CN104911174A - 一种含腈水解酶细胞的固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含腈水解酶细胞的固定化方法，所述方法是将含腈水解酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入缓冲液或蒸馏水中，制成菌悬液；向菌悬液中添加载体，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺，搅拌絮凝0.5～2h，然后加入戊二醛进行交联，10～25℃搅拌交联0.5～2h后，弃去上清液，真空抽滤后，得含腈水解酶的固定化细胞；本发明所提供的固定化方法具有固定化材料成本低，操作简单，重复使用性好，制备的固定化产腈水解酶重组大肠杆菌全细胞用于催化1-氰基环己基乙腈生产1-氰基环己基乙酸，连续转化30批次后，转化产率仍80％以上，具有良好的工业化应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种细胞的固定化方法，特别涉及一种含腈水解酶细胞的固定化方法。
(二)背景技术
腈水解酶具有催化效率高和区域选择性好的特点，能够快速高效地将1-氰基环己基乙腈中亚甲基上的氰基水解为羧基而保留环己基上的氰基，可用于生物合成抗癫痫药加巴喷丁药物中间体1-氰基环己基乙酸的催化剂。相对游离细胞反应过程易破损、重复利用率低，产物回收困难等缺点，通过物理，化学的方法将腈水解酶全细胞固定成颗粒后，可增强细胞对毒性腈类底物的耐受性，有利于催化剂连续多批次使用和产物分离精制，可实现生产过程的连续化，自动化，可控化，从而提高产品质量，降低生产成本。因此在工业化应用中研究了众多固定化的方法，以提高腈水解酶全细胞的稳定性。
在腈水解酶全细胞固定化方法中，Almatawah等人利用海藻酸钠包埋腈水解酶细胞连续生产烟碱酸，在100mM底物浓度下使用10批次后，酶活残留70％(Almatawahet al/Enzyme and Microbial Technology 25(1999)718-274)。Nigam等人利用琼脂包埋腈水解酶细胞连续生产丙烯酸，在100mM底物浓度下使用25批次后，酶活残留65％(Nigam et al/J.Biosci 34(2009)21-26)。柳志强等人利用海藻酸钠和聚乙烯醇复合包埋腈水解酶细胞连续生产亚胺基二乙酸，在75mM底物浓度下使用10批后，酶活残余40％(Zhi-Qiang Liu et al/J Mol Microbiol Biotechnol 22(2012)35-47)。薛亚平等人用海藻酸钠包埋腈水解酶细胞并用聚乙烯亚胺和戊二醛交联生产R-(-)-扁桃酸，在20mM扁桃腈底物浓度下重复利用19批次(Ya-Ping Xue et al/Organic ProcessResearch&Development 17(2013)213-220)。Cooling等人利用卡拉胶包埋腈水解酶细胞并用聚乙烯亚胺和戊二醛交联连续生产4-氰基戊酸，在150mM底物浓度下使用4批后酶活残留80％(Cooling et al/Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 11(2001)295-306)。这些细胞包埋法在工业化应用中都要面临载体基质传质受限制，底物浓度低，载体机械强度不高导致操作稳定性差等缺点。张志军等人用戊二醛交联腈水解酶细胞生产R-(-)-扁桃酸，100mM底物浓度下重复使用15批(Zhi-Jun zhang etal/Bioprocess Biosyst Eng(2014)1241-1248)，虽然解决了传质限制等问题，但仍然存在颗粒强度低，使用批次低的问题。Ni等人用邻苯二酚壳聚糖结合氧化铁纳米颗粒制备固定化腈水解酶细胞生产R-(-)-扁桃酸，100mM底物浓度下重复使用16批(Ni etal/Journal of Biotechnology 167(2013)433-440)。虽然此方法具有一定创新性，但在实际的工业化应用中存在固定化细胞制备复杂，细胞回收不便捷难以在大规模生产中使用等问题。
美国专利(US6551804B2)报道了用海藻酸钙包埋腈水解酶细胞并交联戊二醛和聚乙烯亚胺以及卡拉胶包埋腈水解酶细胞并交联戊二醛和聚乙烯亚胺的方法生产4-氰基戊酸。美国专利(US20050009154A1)报道了用海藻酸钠固定化腈水解酶细胞生产1-氰基环己基乙酸。这些包埋方法受到海藻酸钙载体基质传质限制，大量非催化载体影响催化剂性能。卡拉胶凝胶过程温度较高容易使酶失活等问题而难于很有效应用于工业化生产。
在游离腈水解酶固定化的方法中，Sandeep Kumar等人用交联腈水解酶聚体的方法进行固定化生产R-(-)-扁桃酸，10mM底物浓度下重复使用5批(S.kumar etal/Bioresource Technology 101(2010)6856-6858)。Joshua D.Swartz等人用二氧化硅纳米颗粒包埋腈水解酶生产烟碱酸，5mM底物浓度下重复使用10批(JoshuaD.Swartz/Organic Process Research&Development 13(2009)584-589)。这些方法仍然没有很好解决操作稳定性差，游离酶在固定化过程中易失活，所用材料难以有效放大等问题。
因此研究一种成本低、性能优异，制备简单且可实现1-氰基环己基乙酸工业化生产的固定化方法，具有非常重要的现实意义。
(三)发明内容
本发明目的在于克服腈水解酶催化生产1-氰基环己基乙酸过程中由于双腈底物毒性大，底物溶解度低而造成的反应批次低等问题，提供了一种含腈水解酶细胞的固定化方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种含腈水解酶细胞的固定化方法，所述方法为：将含腈水解酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入缓冲液或蒸馏水中，制成菌悬液；向菌悬液中添加载体，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺，搅拌絮凝0.5～2h，然后加入戊二醛进行交联，10～25℃搅拌交联0.5～2h后，弃去上清液，真空抽滤后，得含腈水解酶的固定化细胞；所述载体为硅藻土、珍珠岩或活性炭；所述载体与菌悬液中湿菌体重量比为0.01～0.1：1。
进一步，所述腈水解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述缓冲液为pH＝7.0、100mM磷酸盐缓冲液。
进一步，所述缓冲液或蒸馏水体积用量以湿菌体湿重计为5ml/g～15ml/g。
进一步，所述戊二醛以体积浓度25％(v/v)戊二醛水溶液形式加入，所述25％(v/v)戊二醛水溶液体积用量以湿菌体重量计为0.05～0.5ml/g(优选0.3ml/g)。
进一步，所述聚乙烯亚胺以体积浓度5％(v/v)聚乙烯亚胺水溶液形式加入，所述5％(v/v)聚乙烯亚胺水溶液体积用量以湿菌体重量计为0.01～1.0ml/g(优选0.1ml/g)，本发明所述聚乙烯亚胺分子量70000，聚合度1600。
进一步，所述重组基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.1所示腈水解酶基因与PGEM-T载体连接后导入E.coli JM109中，提取连接质粒并与质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切后，连接过夜，将连接产物导入宿主E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V。
进一步，所述湿菌体的制备方法为：
(1)将含腈水解酶基因的重组基因工程菌接种至斜面培养基，37℃培养12h，获得斜面菌体；斜面培养基组成为：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，20g/L琼脂，溶剂为水，pH自然；
(2)将斜面菌体接种至种子培养基，37℃培养12h，获得种子液；种子培养基组成：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为水，pH自然；
(3)将种子液以体积浓度3.3％接种量接种至发酵培养基，37℃、150rpm条件下培养2h，然后加入10g/L乳糖诱导剂，28℃、150rpm条件下诱导12h，取发酵液离心，收集湿菌体；发酵培养基组成：甘油12g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，KH2PO41.36g/L，K2HPO42.28g/L，MgSO40.375g/L，(NH4)2SO45g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。
本发明所述重组基因工程菌最优选以含腈水解酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V为例，所述重组大肠杆菌是将Acidovorax facilis ZJB09122腈水解酶突变体基因F168V(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)与PGEM-T载体进行连接后导入E.coli JM109中，对F168V/PGEM-T和质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切，连接酶连接过夜，将连接产物pET28b(+)-F168V导入宿主E.coli BL21(DE3)中，所得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V作为生产菌种(Xin-Hong Zhanget al/Process Biochemistry 49(2014)2141-2148)。
本发明所述硅藻土分子式为SiO2，分子量为60.08，中位粒径19.6μm，比重0.32能吸收大于本身4倍的水；溶于浓碱和氢氟酸，不溶于水、酸或稀碱，优选购自阿拉丁公司。
本发明所述珍珠岩，化学组成SiO2：70～75％，Al2O3：12～16％，Na2O：1.0％～4.0％，K2O：1.0％～4.0％，外观白色颗粒，比重0.09，熔点：1280～1350℃，优选购自杭州锦大绿产业技术有限公司。
本发明所述活性炭，分子式为C，分子量为12.01，比重1.8，对有机色素和含氮碱有高容量的吸附能力，优选购自阿拉丁公司。
本发明方法是在初始高密度培养基中发酵生产腈水解酶；然后将发酵液离心获得菌体与缓冲液或蒸馏水混合成菌悬液，添加载体(如硅藻土)，搅拌混匀，再与聚乙烯亚胺混合，搅拌使菌体絮凝；最后向溶液中加入戊二醛进行交联，真空抽滤后得固定化细胞。
本发明所述含腈水解酶细胞的固定化方法中，在缓冲液或蒸馏水混合成菌悬液中，载体、聚乙烯亚胺、戊二醛的添加顺序是：首先添加载体、然后添加聚乙烯亚胺、最后添加戊二醛；添加顺序调将显著降低固定化细胞酶活回收率和操作稳定性。众所周知，没有一种固定化方法适合所有的酶或细胞，即使是同样的细胞由于含有不同的酶，同样固定化细胞的方法或相同方法不同操作步骤产生的效果也会有巨大的差异。本发明的重点是提供一种适用于SEQ ID NO.1所示核苷酸编码的腈水解酶细胞的固定化方法，为催化1-氰基环己基乙腈生产1-氰基环己基乙酸降低成本。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明所提供的固定化方法具有固定化材料成本低，操作简单，重复使用性好，制备的固定化产腈水解酶重组大肠杆菌全细胞用于催化1-氰基环己基乙腈生产1-氰基环己基乙酸，连续转化30批次后，转化产率仍80％以上，具有良好的工业化应用前景。
(四)附图说明
图1为固定化细胞(实施例5所述方法制备)和游离细胞(实施例1所述方法制备)重复使用批次产率柱形图。
图2为固定化细胞及游离细胞扫描电镜图，a为采用实施例5所述方法制备的固定化细胞扫描电镜图；b为采用实施例1所述方法制备的游离细胞扫描电镜图；c为采用实施例5所述方法制备的固定化细胞重复使用30批次后的扫描电镜图；d为采用实施例1所述方法制备游离细胞重复使用3批次后的扫描电镜图，箭头所示为细胞破裂部分。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用硅藻土分子式为SiO2，分子量为60.08，中位粒径19.6μm，比重0.32能吸收大于本身4倍的水；溶于浓碱和氢氟酸，不溶于水、酸或稀碱，购自阿拉丁公司。
本发明实施例所用珍珠岩，化学组成SiO2：70～75％，Al2O3：12～16％，Na2O：1.0％～4.0％，K2O：1.0％～4.0％，外观白色颗粒，比重0.09，熔点：1280～1350℃，购自杭州锦大绿产业技术有限公司。
本发明实施例所用活性炭，分子式为C，分子量为12.01，比重1.8，对有机色素和含氮碱有高容量的吸附能力，购自阿拉丁公司。
实施例1重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V的构建及湿菌体的制备及性能测定
以本实验室构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V为生产菌种，方法为：
(1)重组菌的构建：将Acidovorax facilis ZJB09122腈水解酶突变体基因F168V(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，已在Xin-Hong Zhang et al/Process Biochemistry49(2014)2141-2148中公开)与PGEM-T载体进行连接后导入E.coli JM109中，对F168V/PGEM-T和质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切，连接酶连接过夜，将连接产物pET28b(+)-F168V导入宿主E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V。
PGEM-T载体连接条件为：10μL连接体系在PCR管中依次加入2×Buffer 5μL，T4连接酶1μL，腈水解酶目的基因3μL，PGEM-T载体1μL；振荡器上充分混匀后16℃条件下连接过夜。
双酶切体系：首先对目的基因进行双酶切，60μL双酶切体系在PCR管中依次加入腈水解酶目的基因40μL，2×Buffer Tango 12μL，Nco I 1μL，Xho I 1μL，ddH2O 6μL，振荡器上充分混匀；然后对表达载体进行双酶切，60μL双酶切体系在PCR管中依次加入pET28b 40μL，2×Buffer Tango 12μL，Nco I 1μL，Xho I 1μL，ddH2O 6μL，振荡器上充分混匀；分别将其放在37℃，200rpm条件下酶切4-5h。
(2)湿菌体的制备
将重组大肠杆菌E.col iBL21(DE3)/pET28b(+)-F168V接种至斜面培养基，37℃培养12h，获得斜面菌体；斜面培养基组成为：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，20g/L琼脂，溶剂为水，pH自然；将斜面菌体接种至种子培养基，37℃培养12h，获得种子液；种子培养基组成：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为水，pH自然。
将种子液以体积浓度3.3％接种量接种至发酵培养基，37℃，150rpm条件下培养2h，28℃，150rpm，10g/L乳糖量诱导12h，取发酵液离心，收集湿菌体；发酵培养基组成：甘油12g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，KH2PO41.36g/L，K2HPO42.28g/L，MgSO40.375g/L，(NH4)2SO45g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。
(3)游离细胞酶活、半衰期及重复使用性能测定
取步骤(2)收集的湿菌体0.25g于10ml pH 7.0磷酸盐缓冲液中，加入200mM底物1-氰基环己基乙腈，40℃反应10min，取样，HPLC检测产物1-氰基环己基乙酸的浓度，根据酶活定义计算游离细胞酶活。
取收集的湿菌体0.25g于10ml pH 7.0磷酸盐缓冲液中，将12个装有10mL缓冲液，0.25g游离细胞(即湿菌体细胞)的50mL转化瓶于45℃下保温36h,每隔3h取样测游离细胞酶活，作温度稳定性曲线，拟合游离细胞一级失活动力学方程，计算出游离细胞的半衰期。
取步骤(2)制备的游离细胞8.8g于250mL装有100mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0,100mM)的三口烧瓶中，加入500mM底物，35℃，200rpm搅拌转速，反应2.5h，真空抽滤进行固液分离后，转化液用HPLC检测产物浓度，计算产率。游离细胞经三次洗涤后，进行下一批转化，计算每一批次的产率。
酶活定义为：40℃，pH＝7.0条件下，每分钟催化生成1mmol的1-氰基环己基乙酸所需的酶量定义为1U。
HPLC检测条件为：产物1-氰基环己基乙酸的浓度通过戴安U3000HPLC分析，色谱柱：C-18column(250mm×4.6mm,5μm)；检测条件：1.83g/L高氯酸钠和0.58g/L磷酸二氢铵溶液混成1L溶液，用高氯酸调节pH至1.8，按照乙腈：盐溶液＝24:76混合均匀得流动相，柱温40℃在215nm紫外波长下检测。
根据上述方法，所得游离细胞性能如下：腈水解酶游离细胞酶活为166.4U/gdcw，45℃半衰期为23.0h，500mM底物浓度下连续操作2批后产率为20.2％，结果如图1。
实施例2
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:12(m/v)混合，即取8.3g湿菌体加入100ml磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)100mL菌悬液中添加0.4g硅藻土，磁力搅拌器上混合均匀，再与3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合磁力搅拌器充分搅拌下混合0.5h。
(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，25℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)取步骤(3)制备的固定化细胞0.625g于10ml pH 7.0磷酸盐缓冲液中，加入200mM底物1-氰基环己基乙腈，40℃反应10min，取样，HPLC检测产物1-氰基环己基乙酸的浓度，根据酶活定义计算固定化细胞酶活；游离细胞酶活测试方法同实施例1。固定化细胞酶活除以游离细胞酶活计算出固定化细胞酶活回收率。
取步骤(3)制备的固定化细胞0.625g于10ml pH 7.0磷酸盐缓冲液中，将12个装有10mL缓冲液，0.625g固定化细胞的50mL转化瓶于45℃下保温36h,每隔3h取样测固定化细胞酶活，作温度稳定性曲线，拟合固定化酶一级失活动力学方程，计算出固定化酶的半衰期。
取步骤(3)制备的固定化细胞22g于250mL装有100mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0,100mM)的三口烧瓶中，加入500mM底物，35℃，200rpm搅拌转速，反应2.5h，真空抽滤进行固液分离后，转化液用HPLC检测产物浓度，计算产率。固定化细胞经三次洗涤后，进行下一批转化，计算每一批次的产率。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为113.3U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为68.1％，45℃半衰期228.7h，500mM底物浓度下连续操作25批次产率为81.5％。
实施例3
(1)取实施例1方法制备的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合得到菌悬液，即取10g湿菌体加入100mL磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)100mL菌悬液中添加0.8g的硅藻土，磁力搅拌器上混合均匀，再与5ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h。
(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，15℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为48.5U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为49.2％，45℃半衰期为289.1h，500mM底物浓度下连续操作29批次后，其产率为80.3％。
实施例4
(1)取实施例1获得的湿菌体，按菌体：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0,100mM)＝1:5(m/v)混合得到菌悬液，即取10g湿菌体加入100mL磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)100mL菌悬液中添加0.3g的硅藻土，磁力搅拌器上混合均匀，再与1ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合0.5h。
(3)向步骤(2)溶液中加入3ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，25℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为47.6U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为48.6％，45℃半衰期为246.3h，500mM底物浓度下连续操作30次后，其产率为77.8％。
实施例5
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100ml磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)获得的100ml菌悬液中添加0.6g硅藻土，磁力搅拌器上混匀，然后与3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h。
(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为96.1U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为57.8％，45℃半衰期为266.5h，500mM底物浓度下连续操作30批次产率为82.3％，结果如图1。
对比例1去除载体对固定化细胞的影响
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100mL磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)获得的100ml菌悬液中加入3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h，使菌体絮凝。
(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，25℃交联0.5h后，弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为42.4U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为21.3％，45℃半衰期为123.2h，500mM底物浓度下连续操作10批后产率为65.2％。
结果表明：无载体固定化时，固定化细胞酶活回收率较低，操作稳定性较差。
对比例2去除聚乙烯亚胺对固定化细胞的影响
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100ml磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)获得的100ml菌悬液中添加0.3g硅藻土，磁力搅拌器上混匀。
(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为62.1U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为37.8％，45℃半衰期为146.5h，500mM底物浓度下连续操作7批次产率为73.5％。
结果表明：无聚乙烯亚胺固定化时，固定化细胞酶活回收率较低，操作稳定性较差。
对比例3去除戊二醛对固定化细胞的影响
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100ml磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)获得的100ml菌悬液中添加0.6g硅藻土，磁力搅拌器上混匀，然后与3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为66.1U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为32.9％，45℃半衰期为155.3h，500mM底物浓度下连续操作9批次产率为55.1％。
结果表明：无聚戊二醛固定化时，固定化细胞酶活回收率较低，操作稳定性较差。
对比例4聚乙烯酰胺与戊二醛加入顺序对固定化细胞的影响
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100ml磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)获得的100ml菌悬液中添加0.6g硅藻土，磁力搅拌器上混匀，然后与1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联0.5h。
(3)向步骤(2)溶液中加入3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为36.3U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为27.8％，45℃半衰期为138.7h，500mM底物浓度下连续操作10批次产率为75.4％。
结果表明：聚乙烯酰胺与戊二醛加入顺序对固定化细胞活性回收率和操作稳定性有重要影响。
对比例5载体与聚乙烯酰胺、戊二醛加入顺序对固定化细胞的影响
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100ml磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，25℃交联0.5h。然后加入3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h。
(3)向步骤(2)溶液中加入0.6g硅藻土，磁力搅拌器上混匀，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为38.8U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为20.7％，45℃半衰期为115.2h，500mM底物浓度下连续操作11批后产率为75.2％。
结果表明：载体与聚乙烯酰胺、戊二醛加入顺序对固定化细胞活性回收率和操作稳定性有重要影响。
对比例6卤醇脱卤酶细胞的固定化
(1)按文献(Zou SP,Du EH,Hu,ZC and Zheng YG*,Enhanced biotransformationof 1,3-dichloro-2-propanol to epichlorohydrin via resin-based in situ product removalprocess.Biotechnol.Lett.,35(6):937-942,2013.)报道的方法发酵制备表达卤醇脱卤酶的重组大肠杆菌湿菌体。按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100ml磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)菌悬液中加入0.6g硅藻土，磁力搅拌器上混匀，然后加入3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h。
(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，25℃交联0.5h，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)取步骤(3)制备的固定化细胞0.625g于10ml pH 8.0磷酸盐缓冲液中，加入150mM底物3-氯-1,2-丙二醇，45℃反应10min，取样，GC检测产物环氧氯丙烷浓度，根据酶活定义计算固定化细胞酶活；同时取等同于固定化细胞量的游离细胞0.25g于10ml pH 8.0磷酸盐缓冲液中，加入150mM底物3-氯-1,2-丙二醇，45℃反应10min，取样，GC检测产物环氧氯丙烷浓度，根据酶活定义计算游离细胞酶活。固定化细胞酶活除以游离细胞酶活计算出固定化细胞酶活回收率。
取步骤(3)制备的固定化细胞0.625g于10ml pH 8.0磷酸盐缓冲液中，将12个装有10mL缓冲液，0.625g固定化细胞的50mL转化瓶于45℃下保温30h,每隔3h取样测固定化细胞酶活，作温度稳定性曲线，拟合固定化酶一级失活动力学方程，计算出固定化酶的半衰期。
取步骤(3)制备的固定化细胞20g于250mL装有100mL磷酸盐缓冲液(pH＝8.0,100mM)的三口烧瓶中，加入150mM底物，45℃，200rpm搅拌转速，反应5h，真空抽滤进行固液分离后，转化液用GC检测产物浓度，计算产率。固定化细胞经三次洗涤后，进行下一批转化，计算每一批次的产率。
卤醇酶活定义参照上述文献报道方法。
GC检测条件参照上述文献报道方法。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：卤醇脱卤酶固定化细胞酶活回收率为10.7％，45℃半衰期为211.5h，连续催化转化3-氯-1,2-丙二醇操作5批后产率为75.2％。
结果表明：本发明公开的固定化方法在卤醇脱卤酶重组大肠杆菌全细胞的固定化中表现较差。
实施例6
(1)取实施例1获得的湿菌体，按菌体：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0,100mM)＝1:12.5(m/v)混合得到菌悬液，即取8g湿菌体加入100mL磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)100mL菌悬液中添加0.7g的硅藻土，磁力搅拌器上混合均匀，再与2ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合2h。
(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，15℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为89.8U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为54.0％，45℃半衰期为232.8h，500mM底物浓度下连续操作27次后产率为83.3％。
实施例7
(1)取实施例1获得的湿菌体，按菌体：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0,100mM)＝1:8.3(m/v)混合得到菌悬液，即取12g湿菌体加入100mL磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)100mL菌悬液中添加0.6g的硅藻土，磁力搅拌器上混合均匀，再与1ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合0.5h。
(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，10℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为96.4U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为58.0％，45℃半衰期为230.5h，500mM底物浓度下连续操作26次后，其产率为82.1％。
实施例8
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100ml蒸馏水中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)获得的100ml菌悬液中添加0.6g硅藻土，磁力搅拌器上混匀，然后与3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h。
(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为85.1U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为52.2％，45℃半衰期为216.2h，500mM底物浓度下连续操作29批次产率为80.2％。
实施例9
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合得到菌悬液，即取10g湿菌体加入100mL磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)100mL菌悬液中添加0.6g的珍珠岩，磁力搅拌器上混合均匀，再与3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h。
(3)向步骤(2)溶液中加入5ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，15℃交联2h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为50.5U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为40.4％，45℃半衰期为273.4h，500mM底物浓度下连续操作29次后产率为80.7％。
实施例10
(1)取实施例1获得的湿菌体，按菌体：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0,100mM)＝1:10(m/v)混合得到菌悬液，即取10g湿菌体加入100mL磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)100mL菌悬液中添加1.0g的珍珠岩，磁力搅拌器上混合均匀，与5ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1.5h。
(3)向步骤(2)溶液中加入2ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，10℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为106.4U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为64.0％，45℃半衰期为208.8h，500mM底物浓度下连续操作24次后产率为81.6％。
实施例11
(1)取实施例1获得的湿菌体，按菌体：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0,100mM)＝1:6.7(m/v)混合得到菌悬液，即取15g湿菌体加入100mL磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)100mL菌悬液中添加0.6g的活性炭，磁力搅拌器上混合均匀，与3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h。
(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，10℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。
(4)固定化细胞酶活、酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作30批次产率测试方法同实施例2。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为56.5U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为44.0％，45℃半衰期为268.8h，500mM底物浓度下连续操作28次后产率为71.4％。
Claims (8)
1.一种含腈水解酶细胞的固定化方法，其特征在于所述方法为：将含腈水解酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入缓冲液或蒸馏水中，制成菌悬液；向菌悬液中添加载体，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺，搅拌絮凝0.5～2h，然后加入戊二醛进行交联，10～25℃搅拌交联0.5～2h后，弃去上清液，真空抽滤后，获得含腈水解酶的固定化细胞；所述载体为硅藻土、珍珠岩或活性炭；所述载体与菌悬液中湿菌体重量比为0.01～0.1：1。
2.如权利要求1所述含腈水解酶细胞的固定化方法，其特征在于所述腈水解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述含腈水解酶细胞的固定化方法，其特征在于所述缓冲液为pH＝7.0、100mM磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述含腈水解酶细胞的固定化方法，其特征在于所述缓冲液或蒸馏水体积用量以湿菌体湿重计为5ml/g～15ml/g。
5.如权利要求1所述含腈水解酶细胞的固定化方法，其特征在于所述戊二醛以体积浓度25％戊二醛水溶液形式加入，所述戊二醛水溶液体积用量以湿菌体重量计为0.05～0.5ml/g。
6.如权利要求1所述含腈水解酶细胞的固定化方法，其特征在于所述聚乙烯亚胺以体积浓度5％聚乙烯亚胺水溶液形式加入，所述聚乙烯亚胺水溶液体积用量以湿菌体重量计为0.01～1.0ml/g。
7.如权利要求2所述含腈水解酶细胞的固定化方法，其特征在于所述重组基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.1所示腈水解酶基因与PGEM-T载体连接后导入E.coliJM109中，提取连接质粒并与质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切后，连接过夜，将连接产物导入宿主E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V。
8.如权利要求1所述含腈水解酶细胞的固定化方法，其特征在于所述湿菌体的制备方法为：
(1)将含腈水解酶基因的重组基因工程菌接种至斜面培养基，37℃培养12h，获得斜面菌体；斜面培养基组成为：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，20g/L琼脂，溶剂为水，pH自然；
(2)将斜面菌体接种至种子培养基，37℃培养12h，获得种子液；种子培养基组成：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为水，pH自然；
(3)将种子液以体积浓度3.3％接种量接种至发酵培养基，37℃、150rpm条件下培养2h，然后加入10g/L乳糖诱导剂，28℃，150rpm条件下诱导12h，取发酵液离心，收集湿菌体；发酵培养基组成：甘油12g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，KH2PO41.36g/L，K2HPO42.28g/L，MgSO40.375g/L，(NH4)2SO45g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。
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