，图A为上清液的结果，图B为超声沉淀的结果，泳道M均为蛋白分子量标准，泳道1均为pYB1s/BW25113，泳道2均为pYB1s-P4H/BW25113，泳道3均为pYB1s-P4Hm/BW25113,泳道4均为pYB1s-P4HGP/BW25113；箭头所示为P4H蛋白质。
3、全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸
实验重复三次，将步骤2得到的pYB1s-P4HGP/BW25113菌体用质量百分浓度为0.85％氯化钠水溶液洗涤2次，4℃，4200rpm离心10min，得到洗涤后的菌体；将洗涤后的菌体按30OD/mL的浓度(该OD值为在600nm下的吸光值，以转化液为空白对照)，重悬于转化液中，在30℃、250rpm下转化12h，以L-脯氨酸为底物转化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，得到pYB1s-P4HGP/BW25113反应产物。其中，转化液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：100mM Tris、100mM L-脯氨酸、4mM FeSO4和8mM维生素C，用HCl调pH至7.0。用氯胺T法测定pYB1s-P4HGP/BW25113反应产物中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。
按照上述方法，将pYB1s-P4HGP/BW25113菌体分别替换为pYB1s-P4Hm/BW25113菌体、pYB1s-P4H/BW25113菌体和pYB1s/BW25113菌体，其他步骤均不变，分别得到pYB1s-P4Hm/BW25113反应产物、pYB1s-P4H/BW25113反应产物和pYB1s/BW25113反应产物。
按照如下氯胺T法测定各反应产物中反式-4-羟基-L-脯氨酸含量：
(1)将样品按照一定比例稀释后，取100μl于2mL离心管中，向离心管中加入200μl异丙醇和100μl氧化剂溶液(氧化剂溶液为将7％(质量百分比浓度)氯胺T水溶液与醋酸-柠檬酸缓冲液(pH 6.0)按照1:4的体积比混合得到的溶液，其中，醋酸-柠檬酸缓冲液(pH6.0)由水与溶质组成，溶质及其浓度分别为34.4g/L无水醋酸钠、37.5g/L二水合柠檬酸钠、5.5g/L一水合柠檬酸和385mL/L异丙醇)。
(2)摇匀，室温放置4分钟；向离心管中加入200μl新配制的艾氏试剂(艾氏试剂由对二甲氨基苯甲醛、高氯酸与异丙醇组成，艾氏试剂中各物质的比例关系为：二甲氨基苯甲醛：高氯酸：异丙醇＝1mg：4mL：6mL)，摇匀，置于60℃水浴中20分钟，自来水冷却至室温；于560nm处检测吸光值。
按照如上步骤(1)和(2)的方法以反式-4-羟基-L-脯氨酸(阿拉丁公司，产品编号H111005)为标准品制备Hyp标准曲线，Hyp标准曲线为y＝5.6665x，R2＝0.9996。
结果(图3)显示，pYB1s/BW25113反应产物中无反式-4-羟基-L-脯氨酸，pYB1s-P4H/BW25113反应产物中含有少量的反式-4-羟基-L-脯氨酸，pYB1s-P4Hm/BW25113反应产物与pYB1s-P4HGP/BW25113反应产物中反式-4-羟基-L-脯氨酸的量均远远高于pYB1s-P4H/BW25113反应产物中反式-4-羟基-L-脯氨酸的量，pYB1s-P4H/BW25113反应产物中反式-4-羟基-L-脯氨酸平均为7.25mM pYB1s-P4Hm/BW25113反应产物中反式-4-羟基-L-脯氨酸平均为29mM，而pYB1s-P4HGP/BW25113反应产物中反式-4-羟基-L-脯氨酸平均达34.7mM，与pYB1s-P4H/BW25113和pYB1s-P4Hm/BW25113相比，pYB1s-P4HGP/BW25113反应产物中反式-4-羟基-L-脯氨酸的分别产量提高了378.6％和19.7％。
Figure IDA0000968607850000011
Figure IDA0000968607850000021
Figure IDA0000968607850000031
Figure IDA0000968607850000041

Claims (9)

1.DNA分子，其序列为序列表中序列1。
2.含有权利要求1所述DNA分子的生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；
B2)含有权利要求1所述DNA分子的重组载体；
B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物；
B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；
B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有权利要求1所述DNA分子的重组细胞系；
B9)含有B1)所述表达盒的重组细胞系。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：所述重组载体为向pYB1s载体的多克隆位点插入权利要求1所述DNA分子得到的重组载体；所述pYB1s载体为将载体pACYCDuet-1的含有复制子和链霉素抗性基因的DNA片段与pBAD/His B载体的含有pBAD启动子、酶切位点和终止子的DNA片段进行拼接得到的载体；
所述重组微生物为将含有权利要求1所述DNA分子的重组载体导入大肠杆菌得到的重组微生物。
4.反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备方法，包括：将权利要求2或3中任一所述重组微生物置入含有制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的初始物质的体系中进行反应，得到反式-4-羟基-L-脯氨酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的初始物质为L-脯氨酸；
和/或，所述重组微生物在所述体系中的浓度为30OD/mL。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述体系由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、100mM L-脯氨酸、4mM FeSO4和8mM维生素C，pH7.0；
和/或，所述反应在30℃下进行。
7.用于制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的物质，由权利要求1所述DNA分子或权利要求2或3所述生物材料与用于制备反式-4-羟基-L-脯氨酸所需要的其他试剂组成。
8.根据权利要求7所述的物质，其特征在于：所述用于制备反式-4-羟基-L-脯氨酸所需要的其他试剂为权利要求4或5中所述制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的初始物质。
9.下述任一应用：
M1、权利要求1所述DNA分子在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
M2、权利要求1所述DNA分子在制备用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的产品中的应用；
M3、权利要求2或3所述生物材料在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
M4、权利要求2或3所述生物材料在制备用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的产品中的应用；
M5、权利要求7或8所述物质在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用。
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