CN106591330A

CN106591330A - 反式‑l‑脯氨酸‑4‑羟化酶基因、酶、载体、工程菌及应用

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Publication number: CN106591330A
Application number: CN201611269776.9A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 周海岩; 王培�; 李会帅; 柳志强
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2016-12-31
Filing date: 2016-12-31
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-12-31
Also published as: CN106591330B

Abstract

本发明公开了一种反式‑L‑脯氨酸‑4‑羟化酶基因、酶、载体、工程菌以及在催化L‑脯氨酸合成反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸中的应用。所述反式‑L‑脯氨酸‑4‑羟化酶的酶活达到1654.08U/L，比酶活为82.74U/mg湿细胞；直接收集含酶的菌体细胞作为酶源进行生物转化，反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的量为24.8mg/L；向反应体系中添加0.8％表面活性剂Nymeen‑S215后产量高达176.0mg/L，比同条件下不添加Nymeen‑S215时提高了6.36倍；在此基础上向反应体系中添加5g/L葡萄糖，产物量为329.2mg/L，是不添加葡萄糖时的1.87倍。

Description

反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因、酶、载体、工程菌及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种产反式-L-脯氨酸-4-羟化酶(trans-L-Proline-4-hydroxylase,简称trans-P4H)的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程领域。

(二)技术背景

反式-L-脯氨酸-4-羟化酶(trans-L-Proline-4-hydroxylase,简称trans-P4H)是依赖α-酮戊二酸和Fe²⁺的双加氧酶超家族成员之一，可以作为生物催化剂在反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline,简称t-4Hyp)的生物法合成中发挥关键作用。trans-P4H在辅助因子α-酮戊二酸(α-KG)、Fe²⁺和O₂存在的条件下(有时还需要以L-抗坏血酸为还原剂)可将游离的L-脯氨酸转化为t-4Hyp。

t-4Hyp是一种重要的非天然氨基酸，是L-羟脯氨酸的同分异构体，其结构中含有一个四氢吡咯环和一个羧基，在生物体中的一些生理和病理过程中扮演着重要的角色，其应用价值和潜力也颇受关注。t-4Hyp拥有巨大的市场前景，在食品、化妆品、医药和化工等多个行业发挥着重要的作用，市场需求呈现逐年递增的趋势，目前国内市场售价高达60多万元/吨。开发t-4Hyp高效、低成本生产技术，是目前t-4Hyp生产和开发领域的一个研究热点。

据报道，生物体内没有携带L-羟脯氨酸的tRNA。肽链中的L-羟脯氨酸是L-脯氨酸在特定羟化酶(对游离的L-Pro不起作用)的作用下羟化而来的。对富含L-羟脯氨酸的动物胶原蛋白进行酸水解，是目前制备t-4Hyp的主要方法。该方法的得率仅为4％-7％，且工艺安全性较差，对设备要求高，并会对环境造成严重污染。同时，动物疾病(疯牛病、口蹄疫等)的爆发严重限制了胶原蛋白的来源，使得该方法已不能满足市场需求。化学合成法路线长(保护/去保护)、环境污染严重、成本高，不适合工业化生产。而以trans-P4H为催化剂，以游离的L-Pro为底物，以α-KG、Fe²⁺和O₂为辅助因子，抗坏血酸为还原剂的生物法生产具有污染小、成本低、效率高、产物光学纯度高的优势，因此t-4Hyp的生物法生产和技术开发受到越来越多的关注。

早在1962，Katz等在利用Streptomyces antibioticus 3720合成放线菌素I的过程中检测到了游离的t-4Hyp，首次发现了t-4Hyp可经微生物代谢合成(Katz,E.,Prockop,D.J.,Undenfriend,S.(1962).Precursors of the hydroxyproline and ketoproline inactinomycin.The Journal of Biological Chemistry,237:1585-1588.)；1979年，Katz等在研究Streptomyces griseoviridus P-D04955合成灰绿菌素的过程中，通过同位素标记试验确证了t-4Hyp是由培养基中游离的L-Pro转化而来(Katz,E.,Kamal,F.,Mason,K.(1979).Biosynthesis of trans-4-hydroxy-L-proline by Streptomycesgriseoviridus.The Journal of Biological Chemistry,254(14):6684-6690.)；1984年，Onishi等在宜他霉素生产菌Streptomyces griseoviridus P8648的细胞破碎体系中检测到了trans-P4H的活性，由此确定了这一重要的生物合成途径(Onishi,M.,Okumura,Y.,Okamoto,R.,Ishikura,T.(1984).Proline hydroxylation by cell freeextract of a streptomycete.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,120(1):45-51.)。20世纪90年代，在对trans-P4H研究的基础上，开始有学者尝试t-4Hyp的微生物发酵生产，但目前发现的具有发酵生产t-4Hyp能力的微生物仍较少，主要为生产抗生素的真菌和放线菌，包括：Clonostachys cylindrospora(Matsuoka,T.,Serizawa,N.,Hosoya,T.,Furuya,K.(1994).Microbial process for the producingof trans-4-hydroxy-L-proline.US Patent,5334517A,1994-08-02；Serizawa,N.,Matsuoka,T.,Tsuyoshi,H.,Furuya,K.(1995).Fermentative production of trans-4-hydroxy-L-proline by Clonostachys cylindrospora.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry,59(3):555-557.)、Nectria gliocladioide(Matsuoka,T.,Serizawa,N.,Hosoya,T.,Furuya,K.(1994).Microbial process for the producing of trans-4-hydroxy-L-proline.US Patent,5334517A,1994-08-02.)、Gliocladium sp.(Matsuoka,T.,Serizawa,N.,Hosoya,T.,Furuya,K.(1994).Microbial process for the producingof trans-4-hydroxy-L-proline.US Patent,5334517A,1994-08-02.)和Streptomycesgriseoviridus(Katz,E.,Kamal,F.,Mason,K.(1979).Biosynthesis of trans-4-hydroxy-L-proline by Streptomyces griseoviridus.The Journal of BiologicalChemistry,254(14):6684-6690；Lawrence,C.C.,Sobey,W.J.,Field,R.A.,Baldwin,J.E.,Schofield,C.J.(1996).Purification and initial characterization of proline 4-hydroxylase from Streptomyces griseoviridus P8648:a 2-oxoacid,ferrous-dependent dioxygenase involved in etamycin biosynthesis.The BiochemicalJournal,313(Pt 1):185-191.)等。

研究表明，无论是生物催化法还是发酵法生产t-4Hyp，trans-P4H的酶活力是影响t-4Hyp合成的重要因素。1999年，日本学者Shibasaki等通过大量的筛选工作，获得了8株有trans-P4H活力的菌株，通过对Dactylosporanyium sp.RH1的trans-P4H进行纯化、N端测序、基因扩增等，获得了trans-P4H的基因，并通过融合β-半乳糖苷酶α片段的N端34个氨基酸的形式在大肠杆菌进行表达，使trans-P4H酶活力提高至原来的13.6倍(Shibasaki,T.,Mori,H.,Chiba,S.,Ozaki,A.(1999).Microbial proline 4-hydroxylase screening andgene cloning.Applied and Environmental Microbiology,65(9):4028-4031.)；接着又将该基因置于一个强启动子的调控下，转化到发酵生产L-Pro的大肠杆菌中，以葡萄糖为碳源对重组菌进行发酵培养，96h后，t-4Hyp产量达到25g/L(Shibasaki,T.,Hashimoto,S.,Mori,H.,Ozaki,A.(2000).Construction of a novel hydroxyproline-producingrecombinant Escherichia coli by introducing a proline 4-hydroxylasegene.Journal of Bioscience and Bioengineering,90(5):522-525.)；Yi等将Pseudomonas stutzeri和Dactylosporangium sp.的trans-P4H基因分别在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中实现了活性表达，摇瓶发酵结果表明，表达Dactylosporangium sp.的trans-P4H的重组菌E.coli BL21/pET-28a-p4hD的产量最高，为0.470g/L(Yi,Y.,Sheng,H.,Li,Z.,Ye,Q.(2014).Biosynthesis of trans-4-hydroxyproline by recombinant strainsof Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli.BMC Biotechnology,14:44.)。2014年，刘合栋等根据密码子偏好性重新设计合成Dactylosporangium sp.的P4H基因，并将其插入含有色氨酸串联启动子的pUC19质粒中，构建的重组菌在摇瓶水平发酵8h可积累0.492g/L t-4Hyp；在4-L发酵罐中采用分批补料的方式进行发酵培养，t-4Hyp可达到42.5g/L(刘合栋,袁春伟,张震宇(2014).脯氨酸-4-羟化酶在大肠杆菌中的密码子优化表达及对反式-4-羟脯氨酸生物合成的作用.生物加工过程,12(6):44-51.)，是目前报道的最高水平。

目前报道的有trans-P4H活性的微生物主要有灰绿链霉菌(StreptomycesgriseoviridusP8648)(Lawrence,C.C.,Sobey,W.J.,Field,R.A.,Baldwin,J.E.,Schofield,C.J.(1996).Purification and initial characterization of proline 4-hydroxylase from Streptomyces griseoviridus P8648:a 2-oxoacid,ferrous-dependent dioxygenase involved in etamycin biosynthesis.The BiochemicalJournal,313(Pt 1):185-191.)、抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus 3720)(Katz,E.,Prockop,D.J.,Undenfriend,S.(1962).Precursors of the hydroxyproline andketoproline in actinomycin.The Journal of Biological Chemistry,237:1585-1588.)、指胞囊菌(Dactylosporangium sp.RH1)(Shibasaki,T.,Mori,H.,Chiba,S.,Ozaki,A.(1999).Microbial proline 4-hydroxylase screening and genecloning.Applied and Environmental Microbiology,65(9):4028-4031.)、拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.RH2)(Shibasaki,T.,Mori,H.,Chiba,S.,Ozaki,A.(1999).Microbialproline 4-hydroxylase screening and gene cloning.Applied and EnvironmentalMicrobiology,65(9):4028-4031.)、Glarea lozoyensis(Petersen,L.,Olewinski,R.,Salmon,P.,Connors,N.(2003).Novel proline hydroxylase activities in thepneumocandin-producing fungus Glarea lozoyensis responsible for the formationof trans 3-and trans 4-hydroxyproline.Applied Microbiology and Biotechnology,62(2-3):263-267.)和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(Bontoux,M.-C.,Gelo-Pujic,M.(2006).Microbial screening in hydroxylation of L-proline.Tetrahedron Letters,47:9073-9076.)等。通过搜索NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的蛋白质数据库，发现注释为(或可能为)trans-P4H的蛋白有162种，通过分子生物学方法，已实现了Dactylosporangium sp.RH1、Pseudomonas stutzeri和Bordetella bronchiseptica RB50来源的P4H的活性表达，其它多种trans-P4H尚待被挖掘和利用。

本实验室从NCBI数据库中搜索到多株微生物的trans-P4H基因序列，对其中的1条序列进行优化和合成后，在大肠杆菌中进行异源表达，并对酶活水平进行了检测，获得了一株有trans-P4H活性的工程菌，分别对其全细胞和透性化处理的全细胞催化合成t-4Hyp的能力进行了考察，为t-4Hyp的生物法生产提供理论基础和技术支持。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种trans-P4H基因、编码酶、重组载体及基因工程菌，以及trans-P4H基因工程菌在催化L-Pro制备t-4Hyp中应用。本发明提供的trans-P4H基因工程菌可用于全细胞催化合成t-4Hyp，过程简单，酶活性和稳定性高，在t-4Hyp的生物法合成中有很大的应用潜力，也为今后构建代谢途径改造的工程菌并用于t-4Hyp的发酵法生产奠定了基础。

本发明采用的技术方案：

本发明涉及一种反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因(即trans-P4H基因)，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO.1所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个或多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码氨基酸的功能。

本发明涉及一种所述trans-P4H基因编码的trans-P4H酶，所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO.2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明涉及一种含所述trans-P4H基因的重组载体。

本发明提供一种由所述重组载体构建的重组基因工程菌。

本发明还提供一种所述trans-P4H基因在制备trans-P4H酶中的应用，所述的应用为：构建含有trans-P4H基因的重组载体，将所述重组载体转化到大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，取培养液分离得到含trans-P4H酶的菌体细胞。

此外，本发明涉及一种所述trans-P4H酶在催化L-脯氨酸(L-Pro)制备反式-4-羟基-L-脯氨酸(t-4Hyp)中的应用，所述的应用为：以含trans-P4H基因的重组菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以L-Pro为底物，以α-酮戊二酸(α-KG)、Fe²⁺为辅底物(优选FeSO₄)，以L-抗坏血酸为抗氧化剂，以pH 5.0-7.0、60-240mM的MES缓冲液(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)为反应介质构成反应体系，在20-40℃、150rpm条件下反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得t-4Hyp；所述反应体系中，湿菌体的质量用量为20g/L，底物初始浓度为0.5-2.0g/L，FeSO₄终浓度为0.1-2.0mM，α-KG终浓度为2.0-12.0mM，L-抗坏血酸终浓度为2.0-10.0mM。

进一步，更优选所述反应体系中，底物初始浓度为1.0g/L，FeSO₄终浓度为0.8-1.0mM(更优选1mM)，α-KG终浓度为6.0-8.0mM(更优选8mM)，L-抗坏血酸终浓度为6.0-10.0mM(更优选6mM)。

进一步，优选所述反应介质MES缓冲液的浓度为80mM，pH为6.5，温度为35℃。

进一步，所述反应体系中添加有表面活性剂Nymeen-S215；所述表面活性剂Nymeen-S215的体积用量以反应体系体积计为0.5-1.5％，优选0.8-1.0％(v/v)，更优选0.8％。

进一步，所述反应体系中还添加有葡萄糖，所述葡萄糖在反应进行4h时添加，所述葡萄糖终浓度以反应体系体积计为2-10g/L，优选5g/L。

本发明优选的反应体系组成为下列之一：(1)以含trans-P4H基因的重组菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以L-Pro为底物，以α-酮戊二酸(α-KG)、Fe²⁺为辅底物(优选FeSO₄)，以L-抗坏血酸为抗氧化剂，以pH 5.0-7.0、60-240mM的MES缓冲液为反应介质构成反应体系；(2)以含trans-P4H基因的重组菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以L-Pro为底物，以α-酮戊二酸(α-KG)、Fe²⁺为辅底物(优选FeSO₄)，以L-抗坏血酸为抗氧化剂，添加表面活性剂Nymeen-S215，以pH 5.0-7.0、60-240mM的MES缓冲液为反应介质构成反应体系；(3)以含trans-P4H基因的重组菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以L-Pro为底物，以α-酮戊二酸(α-KG)、Fe²⁺为辅底物(优选FeSO₄)，以L-抗坏血酸为抗氧化剂，添加表面活性剂Nymeen-S215和葡萄糖，以pH 5.0-7.0、60-240mM的MES缓冲液为反应介质构成反应体系。

进一步，所述酶源按以下步骤制备：将含trans-P4H基因的重组工程菌接种至含终浓度40μg/mL卡那霉素(Kan)的LB液体培养基中，37℃、150rpm培养至OD₆₀₀＝0.8～1.0，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量转入含终浓度40μg/mL Kan的LB液体培养基中，于37℃、150rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.4～0.8，向培养液中添加终浓度0.5mM的IPTG，28℃、150rpm诱导培养10h，获得诱导培养液，将诱导培养液离心，收集湿菌体，即为酶源；所述LB液体培养基组成：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，用1M NaOH将pH调至7.0。

更进一步，本发明所述trans-P4H酶在催化L-Pro制备t-4Hyp中的应用方法为：

(1)重组菌的筛选

所述重组表达质粒上带有Kan抗性基因，如果重组质粒已经转化到大肠杆菌中，重组菌株具有Kan抗性，可在含有40μg/mL Kan的平板上生长；挑取阳性转化子，即为trans-P4H重组菌。

(2)重组菌经培养表达trans-P4H

LB液体培养基(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10，溶剂为水，用1M NaOH将pH调至7.0；LB固体培养基添加20g/L琼脂；高压蒸汽灭菌(121℃、20min)；使用前无菌环境下添加终浓度40μg/mL Kan。

将trans-P4H重组菌接种至终浓度40μg/mL Kan的LB液体培养基，250mL三角瓶，装液量为50mL，培养温度37℃、摇床转速150rpm，培养至OD₆₀₀＝0.8～1.0，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量转入装有100mL终浓度40μg/mL Kan的发酵培养基(LB液体培养基)的500mL三角瓶中，于37℃、150rpm条件下培养2-3h(OD₆₀₀＝0.4～0.8)，添加终浓度0.5mM的IPTG，28℃、150rpm诱导培养10h，获得诱导培养液。

本发明所述trans-P4H酶的反应温度为35℃，底物浓度为20mM时酶活达到了1654.08U/L，比酶活为82.74U/g湿细胞。

本发明取得的有益效果：本发明通过优化trans-P4H基因，构建其工程菌株，并诱导表达trans-P4H蛋白，使其酶活达到1654.08U/L，比酶活为82.74U/g湿细胞，比以同样的条件构建的表达p4hD(目前报道的酶活最高的基因)的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hD的总酶活和比酶活分别高了69.2％和60.3％，因此，在t-4Hyp的生物法合成中有更大的应用潜力。以表面活性剂Nymeen-S215透性化处理的菌体作为转化反应酶源，催化L-Pro转化为t-4Hyp的产量较不经过透性化处理的细胞得到了明显的提高，这为trans-P4H的应用以及t-4Hyp的生物法生产提供了一定的技术支持。直接收集含酶的菌体细胞作为酶源进行生物转化，结果表明，在20mL的反应体系中，湿菌体的质量用量为20g/L，反应介质为80mM、pH 6.5的MES缓冲液，L-Pro初始浓度为1.0g/L，FeSO₄.7H₂O浓度为1.0mM，α-KG浓度为8.0mM，L-抗坏血酸浓度为6.0mM，反应在35℃、150rpm条件下进行24h，生成的t-4Hyp的量为24.8mg/L；向反应体系中添加0.8％(v/v)表面活性剂Nymeen-S215后，转化进行到第12h时，生成的t-4Hyp的量达到最高，为176.0mg/L，比同条件下不添加Nymeen-S215时提高了6.36倍；在此基础上，在反应进行到第4h时，向反应体系中添加5g/L葡萄糖，产物的合成量在第10h时达到最高，为329.2mg/L，是不添加葡萄糖时的1.87倍，说明表明活性剂Nymeen-S215和葡萄糖的添加能显著促进E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ全细胞催化L-脯氨酸合成t-4Hyp的效率。

(四)附图说明

图1为PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000DNA Marker；(a)：以p4hBJ-F和p4hBJ-R为引物PCR扩增的p4hBJ基因片段；(b)：以p4hD-F和p4hD-R为引物PCR扩增的p4hD基因片段。

图2为质粒的酶切电泳图；M：DL5000DNA Marker；(a)：质粒pET-28b-p4hBJ被限制性内切酶Nco I和Xho I双酶切后的片段；(b)：质粒pET-28b-p4hD被限制性内切酶Nco I和Xho I双酶切后的片段。

图3为重组质粒pET-28b-p4hBJ(a)和pET-28b-p4hD(b)的物理图谱。

图4为重组大肠杆菌的SDS-PAGE电泳图；(a)：M，蛋白分子量Marker；1-3分别为E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ全细胞、菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀。(b)：M，蛋白分子量Marker；1-3分别为空宿主E.coli BL21(DE3)(对照)全细胞、菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀，4-6分别为E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hD全细胞、菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀。

图5为透性化处理方式对全细胞催化合成t-4Hyp的影响。

图6为全细胞催化合成t-4Hyp的进程曲线；-△-，对照；-■-，添加0.8％(v/v)表面活性剂Nymeen-S215；-◆-，添加0.8％(v/v)表面活性剂Nymeen-S215和4h时添加5g/L葡萄糖。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限至于此：

实施例1：trans-P4H的基因合成

根据NCBI数据库中公开的来自慢生型大豆根瘤菌Bradyrhizobium japonicumUSDA 6的trans-P4H的基因的序列信息(GenBank No.BAL06808.1)，以大肠杆菌的密码子偏好性为参照对其进行优化，使频率在10％以下的密码子得到调整并替换，整个序列的GC含量尽可能接近50％，同时去掉常用的限制性内切酶Bgl II、BamH I、Nco I和Xho I等识别位点，新设计的trans-P4H基因序列(p4hBJ)如SEQ ID NO.1所示，基因合成工作委托上海旭冠生物科技发展有限公司完成，合成的基因片段连接到克隆载体pES中。

采用同样的方法合成了目前报道的酶活最高的trans-P4H基因p4hD，序列优化参照文献(Falcioni,F.,Blank,L.M.,Frick,O.(2013)Proline availability regulatesproline-4-hydroxylase synthesis and substrate uptake in proline-hydroxylatingrecombinant Escherichia coli.Applied and Environmental Microbiology,79(9):3091-3100.)中报道的p4h1of序列进行，该基因来源于Dactylosporangium sp.RH1(GenBank No.BAA20094.1)，合成的基因片段连接到克隆载体pES中。

实施例2：trans-P4H重组大肠杆菌的构建

在实施例1的基础上，利用PCR技术，以带有p4hBJ基因序列的克隆质粒为模板，以p4hBJ-F(5′-AGGCCATGGGTAAACTGTCTGAAGCGCAGC-3′，下划线部分为Nco I酶切识别位点)和p4hBJ-R(5′-AATCTCGAGTTACTCAGCA GCCTGACGCGG-3′，下划线部分为Xho I酶切识别位点)为引物，对p4hBJ基因进行扩增。同样的，以带有p4hD基因序列的克隆质粒为模板，以p4hD-F(5′-AGGCCATGGGTACTCCAACCGAACTGAAAC-3′，下划线部分为Nco I酶切识别位点)和p4hD-R(5′-AATCTCGAGCACCGGTTGAGCCAGTGCGAA-3′，下划线部分为Xho I酶切识别位点)为引物，对p4hD基因进行扩增。

PCR反应体系(50μL)为：10×Pfu PCR buffer 5μL，dNTP Mixture 8μL；模板DNA 1μL；上下游引物各2μL；Pfu DNA聚合酶0.5μL；无菌水31.5μL。PCR反应的程序为94℃预变性5min；30个循环(94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s)；72℃延伸10min。以1％琼脂糖凝胶电泳验证并以0.8％琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，结果扩增到与目的序列大小相符的p4hBJ基因片段(800bp左右，图1中(a))以及p4hD基因片段(800bp左右，图1中(b))。

用限制性内切酶Nco I和Xho I对PCR产物和表达载体pET-28b分别进行双酶切，回收目的片段并用T4 DNA连接酶于16℃过夜连接，连接反应体系为(20μL)：目的基因片段12μL，载体DNA 5μL，10×T4 DNA连接酶buffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL。连接产物转化E.coliJM109感受态细胞，涂布含40μg/mL Kan的LB平板，37℃培养12～18h；挑取阳性克隆子，37℃、150rpm振荡培养过夜，提取质粒进行酶切验证，结果见图2。pET-28b-p4hBJ和pET-28b-p4hD双酶切后的2个片断均分别为5200bp和800bp左右，与预期结果一致；后又对质粒进行测序验证，得到正确构建的重组质粒pET-28b-p4hBJ和pET-28b-p4hD，其物理图谱见图3。

采用热击法将质粒pET-28b-p4hBJ和pET-28b-p4hD转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ和E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hD。其转化方法如下：取连接产物5～10μL，加入到100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min；将装有混合物的Eppendorf管置于42℃水浴热休克90s，然后立即转移到冰上冷却2min；向管中加入600μL LB液体培养基，置于37℃、150rpm恒温摇床上培养2～4h，然后涂布于含有40μg/mL Kan的LB平板上，37℃培养12～24h，挑取转化子，进行质粒提取和酶切验证，最后得到正确构建的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ和E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hD。LB培养基组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，溶剂为水，用1M NaOH将pH调至7.0。

实施例3：重组大肠杆菌的蛋白电泳和酶活测定

将实施例2中构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ和E.coliBL21(DE3)/pET-28b-p4hD接种至含有40μg/mL Kan的50mL LB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养到OD₆₀₀＝0.8～1.0；培养液以2％(v/v)接种量接种到新鲜的含有40μg/mL Kan的100mL LB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.4～0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，28℃、150rpm诱导培养10h。取菌体培养液，8000rpm、4℃离心10min，菌体沉淀用80mMMES缓冲液(pH6.5)洗涤2次，然后重悬于MES缓冲液中，取出20μL全细胞菌悬液待用；剩余菌液用超声波进行破碎，12000rpm离心1min，取菌体破碎上清液20μL待用；向菌体破碎沉淀中加入MES缓冲液并使之悬浮，取20μL待用。分别向装有20μL全细胞菌悬液、20μL菌体破碎上清液和20μL菌体破碎沉淀悬浮液的离心管中加入20μL SDS缓冲液，混合，沸水浴加热5min，分别取10μL进行SDS-PAGE分析，以空宿主E.coli BL21(DE3)为对照(结果见图4)。与对照相比，在分子量为30kDa处，重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ和E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hD的全细胞菌悬液、菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀中均出现了一条明显的蛋白条带，表明trans-P4H在重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ和E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hD中已成功得到表达，但前者的表达总量和可溶性蛋白表达量均明显高于后者。

酶活测定方法参考文献(Shibasaki,T.,Mori,H.,Ozaki,A.(2000).Enzymaticproduction of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-and stereospecifichydroxylation of L-proline.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,64(4):746-750.)进行。取诱导培养液，4℃、8000rpm离心10min，将离心后回收的菌体称重，加入500μL反应缓冲液(240mM MES pH6.5，20mM L-Pro，40mMα-KG和4mM FeSO₄·7H₂O)使菌体重新悬浮，在35℃水浴摇床中200rpm反应10min，转移到100℃水浴中加热2min终止酶反应，离心(9000rpm、5min)、收集上清、并用氨基酸分析仪测定t-4Hyp浓度(徐建华,邢金川(1997).同时测定羟脯氨酸、脯氨酸的氨基酸分析仪短程序.氨基酸和生物资源,19(2):49-51.)。

酶活定义：35℃条件下，1min内催化L-Pro生成1nmol t-4Hyp所需的酶量定义为1个酶活单位(U)；比酶活单位为U/g湿菌体。

酶活检测结果(表1)表明，在同样的条件下，E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ表达的trans-P4H的总酶活和比酶活比E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hD的分别高了69.2％和60.3％，因此相较于目前研究最广泛、酶活最高的基因p4hD，来源于Bradyrhizobiumjaponicum USDA 6的p4hBJ基因及其基因工程菌在t-4Hyp的生物法合成中或许有更大的应用潜力。

表1不同重组大肠杆菌表达的trans-P4H酶活比较

实施例4：E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ全细胞催化合成t-4Hyp

将实施例3中经IPTG诱导后的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ菌液，于4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体作为转化用酶源，湿菌体的质量用量为20g/L，反应体系为20mL，反应介质为80mM、pH6.5的MES缓冲液，L-Pro初始浓度为1.0g/L，FeSO₄.7H₂O为1.0mM，α-KG为8.0mM，L-抗坏血酸为6.0mM，反应在35℃、150rpm条件下进行24h，反应结束后离心(9000rpm、5min)反应液，收集上清，利用氨基酸分析仪对t-4Hyp浓度进行检测，结果表明，产物t-4Hyp的浓度为24.8mg/L。

实施例5：透性化处理的全细胞催化合成t-4Hyp

在实施例4的基础上，向反应体系中加入终浓度为1％(v/v)的甲苯或0.8％(v/v)的表面活性剂Nymeen-S215，以不加甲苯或Nymeen-S215的为对照，结果如图5所示，通过加入1％的甲苯处理后，产物t-4Hyp的浓度降低了50％左右；而加入0.8％的Nymeen-S215后，重组菌合成t-4Hyp的浓度提高到对照组的6.86倍，达到170.2mg/L；此结果说明甲苯的加入可能破坏了细胞的完整性而降低了trans-P4H的酶活，而0.8％的Nymeen-S215则有利于细胞膜通透性的增加，使得小分子和一些较大分子的物质能够自由进出细胞，从而使得胞内酶的催化作用得到充分发挥。

实施例6：透性化处理的全细胞催化合成t-4Hyp过程

在实施例4的基础上，向反应体系中加入终浓度为0.8％(v/v)的表面活性剂Nymeen-S215，以不加Nymeen-S215的为对照，在反应的第0h、4h、6h、10h、12h和24h分别取出50μL反应液，进行产物浓度的测定，结果如图6所示，无论在对照组还是添加Nymeen-S215的实验组中，产物合成量均呈现出快速增加(0-4h)、缓慢增加(4-12h)、达到稳定(13-24h)的趋势，12h的产物浓度分别为23.9和176.0mg/L，添加0.8％(v/v)的表面活性剂Nymeen-S215后，t-4Hyp的最高浓度较不添加Nymeen-S215时提高了6.36倍。说明Nymeen-S215的添加能显著提高E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ全细胞催化L-Pro合成t-4Hyp的能力。

实施例7：添加葡萄糖的全细胞催化合成t-4Hyp过程

在实施例6的基础上，在反应进行到第4h时，向反应体系中加入终浓度为5g/L的葡萄糖，在反应的第0h、2h、4h、6h、8h、10h和12h分别取出50μL反应液，进行产物浓度的测定，结果如图6所示，产物合成量在4h之后呈现快速增加的趋势，到10h达到最高，为329.2mg/L，是不添加葡萄糖时产物最高浓度的1.87倍。说明在反应过程中添加葡萄糖有利于E.coliBL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ全细胞催化L-Pro合成t-4Hyp的反应的进行。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因、酶、载体、工程菌及应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 804

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

atgggtaaac tgtctgaagc gcagctggaa tttttccacc gcgaaggctg gctgtttctg 60

ccggagctgt ttagccagga agaagttgat ctgctggctc gtgaagcagt tggcatttat 120

gacgctaacc gtccggaagt ttggcgtgaa aaatccggtg cgccgcgtac cgcatttgct 180

gctcacctgt acaacgaagc gttcggtatc ctgggcgcac acccgcgcat gatcgaaccg 240

gtggaacagc tgtttggcga accggtgtac atgcaccagt tcaaaatcaa cgcgaaatcc 300

gcattcactg gcgatgtttg gcagtggcac caggattatg gcacctggaa acgtgatgat 360

ggcatgccgg aaccgcgcgc tatgaacatc gctatctttc tggatgaggt tatgccgatt 420

aacggtccgc tgatgctggt tccgcagtcc cagaacgcag gcgatctgca ggcttctcat 480

gatctggcaa ctacctctta tccgctgtgg accctggacg aagaaactgt gacccgcctg 540

gtgaaacagg gcggtatcgt tgctccgact ggcaaaccgg gcggtatgct gatgttccac 600

ggcaacctgg tgcacggttc ttccggtaac atcactccgt acccgcgcaa aattgtgtat 660

ctgaccctga acgcagtatc caactacatc cgtaccccga cccgtccgga atatatcgct 720

catcgtgact tcgcgccgat caaaaccgtt gacgacgacg cactggtacg tctggcgcgt 780

gcgccgcgtc aggctgctga gtaa 804

<210> 2

<211> 267

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Met Gly Lys Leu Ser Glu Ala Gln Leu Glu Phe Phe His Arg Glu Gly

1 5 10 15

Trp Leu Phe Leu Pro Glu Leu Phe Ser Gln Glu Glu Val Asp Leu Leu

20 25 30

Ala Arg Glu Ala Val Gly Ile Tyr Asp Ala Asn Arg Pro Glu Val Trp

35 40 45

Arg Glu Lys Ser Gly Ala Pro Arg Thr Ala Phe Ala Ala His Leu Tyr

50 55 60

Asn Glu Ala Phe Gly Ile Leu Gly Ala His Pro Arg Met Ile Glu Pro

65 70 75 80

Val Glu Gln Leu Phe Gly Glu Pro Val Tyr Met His Gln Phe Lys Ile

85 90 95

Asn Ala Lys Ser Ala Phe Thr Gly Asp Val Trp Gln Trp His Gln Asp

100 105 110

Tyr Gly Thr Trp Lys Arg Asp Asp Gly Met Pro Glu Pro Arg Ala Met

115 120 125

Asn Ile Ala Ile Phe Leu Asp Glu Val Met Pro Ile Asn Gly Pro Leu

130 135 140

Met Leu Val Pro Gln Ser Gln Asn Ala Gly Asp Leu Gln Ala Ser His

145 150 155 160

Asp Leu Ala Thr Thr Ser Tyr Pro Leu Trp Thr Leu Asp Glu Glu Thr

165 170 175

Val Thr Arg Leu Val Lys Gln Gly Gly Ile Val Ala Pro Thr Gly Lys

180 185 190

Pro Gly Gly Met Leu Met Phe His Gly Asn Leu Val His Gly Ser Ser

195 200 205

Gly Asn Ile Thr Pro Tyr Pro Arg Lys Ile Val Tyr Leu Thr Leu Asn

210 215 220

Ala Val Ser Asn Tyr Ile Arg Thr Pro Thr Arg Pro Glu Tyr Ile Ala

225 230 235 240

His Arg Asp Phe Ala Pro Ile Lys Thr Val Asp Asp Asp Ala Leu Val

245 250 255

Arg Leu Ala Arg Ala Pro Arg Gln Ala Ala Glu

260 265

Claims

1.一种反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种权利要求1所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因编码的反式-L-脯氨酸-4-羟化酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.一种含权利要求1所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体构建的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸酶中的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的重组载体，将所述重组载体转化到大肠杆菌感受态细胞中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，取培养液分离得到含有反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的菌体细胞。

6.一种权利要求2所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶在催化L-脯氨酸制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用，其特征在于所述的应用为：以含有反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体为酶源，以L-脯氨酸为底物，以FeSO₄和α-酮戊二酸为辅底物、以L-抗坏血酸为抗氧化剂、以pH5.0-7.0、60-240mM的MES缓冲液为反应介质构成反应体系，在20～40℃、150rpm条件下反应，反应完全后，将反应液分离纯化，得到产物反式-4-羟基-L-脯氨酸。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中，湿菌体的质量用量为20g/L，底物初始浓度为0.5-2.0g/L，FeSO₄终浓度为0.1-2.0mM，α-酮戊二酸终浓度为2.0-12.0mM，L-抗坏血酸终浓度为2.0-10.0mM。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中添加有表面活性剂Nymeen-S215；所述表面活性剂Nymeen-S215的体积用量以反应体系体积计为0.5-1.5％。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述反应体系中还添加有葡萄糖，所述葡萄糖终浓度以反应体系体积计为2-10g/L。

10.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述酶源制备步骤如下：将含有反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的重组工程菌接种到含终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基种，37℃、150rpm培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量转入含终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150rpm条件下培养OD₆₀₀＝0.4-0.8，向培养液中添加终浓度0.5mM的IPTG，28℃、150rpm诱导培养10h，获得诱导培养液，将诱导培养液离心，pH 6.5、80mM的MES缓冲液洗两次后收集湿菌体，即为酶源；所述LB液体培养基组成：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，溶剂为水，pH值为7.0。