CN107674863B - 一种生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的方法。具体地,本发明提供了一种多肽在生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸或以反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸为前体的下游产物中的用途。本发明还提供了生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的方法,所述方法包括培养表达所述多肽的菌株,从而得到反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。本发明还提供了一种反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸生产菌株,以及所述反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸生产菌株的构建方法。利用本发明的方法可高效、低成本地产生反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地说,本发明涉及一种多肽在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物生产中的用途,以及一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法。
背景技术
反式-4-羟基-L-脯氨酸(简称羟脯氨酸),是一种具有独特生理活性的氨基酸,易溶于水,广泛应用于医药、化工、动物饲料和美容业等领域,市场前景广阔,由于价格昂贵羟脯氨酸目前主要用于合成碳青霉烯类抗生素(美罗培南等)的侧链。碳青霉烯类是第三代抗生素,是抗菌谱最广的一类非典型β-内酰胺类抗生素,具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点,全球总体市场已超过了30亿美元。
反式-4-羟基-L-脯氨酸可以通过脯氨酸4-羟化酶催化L-脯氨酸羟基化来生产,目前用于生产L-脯氨酸等氨基酸的工程菌主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(E.coli)等,但是这些菌都没有编码脯氨酸4-羟化酶的基因。因此,挖掘能够在L-脯氨酸生产菌中表达并具有高效催化活性的脯氨酸4-羟化酶是实现反式-4-羟基-L-脯氨酸工业生产的关键。
脯氨酸4-羟化酶的催化反应
日本协和发酵公司通过筛选得到一株脯氨酸4-羟化酶酶活最高的指孢囊菌,并命名为指孢囊菌RH1,测序获得脯氨酸4-羟化酶基因序列(CN96190335);该脯氨酸4-羟化酶在大肠杆菌中异源表达主要形成包涵体,进行密码子优化后置于一个强启动子的调控下,导入到大肠杆菌中,添加外源L-脯氨酸,在发酵罐中转化100小时后,反式-4-羟基-L-脯氨酸的积累量达到41g/L,转化效率只有87%(Shibasaki,Takeshi,Hideo Mori,and AkioOzaki."Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-andstereospecific hydroxylation of L-proline."Bioscience,biotechnology,andbiochemistry 64.4(2000):746-750)。为了进一步降低反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产成本,日本协和发酵公司又将密码子改造的指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟化酶基因导入到L-脯氨酸生产菌中,在以葡萄糖为底物的发酵培养基中培养99小时后反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到25g/L,发酵温度为33℃,发酵过程中L-脯氨酸最高积累量达到7.8g/L,初步实现了羟脯氨酸的从头合成(CN97117929.8和Shibasaki,Takeshi,et al."Construction of anovel hydroxyproline-producing recombinant Escherichia coli by introducing aproline 4-hydroxylase gene."Journal of bioscience and bioengineering 90.5(2000):522-525.),该文献水平为目前报道的最高水平。
然而,目前报道的具有工业应用前景的脯氨酸4-羟化酶只有来源于指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟化酶。指孢囊菌属于放线菌,是一种高GC含量的革兰氏阳性细菌,指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟化酶基因的GC含量为74%,并且含有大肠杆菌等宿主的稀有密码子。指孢囊菌的野生型脯氨酸4-羟化酶在原核生物,例如大肠杆菌中重组表达时主要以没有活性或活性很低的包涵体形式存在,经过密码子优化后的突变型脯氨酸4-羟化酶在表达量和催化性能上依然较差。目前应用来自指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟化酶在大肠杆菌中生产反式-4-羟基-L-脯氨酸时只能用33-35℃(CN97117929.8),而通常情况下在大肠杆菌中生产其他产品时一般使用大肠杆菌的最适生长温度37℃,启示指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟化酶在37℃时无法更好地生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。经过我们热稳定性检测发现指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟化酶在37℃的稳定性较差,这是导致其不能进行37℃生产的主要原因。酶的稳定性对其生产性能至关重要,一个稳定性好的酶可以显著提升生产水平。
因此,本领域急需获得稳定性好的脯氨酸4-羟化酶,从而有助于提升生物法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的水平。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种多肽在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物中的用途。
本发明的又一目的是提供一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株。
本发明的另一目的是提供一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法。
本发明的再一目的是提供一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的构建方法。
在本发明的第一方面,提供了一种多肽在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物中的用途,所述多肽是:
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能;或
(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
在另一优选例中,所述多肽是从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在两端的任意一端经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
在另一优选例中,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中,所述多肽用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
在另一优选例中,所述以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物是碳青霉烯类抗生素侧链。
本发明的第二方面,提供了一种反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产菌株,所述菌株表达以下多肽:
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能;或
(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
在另一优选例中,所述多肽是从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在两端的任意一端经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
在另一优选例中,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中,所述的生产菌株是细菌。
在另一优选例中,所述的生产菌株选自下组:大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
在另一优选例中,所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
在另一优选例中,所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高0.5倍;较佳地,提高1倍;更佳地,提高1.5倍;最佳地,提高2倍。
在另一优选例中,所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够在37℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
在另一优选例中,所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够在37℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高0.5倍;较佳地,提高1倍;更佳地,提高1.5倍;最佳地,提高2倍。
本发明的第三方面,提供了一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法,所述方法包括:
1)培养权利要求6所述的生产菌株,从而产生反式-4-羟基-L-脯氨酸;或
利用以下多肽催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸;
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能;或
(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。和
2)任选地,从1)的培养体系或催化体系中分离获得反式-4-羟基-L-脯氨酸。
在另一优选例中,所述方法能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
在一优选例中,所述方法能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高0.5倍;较佳地,提高1倍;更佳地,提高1.5倍;最佳地,提高2倍。
在另一优选例中,所述方法能够在37℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
在另一优选例中,所述方法能够在37℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高0.5倍;较佳地,提高1倍;更佳地,提高1.5倍;最佳地,提高2倍。
本发明的第四方面,提供了一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的构建方法,所述方法包括:
使得所述菌株包含表达以下多肽的表达载体或使得所述菌株的基因组中整合有表达以下多肽的基因,所述多肽是:
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能;或
(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
在另一优选例中,所述多肽是从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在两端的任意一端经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
在另一优选例中,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中,所述方法还包括:使得所述菌株还包含解除L-脯氨酸反馈抑制和/或增强谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)和/或谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehyde dehydrogenase)的活性。
在另一优选例中,所述方法还包括:使得所述菌株增强谷氨酸激酶和/或谷氨酸半醛脱氢酶的活性。
在另一优选例中,所述方法还包括:使得所述菌株过表达解除反馈抑制的谷氨酸激酶ProB74和/或谷氨酸半醛脱氢酶ProA。
在另一优选例中,所述方法还包括测定所得菌株的转化率和/或反式-4-羟基-L-脯氨酸产量。
在另一优选例中,所述的生产菌株是细菌。
在另一优选例中,所述的生产菌株选自下组:大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
在一优选例中,所述生产菌株能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
在一优选例中,所述生产菌株能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高0.5倍;较佳地,提高1倍;更佳地,提高1.5倍;最佳地,提高2倍。
在另一优选例中,所述生产菌株能够在37℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
在另一优选例中,所述生产菌株能够在37℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高0.5倍;较佳地,提高1倍;更佳地,提高1.5倍;最佳地,提高2倍。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究,出乎意料地发现一种多肽,其具有脯氨酸4-羟化酶的活性(例如其比酶活高出指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟基化酶的1.34倍),并且在≥35℃的条件下稳定(例如在37℃孵育20min和50min后分别依然保持99.5%和94.1%的活性);表达所述多肽的菌株能够在37℃生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,并且生产强度显著提高(例如提高1.67倍)。在此基础上完成了本发明。
术语定义
多肽
本文所用的术语“多肽”或“本发明多肽”或“本发明的多肽”具有相同的意义,在本文可以互换使用,均是指具有催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸活性的蛋白。大肠杆菌中天然不存在此多肽,其属于外源性蛋白。
基于现有技术的知识,本领域普通技术人员不难知晓,在多肽的某些区域,例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性,例如,适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等,Molecular Biology of The Gene,第四版,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此,本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。
因此,在具体的实施方式中,本发明的多肽可以是:(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能;或(b1)从SEQID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
在优选的实施方式中,所述多肽是从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在两端的任意一端经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
在优选的实施方式中,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在具体的实施方式中,本发明多肽表示氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质,其编码序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明中,本发明多肽包括与氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的多肽相比,有至多20个、较佳地至多10个,再佳地至多3个,更佳地至多2个,最佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的突变体。这些保守性变异的突变体可根据,例如下表所示进行氨基酸替换而产生。
本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
因此,本文所用的“含有”,“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”;“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
多肽的用途
本发明人出乎意料的发现本发明多肽具有脯氨酸4-羟化酶的活性,能够用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物。
在具体的实施方式中,所述多肽是:
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能;或
(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
在优选的实施方式中,所述多肽是从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在两端的任意一端经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
在优选的实施方式中,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在具体的实施方式中,本发明多肽表示氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质,其编码序列如SEQ ID NO:2所示。
在优选的实施方式中,所述以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物是碳青霉烯类抗生素。
生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法
本发明提供了一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法,所述方法能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且转化率和生产强度显著提高。
在具体的实施方式中,所述方法包括:
1)培养表达以下多肽的菌株,从而生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,所述多肽是:
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能;或
(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能;和
2)任选地,从1)的发酵培养体系中分离获得反式-4-羟基-L-脯氨酸。
在另一优选的实施方式中,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选的实施方式中,所述方法能够在≥35℃(例如37℃)的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
在另一优选的实施方式中,所述方法能够在≥35℃(例如37℃)的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高0.5倍;较佳地,提高1倍;更佳地,提高1.5倍;最佳地,提高2倍。
反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株
本发明人出乎意料的发现表达本发明多肽的菌株能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且转化率和生产强度显著提高。
在具体的实施方式中,所述菌株表达以下多肽:
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能;或
(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
在另一优选例中,所述多肽是从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在两端的任意一端经过一个或几个,优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
在另一优选的实施方式中,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选的实施方式中,所述生产菌株本身具有L-脯氨酸和/或反式-4-羟基-L-脯氨酸合成能力。
在另一优选例中,所述的生产菌株是细菌。
在另一优选例中,所述的生产菌株选自下组:大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
在另一优选的实施方式中,所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够在≥35℃(例如37℃)的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
在另一优选的实施方式中,所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够在≥35℃(例如37℃)的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高0.5倍;较佳地,提高1倍;更佳地,提高1.5倍;最佳地,提高2倍。
反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的构建方法
发明人出乎意料地发现通过使得所述菌株包含表达本发明多肽的表达载体或使得所述菌株的基因组中整合有表达本发明多肽的基因,可构建具有高转化率的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株。
在具体的实施方式中,所述方法还包括:使得所述菌株还包含解除L-脯氨酸反馈抑制和/或增强谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)和/或谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehyde dehydrogenase)的活性。
在另一具体的实施方式中,所述方法还包括测定所得菌株的转化率和/或反式-4-羟基-L-脯氨酸产量以验证所得菌株。
基于上文所述,本领域技术人员可以理解,本发明的高转化率反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的构建方法适用于各种菌株,只要该菌株适于产生反式-4-羟基-L-脯氨酸。
鉴于本发明的发明点以及本领域的现有技术知识,本领域技术人员还应知晓本发明的起始菌株可以是本身能产生L-脯氨酸和/或反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株,也可以是本身不产生L-脯氨酸和/或反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株,还可以是本身经改造或修饰而产生L-脯氨酸和/或反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株。
反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物
“反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物”的例子包括:碳青霉烯类抗生素侧链,包括美罗培南侧链、厄他培南侧链和帕尼培南侧链等,以及雷米普利、福森普利、N-乙酰羟脯氨酸等,但不限于以上化合物。
本发明的应用与优点:
1.本发明多肽具有脯氨酸4-羟化酶的活性,其比酶活高出指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟化酶的1.34倍;
2.本发明方法能够在37℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高1.67倍;
3.本发明构建的反式-4-羟基-L-脯氨酸高产菌株无论在表观上,还是在实质上都产生了降低企业运营成本、提升经济效益的技术效果,因而具备重大的经济意义和社会意义。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
除非另有定义,本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明,但优选本文所述的方法和材料。
实施例1.脯氨酸4-羟化酶的全基因合成及克隆表达
首先,发明人通过全基因合成了序列如SEQ ID NO:2所示的基因。随后,通过NdeI和HindIII酶切位点将全基因合成的该基因(序列如SEQ ID NO:2所示)克隆至pET21a质粒(购自Novagen公司),获得的重组质粒命名为pSWXP1,其表达的蛋白在C端带有6个his标签,再将重组质粒导入大肠杆菌Rossetta菌株(购自北京全式金生物技术有限公司),获得大肠杆菌Rossetta(pSWXP1)菌株。大肠杆菌Rossetta(pSWXP1)用于诱导表达SEQ ID NO:1所示蛋白,采用LB培养基,1%接种,加50ug/mL的氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素,37℃220rpm培养2-3h,OD长至0.6-0.8,加入0.5mM IPTG,16℃220rpm诱导表达15h。收集45mL菌体,4℃离心后MES缓冲液(pH 6.5)洗两次,重悬至5mLMES缓冲液(pH 6.5),超声破壁,4℃离心30min,上清作为粗酶液用作粗酶活测定及纯化。
实施例2.脯氨酸4-羟化酶的粗酶活测定
实施例1中制备的粗酶液,以及用相同方法制备大肠杆菌Rossetta(pET21a)空质粒对照菌株的粗酶液。利用BCA蛋白定量分析试剂盒(购自伯乐公司,货号:23227)进行粗酶液的总蛋白定量。酶活测定体系:240mM MES(pH6.5),6mM FeSO4,24mMα-酮戊二酸,8mM L-抗坏血酸,12mM L-脯氨酸及适量的粗酶,35℃反应10min后终止酶活,测定反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。反式-4-羟基-L-脯氨酸的检测方法参考国标GB/T 9695.23-2008。1个酶活力单位U定义为每分钟催化生成1nmol反式-4-羟基-L-脯氨酸所需酶量。大肠杆菌Rossetta(pSWXP1)及对照菌株的粗酶液比酶活如下表所示,说明大肠杆菌Rossetta(pSWXP1)菌株表达目标蛋白具有较高的脯氨酸4-羟化酶活性,命名为P4H-1,而对照没有检测到活性。
表1 P4H-1的粗酶活
菌株 | 比酶活(U/mg) |
大肠杆菌Rossetta(pET21a) | 未检出活性 |
大肠杆菌Rossetta(pSWXP1) | 48.2 |
实施例3.脯氨酸4-羟化酶纯化和稳定性测定
以指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟基化酶为对照比较本发明酶的性能。将文献(刘合栋,袁春伟,张震宇.脯氨酸4羟化酶在大肠杆菌中的密码子优化表达及对反式4羟脯氨酸生物合成的作用[J].生物加工过程,2014,12(6):44-51.)报道的密码子优化的指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟基化酶(命名为P4H-2)基因,通过NdeI和HindIII酶切位点将全基因合成的该基因(序列如文献所示:刘合栋.高产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵优化[D].无锡:江南大学,2013.)克隆至pET21a质粒(购自Novagen公司),获得的重组质粒命名为pSWXP2,其表达的蛋白在C端带有6个his标签,再将重组质粒导入大肠杆菌Rossetta菌株(购自北京全式金生物技术有限公司),获得大肠杆菌Rossetta(pSWXP2)菌株。按照实施例1中的相同方法制备大肠杆菌Rossetta(pSWXP1)菌株和大肠杆菌Rossetta(pSWXP2)菌株的粗酶液,采用His SpinTrap columns(购自GE公司,产品货号28-4013-53)通过组氨酸标签进行镍柱纯化,具体方法参照产品说明书。纯化所得的纯酶采用实施例2相同的方法进行酶活和蛋白浓度测定,酶的热稳定性测定通过在37℃孵育20min和50min后测定比酶活,通过与没有经过孵育的初始酶活比较计算孵育后残留的相对酶活。结果如表2所示,本发明的酶P4H-1的比酶活为272.7U/mg,而指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟基化酶P4H-2的比酶活为203.2U/mg,本发明酶的活性为指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟基化酶的1.34倍,进一步证明我们所筛选到的酶具有很高的脯氨酸4-羟化酶活性;热稳定性试验表明本发明的P4H-1的酶具有非常好的稳定性,37℃孵育20min和50min后分别依然保持99.5%和94.1%的活性,而指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟基化酶P4H-2稳定性在37℃孵育20min和50min后分别只剩55.6%和34.1%的酶活。
表2 P4H-1和P4H-2的比酶活及热稳定
本实施例说明,与现有文献报道的最好的指孢囊菌RH1来源的脯氨酸4-羟基化酶P4H-2相比,本发明的P4H-1的酶具有更高的比酶活及更好的稳定性,更加适用于工业化生产。
实施例4.以L-脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸
参照实施例1的方法诱导表达脯氨酸4-羟化酶,采用诱导表达的菌体直接以L-脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。催化体系:将诱导表达的菌收集OD600=2的菌10ml,重悬在10ml的催化体系中(80mM MES,6mM FeSO4,200mMα-酮戊二酸,6mM L-抗坏血酸,200mM脯氨酸及1%Noidet P-40),35℃200rpm催化20h,反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量如下表,结果显示能够表达脯氨酸4-羟化酶的大肠杆菌Rossetta(pSWXP1)菌株能够以L-脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
表3以L-脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸
本实施例通过全细胞催化证明,包含本发明基因的宿主细胞具有产生催化L-脯氨酸前体生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的活性。
实施例5.以葡萄糖为原料从头发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸
根据文献(Gene.1988Apr 29;64(2):199-205.Nucleotide sequence of amutation in the proB gene of Escherichia coli that confers prolineoverproduction and enhanced tolerance to osmotic stress)报道,大肠杆菌的proB(NCBI-GI:16128228)基因107位Asp突变为Asn,即ProB74突变体可以解除L-脯氨酸对ProB的反馈抑制。根据文献(Shibasaki T,Hashimoto S,Mori H等,Construction of a novelhydroxyproline-producing recombinant Escherichia coli by introducing aproline 4-hydroxylase gene.[J].J Biosci Bioeng.2000,90 5:522-525)报道,在大肠杆菌中过表达ProB74谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)、ProA谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehyde dehydrogenase)(NCBI-GI:16128229)和来源于指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟基化酶基因可以生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。因此发明人按照上述文献的相同策略,构建本发明酶的生产性能评价菌株。在一个P15A复制原点并具有四环素抗性的质粒上基础上构建了proB74(谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase))、proA(谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehyde dehydrogenase))和序列如SEQ ID NO:2基因的过表达质粒pSWXP3,pSWXP3质粒上的基因所表达的蛋白都不带有任何标签。pSWXP3质粒导入E.coliMG1655获得E.coli MG1655(pSWXP3)菌株。
E.coli MG1655(pSWXP3)菌株进行5L发酵罐测试生产性能。种子培养基为LB培养基;发酵罐培养基为起始葡萄糖(20g/L)、酵母粉(5g/L)、蛋白胨(5g/L)、磷酸二氢钾(10g/L)、氯化钠(5g/L)、柠檬酸(3g/L)、氯化铵(8g/L)、硫酸镁(0.5g/L)、硫酸亚铁(0.2g/L)、氯化钙(0.05g/L),VB1(200ug/L)。100mL的LB过夜培养的种子液,接入2L的发酵培养基,控制温度37℃,pH6.5,溶氧30%,流加葡萄糖控制葡萄糖浓度10g/L左右。OD600采用分光光度计检测,反式-4-羟基-L-脯氨酸的检测参照实施例2。E.coli MG1655(pSWXP3)菌株5L罐发酵结果如表4所示,发酵30h反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量达12.7g/L,反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产强度为0.423g/L/h。
表4 E.coli MG1655(pSWXP3)菌株5L罐发酵的产量
发酵时间(h) | OD<sub>600</sub> | 反式-4-羟基-L-脯氨酸(g/L) |
0 | 0.5 | 0.0 |
6 | 13.5 | 0.6 |
12 | 44.5 | 2.3 |
18 | 73.4 | 5.0 |
24 | 67.7 | 11.2 |
27 | 65.2 | 12.4 |
30 | 62.9 | 12.7 |
本实施例的结果可以看出,E.coli MG1655(pSWP3)菌株能够在37℃生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,从而说明本发明的脯氨酸4-羟化酶可以应用于以葡萄糖等糖类原料直接发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。由于本发明的酶在37℃具有很好的稳定性,所以应用本发明酶可以在37℃生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,发酵时间仅为30h产量就可达12.7g/L,生产强度达0.423g/L/h。与报道的最高水平发酵99小时产25g/L的生产强度0.253g/L/h(CN97117929.8)相比,应用本发明的酶的生产强度提高1.67倍。生产强度是生产成本的重要决定因素,因此本发明的脯氨酸4-羟化酶具有非常好的工业化应用前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法
<130> P2017-0936
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Leu Ser Tyr Glu Ser Ile Asp Leu Tyr Arg Glu Asp Gly Phe Leu
1 5 10 15
Phe Ala Asp Pro Leu Thr Glu Lys Glu Thr Asp Leu Leu Arg Glu Gln
20 25 30
Ala Asp Arg Glu Phe Leu Arg Asp Ser Pro Gly Arg Met Leu Glu Lys
35 40 45
Asp Gly Phe Thr Val Arg Gly Val His Gly Ser His Val Val Asn Ser
50 55 60
Thr Phe Ala Arg Leu Val Arg His Pro Lys Ile Val Thr Pro Ala Thr
65 70 75 80
Gln Leu Leu Gly Gly Pro Val Tyr Val His Gln Phe Lys Ile Asn Ala
85 90 95
Lys Lys Ala Leu Thr Gly Asp Val Trp Pro Trp His Gln Asp Tyr Ile
100 105 110
Phe Trp Asn Arg Gly Asp Gly Met Arg Arg Pro Asp Val Val Asn Val
115 120 125
Ala Val Leu Leu Asp Glu Ala Thr Asp Leu Asn Gly Pro Leu Leu Val
130 135 140
Leu Pro Gly Ser His Lys Cys Gly Ser Leu Glu Val Ala Arg Arg Thr
145 150 155 160
Thr Val Cys Gly Asp Gly Ala Trp Arg Ser Asp Ile Ser Ala Asp Leu
165 170 175
Asp Tyr Ala Ile Asp Ala Pro Leu Leu Ser Lys Leu Thr Glu Thr Thr
180 185 190
Lys Val Thr Ala Ile Lys Gly Pro Pro Gly Ser Ile Leu Leu Phe Asp
195 200 205
Pro Leu Leu Val His Ala Ser Gly Val Asn Met Ala Pro Tyr Asp Arg
210 215 220
Arg Met Ile Leu Val Thr Tyr Asn Arg Val Asp Asn Pro Leu Gly Glu
225 230 235 240
Val Pro Ser Pro Arg Pro Asp Phe Leu Ala Ala Arg Asp Asn Thr Pro
245 250 255
Val Arg Pro Leu Asp Pro Gly Ala Asp Leu Leu Ala
260 265
<210> 2
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgttgtcgt acgagagtat cgacctgtat cgcgaggacg ggttcctgtt cgcggacccc 60
cttaccgaaa aggagacaga ccttctacgc gaacaggccg atcgtgagtt tctgcgggat 120
tctcccggcc ggatgttgga gaaggacggt ttcacggtgc gcggggtgca cgggtcgcac 180
gtggtgaaca gcacgttcgc ccggctggta cggcacccaa agatcgtcac accggccacg 240
cagctactgg gtggccccgt atatgtgcac cagttcaaga tcaatgcaaa gaaggcgctg 300
accggcgatg tgtggccctg gcaccaggac tacatcttct ggaaccgggg tgacggaatg 360
cgtcgccccg acgtggtgaa cgtcgccgtc ctgctggatg aggcgaccga tctgaacggt 420
ccactgctcg tcctgcccgg ctcacacaag tgcggctctc tggaagtggc gaggcggacg 480
accgtctgtg gcgacggggc gtggcggtcc gacatctccg cagatctgga ctacgccatc 540
gacgcgccgc tgctgtccaa gctcaccgag actacaaaag tgaccgccat caaagggccg 600
cccggctcga tcctcctctt cgatcccctg ctcgtacacg cctcgggcgt gaacatggct 660
ccctacgatc ggcgcatgat cctcgtcacc tacaaccggg tggacaatcc actcggagag 720
gtgcccagcc ctcgaccgga cttcctcgcc gcccgggaca acacgccggt caggccgctc 780
gaccccggcg cggaccttct cgcctaa 807
Claims (25)
1.一种多肽在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物中的用途,其特征在于,所述多肽是:
(a1)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能;或
(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在C端带有6个his标签而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述多肽用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
4.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物是碳青霉烯类抗生素侧链。
5.一种反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产菌株,其特征在于,所述菌株表达以下多肽:
(a1)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能;或
(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在C端带有6个his标签而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
6.如权利要求5所述的生产菌株,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
7.如权利要求5所述的生产菌株,其特征在于,所述的生产菌株是细菌。
8.如权利要求5所述的生产菌株,其特征在于,所述的生产菌株选自下组:大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
9.如权利要求5所述的生产菌株,其特征在于,所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
10.如权利要求5所述的生产菌株,其特征在于,所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高0.5倍。
11.如权利要求5所述的生产菌株,其特征在于,所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高1倍。
12.如权利要求5所述的生产菌株,其特征在于,所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高1.5倍。
13.如权利要求5所述的生产菌株,其特征在于,所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高2倍。
14.如权利要求5所述的生产菌株,其特征在于,所述反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株能够在37℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
15.一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法,其特征在于,所述方法包括:
1)培养权利要求5所述的生产菌株,从而产生反式-4-羟基-L-脯氨酸;或
利用以下多肽催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸;
(a1)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能;或
(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在C端带有6个his标签而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能,
和
2)任选地,从1)的培养体系或催化体系中分离获得反式-4-羟基-L-脯氨酸。
16.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述方法能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
17.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述方法能够在≥35℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸,且生产强度提高1倍。
18.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述方法能够在37℃的条件下生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
19.一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的构建方法,所述方法包括:
使得所述菌株包含表达以下多肽的表达载体或使得所述菌株的基因组中整合有表达以下多肽的基因,所述多肽是:
(a1)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能;或
(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在C端带有6个his标签而形成,并且具有(a1)所述多肽的功能。
20.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
21.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:使得所述菌株还包含解除L-脯氨酸反馈抑制和/或增强谷氨酸-5-激酶和/或谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehyde dehydrogenase)的活性。
22.如权利要求19所述的方法,其特征在于,使得所述菌株增强谷氨酸-5-激酶和/或谷氨酸半醛脱氢酶的活性。
23.如权利要求19所述的方法,其特征在于,使得所述菌株过表达解除反馈抑制的谷氨酸-5-激酶ProB74和/或谷氨酸半醛脱氢酶ProA。
24.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述的生产菌株是细菌。
25.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述的生产菌株选自下组:大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
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Enzymatic production of trans-4-Hydroxy-L-proline by Regio- and Stereospecific Hydroxylation of L-Proline;Takeshi SHIBASAKI;《Biosci.Biotechnol.Biochem》;20001231;第64卷(第4期);第746-750页 * |
Phytanoyl-CoA dioxygenase;WP_015068683;《Genbank》;20151222;全文 * |
UniProtKB-A0A173G619;UniProt;《UniProt》;20160907;全文 * |
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Publication number | Publication date |
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CN107674863A (zh) | 2018-02-09 |
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