CN103911355A - 脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法及用其生产反式4-羟基-l-脯氨酸的高效转化方法 - Google Patents

脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法及用其生产反式4-羟基-l-脯氨酸的高效转化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了生物转化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，具体包括重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法和将L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化体系中助剂的种类、浓度及转化条件，为建立生物转化法工业化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸工艺提供了重要科学依据。

Description

脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法及用其生产反式4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法
技术领域
本发明属于属于酶工程和生物催化领域，具体涉及一种重组大肠杆菌工程菌中脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法和利用脯氨酸羟化酶将L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法。 
背景技术
羟脯氨酸(Hydroxy proline, Hyp) 不属于常见20种氨基酸，是脯氨酸羟基化修饰的结果，羟基通常加在第4或是第3位碳上。由于有两个不对称的碳原子，所以羟脯氨酸有4种立体异构体。分别为反式-4-羟基-L-脯氨酸，顺式-4-羟基-L-脯氨酸，反式-3-羟基-L-脯氨酸和顺式-3-羟基-L-脯氨酸。 
反式-4-羟基-L-脯氨酸在哺乳动物细胞中主要存在于胶原蛋白中，对形成稳定的三股螺旋胶原蛋白具十分重要的作用，可使结缔组织的弹性和韧性得到加强（Shibasaki, T. Mori, H. ozaki, A. 2000）。体液羟脯氨酸平衡失调会造成许多疾病，例如营养不良，老年痴呆症，牙齿、骨骼中的软骨和韧带组织的韧性减弱以及组织纤维化疾病等（Rajesh N. Kalaria, Andrea B. Pax . 1995）。 
近年来，羟脯氨酸的研究和开发已引起医药、生化、食品及美容业等方面的广泛关注。在医药方面，由于其具有多种生理功能与独特的生物活性，可作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等，又可加快伤口愈合，治疗各种皮肤疾病。反式-4-羟基-L-脯氨酸易于衍生化，药理活性多样，近年来逐渐被应用到原料药手性中间体领域，用于合成新一代培南类抗生素、抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等多种新创制药物的合成。由于其具有抗氧化、抗辐射的作用，在美容业方面，可以作为化妆品添加剂。目前，世界用量为500吨/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趋势。 
目前，我国反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产主要采用化学水解提取工艺，以动物胶原蛋白为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程制备， “三废”排放量大、污染严重，能耗高、纯度低及生产成本高。因此，利用节能、污染少的生物催化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸势在必行。 
生物转化法是指利用细菌或真菌细胞中的酶将底物分子转化为功能产物的过程。反式-4-羟基-L-脯氨酸生物转化法是指利用L-脯氨酸为底物，在Fe2+、α-酮戊二酸和L-抗坏血酸存在的条件下，利用L-脯氨酸羟化酶将L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸。反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因（GenBank ID：D78338.1）长816核苷酸，编码272个氨基酸残基，GC含量为66.67%，研究发现，该酶蛋白主要以包涵体形式出现（Christian Kleina，Wolfgang Huttela. 2011）。 
2011年，德国科学家Christian Klein对含有伴因子的大肠杆菌工程菌转化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化条件进行了优化，在37℃下，140 rpm培养重组工程菌为OD600=1.1–1.4时，加入0.2mM IPTG诱导表达，随后，再加入 6.25mM L-脯氨酸，0.5 mM硫酸亚铁，8 mM α-酮戊二酸，28℃条件下，140rpm培养72h后，测得的将脯氨酸转化为反式-4-L-脯氨酸的转化率仅为61%，底物投入量和转化效率都比较低，不适合工业化生产反式-4-L-脯氨酸。 
另外，对于工程菌株的酶表达，多采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)做诱导剂，其诱导效果虽好，但价格昂贵，不适合工业化生产。 
在前期研究中，我们发现一种编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段，可用于高效转化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。较全长酶，该基因片段编码酶活性高，转化效率高，转化反应时间短，具有较好的工业应用前景（已公布专利号为：CN 103146720 A和CN 103275998 A）。 
在前期研究中，采用的转化体系为：200mM L- 脯氨酸、200mM α- 酮戊二酸、6mM 硫酸亚铁、6mM L- 抗坏血酸、80mM pH 6.5 MES 缓冲液及1% Nonidet P-40。其中Nonidet P-40助剂也存在价格昂贵，不适合工业化生产的缺点。 
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的问题提供一种脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，同时提供用其生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，使该方法具备成本低、转化效率高，转化反应时间短，工业应用前景好的优点。 
为实现上述目的，本发明一方面提供了一种重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，具体采用下述技术方案为： 
一种重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，其为将含重组质粒pET-M-3C-P4Hyd1-257的工程菌株的单克隆接种至下述发酵培养基直接自诱导培养，所述培养基为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，氯化钠2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，七水硫酸亚铁0.1 g/L，乳糖6-10 g/L。
进一步的，所述重组质粒的工程菌株采用如下方法构建：将反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因的截短片段（p4hyd 1-257 ）构建到表达载体pET-M-3C中，获得重组质粒pET-M-3C-P4Hyd1-257，并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)中，获得了重组大肠杆菌工程菌。 
进一步的，所述自诱导培养条件如下：温度24-37℃，转速为140-220 rpm，培养时间为20-24h。 
进一步的，还包括离心收集菌体的步骤。 
本发明的另一方面提供了一种利用上述脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，其采用如下技术方案： 
一种利用脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，将菌体悬浮于转化反应液中对L-脯氨酸进行转化，所述菌体与转化液的比例为1g: 8-18mL，转化液包括MES缓冲液80-240mM，L-脯氨酸180-250mM、α-酮戊二酸180-250mM，FeSO4 6-9mM，L-抗坏血酸1-5mM和助剂，所述助剂选自20-80mg/L的头孢替安抗生素、0.1-1.0mg/mL SDS、0.5%-4%(v/v)TritonX-100、或0.1-1.5mg/mL溶菌酶中的一种。
进一步的，所述转化液pH6.3-6.8，反应温度为24-28℃，转速为140-220 rpm，时间为60-72h。 
进一步的，还包括离心去除菌体的步骤。 
与现有技术相比，本发明取得的有益效果为： 
本发明通过对重组大肠杆菌工程菌中脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达条件和将L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化体系中助剂的种类、浓度及转化条件进行了优化，本发明提供的方法不仅成本低、转化效率高，而且转化反应时间短，具有较好的工业应用前景。
附图说明
图1 自诱导培养基乳糖浓度的优化； 
图2 转化反应体系中头孢替胺（TTCT）抗生素浓度的优化；
图3 转化反应体系中SDS浓度的优化；
图4 转化反应体系中TritonX-100浓度的优化；
图5 转化反应体系中溶菌酶浓度的优化；
图6 转化反应条件优化的响应面实验结果。
具体实施方式
下面将结合附图1-6和具体实施例对本发明进行进一步详细的说明。 
实施例1a 重组大肠杆菌工程菌中脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法 
将含重组质粒的工程菌株的单克隆接种至发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，氯化钠2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，七水硫酸亚铁0.1 g/L和乳糖8 g/L，直接于28℃、140rpm 摇床自诱导培养24小时后，当菌液浓度为OD600达到2-2.5时，离心收集菌体。
实施例1b 重组大肠杆菌工程菌中脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法 
将含重组质粒的工程菌株的单克隆接种至发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，氯化钠2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，七水硫酸亚铁0.1 g/L和乳糖8 g/L，直接于24℃、220rpm 摇床自诱导培养20小时后，当菌液浓度为OD600达到2-2.5时，离心收集菌体。
实施例1c 重组大肠杆菌工程菌中脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法 
将含重组质粒的工程菌株的单克隆接种至发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，氯化钠2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，七水硫酸亚铁0.1 g/L和乳糖8 g/L，直接于37℃、180rpm 摇床自诱导培养22小时后，当菌液浓度为OD600达到2-2.5时，离心收集菌体。
试验例1重组大肠杆菌工程菌中脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达条件的考察 
与实施例1不同之处在于培养基中乳糖的浓度不同，分别设计乳糖浓度为4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L和12 g/L（编号为试验例1a、试验例1b、实施例1a、试验例1c、试验例1d）的五组试验来测量不同自诱导培养基获得菌体L-脯氨酸羟化酶活性。具体测量方法如下：各组分别称取1g菌体悬浮于10mL转化反应液中[200mM L-脯氨酸、200mM α-酮戊二酸、6mM 硫酸亚铁、6mM L-抗坏血酸、80mM MES缓冲液(pH 6.5)、1% Nonidet P-40]，于28℃、140rpm振荡反应72h，离心去除菌体，通过HPLC检测上清中反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成情况来反映不同自诱导培养基获得菌体L-脯氨酸羟化酶活性，具体见表1：
表1 不同自诱导培养基获得菌体的L-羟脯氨酸的转化率
项目 试验例1a 试验例1b 实施例1a 试验例1c 试验例1d
培养基中不同浓度乳糖含量（g/L） 4 6 8 10 12
L-羟脯氨酸生成量（mmol/L） 141.48 196.06 198.3 189.08 178.78
L-羟脯氨酸的转化率（%） 70.74 98.03 99.15 94.54 89.39
由表1显示，含6-8 g/L乳糖的自诱导培养基培养的菌体，L-羟脯氨酸的转化率最高可达98%以上（附图1）。
实施例2a 脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法 
称取实施例1所得到的1g菌体，将菌体悬浮于10mL转化反应液中[200mM L-脯氨酸、200mM α-酮戊二酸、6mM 硫酸亚铁、6mM L-抗坏血酸、80mM MES缓冲液(pH 6.5)、助剂为40mg/mL头孢替安（TTCT）抗生素]，于28℃、140rpm振荡反应72h，离心去除菌体，通过HPLC检测上清中反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成量为198.22 mmol/L，L-羟脯氨酸的转化率为99.11%。
实施例2b 脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法 
称取实施例1所得到的1g菌体，将菌体悬浮于10mL转化反应液中[200mM L-脯氨酸、200mM α-酮戊二酸、6mM 硫酸亚铁、6mM L-抗坏血酸、80mM MES缓冲液(pH 6.5)、助剂为0.1mg/mLSDS]，于28℃、140rpm振荡反应72h，离心去除菌体，通过HPLC检测上清中反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成量为195.96 mmol/L，L-羟脯氨酸的转化率为97.98%。
实施例2c 脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法 
称取实施例1所得到的1g菌体，将菌体悬浮于10mL转化反应液中[200mM L-脯氨酸、200mM α-酮戊二酸、6mM 硫酸亚铁、6mML-抗坏血酸、80mM MES缓冲液(pH 6.5)、助剂为4%（v/v）TritonX-100]，于28℃、140rpm振荡反应72h，离心去除菌体，通过HPLC检测上清中反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成量为189.94 mmol/L，L-羟脯氨酸的转化率为94.97%。
实施例2d 脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法 
称取实施例1所得到的1g菌体，将菌体悬浮于10mL转化反应液中[200mM L-脯氨酸、200mM α-酮戊二酸、6mM 硫酸亚铁、6mML-抗坏血酸、80mM MES缓冲液(pH 6.5)、助剂为0.1 mg/mL的溶菌酶]，于28℃、140rpm振荡反应72h，离心去除菌体，通过HPLC检测上清中反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成量为200mmol/L，L-羟脯氨酸的转化率为100%。
试验例2脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化体系助剂种类和浓度的考察 
设计四个实验组例，分别编号为试验例组2a、试验例组2b、试验例组2c和试验例组2d，考察助剂为头孢替安（TTCT）抗生素、SDS、TritonX-100和溶菌酶时，不同浓度对转化的影响。
试验例组2a 转化体系中加入不同浓度头孢替安对L-羟脯氨酸的转化率的影响 
具体试验方法如实施例2a，区别在头孢替安的浓度不同，分别设计头孢替安浓度为0 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L和80 mg/L /L（编号为试验例2a-1、试验例2a-2、实施例2a、试验例2a-3、试验例2a-3）的五组试验来测量对L-羟脯氨酸的转化率的影响，具体见表2：
表2 转化体系中加入不同浓度头孢替安L-羟脯氨酸的转化率
项目 试验例2a-1 试验例2a-2 实施例2a 试验例2a-3 试验例2a-4
不同浓度头孢替安（mg/L） 0 20 40 60 80
L-羟脯氨酸生成量（mmol/L） 19.5 178.06 198.22 190.28 181.74
L-羟脯氨酸的转化率（%） 9.75 89.03 99.11 95.14 90.87
由表2显示，当转化体系中头孢替安（TTCT）的浓度为40-60mg/L时，L-羟脯氨酸的转化率最高，为95%以上（附图2）。
试验例组2b 转化体系中加入不同浓度SDS对L-羟脯氨酸的转化率的影响 
具体试验方法如实施例2b，区别在SDS的浓度不同，分别设计SDS浓度为0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL和1.5mg/mL（编号为实施例2b、试验例2b-1、试验例2b-2、试验例2b-3）的四组试验来测量对L-羟脯氨酸的转化率的影响，具体见表3：
表3 转化体系中加入不同浓度SDS L-羟脯氨酸的转化率
项目 实施例2b 试验例2b-1 试验例2b-2 试验例2b-3
不同浓度SDS（mg/mL） 0.1 0.5 1.0 1.5
L-羟脯氨酸生成量（mmol/L） 195.96 193.48 193.72 166.68
L-羟脯氨酸的转化率（%） 97.98 96.74 96.86 83.34
表3显示，当转化体系中SDS的浓度为0.1-1.0 mg/L时，L-羟脯氨酸的转化率最高，均在97%左右（附图3）。
试验例组2c 转化体系中加入不同浓度TritonX-100对L-羟脯氨酸的转化率的影响 
具体试验方法如实施例2c，区别在TritonX-100的浓度不同，分别设计TritonX-100浓度为0.5%、1%、2%和4%（v/v）（编号为试验例2c-1、试验例2c-2、试验例2c-3和实施例2c）的四组试验来测量对L-羟脯氨酸的转化率的影响，具体见表4：
表4 转化体系中加入不同浓度TritonX-100 L-羟脯氨酸的转化率
项目 试验例2c-1 试验例2c-2 试验例2c-3 实施例2c
不同浓度TritonX-100（v/v） 0.5 1 2 4
L-羟脯氨酸生成量（mmol/L） 178.24 179 162.84 189.94
L-羟脯氨酸的转化率（%） 89.12 89.5 81.42 94.97
表4显示，当转化体系中TritonX-100的浓度为4%时，L-羟脯氨酸的转化率最高，达95%左右（附图4）。
试验例组2d 转化体系中加入不同浓度溶菌酶对L-羟脯氨酸的转化率的影响 
具体试验方法如实施例2d，区别在溶菌酶的浓度不同，分别设计溶菌酶浓度为0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL和1.5mg/mL（编号为实施例2d、试验例2d-1、试验例2d-2、试验例2d-3）的四组试验来测量对L-羟脯氨酸的转化率的影响，具体见表5：
表5 转化体系中加入不同浓度溶菌酶L-羟脯氨酸的转化率
项目 实施例2d 试验例2d-1 试验例2d-2 试验例2d-3
不同浓度溶菌酶（mg/mL） 0.1 0.5 1.0 1.5
L-羟脯氨酸生成量（mmol/L） 200 188.5 200 193.52
L-羟脯氨酸的转化率（%） 100 94.25 100 96.76
表5显示，当转化体系中溶菌酶的浓度为0.1-1.5 mg/mL时，L-羟脯氨酸的转化率均很高，最高可达100%（附图5）。
试验例3 L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化条件优化 
称取实施例1a得到的1g菌体，将菌体悬浮于10mL转化反应液中[含有200mM L-脯氨酸、200mM α-酮戊二酸、6mM 硫酸亚铁、6mM L-抗坏血酸、80mM MES缓冲液(pH 6.5)、25mg/L的头孢替安]。根据design expert软件以反应温度、转速和反应液pH三因素为变量，设定3水平正交实验，并按设定的组合进行转化反应实验。通过HPLC检测不同实验组合条件下转化反应上清中反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成情况。实验设计及结果见表6。
表6  温度、转速和pH3水平正交实验设计及L-羟脯氨酸的转化率 
表6显示，当转化反应温度为24-28℃，转速为140-220 rpm，pH6.3-6.8，时间为60-72h，在此条件下转化反应中L-羟脯氨酸的转化率最高可达97%以上（附图6）。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。 

Claims (7)

1.一种重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，其特征在于：其为将含重组质粒pET-M-3C-P4Hyd1-257的工程菌株的单克隆接种至下述发酵培养基直接自诱导培养，所述培养基为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，氯化钠2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，七水硫酸亚铁0.1 g/L，乳糖6-10 g/L。
2.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，其特征在于：所述重组质粒pET-M-3C-P4Hyd1-257的工程菌株采用如下方法构建：将反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因的截短片段（p4hyd 1-257 ）构建到表达载体pET-M-3C中，获得重组质粒pET-M-3C-P4Hyd1-257，并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)中，获得了重组大肠杆菌工程菌。
3.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，其特征在于：所述自诱导培养条件如下：温度24-37℃，转速为140-220 rpm，培养时间为20-24h。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，其特征在于：还包括离心收集菌体的步骤。
5.一种利用权利要求1-3任一项所述重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法得到的脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，其特征在于：将菌体悬浮于转化反应液中对L-脯氨酸进行转化，所述菌体与转化液的比例为1g: 8-18mL，转化液包括MES缓冲液80-240mM，L-脯氨酸180-250mM、α-酮戊二酸180-250mM，FeSO4 6-9mM，L-抗坏血酸1-5mM和助剂，所述助剂选自20-80mg/L的头孢替安抗生素、0.1-1.0mg/mL SDS、0.5%-4%(v/v)TritonX-100、或0.1-1.5mg/mL溶菌酶中的一种。
6.根据权利要求5所述的一种利用脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，其特征在于：所述转化液pH6.3-6.8，反应温度为24-28℃，转速为140-220 rpm，时间为60-72h。
7.根据权利要求6所述的一种利用脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，其特征在于：还包括离心去除菌体的步骤。
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