CN113337554A

CN113337554A - 一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法

Info

Publication number: CN113337554A
Application number: CN202110588386.2A
Authority: CN
Inventors: 赵黎明; 张春月; 范立强; 王柯
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2021-09-03

Abstract

本发明涉及一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，属于基因工程与酶工程技术领域。联合利用GDP‑L‑岩藻糖合成相关酶和L‑岩藻糖基转移酶，催化底物GDP‑L‑岩藻糖和乳糖反应，合成岩藻糖基化乳糖。GDP‑L‑岩藻糖合成相关酶和岩藻糖基转移酶双酶偶联反应2‑12小时可获得200‑500mg/L岩藻糖基乳糖；进一步偶联能再生ATP和GTP的PPK酶进行反应，不仅能降低昂贵底物ATP和GTP的用量，减少生产成本，而且反应转化率大幅度提高，反应同样时间，岩藻糖基乳糖产量可提高至500‑700mg/L。本发明与化学法和发酵法相比，生产工艺安全，并且反应耗时较短。本发明提供了一种能高效、低成本、体外制备2’‑FL和3‑FL的新方法。

Description

一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法

技术领域

本发明属于基因工程与酶工程技术领域，尤其是涉及一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法。

背景技术

母乳是一种可以为婴儿肠道和免疫系统的生长和发育提供生物活性的复杂的生物流体，作为母乳中第三丰富的固体组分，人乳寡糖(HMOs)在婴儿发育中发挥重要作用，其可作为可溶性诱饵受体，防止病原体附着在婴儿粘膜表面，降低病毒、细菌和原生动物寄生虫感染的风险。此外，人乳寡糖还可以调节上皮细胞和免疫细胞的反应，减少过度的粘膜白细胞浸润和活化，降低坏死性小肠结肠炎的风险。

人乳寡糖种类繁多，除直接提取外，还可通过化学法、发酵法和酶法获得，目前工业制备以化学法和发酵法为主，酶法尚处于实验室研究阶段。但鉴于化学合成步骤复杂、反应条件苛刻、需要大量有机试剂，发酵法周期长、复杂培养基组分使得产物纯化困难、现用重组宿主多为非食品安全性的大肠杆菌等问题，人们倾向于开发条件温和可控、耗时短、反应体系成分简单的酶法。

岩藻糖基化乳糖在人乳寡糖中占比最大，可由岩藻糖基转移酶催化底物GDP-L-岩藻糖和乳糖反应获得。根据GDP-L-岩藻糖产生的方式，分为从头合成途径和补救途径两种。从头途径中葡萄糖经过磷酸甘露糖变位酶转化为甘露糖-1-P，再经GDP-甘露糖焦磷酸化酶和GTP的作用下转化为GDP-甘露糖，GDP-甘露糖经过GDP-甘露糖4,6-脱水酶和GDP-岩藻糖合成酶即可合成GDP-L岩藻糖；补救途径中L-岩藻糖先经岩藻糖激酶和ATP转化为岩藻糖-1-P，接着在GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶作用下与GTP反应生成GDP-L-岩藻糖，最后GDP-L-岩藻糖和乳糖在岩藻糖基转移酶作用下合成岩藻糖基乳糖。不论从头途径还是补救途径制备岩藻糖基化乳糖，均需要足够的ATP和(或)GTP供给。

近年来有关岩藻糖基乳糖制备的专利与文献不断涌现。丹麦GlycomA/S公司采用化学法合成了公斤级2’-FL，但得率仅为19.8％-27.3％。专利CN202010084247改造高产可拉酸的大肠杆菌，获得的菌株E.coli S17-3能以乳糖为唯一底物发酵96h以上产生0.617g/L 2’-岩藻糖基乳糖。Wen Li等将GDP-L岩藻糖从头合成途径和补救合成途径引入大肠杆菌BL21(DE3)，同时为了使底物乳糖和岩藻糖达到最大利用率并降低GDP-L-岩藻糖的代谢量，采用CRISPR/Cas9技术对LacZ、FucI、FucK和WcaJ基因进行敲除，用该宿主菌在3L发酵罐中高密度发酵80h可得到14.1g/L 2’-FL。Yun Hee Choi等通过向大肠杆菌BL21(DE3)中引入外源基因促进GTP的合成以增加GDP-L-岩藻糖的浓度，最终使用LacZΔM15突变体进行摇瓶发酵得到4.6g/L 3-FL，时空转化率为0.076g/L/h。2020年Chao Li等首次报道了体外多酶级联催化制备2’-FL的方法，时空转化率为0.73g/L/h，但ATP再生所选取的底物磷酸烯醇式丙酮酸非常昂贵，不适合工业应用。目前尚未见GTP再生系统偶联用于人乳寡糖酶法合成的报道。

发明内容

针对岩藻糖基化乳糖酶法制备中需要大量昂贵底物ATP/GTP的问题，本发明提供体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法。

本发明筛选不同经济型ATP/GTP再生体系，优化多酶体系反应条件和酶的配比等，开发了高效、低成本、绿色环保的体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，采用本发明的方法底物岩藻糖转化率由20％提高至75％以上，为岩藻糖基乳糖的工业化生产奠定了基础。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，联合利用GDP-L-岩藻糖合成相关酶和L-岩藻糖基转移酶，催化底物GDP-L-岩藻糖和乳糖反应，合成岩藻糖基化乳糖。

在本发明的一个实施方式中，联合利用GDP-L-岩藻糖合成相关酶和L-岩藻糖基转移酶，催化底物GDP-L-岩藻糖和乳糖反应，合成岩藻糖基化乳糖的过程中，还加入ATP再生酶或GTP再生酶中的一种或多种。

即，多酶级联催化体系至少包括GDP-L-岩藻糖合成相关酶、L-岩藻糖基转移酶，还优选加入ATP再生酶和(或)GTP再生酶中的一种或多种。

在本发明的一个实施方式中，所述GDP-L-岩藻糖合成相关酶选自来源于卵形拟杆菌或脆弱拟杆菌的L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶(Fkp)、来源于大肠杆菌K-12的磷酸甘露糖变位酶(ManB)、GDP-甘露糖焦磷酸化酶(ManC)、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(Gmd)或GDP-岩藻糖合成酶(WcaG)等中的一种或几种，优选为来自脆弱拟杆菌的L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶(Fkp)。

在本发明的一个实施方式中，所述L-岩藻糖基转移酶选自α-1,2-岩藻糖基转移酶或α-1,3-岩藻糖基转移酶中的一种，其来源为幽门螺旋杆菌、大肠杆菌和脆弱拟杆菌等，优选来源为幽门螺旋杆菌。

在本发明的一个实施方式中，所述ATP再生酶选自多磷酸激酶(PPK)、丙酮酸激酶(PyK)或乙酸激酶(AcK)中的一种或几种，优选为多磷酸激酶(PPK)，其来源为大肠杆菌、红色亚栖热菌、铜绿假单胞菌、解脂耶氏酵母、枯草芽孢杆菌等。

在本发明的一个实施方式中，所述GTP再生酶为多磷酸激酶(PPK)，其来源为红色亚栖热菌、铜绿假单胞菌、解脂耶氏酵母、枯草芽孢杆菌等。

在本发明的一个实施方式中，能同时再生ATP和GTP的来源于红色亚栖热菌和铜绿假单胞菌等的多磷酸激酶2(PPK2)可同时作为ATP再生酶和GTP再生酶。

在本发明的一个实施方式中，所述多酶级联催化利用GDP-L-岩藻糖合成相关酶、L-岩藻糖基转移酶、ATP再生酶或GTP再生酶中的两种或多种酶时，所选用的酶经重组质粒构建、表达与纯化获得。

在本发明的一个实施方式中，酶的表达宿主包括大肠杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母、谷氨酸棒状菌等，优选为大肠杆菌。

在本发明的一个实施方式中，表达各种重组酶的重组菌的构建方法包括将相应酶的编码基因构建重组质粒或整合到宿主的基因组上。

在本发明的一个实施方式中，体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法为：利用GDP-L-岩藻糖合成相关酶、L-岩藻糖基转移酶、ATP再生酶或GTP再生酶中的两种或多种酶(至少包括GDP-L-岩藻糖合成相关酶、L-岩藻糖基转移酶)，将选择的酶与相应的底物混合，反应，获得岩藻糖基化乳糖。

在本发明的一个实施方式中，体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法中，反应体系中含有0.1-0.3mg/mL GDP-L-岩藻糖合成相关酶、0.1-0.3mg/mL岩藻糖基转移酶、1-5mM岩藻糖、1-5mM乳糖、1-3mM ATP、1-3mM GTP，反应pH 6.5-9.5，反应温度20-30℃，反应时间2-12h。

在本发明的一个实施方式中，体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法中，反应体系中含有0.1-0.3mg/mL GDP-L-岩藻糖合成相关酶、0.1-0.3mg/mL岩藻糖基转移酶、0.1-0.3mg/mL ATP再生酶、1-5mM岩藻糖、1-5mM乳糖、1-5mM polyP、1-3mM ATP或ADP或AMP、1-3mM GTP，反应pH 6.5-9.5，反应温度20-30℃，反应时间2-12h。

在本发明的一个实施方式中，体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法中，反应体系中含有0.1-0.3mg/mL GDP-L-岩藻糖合成相关酶、0.1-0.3mg/mL岩藻糖基转移酶、0.1-0.3mg/mL ATP和GTP再生酶、1-5mM岩藻糖、1-5mM乳糖、1-5mM polyP、1-3mM ATP或ADP或AMP、1-3mM GTP或GDP或GMP，反应pH 6.5-9.5，反应温度20-30℃，反应时间2-12h。

在本发明的一个实施方式中，如400-800μL pH 6.5-9.5的缓冲液中添加终浓度为0.1-0.3mg/mL GDP-L-岩藻糖合成相关酶、0.1-0.3mg/mL岩藻糖基转移酶、1-5mM岩藻糖、1-5mM乳糖、1-3mM ATP和1-3mM GTP，于20-30℃反应2-12h，可得200-500mg/L的岩藻糖基化乳糖，岩藻糖基化乳糖生成率为50％-75％；上述反应体系中额外添加0.1-0.3mg/mL ATP/GTP再生酶和1-5mM polyP，岩藻糖基乳糖生成量提升了50％-80％。

在本发明的一个实施方式中，所述岩藻糖基化乳糖包括2’-岩藻糖基化乳糖(2’-FL)或3-岩藻糖基化乳糖(3-FL)。

本发明利用GDP-L-岩藻糖合成相关酶、岩藻糖基转移酶、ATP再生酶和GTP再生酶，双酶或多酶偶联高效制备岩藻糖基化乳糖(2’-FL或3-FL)。GDP-L-岩藻糖合成相关酶和岩藻糖基转移酶双酶偶联反应2-12小时可获得200-500mg/L岩藻糖基乳糖；进一步偶联能再生ATP和GTP的PPK酶进行反应，不仅能降低昂贵底物ATP和GTP的用量，减少生产成本，而且反应转化率大幅度提高，反应同样时间，岩藻糖基乳糖产量可提高至500-700mg/L。本发明提供了一种能高效、低成本、体外制备2’-FL和3-FL的新方法。

本发明与化学法和发酵法相比，生产工艺安全，并且反应耗时较短。本发明提供了绿色、高效的GDP-L-岩藻糖的补救合成途径与ATP再生途径相偶联/GDP-L-岩藻糖的补救合成途径与ATP和GTP再生途径相偶联的工业化制备岩藻糖基乳糖的新方法。

附图说明

图1为2’-岩藻糖基乳糖补救合成途径与ATP再生途径偶联示意图；

图2为2’-岩藻糖基乳糖补救合成途径与ATP和GTP再生途径偶联示意图；

图3为2’-岩藻糖基乳糖标品HPLC检测结果图；

图4为3-岩藻糖基乳糖标品HPLC检测结果图；

图5为体外多酶级联催化合成2’-岩藻糖基乳糖的HPLC检测结果图。

具体实施方式

利用GDP-L-岩藻糖合成相关酶、岩藻糖基转移酶、ATP再生酶和GTP再生酶，双酶或多酶偶联高效制备岩藻糖基化乳糖(2’-FL或3-FL)。GDP-L-岩藻糖合成相关酶和岩藻糖基转移酶双酶偶联反应2-12小时可获得200-500mg/L岩藻糖基乳糖；进一步偶联能再生ATP和GTP的PPK酶进行反应，不仅能降低昂贵底物ATP和GTP的用量，减少生产成本，而且反应转化率大幅度提高，反应同样时间，岩藻糖基乳糖产量可提高至500-700mg/L。

GDP-L-岩藻糖的补救合成途径与ATP再生途径相偶联的工业化制备岩藻糖基乳糖的新方法路线如图1所示。

GDP-L-岩藻糖的补救合成途径与ATP和GTP再生途径相偶联的工业化制备岩藻糖基乳糖的新方法路线如图2所示。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：岩藻糖基乳糖合成相关酶的重组表达

1、重组质粒的构建

将脆弱拟杆菌L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶(fkp)编码基因(Gi：61378772)、幽门螺旋杆菌α-1,2-岩藻糖基转移酶(FutC)编码基因(Gi：4808598)、幽门螺旋杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶(FucT)编码基因(Gi：2522367)和红色亚栖热菌多磷酸激酶(PPK)编码基因(Gi：481060151)交捷瑞公司进行密码子优化与合成，分别均以Nde I和XhoI插入pET-28a的相应位点，酶切分析鉴定，获得相应的重组质粒。

2、岩藻糖基乳糖合成相关酶的重组菌的制备

将重组质粒利用化学法导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，复苏后涂布于含有50ug/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置过夜培养后，挑取单克隆并鉴定。

3、岩藻糖基乳糖合成相关酶的蛋白表达

将人乳寡糖合成相关酶的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后获得重组菌株，随后将各菌株接种到3-5mL LB培养基中，37℃、180-220rpm/min培养过夜，再将重组菌株菌液按1-5％接种量分别转接到含有25μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2-0.6mM的IPTG，在16-20℃继续诱导表达18-22h，离心收集菌体(6000rpm，5min)，用pH 6.5-9.5的缓冲液重悬菌体，并于280W(工作5s，间歇5s)进行超声破碎，离心(12000rpm，10min)收集可溶的上清表达组分。

实施例2：体外多酶级联催化合成岩藻糖基乳糖相关酶的蛋白纯化

将上述破碎后的可溶上清表达组分利用Ni柱亲和层析法纯化得到L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶、岩藻糖基转移酶和多磷酸激酶，具体过程如下：

(1)样品的准备：将样品破碎后可溶表达的上清组分过0.45μm滤膜；

(2)Ni柱水洗：用5-10倍柱体积纯水以50-150cm/h清洗树脂，去除乙醇；

(3)Ni柱平衡：用5-10倍柱体积平衡缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl)以150-600cm/h平衡介质，保证介质中的溶液的组分和pH与样本一致；

(4)上样：样品经过离心、过滤(0.45μm)后以低流速进行上样，建议流速150cm/h；

(5)洗杂：用10-20倍柱体积洗杂缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，20mM咪唑)以150cm/h洗杂，清洗非特异吸附的杂蛋白，并收集流穿液用于后续分析；

(6)洗脱：用5-10倍柱体积洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，300mM NaCl，200mM咪唑)以低流速进行洗脱，并收集洗脱液；

(7)透析：将洗脱液置于透析袋中后放入透析缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl)进行12h透析；

(8)保存：将透析后得到的目的蛋白分装后于-20℃保存。

实施例3：双酶偶合催化合成2’-岩藻糖基乳糖

将3mM岩藻糖、3mM乳糖、2mM ATP、2mM GTP、0.2mg/mL L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶和0.2mg/mLα-1,2-岩藻糖基转移酶置于600μL pH 8.0的缓冲液中进行多酶级联催化反应，25℃下反应8h。HPLC检测2’-岩藻糖基乳糖标品(图3)的保留时间为13.679min，多酶级联催化合成2’-岩藻糖基乳糖的HPLC检测结果如图5所示，2’-FL生成量为431.8mg/L。

实施例4：三酶偶合催化合成2’-岩藻糖基乳糖(以ADP、GDP为底物)

将3mM岩藻糖、3mM乳糖、1.5mM polyP、2mM ADP、2mM GDP、0.2mg/mL L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶、0.2mg/mLα-1,2-岩藻糖基转移酶和0.2mg/mL多磷酸激酶置于600μL pH 8.0的缓冲液中进行多酶级联催化反应，25℃下反应8h，HPLC检测2’-岩藻糖基乳糖生成量为297.2mg/L。

实施例5：三酶偶合催化合成2’-岩藻糖基乳糖

将3mM岩藻糖、3mM乳糖、1.5mM polyP、2mM ATP、2mM GTP、0.2mg/mL L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶、0.2mg/mLα-1,2-岩藻糖基转移酶和0.2mg/mL多磷酸激酶置于600μL pH 8.0的缓冲液中进行多酶级联催化反应，25℃下反应8h，HPLC检测2’-岩藻糖基乳糖生成量为687.2mg/L，较实施例3的双酶偶联反应提高了59.1％，较实施例4的三酶偶联反应提高了1.3倍。

实施例6：双酶偶合催化合成3-岩藻糖基乳糖

将3mM岩藻糖、3mM乳糖、2mM ATP、2mM GTP、0.2mg/mL L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶和0.2mg/mLα-1,3-岩藻糖基转移酶置于600μL pH 8.0的缓冲液中进行多酶级联催化反应，25℃下反应8h。HPLC检测3-岩藻糖基乳糖标品(图4)的保留时间为13.243min，多酶级联催化合成3-FL的生成量为302.2mg/L。

实施例7：三酶偶合催化合成3-岩藻糖基乳糖

将3mM岩藻糖、3mM乳糖、1.5mM polyP、2mM ATP、2mM GTP、0.2mg/mL L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶、0.2mg/mLα-1,3-岩藻糖基转移酶和0.2mg/mL多磷酸激酶置于600μL pH 8.0的缓冲液中进行多酶级联催化反应，25℃下反应8h，HPLC检测3-岩藻糖基乳糖生成量为506.7mg/L，较双酶偶联提高了67.7％。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，其特征在于，联合利用GDP-L-岩藻糖合成相关酶和L-岩藻糖基转移酶，催化底物GDP-L-岩藻糖和乳糖反应，合成岩藻糖基化乳糖。

2.根据权利要求1所述的一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，其特征在于，联合利用GDP-L-岩藻糖合成相关酶和L-岩藻糖基转移酶，催化底物GDP-L-岩藻糖和乳糖反应，合成岩藻糖基化乳糖的过程中，还加入ATP再生酶或GTP再生酶中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，其特征在于，所述GDP-L-岩藻糖合成相关酶选自来源于卵形拟杆菌或脆弱拟杆菌的L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶、来源于大肠杆菌K-12的磷酸甘露糖变位酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶或GDP-岩藻糖合成酶中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，其特征在于，所述L-岩藻糖基转移酶选自α-1,2-岩藻糖基转移酶或α-1,3-岩藻糖基转移酶中的一种。

5.根据权利要求2所述的一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，其特征在于，所述ATP再生酶选自多磷酸激酶、丙酮酸激酶或乙酸激酶中的一种或几种；所述GTP再生酶为多磷酸激酶。

6.根据权利要求1所述的一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，其特征在于，多酶级联催化利用多种不同的酶时，选用同时表达各种酶的重组菌，表达各种酶的重组菌的构建方法包括将相应酶的编码基因构建重组质粒或整合到宿主的基因组上；所选用的酶经重组质粒构建、表达与纯化获得。

7.根据权利要求1所述的一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，其特征在于，反应体系中含有0.1-0.3mg/mL GDP-L-岩藻糖合成相关酶、0.1-0.3mg/mL岩藻糖基转移酶、1-5mM岩藻糖、1-5mM乳糖、1-3mM ATP、1-3mM GTP，反应pH 6.5-9.5，反应温度20-30℃，反应时间2-12h。

8.根据权利要求1所述的一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，其特征在于，反应体系中含有0.1-0.3mg/mL GDP-L-岩藻糖合成相关酶、0.1-0.3mg/mL岩藻糖基转移酶、0.1-0.3mg/mL ATP再生酶、1-5mM岩藻糖、1-5mM乳糖、1-5mM polyP、1-3mM ATP或ADP或AMP、1-3mM GTP，反应pH 6.5-9.5，反应温度20-30℃，反应时间2-12h。

9.根据权利要求1所述的一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，其特征在于，反应体系中含有0.1-0.3mg/mL GDP-L-岩藻糖合成相关酶、0.1-0.3mg/mL岩藻糖基转移酶、0.1-0.3mg/mL ATP和GTP再生酶、1-5mM岩藻糖、1-5mM乳糖、1-5mM polyP、1-3mM ATP或ADP或AMP、1-3mM GTP或GDP或GMP，反应pH 6.5-9.5，反应温度20-30℃，反应时间2-12h。

10.根据权利要求1所述的一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，其特征在于，所述岩藻糖基化乳糖包括2’-岩藻糖基化乳糖和3-岩藻糖基化乳糖。