CN108070628B - 一种生产氨基葡萄糖的方法 - Google Patents

一种生产氨基葡萄糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产氨基葡萄糖的方法。本发明提供了一种生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：以N‑乙酰氨基葡萄糖为原料，在工程菌的作用下，生产氨基葡萄糖；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；所述功能蛋白为N‑乙酰‑6‑磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶或几丁二糖脱乙酰酶。采用本发明提供的方法制备氨基葡萄糖，反应条件温和、工艺路线简单、产物纯度高、适合大规模的工业化生产，非常适于推广应用。

Description

一种生产氨基葡萄糖的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种生产氨基葡萄糖的方法。
背景技术
氨基葡萄糖，又叫葡萄糖胺(Glucosamine，GlcN)，简称氨糖，广泛存在于动物外骨骼及微生物细胞壁中。氨基葡萄糖广泛应用于食品、保健、化妆品、医药等行业。氨基葡萄糖是形成软骨组织细胞的重要营养素，是健康关节软骨组织的天然组成成分，可以帮助修复和维护软骨组织，并能刺激软骨组织细胞的生长与发育。
目前，氨基葡萄糖的生产方法主要是甲壳素水解法。甲壳素水解法是酸解虾蟹壳中的甲壳素生产氨基葡萄糖，此方法造成了海洋资源的过渡捕捞，而且加工处理工艺产生的废液对环境污染较为严重，相关研究表明，利用该种方法得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏人群服用。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产氨基葡萄糖的方法。
本发明提供了一种生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：以N-乙酰氨基葡萄糖为原料，在工程菌的作用下，生产氨基葡萄糖；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；所述功能蛋白为N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶或几丁二糖脱乙酰酶。
所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为EcDac蛋白；所述EcDac蛋白为如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。
所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为VcDac蛋白；所述VcDac蛋白为如下(b1)或(b2)：
(b1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。
所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为TmDac蛋白；所述TmDac蛋白为如下(c1)或(c2)：
(c1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c2)将序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。
所述几丁二糖脱乙酰酶为TKDac蛋白；所述TKDac蛋白为如下(d1)或(d2)：
(d1)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(d2)将序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。
所述功能基因为EcDac基因；所述EcDac基因为如下(e1)或(e2)或(e3)的DNA分子：
(e1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
(e2)在严格条件下与(e1)限定的DNA序列杂交且编码EcDac蛋白的DNA分子；
(e3)与(e1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码EcDac蛋白的DNA分子。
所述功能基因为VcDac基因；所述VcDac基因为如下(f1)或(f2)或(f3)的DNA分子：
(f1)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；
(f2)在严格条件下与(f1)限定的DNA序列杂交且编码VcDac蛋白的DNA分子；
(f3)与(f1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码VcDac蛋白的DNA分子。
所述功能基因为TmDac基因；所述TmDac基因为如下(g1)或(g2)或(g3)的DNA分子：
(g1)编码区如序列表中序列5所示的DNA分子；
(g2)在严格条件下与(g1)限定的DNA序列杂交且编码TmDac蛋白的DNA分子；
(g3)与(g1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码TmDac蛋白的DNA分子。
所述功能基因为TKDac基因；所述TKDac基因为如下(h1)或(h2)或(h3)的DNA分子：
(h1)编码区如序列表中序列7所示的DNA分子；
(h2)在严格条件下与(h1)限定的DNA序列杂交且编码TKDac蛋白的DNA分子；
(h3)与(h1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码TKDac蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
所述功能基因通过重组质粒导入出发菌；所述重组质粒是将所述功能基因插入出发载体得到的。所述出发载体可为载体pBAD/HisB。所述重组质粒具体可为：在载体pBAD/HisB的多克隆位点(例如XhoI和EcoRI之间、NcoI和EcoRI之间或XhoI和SpeI之间)插入所述功能基因，得到的重组质粒。所述出发载体还可为pET系列质粒、pETduet系列质粒、pTXB1系列质粒、pTUB1系列质粒、pTYB1系列质粒等。
所述出发菌可为大肠杆菌。所述出发菌可为大肠杆菌BW25113。所述出发菌还可为BL21系列菌株、Rosetta系列菌株、BW25113系列菌株、Origami系列菌株等。
所述方法中采用液相反应体系；初始反应体系中，N-乙酰氨基葡萄糖的浓度为50g/L。所述液相反应体系的溶剂为pH8.0的Tris-HCl缓冲液。
所述液相反应体系由工程菌、N-乙酰氨基葡萄糖、TritonX-100和pH8.0的Tris-HCl缓冲液组成。初始体系OD600nm＝30。初始体系中，N-乙酰氨基葡萄糖浓度为50g/L、TritonX-100浓度为0.1％(体积百分含量)。
所述方法中，反应条件为：25℃-42℃(优选30-37℃)、1-3h。
所述方法中，反应条件为：37℃、1h。
所述方法中，反应pH为7.0-8.0，优选为7.5-8.0。
所述工程菌具体可先进行如下处理：
(1)将工程菌培养至OD600nm＝0.6-0.8(具体可为0.7)；
(2)完成步骤(1)后，在培养体系中加入L-阿拉伯糖进行诱导；
(3)完成步骤(2)后，离心收集工程菌。
所述工程菌具体可先进行如下处理：
(1)将工程菌接种至液体培养基(例如LB液体培养基或2YT液体培养基或M9培养基)，振荡培养至OD600nm＝0.6-0.8(具体可为0.7)；
(2)完成步骤(1)后，在培养体系中加入L-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100mL，振荡培养12小时；
(3)完成步骤(2)后，离心收集工程菌。
所述工程菌具体可先进行如下处理：
(1)将工程菌接种至液体培养基(例如LB液体培养基或2YT液体培养基，液体培养基中还可含有抗生素，例如50μg/mL链霉素)，37℃、220rpm振荡培养至OD600nm＝0.6-0.8(具体可为0.7)；
(2)完成步骤(1)后，在培养体系中加入L-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100mL，30℃、200rpm振荡培养12小时；
(3)完成步骤(2)后，取整个培养体系，4℃、6000rpm离心15min，收集细胞沉淀，即为工程菌。
本发明还保护将重组质粒导入出发菌得到的重组菌；所述重组质粒为将功能基因插入出发载体得到的；所述出发菌为大肠杆菌；所述出发载体为载体pBAD/HisB；所述功能基因为编码功能蛋白的基因。所述重组质粒具体可为：在载体pBAD/HisB的多克隆位点(例如XhoI和EcoRI之间、NcoI和EcoRI之间或XhoI和SpeI之间)插入所述功能基因，得到的重组质粒。所述出发菌可为大肠杆菌BW25113。
本发明还保护所述重组菌在制备氨基葡萄糖中的应用。所述应用中，以N-乙酰氨基葡萄糖为原料。
本发明还保护一种生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：以N-乙酰氨基葡萄糖为原料，在功能蛋白的作用下，生产氨基葡萄糖。
所述方法中采用液相反应体系；初始反应体系中，N-乙酰氨基葡萄糖的浓度为50g/L。所述液相反应体系的溶剂为pH8.0的Tris-HCl缓冲液。
所述方法中，反应条件为：25℃-42℃(优选30-37℃)、1-3h。
所述方法中，反应条件为：37℃、1h。
所述方法中，反应pH为7.5-8.0。
所述功能蛋白的存在形式可为：完整的微生物细胞、细胞破碎液、粗酶或纯酶。
本发明提供的方法，不受资源限制，对环境污染小，符合环保要求。采用本发明提供的方法制备氨基葡萄糖，反应条件温和、工艺路线简单、产物纯度高、适合大规模的工业化生产，非常适于推广应用。
附图说明
图1将N-乙酰氨基葡萄糖标准品和氨基葡萄糖标准品的HPLC图谱。
图2为重组菌Ⅱ进行相应步骤后的HPLC图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。对于同一条件参数下的不同次反应的色谱图来说，目标峰保留时间会有一定的误差范围，一般相差0.1min内可以视为误差。
载体pBAD/HisB：购自Invitrogen公司，产品目录号：V430-01。
大肠杆菌BW25113：Biovector NTCC INC，货号为355297。
N-乙酰氨基葡萄糖：购自Aladdin公司，产品目录号：A105211。
氨基葡萄糖标准品：购自Aladdin公司，产品目录号：G100089。
氨基葡萄糖的结构式如下：
Figure BDA0001151825330000051
实施例1、构建重组菌
一、构建重组菌Ⅰ
构建重组质粒pBAD/HisB-EcDac。根据测序结果，对重组质粒pBAD/HisB-EcDac进行结构描述如下：将载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列1所示的双链DNA分子。序列表的序列1所示的DNA分子编码序列表的序列2所示的蛋白质。序列表的序列2所示的蛋白质为来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶，简称EcDac蛋白。
将重组质粒pBAD/HisB-EcDac导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅰ。
二、构建重组菌Ⅱ
构建重组质粒pBAD/HisB-VcDac。根据测序结果，对重组质粒pBAD/HisB-VcDac进行结构描述如下：将载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列3所示的双链DNA分子。序列表的序列3所示的DNA分子编码序列表的序列4所示的蛋白质。序列表的序列4所示的蛋白质为来源于霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶，简称VcDac蛋白。
将重组质粒pBAD/HisB-VcDac导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅱ。
三、构建重组菌Ⅲ
构建重组质粒pBAD/HisB-TmDac。根据测序结果，对重组质粒pBAD/HisB-TmDac进行结构描述如下：将载体pBAD/HisB的NcoI和EcoRI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列5所示的双链DNA分子。序列表的序列5所示的DNA分子编码序列表的序列6所示的蛋白质。序列表的序列6所示的蛋白质为来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶，简称TmDac蛋白。
将重组质粒pBAD/HisB-TmDac导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅲ。
四、构建重组菌Ⅳ
构建重组质粒pBAD/HisB-TKDac。根据测序结果，对重组质粒pBAD/HisB-TKDac进行结构描述如下：将载体pBAD/HisB的XhoI和SpeI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列7所示的双链DNA分子。序列表的序列7所示的DNA分子编码序列表的序列8所示的蛋白质。序列表的序列8所示的蛋白质为来源于嗜热古菌(Thermococcus kodakaraensis)的几丁二糖脱乙酰酶，简称TKDac蛋白。
将重组质粒pBAD/HisB-TKDac导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅳ。
五、构建重组菌Ⅴ
将载体pBAD/HisB导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅴ。
实施例2、应用重组菌制备氨基葡萄糖
一、制备菌体
试验菌株分别为：实施例1制备的重组菌Ⅰ、重组菌Ⅱ、重组菌Ⅲ、重组菌Ⅳ、重组菌Ⅴ或大肠杆菌BW25113。
1、取试验菌株的单克隆，接种到含50μg/mL链霉素的LB液体培养基(实际应用中，也可采用2YT液体培养基)，37℃、220rpm振荡培养至OD600nm＝0.7(实际应用中，OD600nm＝0.6-0.8均可)。
2、完成步骤1后，在培养体系中加入L-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100mL，30℃、200rpm振荡培养12小时。
3、完成步骤2后，取整个培养体系，4℃、6000rpm离心15min，收集细胞沉淀。
重组菌Ⅰ得到的细胞沉淀命名为菌体Ⅰ。
重组菌Ⅱ得到的细胞沉淀命名为菌体Ⅱ。
重组菌Ⅲ得到的细胞沉淀命名为菌体Ⅲ。
重组菌Ⅳ得到的细胞沉淀命名为菌体Ⅳ。
重组菌Ⅴ得到的细胞沉淀命名为菌体Ⅴ。
大肠杆菌BW25113得到的细胞沉淀命名为菌体Ⅵ。
二、制备氨基葡萄糖
试验菌体分别为：步骤一制备的菌体Ⅰ、菌体Ⅱ、菌体Ⅲ、菌体Ⅳ、菌体Ⅴ或菌体Ⅵ。
将试验菌体、N-乙酰氨基葡萄糖(底物)、TritonX-100和pH 8.0的Tris-HCl缓冲液混匀，即为初始体系。初始体系OD600nm＝30。初始体系中，底物浓度为50g/L、TritonX-100浓度为0.1％(体积百分含量)。初始体系37℃反应1小时(反应过程中，实时监测pH,用2M NaOH水溶液控制pH为7.5-8.0)。完成反应后，即为终止体系。检测终止体系中的氨基葡萄糖浓度。
进行三次重复试验，每次重复中每种菌体设置五个重复处理。
检测氨基葡萄糖浓度的方法如下(HPLC)：
取终止体系，13000rpm离心3min，收集上清液，用无菌水稀释得到稀释液，然后用孔径为0.45μm的滤膜过滤并收集滤液。将滤液作为上样液。
色谱柱：Agilent XDB-C18；HPLC系统：Agilent 1260；
流动相：由3体积份乙腈和97体积份乙酸钠缓冲液组成；乙酸钠缓冲液：含10mM乙酸钠和5mM正庚烷磺酸钠，余量为水(用乙酸调pH至4.5)。
流速：1.0mL/min；
温度：40℃；进样量10μL；检测器：RID。
将N-乙酰氨基葡萄糖标准品和氨基葡萄糖标准品在相同条件下进行HPLC。图谱见图1。N-乙酰氨基葡萄糖标准品(GlcNAc)的出峰位置为1.808min。氨基葡萄糖标准品(GlcN)的出峰位置为5.483min。用氨基葡萄糖标准品建立氨基葡萄糖与峰面积的标准曲线方程如下：y＝93018x+2368.8，R2＝0.9978(x为氨基葡萄糖的浓度，单位为g/L；y为HPLC色谱图中的峰面积)。
重组菌Ⅱ进行上述步骤的相应图谱见图2(分别在1.804min和5.476min显示出峰)。
采用各个不同试验菌体时，终止体系中的氨基葡萄糖浓度见表2(平均值)。
表2
终止体系中的氨基葡萄糖浓度
重组菌Ⅰ 35.7g/L
重组菌Ⅱ 40.8g/L
重组菌Ⅲ 17.6g/L
重组菌Ⅳ 10.2g/L
重组菌Ⅴ 0g/L
菌体Ⅵ 0g/L
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种生产氨基葡萄糖的方法
<130> GNCYX162025
<160> 8
<210> 1
<211> 1149
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtatgcat taacccaggg ccggatcttt accggccacg aatttcttga tgaccacgcg 60
gttgttatcg ctgatggcct gattaaaagc gtctgtccgg tagcggaact gccgccagag 120
atcgaacaac gttcactgaa cggggccatt ctctcccccg gttttatcga tgtgcagtta 180
aacggctgcg gcggcgtaca gtttaacgac accgctgaag cggtcagcgt ggaaacgctg 240
gaaatcatgc agaaagccaa tgagaaatca ggctgtacta actatctgcc gacgcttatc 300
accaccagcg atgagctgat gaaacagggc gtgcgcgtta tgcgcgagta cctggcaaaa 360
catccgaatc aggcgttagg tctgcatctg gaaggtccgt ggctgaatct ggtaaaaaaa 420
ggcacccata atccgaattt tgtgcgtaag cctgatgccg cgctggtcga tttcctgtgt 480
gaaaacgccg acgtcattac caaagtgacc ctggcaccgg aaatggttcc tgcggaagtc 540
atcagcaaac tggcaaatgc cgggattgtg gtttctgccg gtcactccaa cgcgacgttg 600
aaagaagcaa aagccggttt ccgcgcgggg attacctttg ccacccatct gtacaacgcg 660
atgccgtata ttaccggtcg tgaacctggc ctggcgggcg cgatcctcga cgaagctgac 720
atttattgcg gtattattgc tgatggcctg catgttgatt acgccaacat tcgcaacgct 780
aaacgtctga aaggcgacaa actgtgtctg gttactgacg ccaccgcgcc agcaggtgcc 840
aacattgaac agttcatttt tgcgggtaaa acaatatact accgtaacgg actttgtgtg 900
gatgagaacg gtacgttaag cggttcatcc ttaaccatga ttgaaggcgt gcgtaatctg 960
gtcgaacatt gcggtatcgc actggatgaa gtgctacgta tggcgacgct ctatccggcg 1020
cgtgcgattg gcgttgagaa acgtctcggc acactcgccg caggtaaagt agccaacctg 1080
actgcattca cacctgattt taaaatcacc aagaccatcg ttaacggtaa cgaggtcgta 1140
actcaataa 1149
<210> 2
<211> 382
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Tyr Ala Leu Thr Gln Gly Arg Ile Phe Thr Gly His Glu Phe Leu
1 5 10 15
Asp Asp His Ala Val Val Ile Ala Asp Gly Leu Ile Lys Ser Val Cys
20 25 30
Pro Val Ala Glu Leu Pro Pro Glu Ile Glu Gln Arg Ser Leu Asn Gly
35 40 45
Ala Ile Leu Ser Pro Gly Phe Ile Asp Val Gln Leu Asn Gly Cys Gly
50 55 60
Gly Val Gln Phe Asn Asp Thr Ala Glu Ala Val Ser Val Glu Thr Leu
65 70 75 80
Glu Ile Met Gln Lys Ala Asn Glu Lys Ser Gly Cys Thr Asn Tyr Leu
85 90 95
Pro Thr Leu Ile Thr Thr Ser Asp Glu Leu Met Lys Gln Gly Val Arg
100 105 110
Val Met Arg Glu Tyr Leu Ala Lys His Pro Asn Gln Ala Leu Gly Leu
115 120 125
His Leu Glu Gly Pro Trp Leu Asn Leu Val Lys Lys Gly Thr His Asn
130 135 140
Pro Asn Phe Val Arg Lys Pro Asp Ala Ala Leu Val Asp Phe Leu Cys
145 150 155 160
Glu Asn Ala Asp Val Ile Thr Lys Val Thr Leu Ala Pro Glu Met Val
165 170 175
Pro Ala Glu Val Ile Ser Lys Leu Ala Asn Ala Gly Ile Val Val Ser
180 185 190
Ala Gly His Ser Asn Ala Thr Leu Lys Glu Ala Lys Ala Gly Phe Arg
195 200 205
Ala Gly Ile Thr Phe Ala Thr His Leu Tyr Asn Ala Met Pro Tyr Ile
210 215 220
Thr Gly Arg Glu Pro Gly Leu Ala Gly Ala Ile Leu Asp Glu Ala Asp
225 230 235 240
Ile Tyr Cys Gly Ile Ile Ala Asp Gly Leu His Val Asp Tyr Ala Asn
245 250 255
Ile Arg Asn Ala Lys Arg Leu Lys Gly Asp Lys Leu Cys Leu Val Thr
260 265 270
Asp Ala Thr Ala Pro Ala Gly Ala Asn Ile Glu Gln Phe Ile Phe Ala
275 280 285
Gly Lys Thr Ile Tyr Tyr Arg Asn Gly Leu Cys Val Asp Glu Asn Gly
290 295 300
Thr Leu Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Ile Glu Gly Val Arg Asn Leu
305 310 315 320
Val Glu His Cys Gly Ile Ala Leu Asp Glu Val Leu Arg Met Ala Thr
325 330 335
Leu Tyr Pro Ala Arg Ala Ile Gly Val Glu Lys Arg Leu Gly Thr Leu
340 345 350
Ala Ala Gly Lys Val Ala Asn Leu Thr Ala Phe Thr Pro Asp Phe Lys
355 360 365
Ile Thr Lys Thr Ile Val Asn Gly Asn Glu Val Val Thr Gln
370 375 380
<210> 3
<211> 1209
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgggtacct ctcatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagcctc 60
gagtctaacg cgatgtatgc gctgaccaac tgcaaaatct acacgggcaa cgatgttctg 120
gtaaaacacg ctgtgatcat taacggtgac aaaatcgaag cggtgtgtcc gatcgaatct 180
ctgccgtctg aaatgaacgt tgttgacctg aatggtgcga acttgtctcc aggttttatc 240
gatctgcaac tgaacggttg cggtggtgta atgttcaacg acgaaatcac cgccgaaact 300
atcgatacca tgcataaggc taacctgaaa tctggttgta cttctttcct gcccactctg 360
atcacctctt ctgacgaaaa catgcgtcag gcaatcgcgg cagcgcgtga ataccaagca 420
aaatatccta accagagcct cgggctgcac ttggaaggtc cgtacctgaa cgtcatgaaa 480
aaaggcattc acagcgttga ctttatccgt ccgagcgacg acaccatgat cgataccatc 540
tgtgcgaact cagacgttat tgcaaaagtt accctggcgc ctgaaaacaa caaaccagaa 600
catatcgaga aactggtgaa agcgggcatt gtggttagca tcggtcacac caatgccact 660
tattctgaag cacgcaaatc cttcgagtcc ggcattacat tcgcaaccca tctgttcaac 720
gctatgaccc cgatggttgg tcgcgaaccg ggtgtcgtag gcgcgatcta cgacacccca 780
gaagtttatg ccggtatcat tgcggacggt tttcacgtgg attacgctaa catccgtatc 840
gcacacaaaa tcaaaggtga aaaactcgtg ctggtcactg atgctacagc tccggcaggt 900
gcagagatgg actacttcat cttcgtaggt aaaaaagtgt actatcgtga cggcaaatgc 960
gtcgatgaaa atggtactct gggtggctct gcactgacca tgatcgaagc agtacaaaac 1020
accgtcgaac acgttggtat cgcactcgac gaagcgctgc gtatggcgac cttgtacccg 1080
gctaaagcga ttggtgtgga tgaaaaactg ggtcgtatta agaaaggcat gatcgcaaac 1140
ctgactgtct tcgatcgcga tttcaacgtt aaagctacgg tggtgaacgg tcagtacgaa 1200
cagaattaa 1209
<210> 4
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Gly Thr Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser Leu Glu Ser Asn Ala Met Tyr Ala Leu Thr Asn Cys Lys
20 25 30
Ile Tyr Thr Gly Asn Asp Val Leu Val Lys His Ala Val Ile Ile Asn
35 40 45
Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Cys Pro Ile Glu Ser Leu Pro Ser Glu
50 55 60
Met Asn Val Val Asp Leu Asn Gly Ala Asn Leu Ser Pro Gly Phe Ile
65 70 75 80
Asp Leu Gln Leu Asn Gly Cys Gly Gly Val Met Phe Asn Asp Glu Ile
85 90 95
Thr Ala Glu Thr Ile Asp Thr Met His Lys Ala Asn Leu Lys Ser Gly
100 105 110
Cys Thr Ser Phe Leu Pro Thr Leu Ile Thr Ser Ser Asp Glu Asn Met
115 120 125
Arg Gln Ala Ile Ala Ala Ala Arg Glu Tyr Gln Ala Lys Tyr Pro Asn
130 135 140
Gln Ser Leu Gly Leu His Leu Glu Gly Pro Tyr Leu Asn Val Met Lys
145 150 155 160
Lys Gly Ile His Ser Val Asp Phe Ile Arg Pro Ser Asp Asp Thr Met
165 170 175
Ile Asp Thr Ile Cys Ala Asn Ser Asp Val Ile Ala Lys Val Thr Leu
180 185 190
Ala Pro Glu Asn Asn Lys Pro Glu His Ile Glu Lys Leu Val Lys Ala
195 200 205
Gly Ile Val Val Ser Ile Gly His Thr Asn Ala Thr Tyr Ser Glu Ala
210 215 220
Arg Lys Ser Phe Glu Ser Gly Ile Thr Phe Ala Thr His Leu Phe Asn
225 230 235 240
Ala Met Thr Pro Met Val Gly Arg Glu Pro Gly Val Val Gly Ala Ile
245 250 255
Tyr Asp Thr Pro Glu Val Tyr Ala Gly Ile Ile Ala Asp Gly Phe His
260 265 270
Val Asp Tyr Ala Asn Ile Arg Ile Ala His Lys Ile Lys Gly Glu Lys
275 280 285
Leu Val Leu Val Thr Asp Ala Thr Ala Pro Ala Gly Ala Glu Met Asp
290 295 300
Tyr Phe Ile Phe Val Gly Lys Lys Val Tyr Tyr Arg Asp Gly Lys Cys
305 310 315 320
Val Asp Glu Asn Gly Thr Leu Gly Gly Ser Ala Leu Thr Met Ile Glu
325 330 335
Ala Val Gln Asn Thr Val Glu His Val Gly Ile Ala Leu Asp Glu Ala
340 345 350
Leu Arg Met Ala Thr Leu Tyr Pro Ala Lys Ala Ile Gly Val Asp Glu
355 360 365
Lys Leu Gly Arg Ile Lys Lys Gly Met Ile Ala Asn Leu Thr Val Phe
370 375 380
Asp Arg Asp Phe Asn Val Lys Ala Thr Val Val Asn Gly Gln Tyr Glu
385 390 395 400
Gln Asn
<210> 5
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgggctctg acaagattca ccaccaccac catcacatga ttgttgagaa agtactgatc 60
gttgatccga tcgatggcga gttcaccggt gacgtggaga tcgaggaagg caagatcgtg 120
aaagtggaaa agcgtgagtg tatccctcgt ggggtcctga tgccgggttt cgtggacccg 180
catatccacg gcgtggtagg cgcagatacc atgaattgcg atttcagcga aatggaggaa 240
tttctgtaca gccaaggtgt taccaccttc ctcgcgacca ctgtctctac ctctctggaa 300
aagatgaaag aaattctgcg taaagctcgc gactacatcc tggagaaccc gtccacctcc 360
ctgctgggtg tacacctgga gggtccttat atctccaaag aaaagaaagg cgctcattct 420
gagaaacaca tccgtccgcc gtccgagcgt gaactgtccg aaattgactc tccggctaaa 480
atgctgacgt tcgcaccaga aattgaaagc tctgaactgc tgctgcgttt ggtaaagcgt 540
gacatcgtac tgtcggcagg tcactccatc gctaccttcg aagagttcat gaaattctat 600
aaggaaggcg ttaaacggat cactcacttt ccaaacggtc tgaagcctct gcaccaccgt 660
gaaatcggta tcactggtgc tggcctgctg ctggatgacg ttaaactgga gctgatctgt 720
gatggcgtgc atctgagtcg tgaaatggtt aagttggtgt acaaagttaa gaaggccaac 780
ggtatcgttt tagtcaccga ctctattagc gccgctggtc tgaaagatgg taccactacc 840
ctgggtgatt tggtggtaaa agttaaagac ggtgtaccgc gtctggaaga tggcacgctg 900
gcgggcagta ctctgttctt ctctcaggca gtgaaaaact tccgcaaatt cactggttgc 960
tctattactg aactggctaa agtttccagc tataactcct gcgtcgagct gggtctggat 1020
gaccgtggcc gcatcgcgga aggtacccgt gccgacctgg tactgctgga tgaggacctg 1080
aatgtggtaa tgacgatcaa agagggcgag gttgttttcc gctcccgcta a 1131
<210> 6
<211> 376
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Gly Ser Asp Lys Ile His His His His His His Met Ile Val Glu
1 5 10 15
Lys Val Leu Ile Val Asp Pro Ile Asp Gly Glu Phe Thr Gly Asp Val
20 25 30
Glu Ile Glu Glu Gly Lys Ile Val Lys Val Glu Lys Arg Glu Cys Ile
35 40 45
Pro Arg Gly Val Leu Met Pro Gly Phe Val Asp Pro His Ile His Gly
50 55 60
Val Val Gly Ala Asp Thr Met Asn Cys Asp Phe Ser Glu Met Glu Glu
65 70 75 80
Phe Leu Tyr Ser Gln Gly Val Thr Thr Phe Leu Ala Thr Thr Val Ser
85 90 95
Thr Ser Leu Glu Lys Met Lys Glu Ile Leu Arg Lys Ala Arg Asp Tyr
100 105 110
Ile Leu Glu Asn Pro Ser Thr Ser Leu Leu Gly Val His Leu Glu Gly
115 120 125
Pro Tyr Ile Ser Lys Glu Lys Lys Gly Ala His Ser Glu Lys His Ile
130 135 140
Arg Pro Pro Ser Glu Arg Glu Leu Ser Glu Ile Asp Ser Pro Ala Lys
145 150 155 160
Met Leu Thr Phe Ala Pro Glu Ile Glu Ser Ser Glu Leu Leu Leu Arg
165 170 175
Leu Val Lys Arg Asp Ile Val Leu Ser Ala Gly His Ser Ile Ala Thr
180 185 190
Phe Glu Glu Phe Met Lys Phe Tyr Lys Glu Gly Val Lys Arg Ile Thr
195 200 205
His Phe Pro Asn Gly Leu Lys Pro Leu His His Arg Glu Ile Gly Ile
210 215 220
Thr Gly Ala Gly Leu Leu Leu Asp Asp Val Lys Leu Glu Leu Ile Cys
225 230 235 240
Asp Gly Val His Leu Ser Arg Glu Met Val Lys Leu Val Tyr Lys Val
245 250 255
Lys Lys Ala Asn Gly Ile Val Leu Val Thr Asp Ser Ile Ser Ala Ala
260 265 270
Gly Leu Lys Asp Gly Thr Thr Thr Leu Gly Asp Leu Val Val Lys Val
275 280 285
Lys Asp Gly Val Pro Arg Leu Glu Asp Gly Thr Leu Ala Gly Ser Thr
290 295 300
Leu Phe Phe Ser Gln Ala Val Lys Asn Phe Arg Lys Phe Thr Gly Cys
305 310 315 320
Ser Ile Thr Glu Leu Ala Lys Val Ser Ser Tyr Asn Ser Cys Val Glu
325 330 335
Leu Gly Leu Asp Asp Arg Gly Arg Ile Ala Glu Gly Thr Arg Ala Asp
340 345 350
Leu Val Leu Leu Asp Glu Asp Leu Asn Val Val Met Thr Ile Lys Glu
355 360 365
Gly Glu Val Val Phe Arg Ser Arg
370 375
<210> 7
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggtctttg aagaatttaa caactttgac gaagcgttct ctgccttgct gtccaaactc 60
gatttcaaaa tcaacgagcc gtttaacgat gttaagaaag tgctgtgtat cgagccgcac 120
ccggatgact gtgcgattgg cctgggtggt accatcaaaa agctcactga ttctggcatc 180
gacgtcgtgt atctcctgct caccgacggc agcatgggca caaccgatgg cgaagttagt 240
ggtcatgaac tggcactgcg ccgtctggaa gaagaaaagc gctcggcaga aatcctgggt 300
gttaagaaaa tccatgcgct ggacttcggt gatacggaac tcccgtatac gcgcgaggta 360
cgcaaagaaa tcgtaacggt gattcgtaaa gaacgtcctg gtattgttct gatgccggac 420
ccttggttgc cgtatgaagg ccatccggac caccgtcacg ctggcttcct gggcatcgaa 480
gctgtgagct tcgccggtct gccgaacttc aaccgttcgg acctaatcgc tggtctggac 540
ccgcactcta tccaggctgt aggcttctac tatacccaca aacctaacta ctttgttgat 600
atctctgatg tcatggaagt caaactgcgt gccgtgcgta ctcacgagtc tcagttcccg 660
gaagatgttt gggaactgtg ggagccgtat ctgcgtacta ttgccttata ctacggcaaa 720
atgtctggtc accgctacgc tgaaggcatc agattcgtgc cgggtatctt cctgcacatc 780
tgcccgttcg cacacgttat ctaa 804
<210> 8
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Met Val Phe Glu Glu Phe Asn Asn Phe Asp Glu Ala Phe Ser Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ser Lys Leu Asp Phe Lys Ile Asn Glu Pro Phe Asn Asp Val Lys
20 25 30
Lys Val Leu Cys Ile Glu Pro His Pro Asp Asp Cys Ala Ile Gly Leu
35 40 45
Gly Gly Thr Ile Lys Lys Leu Thr Asp Ser Gly Ile Asp Val Val Tyr
50 55 60
Leu Leu Leu Thr Asp Gly Ser Met Gly Thr Thr Asp Gly Glu Val Ser
65 70 75 80
Gly His Glu Leu Ala Leu Arg Arg Leu Glu Glu Glu Lys Arg Ser Ala
85 90 95
Glu Ile Leu Gly Val Lys Lys Ile His Ala Leu Asp Phe Gly Asp Thr
100 105 110
Glu Leu Pro Tyr Thr Arg Glu Val Arg Lys Glu Ile Val Thr Val Ile
115 120 125
Arg Lys Glu Arg Pro Gly Ile Val Leu Met Pro Asp Pro Trp Leu Pro
130 135 140
Tyr Glu Gly His Pro Asp His Arg His Ala Gly Phe Leu Gly Ile Glu
145 150 155 160
Ala Val Ser Phe Ala Gly Leu Pro Asn Phe Asn Arg Ser Asp Leu Ile
165 170 175
Ala Gly Leu Asp Pro His Ser Ile Gln Ala Val Gly Phe Tyr Tyr Thr
180 185 190
His Lys Pro Asn Tyr Phe Val Asp Ile Ser Asp Val Met Glu Val Lys
195 200 205
Leu Arg Ala Val Arg Thr His Glu Ser Gln Phe Pro Glu Asp Val Trp
210 215 220
Glu Leu Trp Glu Pro Tyr Leu Arg Thr Ile Ala Leu Tyr Tyr Gly Lys
225 230 235 240
Met Ser Gly His Arg Tyr Ala Glu Gly Ile Arg Phe Val Pro Gly Ile
245 250 255
Phe Leu His Ile Cys Pro Phe Ala His Val Ile
260 265

Claims (1)

1.一种生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：以N-乙酰氨基葡萄糖为原料，在工程菌的作用下，生产氨基葡萄糖；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；所述功能蛋白为N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶；所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为VcDac蛋白；所述VcDac蛋白为由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述出发菌为大肠杆菌BW25113；
所述工程菌先进行如下处理，然后用于生产氨基葡萄糖：
(1)将工程菌接种至液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD600nm＝0.6-0.8；
(2)完成步骤(1)后，在培养体系中加入L-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100mL，30℃、200rpm振荡培养12小时；
(3)完成步骤(2)后，取整个培养体系，4℃、6000rpm离心15min，收集细胞沉淀，即为工程菌；
所述生产氨基葡萄糖的方法中采用液相反应体系；初始反应体系中，N-乙酰氨基葡萄糖的浓度为50g/L；所述液相反应体系的溶剂为pH8.0的Tris-HCl缓冲液；
所述生产氨基葡萄糖的方法中，反应条件为：37℃、1h；
所述生产氨基葡萄糖的方法中，反应pH为7.5-8.0。
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