CN103275998A

CN103275998A - 一种编码高活性反式-4-羟基-l-脯氨酸羟化酶的基因片段及其应用

Info

Publication number: CN103275998A
Application number: CN2013102353376A
Authority: CN
Inventors: 李玮; 张金秀; 王立安; 李天云; 陈娇娇; 鞠建松; 薛张伟; 张琳琳; 张庆
Original assignee: HEBEI BOLUNTE PHARMACEUTICAL CO Ltd; Hebei Normal University
Current assignee: HEBEI BOLUNTE PHARMACEUTICAL CO Ltd; Hebei Normal University
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-06-14
Also published as: CN103275998B

Abstract

本发明公开了一种具有编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段及其应用，对指孢囊菌（Dactylosporangium sp. RH1）中反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶（GenBankID:BAA20094.1）基因密码子进行优化获得p4hyd基因，对优化后p4hyd基因进行截短，获得P4Hyd _1-257基因，分别构建重组质粒pET-M-3C-P4Hyd和pET-M-3C-P4Hyd_1-257，通过大肠杆菌进行原核表达，以菌体作酶源转化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。实验结果表明，以L-脯氨酸为底物，相比于pET-M-3C-P4Hyd，pET-M-3C-P4Hyd_1-257转化生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的最高转化率由91.4%提高到97.4%，转化反应时间由80小时缩短到60小时，转化率得到明显提高，转化时间明显缩短。本发明可用于生物转化法生产L-羟脯氨酸，具有较好的工业应用前景。

Description

一种编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段及其应用

技术领域

本发明涉及一种编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段及其应用，属于基因工程、酶工程、生物医药领域。

背景技术

羟脯氨酸(Hydroxy proline, Hyp) 不属于常见20种氨基酸，是脯氨酸羟基化修饰的结果，羟基通常加在第4或是第3位碳上。由于有两个不对称的碳原子，所以羟脯氨酸有4种立体异构体。分别为反式-4-羟基-L-脯氨酸，顺式-4-羟基-L-脯氨酸，反式-3-羟基-L-脯氨酸和顺式-3-羟基-L-脯氨酸。

反式-4-羟基-L-脯氨酸在哺乳动物细胞中主要存在于胶原蛋白中，对形成稳定的三股螺旋胶原蛋白具十分重要的作用，可使结缔组织的弹性和韧性得到加强（Shibasaki, T. Mori, H. ozaki, A. 2000）。体液羟脯氨酸平衡失调会造成许多疾病，例如营养不良，老年痴呆症，牙齿、骨骼中的软骨和韧带组织的韧性减弱以及组织纤维化疾病等（Rajesh N. Kalaria, Andrea B. Pax . 1995）。

近年来，羟脯氨酸的研究和开发已引起医药、生化、食品及美容业等方面的广泛关注。在医药方面，由于其具有多种生理功能与独特的生物活性，可作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等，又可加快伤口愈合，治疗各种皮肤疾病。反式-4-羟基-L-脯氨酸易于衍生化，药理活性多样，近年来逐渐被应用到医药原料药手性中间体领域，用于合成新一代培南类抗生素、抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等多种新创制药物的合成。由于其具有抗氧化、抗辐射的作用，在美容业方面，可以作为化妆品添加剂。目前，世界用量为500吨/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趋势。

目前，我国反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产主要采用化学水解提取工艺，以动物胶原蛋白为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程制备， “三废”排放量大、污染严重，能耗高、纯度低及生产成本高。因此，利用节能、污染少的生物催化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸势在必行。

生物转化法是指利用细菌或真菌细胞中的酶将底物分子转化为功能产物的过程。反式-4-羟基-L-脯氨酸生物转化法是指利用L-脯氨酸为底物，在Fe²⁺、α-酮戊二酸和L-抗坏血酸存在的条件下，利用反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶转化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因（GenBank ID：D78338.1）长816核苷酸，编码272个氨基酸残基，GC含量为66.67%，研究发现，该酶蛋白主要以包涵体形式出现（Christian Kleina，Wolfgang Huttela. 2011）。这种酶最早发现于链霉菌属 P-8648菌株中（Sheehan,J.C., H.G.Zachau, and Lawson. 1958）。日本协和发酵公司经过菌株的大量筛选，从自然界中筛选到一株具有反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶活性的孢囊菌属菌株，并且利用此菌株反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因，构建了L-羟脯氨酸生物合成工程菌，进一步提高了L-羟脯氨酸的产量，专利号为：ZL94115662.1。随后，日本科学家利用该菌株中的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因，根据宿主菌的偏好性和密码子的兼并性对该基因进行了密码子的同义突变，构建了不同表达载体进行酶的表达和活性检测研究，发现含有串联双色氨酸启动子的表达载体酶活性最高，催化L-脯氨酸转化成反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化效率可高达87%。但他们构建的表达载体不是常见载体，构建过程十分的繁琐，转化过程是直接将底物加到培养中的大肠杆菌工程菌培养基中，培养基成分复杂，不易于后续的分离纯化，在工业化利用方面存在一定缺陷性。2010年，德国科学家利用pET-28a作为载体，利用GroEL/GroES伴因子来提高酶的可溶性，转化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的能力是61%，转化效率不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段，可用于高效转化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。较全长酶，该基因片段编码酶活性高，转化效率高，转化反应时间短，具有较好的工业应用前景。

本发明还提供所述基因片段的表达产物以及含有所述表达产物的工程菌的构建方法。

本发明还提供了所述基因片段的应用。

本发明实现上述目的采用的技术方案：

本发明提供的编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

含有所述表达产物的工程菌的构建方法为：

（1）根据NCBI数据库中来自指孢囊菌Dactylosporangium sp. RH1的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因序列信息，在不改变氨基酸序列的条件下，对密码子GC含量和稀有密码子进行优化，获得反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的优化基因(p4hyd)，优化基因序列如SEQ ID No.1所示。设计引物，利用聚合酶链式反应对优化后的全长基因进行长度的截短，得到了具有高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因的截短片段（p4hyd _1-257），其基因序列如SEQ ID No.2所示。引物序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

（2）将截短基因p4hyd _1-257构建到表达载体pET-M-3C中，获得重组质粒pET-M-3C-P4Hyd_1-257。

（3）将上述重组质粒转化到大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)中进行酶的诱导表达，表达产物的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明进一步提供了上述高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的应用，具体是将上述构建的工程菌菌体作为反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的酶源，用于生物转化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。

具体的，本发明中工程菌株的培养、诱导条件为：挑取单克隆进行活化，在LB培养基中28℃活化培养3-4代后，培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加0.1-0.4mM的IPTG，于25-30℃低温诱导4-10h。离心收集菌体获得高酶活性菌体。

用上述工程菌株生物转化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法为：将1g菌体重悬于10mL-15mL含有底物的转化体系中（200mM L-脯氨酸、200mM α-酮戊二酸、6mM 硫酸亚铁、6mM L-抗坏血酸、80mM MES pH 6.5缓冲液及1% Nonidet P-40），于28℃振荡反应40-80小时，离心去除菌体，通过HPLC检测上清中L-脯氨酸转化成为反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化率。

本发明优点在于：在相同条件下，密码子优化基因 p4hyd及截短基因p4hyd _1-257的最高转化率分别为91.4%和97.4%，达到最高转化率所需时间分别为80小时和60小时。可见本发明通过截短反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因长度，提高了酶活性，使催化L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化率得到了很大提高，转化时间大大缩短，具有较好的工业应用前景。

附图说明

图1为pET-M-3C质粒图谱。

图2为pET-M-3C-P4Hyd工程菌生物转化生产羟脯氨酸的HPLC检测图。

峰1为转化生成的反式-4-羟基-L-脯氨酸；

峰2为未被转化的底物L-脯氨酸。

图3为pET-M-3C-P4Hyd_1-257工程菌生物转化生产羟脯氨酸的HPLC检测图。

峰1为转化生成的反式-4-羟基-L-脯氨酸；

峰2为未被转化的底物L-脯氨酸。

具体实施方式

以下实施例用于具体说明本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因优化及工程菌株的构建

（1）基因密码子的优化

优化密码子后的基因如附图一中SEQ ID No.1所示，命名为p4hyd。

（2）基因长度的截短

设计基因截短引物如下：

5′-3′（SEQ ID No.4和SEQ ID No.5）

上游引物：5′GT GAATTC ATGCTGACCCCGACCGAACTG3′（下划线斜体部分为EcoR I酶切位点）

下游引物：5′CT CTCGAG CTAGGTGGCGTCACGAGCAGC3′（下划线斜体部分为Xho I酶切位点）

利用聚合酶链式反应（PCR）扩增截短基因，并将其克隆构建到表达载体pET-M-3C中，测序验证。获得的基因序列如SEQ ID No.2所示，相应氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

PCR反应体系如下：

10×PCR缓冲液 3μL

4种dNTP(各2.5 mM) 2.1μL

上下游引物（各10 μM） 1μL

DNA模板 50 ng

Pfu酶 1-5U

水补足体系到30μL。

PCR扩增条件：

94℃变性5分钟；

94℃变性30秒；

54℃退火30秒；

72℃延伸2分钟；

72℃延伸10分钟。

其中，2-4步循环30次。

（3）重组质粒构建

以反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的优化基因(p4hyd)为模板，通过聚合酶链式反应分别获得全长基因及截短基因的PCR产物，并将其分别构建进入pET-M-3C表达载体（见图1）单克隆位点，获得重组质粒pET-M-3C-P4Hyd和pET-M-3C-P4Hyd_1-257，将重组质粒分别转化到E.coli BL21-CodonPlus(DE3) 进行蛋白表达。

构建重组质粒程序如下：

用EcoR I和Xho I限制性内切酶分别将PCR产物和pET-M-3C载体进行双酶切，用T4 DNA连接酶进行连接，转化到Trans-T1感受态菌株中，待第二天长出单菌落后筛选阳性克隆。提取质粒后送到测序公司进行测序。待测序正确后，将构建好的重组质粒转化进入E.coli BL21-CodonPlus(DE3)感受态菌株中。

实施例2 重组质粒在工程菌中的表达及生物转化效率检测

分别将含有两种重组质粒的工程菌株的单克隆进行活化，在LB培养基中，28℃活化培养3-4代后，培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，加0.1-0.4mM的IPTG，于25-30℃低温诱导蛋白表达4-10h。离心收集菌体，弃上清，每1g菌体重悬于10mL-15mL含有底物的转化体系中（200mM L-脯氨酸、200mM α-酮戊二酸、6mM 硫酸亚铁、6mM L-抗坏血酸、80mM MES pH 6.5和1% Nonidet P-40），于28℃振荡反应40-80小时，离心去除菌体，通过HPLC检测上清中L-脯氨酸转化成为反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化率，如表1所示。在相同条件下，P4Hyd及P4Hyd_1-257的最高转化率分别为91.4%（附图1）和97.4%（附图2），达到最高转化率所需时间分别为80小时和60小时（表1）。

表1 重组质粒工程菌生物转化效率和转化时间

重组质粒工程菌	L-脯氨酸（mM）	转化时间（h）	反式-4-羟基-L-脯氨酸（mM）	转化率 (%)
					pET-M-3C-P4Hyd	200	80	182.8	91.4
pET-M-3C-P4Hyd_1-257	200	60	194.9	97.4

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是十分常见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列一： L-脯氨酸羟化酶密码子优化基因的核苷酸序列（SEQ ID No.1）

<110> 河北博伦特药业有限公司；河北师范大学

<120>一种编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段及其应用

<130> 2013

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 816

<212> DNA

<213> Dactylosporangiumsp. RH1

<400> 1

atgctgaccc cgactgaact gaagcaatac cgtgaagcgg gctacctgct gatcgaggat 60

ggtctgggcc cgcgtgaggt tgattgtctg cgtcgtgcgg cggccgcgct gtatgcacaa 120

gactctccag accgtacgct ggaaaaagac ggtcgtaccg tccgtgctgt acacggctgc 180

caccgtcgtg acccggtttg ccgtgatctg gttcgccacc cgcgcctgct gggtccggct 240

atgcagatcc tgtccggcga tgtttacgtt catcagttca aaatcaatgc aaaagcgccg 300

atgactggcg acgtttggcc ttggcaccag gactatatct tctgggcgcg cgaagatggc 360

atggatcgcc cgcatgtagt taacgttgct gtcctgctgg atgaagcgac tcatctgaac 420

ggtccgctgc tgttcgtacc gggtactcac gaactgggcc tgattgacgt agaacgccgt 480

gcacctgcgg gtgacggcga tgcgcagtgg ctgccgcagc tgtccgcaga tctggattac 540

gcaattgacg cggacctgct ggcacgcctg accgctggcc gtggcattga aagcgccacc 600

ggtccggcag gttctatcct gctgtttgac tctcgcatcg tccacggttc cggtaccaac 660

atgagcccgc accctcgcgg tgtggtgctg gtgacctaca accgtacgga taacgccctg 720

ccggcacagg ctgctccacg tccggaattt ctggctgctc gtgacgccac cccgctggtg 780

ccgctgccgg ctggtttcgc cctggcgcag ccagtg 816

序列二：L-脯氨酸羟化酶截短基因的核苷酸序列（SEQ ID No.2）

<110> 河北博伦特药业有限公司；河北师范大学

<130> 2013

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 2

<211> 774

<212> DNA

<213> Dactylosporangiumsp. RH1

<400> 2

atgctgaccc cgaccgaact gaaacagtat cgtgaagcgg gctatctgct gattgaagat 60

ggcctgggcc cgcgtgaagt cgactgtctg cgtcgtgcgg cggccgcgct gtatgcacaa 120

gactctccag accgtacgct ggaaaaagac ggtcgtaccg tccgtgctgt acacggctgc 180

caccgtcgtg acccggtttg ccgtgatctg gttcgccacc cgcgcctgct gggtccggct 240

atgcagatcc tgtccggcga tgtttacgtt catcagttca aaatcaatgc aaaagcgccg 300

atgactggcg acgtttggcc ttggcaccag gactatatct tctgggcgcg cgaagatggc 360

atggatcgcc cgcatgtagt taacgttgct gtcctgctgg atgaagcgac tcatctgaac 420

ggtccgctgc tgttcgtacc gggtactcac gaactgggcc tgattgacgt agaacgccgt 480

gcacctgcgg gtgacggcga tgcgcagtgg ctgccgcagc tgtccgcaga tctggattac 540

gcaattgacg cggacctgct ggcacgcctg accgctggcc gtggcattga aagcgccacc 600

ggtccggcag gttctatcct gctgtttgac tctcgcatcg tccacggttc cggtaccaac 660

atgagcccgc accctcgcgg tgtggtgctg gtgacctaca accgtacgga taacgccctg 720

ccggcacagg ctgctccacg tccggaattt ctggctgctc gtgacgccac ctag 774

序列三：L-脯氨酸羟化酶截短基因编码氨基酸序列（SEQ ID No.3）

<110> 河北博伦特药业有限公司；河北师范大学

<130> 2013

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 3

<211> 257

<212> 氨基酸

<213> Dactylosporangiumsp. RH1

<400> 3

Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Glu Val Asp Cys Leu Arg Arg

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Leu Tyr Ala Gln Asp Ser Pro Asp Arg Thr Leu Glu

35 40 45

Lys Asp Gly Arg Thr Val Arg Ala Val His Gly Cys His Arg Arg Asp

50 55 60

Pro Val Cys Arg Asp Leu Val Arg His Pro Arg Leu Leu Gly Pro Ala

65 70 75 80

Met Gln Ile Leu Ser Gly Asp Val Tyr Val His Gln Phe Lys Ile Asn

85 90 95

Ala Lys Ala Pro Met Thr Gly Asp Val Trp Pro Trp His Gln Asp Tyr

100 105 110

Ile Phe Trp Ala Arg Glu Asp Gly Met Asp Arg Pro His Val Val Asn

115 120 125

Val Ala Val Leu Leu Asp Glu Ala Thr His Leu Asn Gly Pro Leu Leu

130 135 140

Phe Val Pro Gly Thr His Glu Leu Gly Leu Ile Asp Val Glu Arg Arg

145 150 155 160

Ala Pro Ala Gly Asp Gly Asp Ala Gln Trp Leu Pro Gln Leu Ser Ala

165 170 175

Asp Leu Asp Tyr Ala Ile Asp Ala Asp Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ala

180 185 190

Gly Arg Gly Ile Glu Ser Ala Thr Gly Pro Ala Gly Ser Ile Leu Leu

195 200 205

Phe Asp Ser Arg Ile Val His Gly Ser Gly Thr Asn Met Ser Pro His

210 215 220

Pro Arg Gly Val Val Leu Val Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Asn Ala Leu

225 230 235 240

Pro Ala Gln Ala Ala Pro Arg Pro Glu Phe Leu Ala Ala Arg Asp Ala

245 250 255

Thr

序列四：克隆反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶截短基因上游引物序列（SEQ ID No.4）

<110> 河北博伦特药业有限公司；河北师范大学

<130> 2013

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

5′GT GAATTC ATGCTGACCCCGACCGAACTG 3′

序列五：克隆反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶截短基因下游引物序列（SEQ ID No.5）

<110> 河北博伦特药业有限公司；河北师范大学

<130> 2013

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

5′CT CTCGAG CTAGGTGGCGTCACGAGCAGC 3′

Claims

1.一种具有编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因片段的表达产物，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.含有权利要求2所述表达产物的工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：将所述具有编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段，构建于表达载体pET-M-3C，转化至大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)中并诱导蛋白表达。

4.权利要求1、2或3所述基因片段的应用，其特征在于用于以L-脯氨酸为底物，生物转化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。