CN109136309A - 一种利用腺苷代替atp进行酶促反应的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应生产的方法及其应用，该方法包括以下步骤：(1)在酶促反应体系中，按比例添加ATP再生酶、AK酶以及腺苷进行酶促反应；(2)固定化的ATP再生酶和AK酶在反应罐中直接分离，游离的ATP再生酶和AK酶通过过滤器中超滤膜分离；(3)将步骤(2)滤出液进行分离、纯化，获得产物。本发明具有如下有益效果：1)使用腺苷替代ATP或AMP，为工业生产节约了大量成本；2)建立了稳定的酶回收体系，节能环保；3)少量生成的副产物ATP、ADP及AMP或直接用于循环反应，或用于生产ATP，或集中通过过滤、离子交换等方法进行纯化，操作简单。

Description

一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)由一个腺苷和三个磷酸基团组成，分子量为507，分子式C10H16N5O13P3。它是生物能量的转换器和贮存器，在利用和转换能量的酶促反应中，起着不可替代的重要作用。
由于目前ATP成本偏高，在工业生产中直接使用ATP进行酶促反应收益甚微。因此，能够在反应生产中投入少量的ATP，通过建立稳定、有效的ATP再生体系，使ATP在反应过程中循环利用是目前利用ATP进行工业化生产的研究方向。
工业上ATP再生常用的方法是利用酵母菌的糖酵解途径，进行底物水平磷酸化方式再生ATP。此法参与催化反应的酶众多，反应过程复杂，反应过程不易控制，产品批次间质量差异较大。同时酵母酶系质量常因供应的厂家不同、批次不同、甚至季节不同而有很大差异。另外反应过程需要加入大量的酵母细胞酶液，引入了许多蛋白、色素等杂质给后期纯化带来一定困难。近年来，ATP再生的研究重点转向使用单一酶或较简单的酶系，获得高效稳定的再生效果。其中，乙酸激酶、氨激酶、丙酮酸激酶等酶均可有效再生ATP。但是，这些酶所利用的底物价值昂贵，如丙酮酸激酶所利用的磷酸烯醇式丙酮酸；且生成的副产物有一定的生物毒性和污染性，如乙酸激酶、氨激酶催化反应的产物分别为乙酸和氨气，因此较难在工业生产中大量使用。
专利CN201610268246.6利用多聚磷酸或其盐作为磷酸和能量供体，使用多聚磷酸激酶(PPK，EC 2.7.4.1)、腺苷酸激酶(ADK，EC 2.7.4.3)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP，EC 2.7.4.-，有文献报道该酶也属于PPK酶中的一类，但IUBMB对该酶分类尚不十分明确)三种“ATP再生酶”合理组合，再生ATP，并应用于多种需ATP的酶促反应。此方法反应底物价格相对低廉，产物污染较小，适用于工业化生产。但使用此方法仍需加入一定量的ATP进行酶促反应。
发明内容
本发明提供了一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法，该方法可进一步降低生产成本，即在原有含有ATP再生酶的反应体系中添加腺苷激酶(AK，EC 2.7.1.20)，该酶可催化腺苷生成AMP，组合上述其它ATP再生酶，可不使用ATP，仅添加少量腺苷即可进行酶促反应，是该领域一项重大革新。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法，所述酶促反应为需要ATP的酶促反应，包括以下步骤：
(1)在酶促反应体系中，按比例添加ATP再生酶、AK酶以及腺苷进行酶促反应：
通过基因工程改造、发酵、纯化获得ATP再生酶和AK酶，或以自然提取等其它方式获得ATP再生酶和AK酶。ATP再生酶和AK酶可以游离酶的形式制成酶液或者干粉；也可进一步固定于固定化载体上，制得固定化ATP再生酶和AK酶。
在酶促反应体系中，按比例添加ATP再生酶和AK酶，并添加腺苷代替ATP进行酶促反应。其中所述反应体系为含有腺苷、多聚磷酸或其盐以及镁离子和锰离子的一种或两种的水溶液。另外，反应体系中还可包含钾离子、钠离子、铵离子的一种或几种，Tris和磷酸根离子的一种或几种。本发明添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。
(2)固定化的ATP再生酶和AK酶在反应罐中直接分离，游离的ATP再生酶和AK酶通过过滤器中超滤膜分离：
固定化的ATP再生酶和AK酶在反应罐中直接分离。上述分离可通过滤袋分离，也可在反应柱中直接分离。或
游离的ATP再生酶和AK酶通过滤器中超滤膜分离。其中，过滤器具有进料口、出料口和回流口，内设截留的超滤膜。经过滤器的截留液为回收的酶液，滤出液为分离出酶之后含产物的反应液。
(3)将步骤(2)滤出液进行分离、纯化，获得产物。
优选地，上述技术方案中，所述方法还包括以下步骤：
(4)回收ATP再生酶和AK酶，并重复利用于步骤(1)中进行反应；
(5)反应生成的少量ATP、ADP或AMP通过过滤或离子交换方法分离，生产ATP；或回收ATP、ADP或AMP，并重复利用于步骤(1)中进行反应。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中，ATP再生酶和AK酶为固定化酶或游离酶，AK酶浓度为0.01-8000U/L，其中将1μM底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)；ATP再生酶为多聚磷酸激酶(PPK)、腺苷酸激酶(ADK)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP)的任意两种或三种组合，即使用PPK和ADK组合，或ADK和PAP组合，或PPK和PAP组合，或PPK、ADK和PAP的组合；酶添加量PPK酶浓度为0.01-5000U/L，ADK酶浓度为0.01-5000U/L，PAP酶浓度为0.01-5000U/L。上述的ATP再生酶和AK酶可来源于任何生物，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)的反应条件如下：
反应温度为25-60℃，优选温度为30-50℃；
反应pH为5-10，优选pH为6-9；
反应体系包括：腺苷；多聚磷酸或其盐；镁离子、锰离子中的一种或两种组合；
在酶促反应体系中，按比例添加ATP再生酶和AK酶，进行酶促反应。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)的反应还包括：
铵离子、钾离子或钠离子的一种或几种组合；Tris或磷酸根离子的一种或两种组合；其中，钾离子浓度为0.01-0.5M；钠离子浓度为0.01-0.5M；铵离子浓度为0.01-0.3M；Tris浓度为0.01-0.1M；磷酸盐浓度为0.01-0.1M。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中腺苷浓度为0.01-20g/L；多聚磷酸或其盐的浓度为0.01-0.3M；镁离子浓度为0.01-0.2M；锰离子浓度为0.005-0.15M。
优选地，上述技术方案中，镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种；锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种；钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的一种或多种；钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的一种或多种；铵离子选自于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的一种或多种；多聚磷酸或其盐选自于多聚磷酸钠、多聚磷酸钾和多聚磷酸铵中的一种或多种。
优选地，上述技术方案中，在步骤(2)中，ATP再生酶和AK酶是通过下列方式固定于固定化载体：吸附、包埋、共价、结合、交联或其组合；所述固定化载体选自于高分子载体、无机载体、磁性高分子微球载体中的一种或多种。其中，高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙或合成高聚物等；无机载体选自于多孔玻璃、氧化硅、硅胶、活性炭或硅藻土。
优选地，上述技术方案中，超滤膜选自于醋酸纤维素膜、聚砜膜、聚丙烯腈膜、聚氯乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜或陶瓷膜。
一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法的应用，所述方法用于多种需要ATP的酶促反应，用于合成物质以及无细胞蛋白表达。
优选地，上述技术方案中，所述方法应用于无细胞蛋白表达技术。
优选地，上述技术方案中，所述需要ATP的酶促反应为转移磷酸根基团的转移酶(EC 2.7)所参与的酶促反应，以及部分连接酶所参与的酶促反应。所述转移磷酸根基团的转移酶(EC 2.7)所参与的酶促反应，例如：磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1,6-磷酸果糖、3-磷酸甘油、氧化型辅酶II、CT(D)P、GT(D)P、UT(D)P等物质的合成反应，以及部分连接酶(EC 6)所参与的酶促反应，例如：乙酰辅酶A、肌肽、肠菌素、谷氨酰氨、L-茶氨酸、藻青素和D-丙氨酰丙氨酸等物质的合成反应。
上述酶促合成反应所需的催化用酶及底物见下表1。表1所列催化用酶可以来源于任何生物、或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶，可商购获得。
表1.本发明所涉及的酶促反应催化用酶及底物
无细胞蛋白表达技术是指含有蛋白合成必需的组分(核糖体、转运RNA、启动/延伸/终止因子、ATP、镁离子和钾离子等)的细胞裂解物在体外进行蛋白合成。
本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
1)使用腺苷替代ATP或AMP，为工业生产节约了大量成本，腺苷售价仅为ATP的10％或AMP的30％左右，价格低廉，来源广泛，且其在反应中的用量可优化至原ATP用量的10％以下。
2)建立了稳定的酶回收体系，整个反应过程中无论固定化酶还是游离酶都可以循环利用，可应用于大规模连续生产，成本低，节能环保；
3)少量生成的副产物ATP、ADP及AMP或直接用于循环反应，或用于生产ATP，或集中通过过滤、离子交换等方法进行纯化，操作简单，纯化后成品可作为附加产品，具有经济效益。
附图说明
图1为大肠杆菌表达的PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的SDS-PAGE图。
图2为本发明使用游离酶的反应工艺流程图。
图3为本发明方法使用固定酶进行反应的工艺流程图。
图4为高效液相色谱(HPLC)检测肌酸的剩余量及磷酸肌酸的生成量图。
图5为本发明使用无细胞抽提物表达gshF酶的SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。
本发明以下实施例及对比例中使用的各种物质，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1粗酶的制备
本发明方法中的ATP再生酶和AK酶可以商购获得，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
酶的制备过程如下：
根据PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶各酶基因序列设计引物，通过PCR分别扩增出基因片段，并将其分别连接至pET22b载体(市售)，经测序正确后，分别转入E.coli BL21(DE3)菌株(市售)。
将转化后的E.coli BL21(DE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导5小时收集菌体，使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。
将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后扩大培养，最终接入含500L发酵培养基的发酵罐中，培养至OD600值20-30时加入1mM IPTG诱导5小时后，离心收集菌体。
其中LB培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％NaCl；种子培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％氯化钠；发酵培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、5％磷酸氢二钠、1％磷酸二氢钠、0.01％硫酸镁和1％甘油。
图1为大肠杆菌表达的PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的SDS-PAGE图。如图1所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(市售)；泳道2为PPK酶，40kDa；泳道3为ADK酶，25kDa；泳道4为PAP酶，55kDa；泳道5为AK酶，40kDa。
收获的菌体经超声或高压匀浆破菌后，离心收集上清。通过沉淀和过滤方法制得粗酶。
实施例2酶促法生产磷酸肌酸
图2为本发明使用游离酶的反应工艺流程图。如图2所示，酶法制备磷酸肌酸的操作步骤如下：
(1)在反应罐中合成磷酸肌酸的反应：
在反应罐中，100L的反应体系为含有底物2.0kg肌酸，以及0.2kg腺苷、1.8kg多聚磷酸钠、0.4kg氯化钾、0.5kg六水氯化镁和0.3kg磷酸氢二钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.0，在反应体系中添加肌酸激酶1000U/L、PPK酶500U/L、ADK酶500U/L及AK酶500U/L开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为35℃。
图4为高效液相色谱(HPLC)检测肌酸的剩余量及磷酸肌酸的生成量图。如图4所示，每隔1小时高效液相色谱(HPLC)检测肌酸的剩余量及磷酸肌酸的生成量，在反应6小时后，磷酸肌酸生成量为30g/L。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm，检测温度25℃，检测流速1ml/min，流动相为含有0.2％磷酸二氢钾、0.1％四丁基氢氧化铵和5％乙腈的水溶液(pH值6.6)。
(2)在过滤器中分离肌酸激酶、ATP再生酶和AK酶：
通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离肌酸激酶、ATP再生酶和AK酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量20kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液，含有磷酸肌酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
检测到回收的肌酸激酶、PPK酶、ADK酶和AK酶的活性较反应前减少5％-20％，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
实施例3酶促法生产1,6-二磷酸果糖(固定化酶)
图3为本发明方法使用固定酶进行反应的工艺流程图。如图3所示，固定酶法制备1,6-二磷酸果糖的操作步骤如下：
(1)催化用酶、ATP再生酶和AK酶的固定：
催化用酶果糖激酶(FK)和磷酸果糖激酶(PFK)通过商购获得，同实施例1中初步纯化的ADK酶、PAP酶和AK酶一同以商业化的环氧基固定化载体LX1000EP固定。
将FK、PFK、ADK、PAP和AK酶按照活性比2：2：1：1：1混合配成混合酶液，酶液中AK酶活性为2000U/L。在恒温搅拌罐中加入LX1000EP湿载体2kg与上述酶液混合，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化混合酶。
(2)在反应柱中生成1,6-二磷酸果糖：
配制反应液，每100L含有底物1.8kg果糖，以及0.3kg腺苷、2.0kg六偏磷酸钠、0.5kg氯化铵、0.5kg氯化钠、0.5kg七水硫酸镁、0.2kg硫酸锰和0.85kg磷酸氢二钠，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至6.8，温度升为35-40℃。
将上述步骤(1)中的混合固定酶10kg装入反应柱，排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以30L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱，反应期间控制温度为37℃。循环反应6小时后，收集反应液，检测1,6-二磷酸果糖的生成量为30g/L。
固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上，酶活性降低10-15％，需按比例补加或更换部分新酶。
实施例4酶促法生产肌肽
如图2所示，酶法制备肌肽同时偶联游离的ATP再生酶和AK酶的操作步骤如下：
(1)在反应罐中合成肌肽的反应：
在反应罐中，100L的反应体系为含有底物1.8kg L-组氨酸、1.0kgβ-丙氨酸，以及0.25kg腺苷、1.0kg多聚磷酸钠、0.3kg氯化钠、0.38kg氯化钾、1.0kg六水氯化镁和0.6kg磷酸氢二钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至8.0，在反应体系中添加1000U/L肌肽合成酶及600U/L ADK酶、600U/L PAP酶、800U/L AK酶开始反应。反应期间控制pH值为8.0，温度为37℃。
反应6小时后，肌肽生成量为21g/L。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm，检测温度25℃，检测流速0.8ml/min，流动相为含有80mM磷酸盐缓冲液和15％甲醇的水溶液。
(2)在过滤器中分离肌肽合成酶和ATP再生酶：
通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离肌肽合成酶、ATP再生酶和AK酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量20kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液，含有肌肽、ATP、ADP、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
检测到回收的肌肽合成酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的活性较反应前减少10％-20％不等，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
实施例5酶促法生产茶氨酸
如图2所示，酶法制备茶氨酸同时偶联游离的ATP再生酶和AK酶的操作步骤如下：
(1)在反应罐中合成茶氨酸和再生ATP的反应：
在反应罐中，100L的反应体系为含有底物1.5kg谷氨酸钠、0.7kg盐酸乙胺，以及0.2kg腺苷、2.0kg四聚磷酸、1.0kg六水氯化镁和0.5kg磷酸氢二钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.0，在反应体系中添加500U/L茶氨酸合成酶及500U/L PPK酶、500U/L ADK酶、800U/L AK酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为30℃。
反应5小时后，茶氨酸生成量为14g/L。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长203nm，检测温度30℃，检测流速1ml/min，流动相为含有0.05％TFA和5％乙腈的水溶液。
(2)在过滤器中分离茶氨酸和ATP再生酶：
通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离茶氨酸合成酶、ATP再生酶和AK酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量20kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液，含有茶氨酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
检测到回收的茶氨酸合成酶、PPK酶、ADK酶和AK酶的活性较反应前减少5-10％不等，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
实施例6酶促法生产磷酸肌酸
如图2所示，酶法制备磷酸肌酸同时偶联游离的ATP再生酶和AK酶的操作步骤如下：
(1)在反应罐中合成磷酸肌酸的反应：
在反应罐中，100L的反应体系为含有底物0.2kg肌酸，以及0.001kg腺苷、0.47kg四聚磷酸、0.053kg氯化铵、0.2kg六水氯化镁、0.072kg一水氯化锰和1.2kg Tris的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至10.0，在反应体系中添加肌酸激酶1U/L、PPK酶0.01U/L、ADK酶0.01U/L、PAP酶0.01U/L及AK酶0.01U/L开始反应。反应期间控制pH值为10.0，温度为55℃。
反应5小时后，HPLC检测磷酸肌酸生成量为2g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
(2)在过滤器中分离肌酸激酶、ATP再生酶和AK酶：
通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离肌酸激酶、ATP再生酶和AK酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量20kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液，含有磷酸肌酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
检测到回收的肌酸激酶、PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的活性较反应前减少30％-50％，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
实施例7酶促法生产磷酸肌酸
参见图2，酶法制备磷酸肌酸同时偶联游离的ATP再生酶和AK酶的操作步骤如下：
(1)在反应罐中合成磷酸肌酸的反应：
在反应罐中，100L的反应体系为含有底物2.0kg肌酸，以及2.0kg腺苷、14.0kg四聚磷酸、3.73kg氯化钾、4.07kg六水氯化镁和1.56kg二水磷酸二氢钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至5.0，在反应体系中添加肌酸激酶2000U/L、PPK酶1000U/L、PAP酶1000U/L及AK酶1000U/L开始反应。反应期间控制pH值为5.0，温度为25℃。
反应8小时后，HPLC检测磷酸肌酸生成量为14g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
(2)在过滤器中分离肌酸激酶、ATP再生酶和AK酶：
通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离肌酸激酶、ATP再生酶和AK酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量20kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液，含有磷酸肌酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质，可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
检测到回收的肌酸激酶、PPK酶、PAP酶和AK酶的活性较反应前减少20％-40％，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
实施例8酶促法生产1,6-二磷酸果糖(固定化酶)
参见图3，固定酶法制备1,6-二磷酸果糖同时偶联ATP再生酶和AK酶的操作步骤如下：
(1)催化用酶、ATP再生酶和AK酶的固定：
催化用酶果糖激酶(FK)和磷酸果糖激酶(PFK)通过商购获得，同实施例1中初步纯化的ATP再生酶PPK酶和PAP酶分别以商业化的环氧基固定化载体LX1000EP或含氨基合成高聚物载体LX1000HA固定。
分别将FK、PFK、PPK、PAP和AK酶制成酶液，各3L，FK、PFK和AK酶液活性均为8000U/L，PPK和PAP酶液活性均为5000U/L。
在恒温搅拌罐中加入LX1000EP湿载体1kg与FK酶液3L混合，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化FK酶。PFK酶以相同方法固定。
在恒温搅拌罐中加入LX1000HA湿载体1kg与PPK酶液3L混合，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化PPK酶。PAP和AK酶以相同方法固定。
(2)在反应柱中生成1,6-二磷酸果糖：
配制反应液，每100L含有底物3.6kg果糖，以及2.0kg腺苷、8.0kg六偏磷酸钠、1.6kg氯化铵、4.0kg六水氯化镁和1.56kg二水磷酸二氢钠，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至6.0，温度升为50℃。
将上述步骤(1)中的混合固定酶10kg装入反应柱，排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以30L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱，反应期间控制温度为50℃。循环反应6小时后，收集反应液，HPLC检测检测1,6-二磷酸果糖的生成量为25g/L。
固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上，酶活性降低20-40％，需按比例补加或更换部分新酶。
实施例9无细胞蛋白表达GshF酶
无细胞蛋白表达GshF酶同时偶联ATP再生酶和AK酶的操作步骤如下：
(1)表达载体pIVEX2.4d-gshF的构建：
根据gshF基因的序列，设计一对扩增引物，引物序列如下：
gshF正义引物：5’-TCCATGGCATTAAACCAACTTCTTCAAAAACTG-3’；和
gshF反义引物：5’-CGGATCCTTAAGTTTGACCAGCCACTATTTC-3’；
提取嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株DNA，以其为模板，通过PCR扩增出gshF基因片段，使用Nco I和BamH I双酶切后，连接至pIVEX2.4d载体(购于Roche公司)，构建成pIVEX2.4d-gshF载体，经测序正确。
(2)大肠杆菌无细胞抽提物制备：
将E.coli A19(缺失核酸酶I基因，不降解外源基因)单克隆接入LB培养基，培养至对数生长期后接入含5L发酵培养基的发酵罐中，培养至OD600达到3时离心收集菌体。LB培养基及发酵培养基成分参见实施例1。
用S30缓冲液重悬菌体，4℃离心洗涤3次，收集菌体，保存于-80℃。S30缓冲液成分为：14mM醋酸镁、60mM醋酸钾、1mM二硫苏糖醇(DTT)及10mM Tris(pH值8.1)。
称量菌体重量，每10克菌体加入100ml S30缓冲液重溶，同时加入1mM DTT。在75kPa压力下高压均质破碎菌体，再加入1mM DTT，4℃离心收集上清。在恒温摇床中100rpm、37℃孵育30分钟，制得大肠杆菌无细胞抽提物。
(3)使用无细胞抽提物表达蛋白并偶联ATP再生酶和AK酶
在100μl蛋白表达体系中，加入20μl步骤(2)所述大肠杆菌无细胞抽提物，加入15μg/ml步骤(1)所述表达载体pIVEX2.4d-gshF，加入15mM醋酸镁、50mM醋酸铵、50mM HEPES-氢氧化钾(pH值7.5)、2％PEG8000、2mM DTT、0.33mM NAD+、0.27mM辅酶A、4mM草酸、1U/μlT7RNA聚合酶、2mM腺苷、1mM GTP、1mM CTP、1mM UTP以及20种氨基酸各2mM，同时加入1U/μlPPK酶、1U/μl ADK酶、1U/μl AK酶以及10mM多聚磷酸钠用作生产和再生ATP。在恒温摇床中200rpm、30℃反应6小时。
图5为使用无细胞抽提物表达gshF酶的SDS-PAGE图，如图5所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa；泳道2为无细胞表达的gshF酶，85kDa。
对比例1酶促法生产磷酸肌酸
酶法制备磷酸肌酸的操作步骤如下：
在反应罐中，100L的反应体系为含有底物2.0kg肌酸，以及8.0kg ATP、0.4kg氯化钾、0.5kg六水氯化镁和0.3kg磷酸氢二钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.0，在反应体系中添加1000U/L肌酸激酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为35℃。
反应6小时后，磷酸肌酸生成量为25g/L，90％以上ATP转化为ADP、AMP。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
对比实施例2可以看出：使用腺苷代替ATP，加入AK酶和ATP再生酶进行酶促反应，虽然反应总体需要的酶量增加，但是腺苷用量少、价格低，为工业生产节约了大量成本。少量生成的副产物ATP、ADP及AMP或直接用于循环反应，或用于生产ATP，有一定的经济效益，更加适用于工业化大规模生产。
同时，本发明中所描述的ATP再生体系还可应用于多种需要ATP的酶促反应。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法，其特征在于，所述酶促反应为需要ATP的酶促反应，所述方法包括以下步骤：
(1)在酶促反应体系中，按比例添加ATP再生酶、AK酶以及腺苷进行酶促反应；
(2)固定化的ATP再生酶和AK酶在反应罐中直接分离，游离的ATP再生酶和AK酶通过过滤器中超滤膜分离；
(3)将步骤(2)滤出液进行分离、纯化，获得产物。
2.根据权利要求1所述的一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
(4)回收ATP再生酶和AK酶，并重复利用于步骤(1)中进行反应；
(5)反应生成的ATP、ADP或AMP通过过滤或离子交换方法分离，生产ATP；或回收ATP、ADP或AMP，并重复利用于步骤(1)中进行反应。
3.根据权利要求1所述的一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法，其特征在于，所述步骤(1)中，ATP再生酶和AK酶为固定化酶或游离酶，AK酶浓度为0.01-8000U/L；ATP再生酶为多聚磷酸激酶(PPK)、腺苷酸激酶(ADK)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP)的任意两种或三种组合；酶添加量PPK酶浓度为0.01-5000U/L，ADK酶浓度为0.01-5000U/L，PAP酶浓度为0.01-5000U/L。
4.根据权利要求1所述的一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法，其特征在于，所述步骤(1)的反应条件如下：
反应温度为25-60℃，优选温度为30-50℃；
反应pH为5-10，优选pH为6-9；
反应体系包括：腺苷；多聚磷酸或其盐；镁离子、锰离子中的一种或两种组合；
在酶促反应体系中，按比例添加ATP再生酶和AK酶，进行酶促反应。
5.根据权利要求4所述的一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法，其特征在于，所述步骤(1)的反应还包括：
铵离子、钾离子或钠离子的一种或几种组合；Tris或磷酸根离子的一种或两种组合；钾离子浓度为0.01-0.5M；钠离子浓度为0.01-0.5M；铵离子浓度为0.01-0.3M；Tris浓度为0.01-0.1M；磷酸盐浓度为0.01-0.1M。
6.根据权利要求4所述的一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法，其特征在于，所述步骤(1)中腺苷浓度为0.01-20g/L；多聚磷酸或其盐的浓度为0.01-0.3M；镁离子浓度为0.01-0.2M；锰离子浓度为0.005-0.15M。
7.根据权利要求4所述的一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法，其特征在于，镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种；锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种；钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的一种或多种；钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的一种或多种；铵离子选自于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的一种或多种；多聚磷酸或其盐选自于多聚磷酸钠、多聚磷酸钾和多聚磷酸铵中的一种或多种。
8.根据权利要求1-7任一所述的一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法的应用，其特征在于，所述方法用于多种需要ATP的酶促反应，用于合成物质以及无细胞蛋白表达。
9.根据权利要求8所述的一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法的应用，其特征在于，所述需要ATP的酶促反应为转移磷酸根基团的转移酶所参与的酶促反应，以及部分连接酶所参与的酶促反应；所述转移磷酸根基团的转移酶所参与的酶促反应为磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1,6-磷酸果糖、3-磷酸甘油、氧化型辅酶II、CT(D)P、GT(D)P或UT(D)P的合成反应；所述部分连接酶所参与的酶促反应为乙酰辅酶A、肌肽、肠菌素、谷氨酰胺、L-茶氨酸、藻青素或D-丙氨酰丙氨酸的合成反应。
10.根据权利要求8所述的一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法的应用，其特征在于，所述方法应用于无细胞蛋白表达技术。
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