CN1597962A - D－泛解酸内酯水解酶cDNA及其克隆、表达和应用 - Google Patents
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Abstract
D－泛解酸内酯水解酶cDNA及其克隆、表达和应用，涉及D－泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因技术领域。本发明利用反转录PCR技术，以串珠镰孢霉(Fusariummoniliforme)CGMCC 0536菌株总RNA为模板合成cDNA第一链，再在引物1、引物2作用下扩增得到长度为1.5kb的片段，经切胶回收并纯化处理后同T载体连接得到克隆载体重组质粒pMD18－T－LAC，在引物3、引物4作用下以该克隆载体为模板扩增，获得长为1146bp的编码D－泛解酸内酯水解酶cDNA的结构基因。构建表达载体重组质粒pTrc99a－LAC或pYX212－LAC及对应的含有以上重组质粒的重组菌。应用重组菌生物转化D－泛解酸内酯或D，L－泛解酸内酯制备D－泛解酸。
Description
技术领域
本发明涉及来源于串珠镰孢霉(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536菌株中的D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因及其克隆载体，表达载体重组质粒，电转化构建重组菌及转化制备D-泛解酸，涉及D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因技术领域。
背景技术
泛解酸，Pantothenic acid，D(+)-N(α，γ-二羟基-β，β-二甲基丁酰)-β丙氨酸[D(+)-N(α，γ-dihydroxy-β，β-dimethylbutyl)-β-alanine]，又称遍多酸、维生素B5、或B3，是一种重要的药物、食品添加剂和饲料添加剂。它又是辅酶A的组成部分，参与糖、脂肪、蛋白质代谢，其产品形式一般为其右旋体钙盐D-泛酸钙。D-泛解酸的制备方法主要有：化学拆分法，物理拆分法，生物拆分法，目前只有生物拆分法中的利用产D-泛解酸内酯水解酶菌株选择性地不对称水解D-泛解酸内酯，得到D-泛解酸。
可以产生D-泛解酸内酯水解酶的菌株有镰孢霉菌属Fusarium，赤霉菌属Gibberella，粘帚霉菌属Gliocladium，黑曲霉菌属Aspergillus，以及柱盘孢菌属Cylindrocarpon，Volutella等。
1994年日本的Sakamoto等人[Shimizu S，Kataoka M，Shimizu K，HirakataM，Sakamoto K，Yamada H.Purification and characterization of a novellactonohydrolase，catalyzing the hydrolysis of aldonate lactones andaromatic lactones，from Fusarium oxysporum.Eur J Biochem，1992，209：383-390.]对Genera属的Fusarium Oxysporm IFO5942菌株中可立体专一性拆分D，L-泛解酸内酯的酶进行了分离纯化，并对酶的反应条件进行了探索性研究，确定了酶转化的最佳反应条件[Kataoka M，Shimizu K，Sakamoto K，Yamada H，Shimizu S.Appl.Microbiol.biotechnol，1995，43：974～977]。同时他们对酶的分子量及亚基组成也进行了测定，发现该酶由两个亚基组成，分子量约为12500。对该酶的抑制剂也进行了研究，可抑制该酶的因子有：Zn2+、Cd2+、Cu2+、Hg2+以及EDTA。
1998年日本的Michihiko Kobayashi等[Kobayashi M，Shinohara M，SakohC，Kataoka M，Shimizu S.Lactone-ring-cleaving enzyme：Genetic analysis，novel RNAediting，and evolutionary implications.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998，95：12787～12792.]对Fusarium Oxysporm AKU 3702菌株中的D-泛解酸内酯水解酶基因进行了研究，发现D-泛解酸内酯水解酶基因组全长约2.2kb左右，含有6个内涵子，通过构建cDNA文库，利用基因探针筛选到了编码D-泛解酸内酯水解酶cDNA基因，其全长约为1.2kb左右，将该酶cDNA基因与载体连接后转入大肠杆菌中，并进行了活性表达，经SDS-PAGE检测，发现有两种不同分子量(49kDa和51kDa)的基因表达产物，二者都具有D-泛解酸内酯水解酶，怀疑49kDa的酶为51kDa酶在细胞内蛋白酶作用下的产物。
2002年日本的Sakamoto等人发表了源于真核生物的D-泛解酸内酯水解酶的基因序列并将该基因修饰后转至原核生物细胞内，进行了过量表达，经测定该表达产物有立体专一性拆分D，L-泛解酸内酯的活力并对其序列进行了分析。利用该表达产物进行工业化生产效果较好。这一研究解决了利用菌体细胞直接转化所带来的困难，也提高了酶的活力及产物的收率。
发明内容
本发明目的是提供一种D-泛解酸内酯水解酶cDNA及其克隆、表达和应用。发表来源于串珠镰孢霉(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536菌株[中国专利.01104070.X，2001.]中D-泛解酸内酯水解酶cDNA基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列，构建含有该序列的克隆载体，表达载体和转化了表达载体的重组菌，以及利用含有表达载体重组菌以D-泛解酸内酯或D，L-泛解酸内酯为底物生物转化制备D-泛解酸。
本发明的技术方案是：利用反转录PCR技术(RT-PCR技术)并以来源于串珠镰孢霉(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536菌株中的总RNA为模板合成cDNA第一链。在引物1、引物2的作用下利用cDNA第一链为模板扩增了约1500bp的片断，将该片段连接到pMD18-T载体上获得克隆载体pMD18-T-LAC和转化了pMD18-T-LAC的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并对测序结果利用软件分析，该序列含有一个开放阅读框。根据测序结果设计引物3、引物4，利用引物3、引物4以克隆载体pMD18-T-LAC为模板，获得了长为1146bp的编码D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因。该基因核苷酸序列为：
ATGGCTAAGC TTCCTTCTAC GGCCCAGATT ATTGACCAGA AGTCCTTTAA TGTCTTGAAG 60
GATGTGCCGC CTCCCGCAGT GGCCAATGAC TCTCTGGTGT TCACTTGGCC TGGTGTGACT 120
GAGGAGTCTC TTGTTGAGAA GCCTTTTCAT GTCTACGATG AAGAGTTTTA CGACGTCATC 180
GGAAAGGACC CCTCTTTGAC CCTCATCGCA ACATCGGACA CCGACCCAAT CTTCCATGAG 240
GCTGTCGTAT GGTATCCTCC TACTGAAGAG GTCTTCTTTG TCCAGAATGC TGGCGCTCCC 300
GCTGCTGGCA CTGGCTTGAA CAAGTCTTCC ATCATTCAGA AGATTTCCCT CAAGGAGGCC 360
GACGAGGTCC GCAAGGGCAA GAAGGATGAG GTCAAGGTCG CGGTTGTTGA CTCAAACCCT 420
CAGGTCATCA ACCCCAATGG TGGCACTTAC TACAAGGGCA ACATCATCTT TGCTGGTGAG 480
GGCCAAGGCG ACGATGTTCC CTCCGCCCTG TACCTGATGA ACCCTCTCCC TCCTTACAAC 540
ACCACCACCC TCCTCAACAA CTACTTTGGT CGCCAGTTCA ACTCCCTCAA CGACGTCGGT 600
ATCAACCCCA GGAACGGTGA CTTGTACTTC ACCGATACCC TCTATGGATA CCTCCAGGAC 660
TTCCGTCCTG TTCCTGGTCT GCGAAACCAA GTCTATCGTT ACAACTTTGA CACCGGCGCC 720
GTCACTGTCG TCGCTGATGA CTTTACCCTC CCTAACGGTA TTGGCTTTGG CCCCGACGGC 780
AAGAAGGTCT ATGTCACCGA CACTGGTATC GCTCTTGGCT TTTACGGCCG CAACCTCTCT 840
TCACCCGCCT CTGTTTACTC CTTCGATGTA AACCAGGACG GTACTCTCCA GAACCGCAAG 900
ACCTTTGCTT ACGTCGCGTC TTTCATCCCC GATGGTGTTC ATACCGACTC CAAGGGCCGT 960
GTTTATGCCG GTTGCGGCGA TGGTGTCCAC GTCTGGAACC CTTCGGGCAA GCTAATCGGC 1020
AAGATCTACA CCGGTACTGT TGCTGCTAAC TTCCAGTTTG CCGGCAAGGG AAGGATGATT 1080
ATTACTGGAC AGACCAAGTT GTTCTATGTT ACTTTAGGGG CTTCGGGTCC CAAGCTCTAT 1140
GATTAG 1146
利用软件对该基因序列进行分析，并推知其编码的氨基酸序列为：
MAKLPSTAQI IDQKSFNVLK 20
DVPPPAVAND SLVFTWPGVT 40
EESLVEKPFH VYDEEFYDVI 60
GKDPSLTLIA TSDTDPIFHE 80
AVVWYPPTEE VFFVQNAGAP 100
AAGTGLNKSS IIQKISLKEA 120
DEVRKGKKDE VKVAVVDSNP 140
QVINPNGGTY YKGNIIFAGE 160
GQGDDVPSAL YLMNPLPPYN 180
TTTLLNNYFG RQFNSLNDVG 200
INPRNGDLYF TDTLYGYLQD 220
FRPVPGLRNQ VYRYNFDTGA 240
VTVVADDFTL PNGIGFGPDG 260
KKVYVTDTGI ALGFYGRNLS 280
SPASVYSFDV NQDGTLQNRK 300
TFAYVASFIP DGVHTDSKGR 320
VYAGCGDGVH VWNPSGKLIG 340
KIYTGTVAAN FQFAGKGRMI 360
ITGQTKLFYV TLGASGPKLY 380
D* 381
本发明将D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因同表达载体pTrc99a(PharmaciaBiotech，Inc.，Piscataway)或穿梭表达载体pYX212(Novogen company)连接构建了含有D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因的表达重组质粒pTrc99a-LAC或pYX212-LAC。
将重组质粒pTrc99a-LAC转化至大肠杆菌获得含有重组质粒pTrc99a-LAC的重组大肠杆菌，或将重组质粒pYX212-LAC转化至酿酒酵母，获得含有穿梭表达载体pYX212-LAC的重组酿酒酵母。以重组菌为酶源，利用D-泛解酸内酯或D，L-泛解酸内酯为底物转化制备D-泛解酸。
本发明的有益效果：
本发明发表了一种来源于串珠镰孢霉菌(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536中的D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因核苷酸序列；并将该基因与表达载体连接构建得到含该基因的表达重组质粒pTrc99a-LAC或pYX212-LAC，再分别对应转化至大肠杆菌或酿酒酵母，获得含有重组质粒pTrc99a-LAC的重组大肠杆菌或含有穿梭表达载体pYX212-LAC的重组酿酒酵母，经测定含有该基因的重组菌有立体专一性拆分D-泛解酸内酯或D，L-泛解酸内酯的活力，可利用该重组菌生物法拆分制备D-泛解酸。重组大肠杆菌酶活力达37-41U/g，重组酿酒酵母酶活力达60-64U/g。
附图说明
图1克隆载体pMD18-T-LAC物理图谱。
图2pTrc99a-LAC重组质粒物理图谱。
图3pYX212-LAC重组质粒物理图谱。
图4D-泛解酸内酯水解酶cDNA基因PCR扩增argrose电泳图。
1.利用引物1和引物2扩增得到的cDNA片段；
2.250bp DNA Marker；
3.利用引物3和引物4扩增得到的cDNA片段。
图5阳性重组质粒pTrc99a-LAC的酶切结构图。
1.DL2000 DNA Marker；
2.D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因片段；
3.pTrc-LAC/EcoRI；
4.pTrc-LAC/SalI；
5.pTrc-LAC/EcoRI and SalI；
6.λDNA/HindIII DNA Marker。
图6阳性重组质粒pYX212-LAC的酶切结构图。
1.λDNA/HindIII DNA Marker；
2.D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因片段；
3.pYX212-LAC/EcoRI；
4.pYX212-LAC/SalI；
5.pYX212-LAC/EcoRI and SalI；
6.DL2000 DNA Marker。
具体实施方式
实施例1
参照文献[Chomczynski P.，Sacchi N.，Single Step Method of RNAIsolation by Acid Guanidinium Thiocyanate Phenol Chloroform Extraction.Anal.Biochem.1987，162：156-159]的方法并对其进行改良，用以提取Fusariummoniliforme CGMCC 0536菌体的总RNA，具体操作如下：取处理过的Fusariummoniliforme CGMCC 0536菌丝体0.4g，液氮速冻并研磨(加入少量石英砂)成粉末，快速将粉末移入50mL离心管中，加12mL变性液(异硫氢酸胍6mol/L，柠檬酸37.5mol/L，十二烷基肌酸钠0.75mol/L，β-巯基乙醇0.15mol/L)，充分摇匀。向离心管中加入1.2mL乙酸钠(2M pH4.0)混匀，加入12mL饱和酚混匀，加12mL氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)混匀。震荡10s，冰浴15min。10000g离心20min。上清液移至新管，加与上清液等体积的混合溶剂(酚∶氯仿∶异戊醇体积比为25∶24∶1)，震荡完全，冰浴15min。4℃10000g离心20min，上清液移至新管，加等体积异丙醇，混匀，-20℃沉淀1h。4℃10000g离心20min，收集RNA，倾倒上清(小心)，将RNA沉淀溶解于3.5mL变性液中，溶解混匀。将溶解液分装几管，700μL/管，加等体积异丙醇，-20沉淀1h。4℃10000g离心10min后，75％乙醇洗2次，每次500μL/管，将沉淀悬起后，室温静止10min，室温10000g离心5min，倾去上清，操作台上风干。每管加100μL无核糖核酸酶的水(RNase-free水)，溶解好后，测OD值，并取适量样品进行甲醛变性电泳。
实施例2
利用商品化的mRNA分离试剂盒分离从实施例1获得的总RNA中分离mRNA。分离的原理是：在总RNA中只有mRNA在3’末端有一个PolyA结构，当总RNA通过含有Oligo(dT)的介质时，具有3’末端PolyA结构的mRNA被吸附，利用洗液将杂质及其他RNA洗去后，再利用洗脱液将mRNA洗脱下来，即可得到纯度较高的mRNA。本实施例利用Promega公司的mRNA分离试剂盒，具体操作如下：
1.0.1～1mg的RNA加无核糖核酸酶的水(RNase-free水)至500μL(1μg/ml)，65℃水浴10min，加3μL由试剂盒提供的Biotinglated-Oligo(dT)，加13μL由试剂盒提供的20×SSC，轻柔混合后放置室温至完全冷却(放置时间不超过10min)。
2.洗SA-PMP(由试剂盒提供的含有Oligo(dT)的磁性小珠)，轻弹试管将SA-PMP悬起，放置于磁架上，小心移去上清，用由试剂盒提供的0.5×SSC洗3次(300μL/次)，将SA-PMP重悬于100μL 0.5×SSC中。
3.将1中产物放入2中，室温放置10min，轻柔倒转1～2min，SA放置于磁架上，小心移去上清，用0.1×SSC洗4次(300μL/次)，每次轻柔充分混合。
4.用RNase-free水(100μL)重悬SA，轻柔混合，放置于磁架上，将上清移至干净的离心管中，用150μL RNase-free水重复洗SA-PMP几次(若有沉淀，可12000g 4℃离心1min)。
实施例3
在反转录酶的作用下，以mRNA为模板合成cDNA第一链，设计的Oligo(dT)引物中T碱基的数量介于12～18个之间。在50℃下恒温进行反转录反应，反应时间为1～2h，获得的cDNA第一链用作cDNA第二链合成的模板。
首先，对基因数据库中公布的编码D-泛解酸内酯水解酶基因序列进行对比分析，根据分析结果我们设计了一对引物。
参照基因数据库中公布的尖镰孢霉菌株中编码D-泛解酸内酯水解酶的基因组和cDNA设计引物1：序列为5’-GCTAAGCTTCCTTCTACGGC-3’，引物2：Oligo(dT15)，由上海生工生物工程公司提供，根据mRNA3’末端结构进行设计。
利用高保真Pyrobest DNA聚合酶以D-泛解酸内酯水解酶cDNA第一链为模板，在引物1、引物2的引发下，合成cDNA第二链。经琼脂糖凝胶电泳检测发现扩增得到一长度为1.5kb的片段，琼脂糖凝胶电泳结果见图4。
切胶回收该片段并纯化，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。在T4 DNA连接酶作用下将该片段同T载体进行连接，得到克隆重组质粒pMD18-T-LAC见图1。
将该重组质粒电转化至大肠杆菌中，利用篮白筛选系统进行筛选，随机挑取白色克隆测序，利用软件分析测序结果，根据分析结果设计以下引物：
引物3：5’-CCGGAATTCATGGCTAAGCTTCCTTCTACGGC-3’
引物4：5’-ATTCCGGTCGACCTAATCATAGAGCTTGGGAC-3’
分别在引物3和引物4中引入了EcoRI和SalI限制性酶切位点。
实施例4
以实施例3中的克隆重组质粒pMD18-T-LAC为模板，在实施例3中的引物3和引物4的引发下，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶进行扩增，获得长为1146bp的编码D-泛解酸内酯水解酶cDNA的结构基因，测序后利用EcoRI和SalI限制性内切酶对扩增片段进行处理，并利用T4 DNA连接酶将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pTrc99a或穿梭表达载体pYX212进行连接，构建表达载体pTrc99a-LAC或穿梭表达载体pYX212-LAC。将构建的表达载体pTrc99a-LAC电转化至大肠杆菌，涂平板37℃进行培养过夜，或穿梭表达载体pYX212-LAC电转化至酿酒酵母，涂平板在30℃进行培养2-3天，随机挑取克隆抽提质粒进行酶切鉴定，鉴定结果见图5和图6。
实施例5
以实施例4中获得的含有表达载体pTrc99a-LAC的重组大肠杆菌或含有穿梭表达载体pYX212-LAC的重组酿酒酵母湿菌体作为转化用酶，以D-泛解酸内酯或D，L-泛解酸内酯为底物，进行转化反应制备D-泛解酸。转化体系组成及转化操作如下：在250mL三角瓶中加入0.5g湿菌体和底物浓度为2％的50mL反应液，30℃摇床150r/min条件下反应60min，离心去除菌体，清液为含有D-泛解酸的水溶液。用HPLC分析测定D-泛解酸生成量，推知重组菌酶活。测定结果见表1和表2。
表1.以重组大肠杆菌为酶源测定的D-泛解酸内酯水解酶酶活力测定结果
| 菌株/质粒 | 酶活(U/g(wet cells)) |
| 大肠杆菌JM109 | 0 |
| 大肠杆菌JM109/pTrc99a | 0 |
| 大肠杆菌JM109/pTrc99a-LAC-1 | 37 |
| 大肠杆菌JM109/pTrc99a-LAC-2 | 41 |
表2.以重组酿酒酵母为酶源测定的D-泛解酸内酯水解酶酶活力测定结果
| 菌株/质粒 | 酶活(U/g(wet cells)) |
| 酿酒酵母W303-1A | 0 |
| 酿酒酵母W303-1A/pYX212-LAC-1 | 60 |
| 酿酒酵母W303-1A/pYX212-LAC-2 | 64 |
Claims (5)
1.一种来源于串珠镰孢霉(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536菌株中的D-泛解酸内酯水解酶cDNA，其结构基因核苷酸序列为：
ATGGCTAAGC TTCCTTCTAC GGCCCAGATT ATTGACCAGA AGTCCTTTAA TGTCTTGAAG 60
GATGTGCCGC CTCCCGCAGT GGCCAATGAC TCTCTGGTGT TCACTTGGCC TGGTGTGACT 120
GAGGAGTCTC TTGTTGAGAA GCCTTTTCAT GTCTACGATG AAGAGTTTTA CGACGTCATC 180
GGAAAGGACC CCTCTTTGAC CCTCATCGCA ACATCGGACA CCGACCCAAT CTTCCATGAG 240
GCTGTCGTAT GGTATCCTCC TACTGAAGAG GTCTTCTTTG TCCAGAATGC TGGCGCTCCC 300
GCTGCTGGCA CTGGCTTGAA CAAGTCTTCC ATCATTCAGA AGATTTCCCT CAAGGAGGCC 360
GACGAGGTCC GCAAGGGCAA GAAGGATGAG GTCAAGGTCG CGGTTGTTGA CTCAAACCCT 420
CAGGTCATCA ACCCCAATGG TGGCACTTAC TACAAGGGCA ACATCATCTT TGCTGGTGAG 480
GGCCAAGGCG ACGATGTTCC CTCCGCCCTG TACCTGATGA ACCCTCTCCC TCCTTACAAC 540
ACCACCACCC TCCTCAACAA CTACTTTGGT CGCCAGTTCA ACTCCCTCAA CGACGTCGGT 600
ATCAACCCCA GGAACGGTGA CTTGTACTTC ACCGATACCC TCTATGGATA CCTCCAGGAC 660
TTCCGTCCTG TTCCTGGTCT GCGAAACCAA GTCTATCGTT ACAACTTTGA CACCGGCGCC 720
GTCACTGTCG TCGCTGATGA CTTTACCCTC CCTAACGGTA TTGGCTTTGG CCCCGACGGC 780
AAGAAGGTCT ATGTCACCGA CACTGGTATC GCTCTTGGCT TTTACGGCCG CAACCTCTCT 840
TCACCCGCCT CTGTTTACTC CTTCGATGTA AACCAGGACG GTACTCTCCA GAACCGCAAG 900
ACCTTTGCTT ACGTCGCGTC TTTCATCCCC GATGGTGTTC ATACCGACTC CAAGGGCCGT 960
GTTTATGCCG GTTGCGGCGA TGGTGTCCAC GTCTGGAACC CTTCGGGCAA GCTAATCGGC 1020
AAGATCTACA CCGGTACTGT TGCTGCTAAC TTCCAGTTTG CCGGCAAGGG AAGGATGATT 1080
ATTACTGGAC AGACCAAGTT GTTCTATGTT ACTTTAGGGG CTTCGGGTCC CAAGCTCTAT 1140
GATTAG 1146。
2.如权利要求1所述的D-泛解酸内酯水解酶cDNA，由权利要求1中的核苷酸序列编码，其氨基酸组成为：
MAKLPSTAQI IDQKSFNVLK 20
DVPPPAVAND SLVFTWPGVT 40
EESLVEKPFH VYDEEFYDVI 60
GKDPSLTLIA TSDTDPIFHE 80
AVVWYPPTEE VFFVQNAGAP 100
AAGTGLNKSS IIQKISLKEA 120
DEVRKGKKDE VKVAVVDSNP 140
QVINPNGGTY YKGNIIFAGE 160
GQGDDVPSAL YLMNPLPPYN 180
TTTLLNNYFG RQFNSLNDVG 200
INPRNGDLYF TDTLYGYLQD 220
FRPVPGLRNQ VYRYNFDTGA 240
VTVVADDFTL PNGIGFGPDG 260
KKVYVTDTGI ALGFYGRNLS 280
SPASVYSFDV NQDGTLQNRK 300
TFAYVASFIP DGVHTDSKGR 320
VYAGCGDGVH VWNPSGKLIG 340
KIYTGTVAAN FQFAGKGRMI 360
ITGQTKLFYV TLGASGPKLY 380
D* 381。
3.如权利要求1所述的D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因的克隆，其特征是：
a)利用反转录PCR技术，以串珠镰孢霉(Fusariummoniliforme)CGMCC 0536菌株中的总RNA为模板合成了cDNA第一链；
b)引物1：5’-GCTAAGCTTCCTTCTACGGC-3’
引物2：Oligo(dT15)，
在引物1、引物2作用下，以cDNA第一链为模板，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶进行扩增得到长度为1.5kb的片段；
c)经切胶回收该片段并纯化，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A，在T4 DNA连接酶作用下将该片段同T载体进行连接，得到克隆载体重组质粒pMD18-T-LAC和转化了pMD18-T-LAC的大肠杆菌，并对重组质粒测序；
d)设计引物3：5’-CCGGAATTCATGGCTAAGCTTCCTTCTACGGC-3’
引物4：5’-ATTCCGGTCGACCTAATCATAGAGCTTGGGAC-3’
在引物3、引物4作用下，以pMD18-T-LAC为模板，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶进行扩增得到长度为1146bp的编码D-泛解酸内酯水解酶cDNA的结构基因。
4.如权利要求1所述的D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因的表达，其特征是利用EcoRI和SalI限制性内切酶对长度为1146bp的扩增片段进行处理，并利用T4 DNA连接酶将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pTrc99a或穿梭表达载体pYX212进行连接，构建表达载体重组质粒pTrc99a-LAC，并电转化至大肠杆菌，涂平板在37℃进行培养过夜，或构建穿梭表达载体重组质粒pYX212-LAC，并电转化至酿酒酵母中，涂平板在30℃进行培养2-3天；随机挑取克隆抽提质粒进行酶切鉴定。
5.如权利要求1所述的D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因的应用，其特征是获得的含有表达载体pTrc99a-LAC的重组大肠杆菌或含有穿梭表达载体pYX212-LAC的重组酿酒酵母湿菌体作为转化用酶，以D-泛解酸内酯或D，L-泛解酸内酯为底物，进行转化反应制备D-泛解酸，转化体系组成及转化操作如下：在250mL三角瓶中加入0.5g湿菌体和底物浓度为2％的50mL反应液，30℃摇床150r/min条件下反应60min，离心去除菌体，清液为含有D-泛解酸的水溶液。
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