CN116042739A - 一种酶促法生产肌肽的方法 - Google Patents
一种酶促法生产肌肽的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116042739A CN116042739A CN202310013464.5A CN202310013464A CN116042739A CN 116042739 A CN116042739 A CN 116042739A CN 202310013464 A CN202310013464 A CN 202310013464A CN 116042739 A CN116042739 A CN 116042739A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzyme
- reaction
- atp
- carnosine
- enzymatic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/18—Multi-enzyme systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1229—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01004—Fructokinase (2.7.1.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01011—6-Phosphofructokinase (2.7.1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/0102—Adenosine kinase (2.7.1.20)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/04—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/04—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
- C12Y207/04003—Adenylate kinase (2.7.4.3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本分案申请公开了一种酶促法生产肌肽的方法,包括以下步骤:(1)在反应罐中合成肌肽的反应;(2)在过滤器中分离肌肽合成酶和ATP再生酶:通过超滤方法,将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离肌肽合成酶、ATP再生酶和AK酶,滤出液为分离出酶之后的反应液,通过离子交换层析等方式进一步纯化;检测到回收的酶,可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。本发明具有如下有益效果:1)使用腺苷替代ATP或AMP,为工业生产节约了大量成本;2)建立了稳定的酶回收体系,节能环保;3)少量生成的副产物ATP、ADP及AMP或直接用于循环反应,或用于生产ATP,或集中通过过滤、离子交换等方法进行纯化,操作简单。
Description
本申请是申请日为2017年6月15日、申请号为201710453365.3、发明名称为“一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法,具体涉及一种酶促法生产肌肽的方法。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)由一个腺苷和三个磷酸基团组成,分子量为507,分子式C10H16N5O13P3。它是生物能量的转换器和贮存器,在利用和转换能量的酶促反应中,起着不可替代的重要作用。
由于目前ATP成本偏高,在工业生产中直接使用ATP进行酶促反应收益甚微。因此,能够在反应生产中投入少量的ATP,通过建立稳定、有效的ATP再生体系,使ATP在反应过程中循环利用是目前利用ATP进行工业化生产的研究方向。
工业上ATP再生常用的方法是利用酵母菌的糖酵解途径,进行底物水平磷酸化方式再生ATP。此法参与催化反应的酶众多,反应过程复杂,反应过程不易控制,产品批次间质量差异较大。同时酵母酶系质量常因供应的厂家不同、批次不同、甚至季节不同而有很大差异。另外反应过程需要加入大量的酵母细胞酶液,引入了许多蛋白、色素等杂质给后期纯化带来一定困难。近年来,ATP再生的研究重点转向使用单一酶或较简单的酶系,获得高效稳定的再生效果。其中,乙酸激酶、氨激酶、丙酮酸激酶等酶均可有效再生ATP。但是,这些酶所利用的底物价值昂贵,如丙酮酸激酶所利用的磷酸烯醇式丙酮酸;且生成的副产物有一定的生物毒性和污染性,如乙酸激酶、氨激酶催化反应的产物分别为乙酸和氨气,因此较难在工业生产中大量使用。
专利CN201610268246.6利用多聚磷酸或其盐作为磷酸和能量供体,使用多聚磷酸激酶(PPK,EC 2.7.4.1)、腺苷酸激酶(ADK,EC 2.7.4.3)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP,EC 2.7.4.-,有文献报道该酶也属于PPK酶中的一类,但IUBMB对该酶分类尚不十分明确)三种“ATP再生酶”合理组合,再生ATP,并应用于多种需ATP的酶促反应。此方法反应底物价格相对低廉,产物污染较小,适用于工业化生产。但使用此方法仍需加入一定量的ATP进行酶促反应。
发明内容
本发明提供了一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法,具体为酶促法生产肌肽的方法,该方法可进一步降低生产成本,即在原有含有ATP再生酶的反应体系中添加腺苷激酶(AK,EC 2.7.1.20),该酶可催化腺苷生成AMP,组合上述其它ATP再生酶,可不使用ATP,仅添加少量腺苷即可进行酶促反应,是该领域一项重大革新。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法,所述酶促反应为需要ATP的酶促反应,包括以下步骤:
(1)在酶促反应体系中,按比例添加ATP再生酶、AK酶以及腺苷进行酶促反应:
通过基因工程改造、发酵、纯化获得ATP再生酶和AK酶,或以自然提取等其它方式获得ATP再生酶和AK酶。ATP再生酶和AK酶可以游离酶的形式制成酶液或者干粉;也可进一步固定于固定化载体上,制得固定化ATP再生酶和AK酶。
在酶促反应体系中,按比例添加ATP再生酶和AK酶,并添加腺苷代替ATP进行酶促反应。其中所述反应体系为含有腺苷、多聚磷酸或其盐以及镁离子和锰离子的一种或两种的水溶液。另外,反应体系中还可包含钾离子、钠离子、铵离子的一种或几种,Tris和磷酸根离子的一种或几种。本发明添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系,也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。
(2)固定化的ATP再生酶和AK酶在反应罐中直接分离,游离的ATP再生酶和AK酶通过过滤器中超滤膜分离:
固定化的ATP再生酶和AK酶在反应罐中直接分离。上述分离可通过滤袋分离,也可在反应柱中直接分离。或
游离的ATP再生酶和AK酶通过滤器中超滤膜分离。其中,过滤器具有进料口、出料口和回流口,内设截留的超滤膜。经过滤器的截留液为回收的酶液,滤出液为分离出酶之后含产物的反应液。
(3)将步骤(2)滤出液进行分离、纯化,获得产物。
优选地,上述技术方案中,所述方法还包括以下步骤:
(4)回收ATP再生酶和AK酶,并重复利用于步骤(1)中进行反应;
(5)反应生成的少量ATP、ADP或AMP通过过滤或离子交换方法分离,生产ATP;或回收ATP、ADP或AMP,并重复利用于步骤(1)中进行反应。
优选地,上述技术方案中,所述步骤(1)中,ATP再生酶和AK酶为固定化酶或游离酶,AK酶浓度为0.01-8000U/L,其中将1μM底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U);ATP再生酶为多聚磷酸激酶(PPK)、腺苷酸激酶(ADK)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP)的任意两种或三种组合,即使用PPK和ADK组合,或ADK和PAP组合,或PPK和PAP组合,或PPK、ADK和PAP的组合;酶添加量PPK酶浓度为0.01-5000U/L,ADK酶浓度为0.01-5000U/L,PAP酶浓度为0.01-5000U/L。上述的ATP再生酶和AK酶可来源于任何生物,或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
优选地,上述技术方案中,所述步骤(1)的反应条件如下:
反应温度为25-60℃,优选温度为30-50℃;
反应pH为5-10,优选pH为6-9;
反应体系包括:腺苷;多聚磷酸或其盐;镁离子、锰离子中的一种或两种组合;
在酶促反应体系中,按比例添加ATP再生酶和AK酶,进行酶促反应。
优选地,上述技术方案中,所述步骤(1)的反应还包括:
铵离子、钾离子或钠离子的一种或几种组合;Tris或磷酸根离子的一种或两种组合;其中,钾离子浓度为0.01-0.5M;钠离子浓度为0.01-0.5M;铵离子浓度为0.01-0.3M;Tris浓度为0.01-0.1M;磷酸盐浓度为0.01-0.1M。
优选地,上述技术方案中,所述步骤(1)中腺苷浓度为0.01-20g/L;多聚磷酸或其盐的浓度为0.01-0.3M;镁离子浓度为0.01-0.2M;锰离子浓度为0.005-0.15M。
优选地,上述技术方案中,镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种;锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种;钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的一种或多种;钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的一种或多种;铵离子选自于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的一种或多种;多聚磷酸或其盐选自于多聚磷酸钠、多聚磷酸钾和多聚磷酸铵中的一种或多种。
优选地,上述技术方案中,在步骤(2)中,ATP再生酶和AK酶是通过下列方式固定于固定化载体:吸附、包埋、共价、结合、交联或其组合;所述固定化载体选自于高分子载体、无机载体、磁性高分子微球载体中的一种或多种。其中,高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙或合成高聚物等;无机载体选自于多孔玻璃、氧化硅、硅胶、活性炭或硅藻土。
优选地,上述技术方案中,超滤膜选自于醋酸纤维素膜、聚砜膜、聚丙烯腈膜、聚氯乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜或陶瓷膜。
一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法的应用,所述方法用于多种需要ATP的酶促反应,用于合成物质以及无细胞蛋白表达。
优选地,上述技术方案中,所述方法应用于无细胞蛋白表达技术。
优选地,上述技术方案中,所述需要ATP的酶促反应为转移磷酸根基团的转移酶(EC 2.7)所参与的酶促反应,以及部分连接酶所参与的酶促反应。所述转移磷酸根基团的转移酶(EC 2.7)所参与的酶促反应,例如:磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1,6-磷酸果糖、3-磷酸甘油、氧化型辅酶II、CT(D)P、GT(D)P、UT(D)P等物质的合成反应,以及部分连接酶(EC 6)所参与的酶促反应,例如:乙酰辅酶A、肌肽、肠菌素、谷氨酰氨、L-茶氨酸、藻青素和D-丙氨酰丙氨酸等物质的合成反应。
上述酶促合成反应所需的催化用酶及底物见下表1。表1所列催化用酶可以来源于任何生物、或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶,可商购获得。
表1.本发明所涉及的酶促反应催化用酶及底物
无细胞蛋白表达技术是指含有蛋白合成必需的组分(核糖体、转运RNA、启动/延伸/终止因子、ATP、镁离子和钾离子等)的细胞裂解物在体外进行蛋白合成。
本发明上述技术方案,具有如下有益效果:
1)使用腺苷替代ATP或AMP,为工业生产节约了大量成本,腺苷售价仅为ATP的10%或AMP的30%左右,价格低廉,来源广泛,且其在反应中的用量可优化至原ATP用量的10%以下。
2)建立了稳定的酶回收体系,整个反应过程中无论固定化酶还是游离酶都可以循环利用,可应用于大规模连续生产,成本低,节能环保;
3)少量生成的副产物ATP、ADP及AMP或直接用于循环反应,或用于生产ATP,或集中通过过滤、离子交换等方法进行纯化,操作简单,纯化后成品可作为附加产品,具有经济效益。
附图说明
图1为大肠杆菌表达的PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的SDS-PAGE图。
图2为本发明使用游离酶的反应工艺流程图。
图3为本发明方法使用固定酶进行反应的工艺流程图。
图4为高效液相色谱(HPLC)检测肌酸的剩余量及磷酸肌酸的生成量图。
图5为本发明使用无细胞抽提物表达gshF酶的SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细描述,以便于进一步理解本发明。
本发明以下实施例及对比例中使用的各种物质,如无特殊说明,均可通过商业途径获得。
实施例1粗酶的制备
本发明方法中的ATP再生酶和AK酶可以商购获得,或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
酶的制备过程如下:
根据PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶各酶基因序列设计引物,通过PCR分别扩增出基因片段,并将其分别连接至pET22b载体(市售),经测序正确后,分别转入E.coli BL21(DE3)菌株(市售)。
将转化后的E.coli BL21(DE3)单克隆接入LB培养基,培养至对数期后,加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导,诱导5小时收集菌体,使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。
将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基,培养至对数生长期后扩大培养,最终接入含500L发酵培养基的发酵罐中,培养至OD600值20-30时加入1mM IPTG诱导5小时后,离心收集菌体。
其中LB培养基成分为:1%蛋白胨、0.5%酵母粉和1% NaCl;种子培养基成分为:1%蛋白胨、0.5%酵母粉和1%氯化钠;发酵培养基成分为:1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化钠、5%磷酸氢二钠、1%磷酸二氢钠、0.01%硫酸镁和1%甘油。
图1为大肠杆菌表达的PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的SDS-PAGE图。如图1所示:泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(市售);泳道2为PPK酶,40kDa;泳道3为ADK酶,25kDa;泳道4为PAP酶,55kDa;泳道5为AK酶,40kDa。
收获的菌体经超声或高压匀浆破菌后,离心收集上清。通过沉淀和过滤方法制得粗酶。
实施例2酶促法生产磷酸肌酸
图2为本发明使用游离酶的反应工艺流程图。如图2所示,酶法制备磷酸肌酸的操作步骤如下:
(1)在反应罐中合成磷酸肌酸的反应:
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物2.0kg肌酸,以及0.2kg腺苷、1.8kg多聚磷酸钠、0.4kg氯化钾、0.5kg六水氯化镁和0.3kg磷酸氢二钠的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.0,在反应体系中添加肌酸激酶1000U/L、PPK酶500U/L、ADK酶500U/L及AK酶500U/L开始反应。反应期间控制pH值为7.0,温度为35℃。
图4为高效液相色谱(HPLC)检测肌酸的剩余量及磷酸肌酸的生成量图。如图4所示,每隔1小时高效液相色谱(HPLC)检测肌酸的剩余量及磷酸肌酸的生成量,在反应6小时后,磷酸肌酸生成量为30g/L。HPLC检测条件为:Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm),检测波长210nm,检测温度25℃,检测流速1ml/min,流动相为含有0.2%磷酸二氢钾、0.1%四丁基氢氧化铵和5%乙腈的水溶液(pH值6.6)。
(2)在过滤器中分离肌酸激酶、ATP再生酶和AK酶:
通过超滤方法,将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离肌酸激酶、ATP再生酶和AK酶,过滤器内装膜包(购于Pall公司,截留分子量20kDa),滤出液为分离出酶之后的反应液,含有磷酸肌酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质,可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
检测到回收的肌酸激酶、PPK酶、ADK酶和AK酶的活性较反应前减少5%-20%,可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
实施例3酶促法生产1,6-二磷酸果糖(固定化酶)
图3为本发明方法使用固定酶进行反应的工艺流程图。如图3所示,固定酶法制备1,6-二磷酸果糖的操作步骤如下:
(1)催化用酶、ATP再生酶和AK酶的固定:
催化用酶果糖激酶(FK)和磷酸果糖激酶(PFK)通过商购获得,同实施例1中初步纯化的ADK酶、PAP酶和AK酶一同以商业化的环氧基固定化载体LX1000EP固定。
将FK、PFK、ADK、PAP和AK酶按照活性比2:2:1:1:1混合配成混合酶液,酶液中AK酶活性为2000U/L。在恒温搅拌罐中加入LX1000EP湿载体2kg与上述酶液混合,在20℃条件下,150rpm搅拌12小时。过滤收集载体,用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍,即得固定化混合酶。
(2)在反应柱中生成1,6-二磷酸果糖:
配制反应液,每100L含有底物1.8kg果糖,以及0.3kg腺苷、2.0kg六偏磷酸钠、0.5kg氯化铵、0.5kg氯化钠、0.5kg七水硫酸镁、0.2kg硫酸锰和0.85kg磷酸氢二钠,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至6.8,温度升为35-40℃。
将上述步骤(1)中的混合固定酶10kg装入反应柱,排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以30L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱,反应期间控制温度为37℃。循环反应6小时后,收集反应液,检测1,6-二磷酸果糖的生成量为30g/L。
固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上,酶活性降低10-15%,需按比例补加或更换部分新酶。
实施例4酶促法生产肌肽
如图2所示,酶法制备肌肽同时偶联游离的ATP再生酶和AK酶的操作步骤如下:
(1)在反应罐中合成肌肽的反应:
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物1.8kg L-组氨酸、1.0kgβ-丙氨酸,以及0.25kg腺苷、1.0kg多聚磷酸钠、0.3kg氯化钠、0.38kg氯化钾、1.0kg六水氯化镁和0.6kg磷酸氢二钠的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至8.0,在反应体系中添加1000U/L肌肽合成酶及600U/L ADK酶、600U/L PAP酶、800U/L AK酶开始反应。反应期间控制pH值为8.0,温度为37℃。
反应6小时后,肌肽生成量为21g/L。HPLC检测条件为:Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm),检测波长210nm,检测温度25℃,检测流速0.8ml/min,流动相为含有80mM磷酸盐缓冲液和15%甲醇的水溶液。
(2)在过滤器中分离肌肽合成酶和ATP再生酶:
通过超滤方法,将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离肌肽合成酶、ATP再生酶和AK酶,过滤器内装膜包(购于Pall公司,截留分子量20kDa),滤出液为分离出酶之后的反应液,含有肌肽、ATP、ADP、AMP及盐等物质,可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
检测到回收的肌肽合成酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的活性较反应前减少10%-20%不等,可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
实施例5酶促法生产茶氨酸
如图2所示,酶法制备茶氨酸同时偶联游离的ATP再生酶和AK酶的操作步骤如下:
(1)在反应罐中合成茶氨酸和再生ATP的反应:
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物1.5kg谷氨酸钠、0.7kg盐酸乙胺,以及0.2kg腺苷、2.0kg四聚磷酸、1.0kg六水氯化镁和0.5kg磷酸氢二钠的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.0,在反应体系中添加500U/L茶氨酸合成酶及500U/L PPK酶、500U/L ADK酶、800U/L AK酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0,温度为30℃。
反应5小时后,茶氨酸生成量为14g/L。HPLC检测条件为:Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm),检测波长203nm,检测温度30℃,检测流速1ml/min,流动相为含有0.05% TFA和5%乙腈的水溶液。
(2)在过滤器中分离茶氨酸和ATP再生酶:
通过超滤方法,将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离茶氨酸合成酶、ATP再生酶和AK酶,过滤器内装膜包(购于Pall公司,截留分子量20kDa),滤出液为分离出酶之后的反应液,含有茶氨酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质,可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
检测到回收的茶氨酸合成酶、PPK酶、ADK酶和AK酶的活性较反应前减少5-10%不等,可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
实施例6酶促法生产磷酸肌酸
如图2所示,酶法制备磷酸肌酸同时偶联游离的ATP再生酶和AK酶的操作步骤如下:
(1)在反应罐中合成磷酸肌酸的反应:
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物0.2kg肌酸,以及0.001kg腺苷、0.47kg四聚磷酸、0.053kg氯化铵、0.2kg六水氯化镁、0.072kg一水氯化锰和1.2kg Tris的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至10.0,在反应体系中添加肌酸激酶1U/L、PPK酶0.01U/L、ADK酶0.01U/L、PAP酶0.01U/L及AK酶0.01U/L开始反应。反应期间控制pH值为10.0,温度为55℃。
反应5小时后,HPLC检测磷酸肌酸生成量为2g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
(2)在过滤器中分离肌酸激酶、ATP再生酶和AK酶:
通过超滤方法,将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离肌酸激酶、ATP再生酶和AK酶,过滤器内装膜包(购于Pall公司,截留分子量20kDa),滤出液为分离出酶之后的反应液,含有磷酸肌酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质,可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
检测到回收的肌酸激酶、PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的活性较反应前减少30%-50%,可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
实施例7酶促法生产磷酸肌酸
参见图2,酶法制备磷酸肌酸同时偶联游离的ATP再生酶和AK酶的操作步骤如下:
(1)在反应罐中合成磷酸肌酸的反应:
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物2.0kg肌酸,以及2.0kg腺苷、14.0kg四聚磷酸、3.73kg氯化钾、4.07kg六水氯化镁和1.56kg二水磷酸二氢钠的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至5.0,在反应体系中添加肌酸激酶2000U/L、PPK酶1000U/L、PAP酶1000U/L及AK酶1000U/L开始反应。反应期间控制pH值为5.0,温度为25℃。
反应8小时后,HPLC检测磷酸肌酸生成量为14g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
(2)在过滤器中分离肌酸激酶、ATP再生酶和AK酶:
通过超滤方法,将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离肌酸激酶、ATP再生酶和AK酶,过滤器内装膜包(购于Pall公司,截留分子量20kDa),滤出液为分离出酶之后的反应液,含有磷酸肌酸、ATP、ADP、AMP及盐等物质,可通过离子交换层析等方式进一步纯化。
检测到回收的肌酸激酶、PPK酶、PAP酶和AK酶的活性较反应前减少20%-40%,可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
实施例8酶促法生产1,6-二磷酸果糖(固定化酶)
参见图3,固定酶法制备1,6-二磷酸果糖同时偶联ATP再生酶和AK酶的操作步骤如下:
(1)催化用酶、ATP再生酶和AK酶的固定:
催化用酶果糖激酶(FK)和磷酸果糖激酶(PFK)通过商购获得,同实施例1中初步纯化的ATP再生酶PPK酶和PAP酶分别以商业化的环氧基固定化载体LX1000EP或含氨基合成高聚物载体LX1000HA固定。
分别将FK、PFK、PPK、PAP和AK酶制成酶液,各3L,FK、PFK和AK酶液活性均为8000U/L,PPK和PAP酶液活性均为5000U/L。
在恒温搅拌罐中加入LX1000EP湿载体1kg与FK酶液3L混合,在20℃条件下,150rpm搅拌12小时。过滤收集载体,用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍,即得固定化FK酶。PFK酶以相同方法固定。
在恒温搅拌罐中加入LX1000HA湿载体1kg与PPK酶液3L混合,在20℃条件下,150rpm搅拌12小时。过滤收集载体,用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍,即得固定化PPK酶。PAP和AK酶以相同方法固定。
(2)在反应柱中生成1,6-二磷酸果糖:
配制反应液,每100L含有底物3.6kg果糖,以及2.0kg腺苷、8.0kg六偏磷酸钠、1.6kg氯化铵、4.0kg六水氯化镁和1.56kg二水磷酸二氢钠,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至6.0,温度升为50℃。
将上述步骤(1)中的混合固定酶10kg装入反应柱,排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以30L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱,反应期间控制温度为50℃。循环反应6小时后,收集反应液,HPLC检测检测1,6-二磷酸果糖的生成量为25g/L。
固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上,酶活性降低20-40%,需按比例补加或更换部分新酶。
实施例9无细胞蛋白表达GshF酶
无细胞蛋白表达GshF酶同时偶联ATP再生酶和AK酶的操作步骤如下:
(1)表达载体pIVEX2.4d-gshF的构建:
根据gshF基因的序列,设计一对扩增引物,引物序列如下:
gshF正义引物:5’-TCCATGGCATTAAACCAACTTCTTCAAAAACTG-3’;和
gshF反义引物:5’-CGGATCCTTAAGTTTGACCAGCCACTATTTC-3’;
提取嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株DNA,以其为模板,通过PCR扩增出gshF基因片段,使用Nco I和BamH I双酶切后,连接至pIVEX2.4d载体(购于Roche公司),构建成pIVEX2.4d-gshF载体,经测序正确。
(2)大肠杆菌无细胞抽提物制备:
将E.coli A19(缺失核酸酶I基因,不降解外源基因)单克隆接入LB培养基,培养至对数生长期后接入含5L发酵培养基的发酵罐中,培养至OD600达到3时离心收集菌体。LB培养基及发酵培养基成分参见实施例1。
用S30缓冲液重悬菌体,4℃离心洗涤3次,收集菌体,保存于-80℃。S30缓冲液成分为:14mM醋酸镁、60mM醋酸钾、1mM二硫苏糖醇(DTT)及10mM Tris(pH值8.1)。
称量菌体重量,每10克菌体加入100ml S30缓冲液重溶,同时加入1mM DTT。在75kPa压力下高压均质破碎菌体,再加入1mM DTT,4℃离心收集上清。在恒温摇床中100rpm、37℃孵育30分钟,制得大肠杆菌无细胞抽提物。
(3)使用无细胞抽提物表达蛋白并偶联ATP再生酶和AK酶
在100μl蛋白表达体系中,加入20μl步骤(2)所述大肠杆菌无细胞抽提物,加入15μg/ml步骤(1)所述表达载体pIVEX2.4d-gshF,加入15mM醋酸镁、50mM醋酸铵、50mM HEPES-氢氧化钾(pH值7.5)、2% PEG8000、2mM DTT、0.33mM NAD+、0.27mM辅酶A、4mM草酸、1U/μl T7RNA聚合酶、2mM腺苷、1mM GTP、1mM CTP、1mM UTP以及20种氨基酸各2mM,同时加入1U/μlPPK酶、1U/μl ADK酶、1U/μl AK酶以及10mM多聚磷酸钠用作生产和再生ATP。在恒温摇床中200rpm、30℃反应6小时。
图5为使用无细胞抽提物表达gshF酶的SDS-PAGE图,如图5所示:泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa;泳道2为无细胞表达的gshF酶,85kDa。
对比例1酶促法生产磷酸肌酸
酶法制备磷酸肌酸的操作步骤如下:
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物2.0kg肌酸,以及8.0kg ATP、0.4kg氯化钾、0.5kg六水氯化镁和0.3kg磷酸氢二钠的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.0,在反应体系中添加1000U/L肌酸激酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0,温度为35℃。
反应6小时后,磷酸肌酸生成量为25g/L,90%以上ATP转化为ADP、AMP。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。
对比实施例2可以看出:使用腺苷代替ATP,加入AK酶和ATP再生酶进行酶促反应,虽然反应总体需要的酶量增加,但是腺苷用量少、价格低,为工业生产节约了大量成本。少量生成的副产物ATP、ADP及AMP或直接用于循环反应,或用于生产ATP,有一定的经济效益,更加适用于工业化大规模生产。
同时,本发明中所描述的ATP再生体系还可应用于多种需要ATP的酶促反应。
虽然本发明已以实施例公开如上,然其并非用于限定本发明,任何本领域技术人员,在不脱离本发明的精神和范围内,均可作各种不同的选择和修改,因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (1)
1.一种酶促法生产肌肽的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)在反应罐中合成肌肽的反应:
在反应罐中,100L的反应体系为含有底物1.8kg L-组氨酸、1.0kgβ-丙氨酸,以及0.25kg腺苷、1.0kg多聚磷酸钠、0.3kg氯化钠、0.38kg氯化钾、1.0kg六水氯化镁和0.6kg磷酸氢二钠的溶液,配制时均匀搅拌防止出现沉淀;调节pH值至8.0,在反应体系中添加1000U/L肌肽合成酶及600U/L ADK酶、600U/L PAP酶、800U/L AK酶开始反应;反应期间控制pH值为8.0,温度为37℃;
(2)在过滤器中分离肌肽合成酶和ATP再生酶:
通过超滤方法,将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离肌肽合成酶、ATP再生酶和AK酶,过滤器内装膜包,滤出液为分离出酶之后的反应液,含有肌肽、ATP、ADP、AMP及盐物质,再通过离子交换层析方式进一步纯化;
检测到回收的肌肽合成酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的活性较反应前减少10%-20%不等,可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310013464.5A CN116042739A (zh) | 2017-06-15 | 2017-06-15 | 一种酶促法生产肌肽的方法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310013464.5A CN116042739A (zh) | 2017-06-15 | 2017-06-15 | 一种酶促法生产肌肽的方法 |
CN201710453365.3A CN109136309B (zh) | 2017-06-15 | 2017-06-15 | 一种利用腺苷代替atp进行酶促反应的生产方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710453365.3A Division CN109136309B (zh) | 2017-06-15 | 2017-06-15 | 一种利用腺苷代替atp进行酶促反应的生产方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116042739A true CN116042739A (zh) | 2023-05-02 |
Family
ID=64830138
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710453365.3A Active CN109136309B (zh) | 2017-06-15 | 2017-06-15 | 一种利用腺苷代替atp进行酶促反应的生产方法 |
CN202310013462.6A Pending CN116042745A (zh) | 2017-06-15 | 2017-06-15 | 一种酶促法生产1,6-二磷酸果糖的方法 |
CN202310013464.5A Pending CN116042739A (zh) | 2017-06-15 | 2017-06-15 | 一种酶促法生产肌肽的方法 |
CN202310020262.3A Pending CN115960974A (zh) | 2017-06-15 | 2017-06-15 | 一种酶促法生产茶氨酸的方法 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710453365.3A Active CN109136309B (zh) | 2017-06-15 | 2017-06-15 | 一种利用腺苷代替atp进行酶促反应的生产方法 |
CN202310013462.6A Pending CN116042745A (zh) | 2017-06-15 | 2017-06-15 | 一种酶促法生产1,6-二磷酸果糖的方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310020262.3A Pending CN115960974A (zh) | 2017-06-15 | 2017-06-15 | 一种酶促法生产茶氨酸的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (4) | CN109136309B (zh) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109593805B (zh) * | 2019-01-16 | 2021-02-09 | 常熟理工学院 | 一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法 |
CN109851658B (zh) * | 2019-01-16 | 2021-02-09 | 常熟理工学院 | 一种一步法合成l-肌肽的方法及截短的l-肌肽合成酶 |
CN111662358A (zh) * | 2019-03-07 | 2020-09-15 | 华东理工大学 | 一种无细胞自组装体系高效合成谷胱甘肽的方法 |
CN112063669A (zh) * | 2019-06-11 | 2020-12-11 | 百瑞全球有限公司 | 酶法反应组合物、增加酶法反应中三磷酸腺苷(atp)量的方法及其应用 |
CN110643587B (zh) * | 2019-10-29 | 2020-08-28 | 杭州唯泰生物药业有限公司 | 一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法 |
CN110777180A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-02-11 | 美亚药业海安有限公司 | 一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法 |
CN113122593A (zh) * | 2019-12-31 | 2021-07-16 | 安徽古特生物科技有限公司 | 一种利用多聚磷酸盐制备核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸的方法 |
CN111235084B (zh) * | 2020-04-01 | 2021-08-20 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 重组大肠杆菌工程菌及利用其制备s-腺苷甲硫氨酸的方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102978267B (zh) * | 2012-06-15 | 2014-07-16 | 北京天开易达生物科技有限公司 | 酶法制备谷胱甘肽的方法 |
CN105219823B (zh) * | 2015-11-10 | 2018-06-05 | 深圳市古特新生生物科技有限公司 | 一种酶法制备谷胱甘肽的方法 |
CN105647996B (zh) * | 2016-03-22 | 2019-02-19 | 深圳市古特新生生物科技有限公司 | 固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法 |
CN105603028B (zh) * | 2016-03-22 | 2019-04-16 | 深圳市古特新生生物科技有限公司 | 酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法 |
CN105861598A (zh) * | 2016-04-27 | 2016-08-17 | 深圳市古特新生生物科技有限公司 | 一种酶法再生atp的方法及其应用 |
CN106191170B (zh) * | 2016-08-09 | 2019-04-16 | 深圳市古特新生生物科技有限公司 | 一种酶法制备三磷酸腺苷的方法 |
-
2017
- 2017-06-15 CN CN201710453365.3A patent/CN109136309B/zh active Active
- 2017-06-15 CN CN202310013462.6A patent/CN116042745A/zh active Pending
- 2017-06-15 CN CN202310013464.5A patent/CN116042739A/zh active Pending
- 2017-06-15 CN CN202310020262.3A patent/CN115960974A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109136309B (zh) | 2023-01-13 |
CN115960974A (zh) | 2023-04-14 |
CN116042745A (zh) | 2023-05-02 |
CN109136309A (zh) | 2019-01-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN116042739A (zh) | 一种酶促法生产肌肽的方法 | |
CN109134594B (zh) | 一种酶法制备谷胱甘肽的方法 | |
CN106191170B (zh) | 一种酶法制备三磷酸腺苷的方法 | |
CN109280680B (zh) | 一种酶促联产的方法 | |
CN105861598A (zh) | 一种酶法再生atp的方法及其应用 | |
CN105603015B (zh) | 一种l-草铵膦的生产方法 | |
CN105647996B (zh) | 固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法 | |
CN112795606B (zh) | 一种β-烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法 | |
US11939615B2 (en) | Production method of enzymatic reaction using adenosine instead of ATP | |
US20230111631A1 (en) | Method for preparing l-glufosinate ammonium by biological enzymatic de-racemization, glufosinate ammonium dehydrogenase mutant and use thereof | |
CN110724675B (zh) | 转氨酶催化剂和酶法合成(r)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的方法 | |
CN108690854B (zh) | 一种利用化学-酶法生产l-草铵膦的方法 | |
US10612054B2 (en) | Single-cell factory for efficiently synthesizing α-aminobutyric acid and construction and application thereof | |
CN105603028A (zh) | 酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法 | |
CN104726478A (zh) | 表达精氨酸脱亚胺酶基因的重组大肠杆菌及其应用 | |
CN110885812A (zh) | 一种酶法制备尿苷酸的方法 | |
CN112980906B (zh) | 一种用于制备β-烟酰胺单核苷酸的酶组合物及其应用 | |
CN108239664B (zh) | 一种制备4-羟基-l-苏氨酸的工艺 | |
CN112921023B (zh) | 一种重组天冬氨酸裂解酶及高重复利用率用于制备r-3-氨基丁酸的方法 | |
CN116410938B (zh) | β-丙氨酸连接酶突变体及其应用 | |
CN113088501B (zh) | 一种用于生产l-草铵膦的谷氨酸脱氢酶突变体及l-草铵膦生产方法 | |
CN106191151B (zh) | 一种生物转化联产d-赖氨酸和5-氨基戊酸的方法 | |
US20240182939A1 (en) | Production method of enzymatic reaction using adenosine instead of atp | |
CN109136311B (zh) | 一种酶法制备s-腺苷甲硫氨酸的方法 | |
CN111979206A (zh) | 固定化融合酶及用其制备谷胱甘肽的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |