CN110004135A - 一种球形固定化含d-泛解酸内酯水解酶细胞及其制备方法和水解d-泛解酸内酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种球形固定化含D‑泛解酸内酯水解酶细胞及其制备方法和水解D‑泛解酸内酯的方法。所述球形固定化含D‑泛解酸内酯水解酶细胞的制备方法，包含如下步骤：以海藻酸钠、明胶和聚乙烯醇为原料制备固定化载体，以含CaCl2的硼酸溶液为固化剂，固定化产D‑泛解酸内酯水解酶大肠杆菌得到固定化含D‑泛解酸内酯水解酶细胞。本发明的球形固定化含D‑泛解酸内酯水解酶细胞对D‑泛解酸内酯的选择性高，重复使用性好。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞及其制备方法和水解D-泛解酸内酯的方法。
背景技术
D-泛酸，又名维生素B5，在动物体内是合成辅酶A的原料，其主要作用是参与蛋白质、脂肪和糖的新陈代谢，被广泛应用于医药、食品和饲料等领域。生产D-泛酸的主要技术是中间体D,L-泛解酸内酯的手性拆分技术。合成路线是通过拆分D,L-泛解酸内酯制备中间体(D-泛解酸或D-泛解酸内酯)，再由D-泛解酸或D-泛解酸内酯与β-氨基丙酸反应得到D-泛酸。
固定化细胞技术是在固定化酶的基础上发展起来的，是将特定的微生物固定在载体上，使其高度密集并保持生物活性。因其具有酶活力损失少、成本低和生产周期短等优点，能够弥补悬浮微生物反应固液分离困难、抗毒性差等缺点，使其在工业上更具应用潜力。王雪梅等研究了海藻酸钠及其与聚丙烯酰胺(PAM)和聚乙烯醇(PVA)的复合载体对镰孢霉菌(Fusarium oxysporum BU-11)细胞的固定，用来拆分DL-泛解酸内酯。华蕾等报道了卡拉胶包埋固定细胞拆分DL-泛解酸内酯的研究。海藻酸钠是常见的包埋法固定化细胞载体，具有酶活损失少和制备简单的优点，但对不同的体系(尤其是磷酸盐体系) 易出现载体破裂和细胞泄漏的现象。而明胶的机械强度相对海藻酸钠来说较差。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种球形固定化含 D-泛解酸内酯水解酶细胞。
本发明的目的之二是提供一种球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞的制备方法。
本发明的目的之三是提供一种水解D-泛解酸内酯的方法。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞的制备方法，以海藻酸钠、明胶和聚乙烯醇为原料制备固定化载体，以含CaCl2的硼酸溶液为固化剂，固定化产D-泛解酸内酯水解酶大肠杆菌得到固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞。
优选条件下，在步骤(1)中，所述载体为硅藻土、活性炭、珍珠岩中的至少一种，优选为活性炭。
优选条件下，所述D-泛解酸内酯水解酶菌体为大肠杆菌。本发明中采用的产D-泛解酸内酯水解酶的大肠杆菌参照专利CN200410041614.0中公开的方法构建所得。
优选条件下，在步骤(2)中，所述混合溶液a中，所述海藻酸钠的浓度为1～3wt％，更优选为2wt％。
优选条件下，所述明胶的浓度为2.8～3.6wt％，更优选为3.33wt％。
优选条件下，所述聚乙烯醇的浓度为4.8～8.5wt％，更优选为6.67wt％。
优选条件下，在步骤(3)中，所述混合溶液b中，所述菌体的浓度为2～10 g/L，更优选为5g/L。
优选条件下，所述海藻酸钠的终浓度为1～2wt％，更优选为1.5wt％。
优选条件下，所述明胶的终浓度为2～3wt％，更优选为2.5wt％。
优选条件下，所述聚乙烯醇的终浓度为3～8wt％，更优选为5wt％。
所述载体炭的终浓度为0.2～1wt％，更优选为0.5wt％。
优选条件下，在步骤(4)中，所述硼酸溶液的浓度为5～15g/L，更优选为10g/L。
优选条件下，在步骤(4)中，所述硼酸溶液中氯化钙的浓度为10～20g/L，更优选为15g/L。
优选条件下，在步骤(4)中，所述硼酸溶液的pH为6.5～7.5。
优选条件下，在步骤(4)中，所述固化的时间为3～5h。
优选条件下，在步骤(4)中，所述混合溶液b的滴加速度为70～120滴/min，更优选为100滴/min。
本发明第二方面提供一种球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞，所述的制备方法制备得到。
优选条件下，所述球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞的活回收率为 76.22～85.12％。
本发明第三方面提供一种水解D-泛解酸内酯的方法，使用本发明的固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞水解D-泛解酸内酯，具体步骤如下：配制DL- 泛解酸内酯转化液，调节pH值为7.0～7.5，向DL-泛解酸内酯转化液中加入球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞，在转化液温度为30℃～35℃下转化 1～3h，得到D-泛解酸。
优选的，所述转化液中含DL-泛解酸内酯与所述球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞的质量浓度比为1:1.33～2。
通过上述技术方案，本发明具有以下技术效果：
(1)本发明采用海藻酸钠、明胶和聚乙烯醇共混作为复合载体，能够优化球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞的结构，使其具有更好的强度、稳定性和扩散性，延长其重复使用批次。
(2)本发明的球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞对D-泛解酸内酯的选择性高，在连续转化30批次后，固定化细胞酶活仍保持为游离细胞酶活 50％以上，重复使用性好，具有良好的工业化应用前景。
(3)本发明提供的球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞的制备方法具有原材料来源广、成本低、操作简单的特点。
(4)采用本发明提供的球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞水解D- 泛解酸内酯，能够缩短生产周期，提高经济效益。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明实施例1中的球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞A1 在反应30批次后的酶活回收率；
图2是本发明对比例1中的球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞B1 在反应30批次后的酶活回收率。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
实施例1
一种球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞的制备方法，步骤如下：
(1)向0.5g D-泛解酸内酯水解酶菌体(大肠杆菌)中加入生理盐水，并定容至25mL，得到浓度为20g/L的菌悬液；
在菌悬液中加入0.5g活性炭，搅拌均匀后静置1h，得到含有载体的菌悬液；
(2)配制75mL海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇的混合溶液，其中海藻酸钠浓度为2wt％，明胶浓度为3.33wt％，聚乙烯醇浓度为6.67wt％，得到混合液 a；
(3)将菌悬液和混合液a混合均匀，得到混合液b，混合液b中各物质的含量为：菌体浓度为5g/L，海藻酸钠终浓度为1.5wt％，明胶终浓度为2.5wt％，聚乙烯醇终浓度为5wt％，活性炭终浓度为0.5wt％；
(4)将混合溶液b以90滴/min的滴速滴入10g/L硼酸溶液中(硼酸溶液中 CaCl2的浓度为10g/L，pH为6.8)，固化4h，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞A1。
实施例2
按照实施例1的方法，不同的是，在步骤(2)中，海藻酸钠的浓度为1wt％；明胶的浓度为2.8wt％；聚乙烯醇的浓度为4.8wt％，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞A2。
实施例3
按照实施例1的方法，不同的是，在步骤(2)中，海藻酸钠的浓度为3wt％；明胶的浓度为3.6wt％；聚乙烯醇的浓度为8.5wt％，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞A3。
实施例4
按照实施例1的方法，不同的是，在步骤(3)中，所述混合溶液b中，所述菌体的浓度为2g/L；所述海藻酸钠的终浓度为2wt％；所述明胶的终浓度为3wt％；所述聚乙烯醇的终浓度为3wt％，所述活性炭的终浓度为0.2wt％，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞A4。
实施例5
按照实施例1的方法，不同的是，在步骤(3)中，所述混合溶液b中，所述菌体的浓度为10g/L；所述海藻酸钠的终浓度为1wt％；所述明胶的终浓度为2wt％；所述聚乙烯醇的终浓度为8wt％，所述活性炭的终浓度为1wt％，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞A5。
实施例6
按照实施例1的方法，不同的是，在步骤(4)中，所述硼酸溶液的浓度为15g/L；所述硼酸溶液中氯化钙的浓度为20g/L；所述硼酸溶液的pH为6.5，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞A6。
实施例7
按照实施例1的方法，不同的是，在步骤(4)中，固化时间为2h，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞A7。
实施例8
按照实施例1的方法，不同的是，在步骤(4)中，固化时间为8h，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞A8。
实施例9
按照实施例1的方法，不同的是，在步骤(4)中，混合溶液b的滴加速度为120滴/min，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞A9。
实施例10
按照实施例1的方法，不同的是，在步骤(4)中，混合溶液b的滴加速度为70滴/min，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞A10。
对比例1
按照实施例1的方法，不同的是，混合溶液a中不含有聚乙烯醇和明胶，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞B1。
对比例2
按照实施例1的方法，不同的是，混合溶液a中不含有海藻酸钠和聚乙烯醇，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞B2。
对比例3
按照实施例1的方法，不同的是，混合溶液a中不含有海藻酸钠和明胶，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞B3。
以上实施例中，大肠杆菌的培养方法为：
(1)微量无机盐的配置：将FeCl3·6H2O 1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O0.1mg，ZnCl20.1mg，Na2MoO4·2H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O 20.2mg溶解于蒸馏水中，然后加蒸馏水定容至1L，过滤除菌；
(2)种子培养基和发酵培养基组成均为：葡萄糖120g/L，氯化铵4g/L， NaH2PO45g/L，Na2HPO45g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，微量无机盐4ml/L，培养基pH 6.5；
(3)将大肠杆菌种子液按1％的接种量接种到发酵培养基中，于5L发酵罐中发酵培养20h，培养条件为前期35℃，后期诱导25℃，通气量1.0vvm，转速500rmp，pH 6.8～7.0，发酵完毕后，离心得到大肠杆菌菌体。
一种水解D-泛解酸内酯的方法，采用实施例1～10和对比例1～3得到的球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞A1～A10和B1～B3水解D-泛解酸内酯；具体步骤如下：
配制浓度为160g/L D-PL的DL-泛解酸内酯转化液，调节pH值为7.0～7.5，向DL-泛解酸内酯转化液中加入100g/L球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞，在转化液温度为30℃～35℃下转化2h，得到D-泛解酸。
测试例
1、酶活检测的方法为：
(1)底物配制：取10g DL-PL(DL-泛解酸内酯)于烧杯中，在50～60℃下干燥1～2h，干燥结束置于烘箱中自然冷却后，称取4.000g干燥后的DL-PL (DL-泛解酸内酯)至25mL容量瓶中，用Tris-HCL缓冲液溶解，并定容至 25mL，得到浓度为160g/L D-PL底物；
所述Tris-HCL缓冲液溶解的配置方法为：称取6.05gTris，用超纯水溶解并定容至25mL，接着用浓HCL调节pH至7.0～7.5，即得到2mol/L的Tris-HCL 缓冲液；
(2)发酵液离心：将发酵液置于离心管中离心，离心条件如下： 10000rpm/min离心5min，离心结束后，去除上层清液，得到菌泥。
(3)游离细胞催化反应：取1g菌泥至10mL离心管中，加入5mL的160g/L 的D-PL底物，在30℃下水浴反应20min；
(4)酶活检测：反应结束后，得到反应液，取10μL反应液稀释至100mL，并采用0.22um滤膜过滤，得到待测液，对待测液进行液相检测，检测D-泛解酸的含量，并计算游离细胞的酶活力，游离细胞作为对照组，以1mL纯水为空白组；
(5)球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞的酶活力检测：取一定质量固定化细胞(实施例1～10和对比例1～3方法制备，包含了1g游离细胞)，加入到10mL离心管中，加入5mL的160g/L的D-PL底物，在30℃下水浴反应 20min；
(6)将剩余的反应液按照步骤(5)的方法连续反应30次，并于每次反应结束后按照步骤(4)的方法检测酶活力，并计算酶活回收率，实验结果如表1～2、图1～图2所示；
酶活回收率＝v2/v1×100％；对照组大肠杆菌菌泥酶活力为v1，固定化细胞组酶活力为v2。
液相检测的条件为：仪器型号：Agilent 1200Series
色谱柱：大赛璐chiralpak IG，4.6×250mm，5μm
柱温：35℃；紫外检测波长：210nm；采集时间：18min；进样量：10 μL；流速：0.50mL/min；流动相：A相(0.1％甲酸水溶液)：B相(甲醇) ＝65:35。
酶活力单位定义：每分钟水解1μmolD-泛解酸内酯生成D-泛解酸的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
表1
表2实施例1和对比例1进行30批次反应数据。
通过图1和图2比较可以得知，与单一海藻酸钠固定化细胞相比，本发明制备的复合载体固定化细胞在多批次转化后酶活力没有明显的下降。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞的制备方法，其特征在于，以海藻酸钠、明胶和聚乙烯醇为原料制备固定化载体，以含CaCl2的硼酸溶液为固化剂，固定化产D-泛解酸内酯水解酶大肠杆菌得到固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞。
2.根据权利要求1所述的球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)向含D-泛以解酸内酯水解酶菌体中加入生理盐水，制成菌悬液，然后加入载体，搅拌均匀，得到含有载体的菌悬液；
(2)配制海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇混合，得到混合溶液a；
(3)将含有载体的菌悬液和混合溶液a进行混合，得到混合溶液b；
(4)将混合溶液b滴入CaCl2的硼酸溶液中，固化2～8h，得到球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述载体为硅藻土、活性炭、珍珠岩中的至少一种；和/或
所述D-泛解酸内酯水解酶菌体为大肠杆菌。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述混合溶液a中，所述海藻酸钠的浓度为1～3wt％；和/或
所述明胶的浓度为2.8～3.6wt％；和/或
所述聚乙烯醇的浓度为4.8～8.5wt％。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述混合溶液b中，所述菌体的浓度为2～10g/L；和/或
所述海藻酸钠的终浓度为1～2wt％；和/或
所述明胶的终浓度为2～3wt％；和/或
所述聚乙烯醇的终浓度为3～8wt％；和/或
所述载体的终浓度为0.2～1wt％。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述硼酸溶液的浓度为5～15g/L；和/或
所述硼酸溶液中氯化钙的浓度为10～20g/L；和/或
所述硼酸溶液的pH为6.5～7.5。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述固化的时间为3～5h。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述混合溶液b的滴加速度为70～120滴/min。
9.一种球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞，其特征在于，根据权利要求1～8中任意一项所述的制备方法制备得到；
优选的，所述球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞的酶活回收率为76.22～85.12％。
10.一种水解D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，使用权利要求9所述的球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞水解D-泛解酸内酯；具体步骤如下：配制DL-泛解酸内酯转化液，调节pH值为7.0～7.5，向DL-泛解酸内酯转化液中加入球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞，在转化液温度为30℃～35℃下转化1～3h，得到D-泛解酸；
优选的，所述转化液中含DL-泛解酸内酯与所述球形固定化含D-泛解酸内酯水解酶细胞的质量浓度比为1:1.33～2。
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