CN103146720A

CN103146720A - 一种具有高转化率的反式-4-羟基-l-脯氨酸羟化酶改造基因及其应用

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Publication number: CN103146720A
Application number: CN2013100643389A
Authority: CN
Inventors: 李玮; 鞠建松; 薛张伟; 张金秀; 王立安; 张琳琳; 李天云; 张庆; 陈娇娇
Original assignee: HEBEI BOLUNTE PHARMACEUTICAL CO Ltd; Hebei Normal University
Current assignee: HEBEI BOLUNTE PHARMACEUTICAL CO Ltd; Hebei Normal University
Priority date: 2013-03-01
Filing date: 2013-03-01
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2033-03-01
Also published as: CN103146720B

Abstract

本发明公开了一种具有高转化率的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶改造基因及其应用。通过优化指孢囊菌（Dactylosporangium sp. RH1）中反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶（GenBankID:D78338.1）的核苷酸序列，构建优化基因的表达载体，通过原核表达，收集菌体作为转化反应的酶源，实验结果表明，以L-脯氨酸为底物，生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化率高达91%。本发明可用于生物法生产反式-4-羟基-L-羟脯氨酸，具有较好的工业应用价值。

Description

一种具有高转化率的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶改造基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有高转化率的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶改造基因及其应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸 (L-羟脯氨酸，trans-4-hydroxy-L-proline, Hyp)不属于20种常见的氨基酸，是羟化酶对脯氨酸羟基化修饰的结果，主要存在于胶原蛋白中，其作用是加强了结缔组织的弹性和韧性。胶原蛋白含量最丰富的材料为骨胶和明胶。骨胶、明胶中羟脯氨酸含量为10-10.5%，脯氨酸含量为12-13%。

近些年来，Hyp的研究和开发已经引起医药、生化、食品及美容业等方面的广泛关注。在医药领域，Hyp具有多种生理功能与独特的生物活性，既可作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等，又可加快伤口愈合，以及治疗各种皮肤疾病；作为氨基酸注射液的重要组分，它对急慢性肝病所导致的低蛋白血症有一定的疗效；Hyp参与脂肪的乳化及红细胞血红素和球蛋白的形成，具有调节脂肪乳化等作用；它还是多种药物，如第三代抗生素、抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等的合成原料。它具有减肥作用，可望成为比较理想的减肥药物。在化妆品添加剂领域，由于其具有抗氧化、抗辐射的作用，是化妆品的重要添加剂。在农业生产上，主要用作杀虫剂和抗旱剂。反式-4-羟基-L-羟脯氨酸存在两个手性中心，易于衍生化，药理活性多样，近年来逐渐被应用到医药原料药手性中间体领域，用于合成新一代培南类抗生素和多种新创制药物的合成。目前，反式-4-羟基-L-羟脯氨酸的世界用量为500吨/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趋势。

我国反式-4-羟基-L-羟脯氨酸的生产采用化学水解提取工艺，以动物胶原蛋白为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程，收率仅为5%，存在原料消耗量大、“三废”排放量大、能耗高、纯度低及生产成本高等不足。由于该工艺采用的是动物源原料，生产过程采用亚硝酸氧化工艺，该工艺的微量残存物或杂质会对后续衍生化的中间体或原料药产生潜在的危害。国内外许多制药公司已经提出了对于反式-4-羟基-L-羟脯氨酸的生物源来源要求，这种要求限制了动物源反式-4-羟基-L-羟脯氨酸的使用。目前国内所有采用化学水解工艺生产的企业均无法满足上述要求，再加上“三废”排放不达标，随时面临着关停的窘境。因此，急需开发一种污染小、能耗低、产品纯度高，具备规模化生产的技术，以替代目前的化学法水解提取工艺。

生物法转化生产反式-4-羟基-L-羟脯氨酸，是当前世界上解决当前化学法能耗高、污染大、成本高等问题的最佳途径。目前用于生物法转化生产反式-4-羟基-L-羟脯氨酸的酶主要来自指孢囊菌（Dactylosporangium sp. RH1），该菌株的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因（GenBank ID：BAA20094.1）长816bp核苷酸，编码272个氨基酸残基，GC含量为66.67%，Klein等研究发现该酶蛋白主要以包涵体形式出现（Klein et al. 2010），通过加入伴因子pG-KJE后目的蛋白的可溶性有所提升；以活菌体作为催化剂，添加低浓度底物L-脯氨酸（6.25mM），28℃下培养3d，反式-4-羟基-L-羟脯氨酸的最高转化率为63%。从以上结果可以看出，要利用该基因生物转化法生产反式-4-羟基-L-羟脯氨酸还存在着如下三个问题：1）需要添加伴因子，这将导致生产工艺复杂；2）转化率还比较低，导致产物中成分较多，尤其是L-脯氨酸的大量存在，给产物分离带来困难；3）转化反应中目的产物浓度低，导致分离成本上升。这三个问题的存在必将导致生产成本过高，不利于工业化生产。因此，必须发明更为高效的生物转化方法，为工业化服务。

本发明提供了一种含有反式-4-羟基-L-羟脯氨酸酶的改造基因，可用于高效制造反式-4-羟基-L-脯氨酸，具有较好的工业应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高转化率的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶改造基因序列。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有上述基因的载体及宿主细胞。

本发明还提供含有上述基因的工程菌。

本发明还提供上述反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶工程菌的培养方法和酶蛋白的诱导条件。

本发明的技术方案包括以下步骤：

（1）根据NCBI数据库中公开的来自Dactylosporangiumsp.RH1的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因phy-1序列信息，依据大肠杆菌的密码子频率进行调整，降低整个DNA序列的GC含量，获得优化后的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因（phy-2）。

（2）将优化后的基因phy-2与表达载体连接，构建反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的表达载体；

（3）将上述表达载体转化可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达该酶蛋白。

制备方法的优选条件：步骤（2）中所述表达载体为pET系列的pET-28a或pET-M-3C；

步骤（3）中所述工程菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)或BL21-CodonPlus(DE3)。

本发明进一步提供上述反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的应用，具体是将菌体作为反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的酶源用于生物法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。

具体地，本发明是从指孢囊菌(Dactylosporangiumsp. RH1)中获得反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因phy-1(GenBank ID: D78338.1)，所构建基因phy-1的表达载体做为对照；根据基因phy-1的序列信息，依据大肠杆菌的密码子频率进行调整，降低整个DNA序列的GC含量，获得优化的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因phy-2，构建其表达载体，将表达载体分别转化到宿主菌中，菌株培养在相应培养基中在28℃培养，经扩大培养OD₆₀₀至0.5-1.0时，加入0.1-0.5mM的IPTG在16-20℃低温诱导表达8-12h，收集菌体作为转化反应酶源，以转化率表示，含改造基因phy-2的表达载体的转化率最高达91%，而含基因phy-1的表达载体的转化率仅为62%。

指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.RH1) 反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶改造基因phy-2的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。

本发明取得的有益效果：本发明通过优化反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因，构建其工程菌株，并诱导表达反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶蛋白，以菌体作为转化反应酶源，催化L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化率得到了很大提高，降低了反应产物中L-脯氨酸的量，有利于反应产物反式-4-羟基-L-脯氨酸的纯化分离，具有较好的工业应用前景。

附图说明

图1A为含反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因phy-1的表达载体双酶切电泳图谱，图1A中1：pET-28a-Phy-1；M：1Kb Marker；

图1B为含优化基因phy-2的表达载体双酶切电泳图谱，图1B中1：pET-28a-Phy-2；2：pET-M-3C-Phy-2；M：Trans15K Marker。

图2A-图2C为以BL21（DE3）为宿主进行转化反应的HPLC检测图；

其中：图2A为E.coli BL21(DE3)/pET-28a-Phy-1；

图2B为E.coli BL21(DE3)/pET-28a-Phy-2；

图2C为E.coli BL21(DE3)/pET-M-3C-Phy-2。

图3A和图3B为以BL21-CodonPlus (DE3)为宿主进行转化反应的HPLC检测图；

其中：图3A为E.coli BL21-CodonPlus(DE3)/pET-28a-Phy-1；

图3B为E.coli BL21-CodonPlus(DE3)/pET-28a-Phy-2。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因优化及工程菌株的构建

（1）基因优化

根据NCBI数据库中公开的来自Dactylosporangiumsp.RH1的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因phy-1序列信息（GenBank ID: D78338.1），按照以下原则进行基因优化：①参照表达物种的密码子频率进行调整并替换频率在10%以下的密码子，以使基因序列的密码子使用频率尽可能的与物种的最优密码子频率一致；②尽可能的降低序列中的碱基重复结构，使RNA二级结构相对简单、稳定；③让整个DNA序列的GC含量尽可能的接近50%。

（2）质粒构建

将优化好的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因phy-2分别与表达载体pET-28a和pET-M-3C相连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，筛选阳性克隆，获得相应的表达质粒pET-28a-Phy-2和pET-M-3C-Phy-2；将反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶原始基因phy-1连接到表达载体pET-28a上，得到表达载体pET-28a-Phy-1；表达载体双酶切验证图谱见附图1A和图1B。

实施例2 不同表达载体在宿主E.coli BL21(DE3) 的转化实验

将上述3种表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，28℃140rpm摇菌约2-3h（OD₆₀₀达到0.5-1.0），添加0.1-0.5mM的IPTG，20℃诱导表达8-12h，离心收集菌体，称取1g菌体并重新悬浮于10mL转化反应液中（含有200mM L-脯氨酸、200mM α-酮戊二酸、6mM 硫酸亚铁、6mM L-抗坏血酸、80mM pH 6.5 MES缓冲液及1% Nonidet P-40），于35℃140rpm振荡反应72h，离心去除菌体，通过HPLC检测上清中反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成情况，其转化率如表1所示。其中含表达载体pET-28a-Phy-1菌株的转化率最低，仅为62.0%，含优化基因phy-2的菌株转化率明显提高，其中含表达质粒pET-28a-Phy-2菌株的转化率最高，为79.1%（图2A-图2C）（表1）。

表1 不同表达载体在宿主BL21（DE3）中的转化率

plasmid	L-Pro（mM）	Reaction time（h）	L-Hyp（mM）	Conversion rate (%)
					pET-28a-Phy-1	200	72	124.0	62.0
pET-28a-Phy-2	200	72	158.1	79.1
					pET-M-3C-Phy-2	200	72	150.2	75.1

实施例3 以E.coli BL21-CodonPlus（DE3）为宿主的转化实验

将表达载体pET28a-Phy-1及pET28a-Phy-2分别转化到大肠杆菌 BL21-CodonPlus（DE3）中，28℃140rpm摇菌约2-3h（OD₆₀₀达到0.5-1.0），添加0.1-0.5mM的IPTG，20℃诱导表达8-12h，离心收集菌体，称取1g菌体悬浮在10mL转化反应液中（含有200mM L-脯氨酸、200mM α-酮戊二酸、6mM 硫酸亚铁、6mM L-抗坏血酸、80mM pH 6.5 MES缓冲液及1% Nonidet P-40），于35℃140rpm振荡反应80h，离心去除菌体，通过HPLC检测上清中反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成情况，其中含pET28a-Phy-1的菌株的转化率仅为64.3%，而含表达载体pET28a-Phy-2的菌株的转化率高达91%（图3A、图3B）。

表2 以E.coli BL21-CodonPlus（DE3）为宿主的转化率

plasmid	L-Pro（mM）	Reaction time（h）	L-Hyp（mM）	Conversion rate (%)
					pET-28a-Phy-1	200	80	128.6	64.3
pET-28a-Phy-2	200	80	182.0	91.0

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列一：反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶蛋白的核苷酸序列（SEQ ID No.1）

<110> 河北博伦特药业有限公司；河北师范大学

<120> 一种具有高转化率的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶改造基因及其应用

<130> 2013

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 816

<212> DNA

<213> Dactylosporangium sp.RH1

<400> 1

atgctgaccc cgactgaact gaagcaatac cgtgaagcgg gctacctgct gatcgaggat 60

ggtctgggcc cgcgtgaggt tgattgtctg cgtcgtgcgg cggccgcgct gtatgcacaa 120

gactctccag accgtacgct ggaaaaagac ggtcgtaccg tccgtgctgt acacggctgc 180

caccgtcgtg acccggtttg ccgtgatctg gttcgccacc cgcgcctgct gggtccggct 240

atgcagatcc tgtccggcga tgtttacgtt catcagttca aaatcaatgc aaaagcgccg 300

atgactggcg acgtttggcc ttggcaccag gactatatct tctgggcgcg cgaagatggc 360

atggatcgcc cgcatgtagt taacgttgct gtcctgctgg atgaagcgac tcatctgaac 420

ggtccgctgc tgttcgtacc gggtactcac gaactgggcc tgattgacgt agaacgccgt 480

gcacctgcgg gtgacggcga tgcgcagtgg ctgccgcagc tgtccgcaga tctggattac 540

gcaattgacg cggacctgct ggcacgcctg accgctggcc gtggcattga aagcgccacc 600

ggtccggcag gttctatcct gctgtttgac tctcgcatcg tccacggttc cggtaccaac 660

atgagcccgc accctcgcgg tgtggtgctg gtgacctaca accgtacgga taacgccctg 720

ccggcacagg ctgctccacg tccggaattt ctggctgctc gtgacgccac cccgctggtg 780

ccgctgccgg ctggtttcgc cctggcgcag ccagtg 816

Claims

1.一种具有高转化率的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶改造基因序列，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.含有权利要求1记载的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶改造基因的工程菌的构建方法，其特征在于：将所述改造基因构建于表达载体中，并转化到大肠杆菌中；所述表达载体为pET-28a或pET-M-3C，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)或BL21-CodonPlus(DE3)。

3.含有权利要求1记载的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶改造基因的工程菌的培养方法，其特征在于：在LB培养基中28℃培养至OD₆₀₀为0.5-1.0时，加0.1-0.5mM的IPTG，于16-20℃低温诱导8-12h，收集菌体作为转化反应的酶源。

4.权利要求1所述改造基因的应用，其特征在于用于生物法生产反式-4-羟基-L-羟脯氨酸。