CN107674864B

CN107674864B - 一种生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的方法

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Publication number: CN107674864B
Application number: CN201710707917.9A
Authority: CN
Inventors: 孙际宾; 刘娇; 郑平; 王兴初; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-08-17
Filing date: 2017-08-17
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2037-08-17
Also published as: CN107674864A

Abstract

本发明公开了一种脯氨酸4‑羟化酶及其应用。具体地，本发明提供了一种多肽在生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸或以反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸为前体的下游产物中的用途，所述多肽是：(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽，并且具有催化L‑脯氨酸生成反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的功能；或(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成，并且具有(a1)所述多肽的功能。本发明还提供了表达所述多肽的反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸生产菌株及其构建方法，以及生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的方法。

Description

一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及具有脯氨酸4-羟化酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因和包含该酶或其编码基因的基因工程菌以及它们在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸(简称羟脯氨酸),是一种具有独特生理活性的氨基酸,易溶于水，广泛应用于医药、化工、动物饲料和美容业等领域，市场前景广阔，由于价格昂贵羟脯氨酸目前主要用于合成碳青霉烯类抗生素(美罗培南等)的侧链。碳青霉烯类是第三代抗生素，是抗菌谱最广的一类非典型β-内酰胺类抗生素，具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，全球总体市场已超过了30亿美元。

反式-4-羟基-L-脯氨酸可以通过脯氨酸4-羟化酶催化L-脯氨酸羟基化来生产，目前用于生产L-脯氨酸等氨基酸的工程菌主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(E.coli)等，但是这些菌都没有编码脯氨酸4-羟化酶的基因。因此，挖掘能够在L-脯氨酸生产菌中表达并具有高效催化活性的脯氨酸4-羟化酶是实现反式-4-羟基-L-脯氨酸工业生产的关键。

日本协和发酵公司通过筛选得到一株脯氨酸4-羟化酶酶活最高的指孢囊菌，并命名为指孢囊菌RH1，测序获得脯氨酸4-羟化酶基因序列(CN96190335)；该脯氨酸4-羟化酶在大肠杆菌中异源表达主要形成包涵体，进行密码子优化后置于一个强启动子的调控下，导入到大肠杆菌中，添加外源L-脯氨酸，在发酵罐中转化100h后，反式-4-羟基-L-脯氨酸的积累量达到41g/L，转化效率只有87％(Shibasaki,Takeshi,Hideo Mori,and Akio Ozaki."Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-and stereospecifichydroxylation of L-proline."Bioscience,biotechnology,and biochemistry 64.4(2000):746-750)。为了进一步降低反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产成本，日本协和发酵公司又将密码子改造的指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟化酶基因导入到L-脯氨酸生产菌中，在以葡萄糖为底物的发酵培养基中培养99h后反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到25g/L，发酵温度为33℃，发酵过程L-脯氨酸最高积累量达到7.8g/L，初步实现了反式-4-羟基-L-脯氨酸的从头合成(CN97117929.8和Shibasaki,Takeshi,et al."Construction of a novelhydroxyproline-producing recombinant Escherichia coli by introducing aproline 4-hydroxylase gene."Journal of bioscience and bioengineering 90.5(2000):522-525.)，该文献水平为目前报道的最高水平。

然而，目前报道的具有工业应用前景的脯氨酸4-羟化酶只有来源于指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟化酶。指孢囊菌属于放线菌，是一种高GC含量的革兰氏阳性细菌，指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟化酶基因的GC含量为74％，并且含有大肠杆菌的稀有密码子。因此，指孢囊菌的野生型脯氨酸4-羟化酶在原核生物，例如大肠杆菌中重组表达时主要以没有活性或活性很低的包涵体形式存在，经过密码子优化后的突变型脯氨酸4-羟化酶在表达量和催化性能上依然较差。

因此，本领域急需能够在反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中高效表达且具有高催化性能的新型脯氨酸4-羟化酶，从而有助于提升生物法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的水平。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型脯氨酸4-羟化酶，该新型脯氨酸4-羟化酶能够在反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中高效表达且有助于提升生物法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量水平。

本发明的第一方面，提供了一种多肽在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物中的用途，所述多肽是：

(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽，并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能；或

(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成，并且具有(a1)所述多肽的功能。

在另一优选例中，所述多肽是从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽，由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在两端的任意一端经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成，并且具有(a1)所述多肽的功能。

在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性的任一多肽序列。

在另一优选例中，所述多肽具有脯氨酸-4-羟化酶活性，粗酶比酶活为≥50U/mg，较佳地为≥60U/mg，更佳地为≥75U/mg。

在另一优选例中，所述脯氨酸4-羟化酶纯酶比酶活为≥80U/mg，较佳地为≥100U/mg，更佳地为≥150U/mg，最佳地为≥200U/mg。

在另一优选例中，所述多肽用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。

在另一优选例中，所述以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物是碳青霉烯类抗生素侧链。

本发明的第二方面，提供了一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株，所述菌株表达以下多肽：

在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述的生产菌株是细菌。

在另一优选例中，所述的生产菌株选自下组：大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

在另一优选例中，所述的生产菌株为解除谷氨酸激酶的L-脯氨酸的反馈抑制的菌株(例如proB74突变体)。

在另一优选例中，所述的生产菌株为增强谷氨酸激酶和/或谷氨酸半醛脱氢酶的活性的菌株。

在另一优选例中，所述的生产菌株为过表达ProB74谷氨酸激酶和/或ProA谷氨酸半醛脱氢酶的菌株。

在另一优选例中，所述的生产菌株为E.coli MG1655(pSWP2)菌株。

在另一优选例中，所述的生产菌株发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，30h产量≥10g/L，较佳地≥20g/L，更佳地≥30g/L，最佳地≥35g/L。

在另一优选例中，所述的生产菌株是细菌或真菌；优选地，所述的生产菌株选自下组：大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

在另一优选例中，所述生产菌株为解除谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)的L-脯氨酸的反馈抑制的菌株(例如proB74突变体)。

本发明的第三方面，提供了一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，所述方法包括：

1)培养权利要求6所述的生产菌株，从而产生反式-4-羟基-L-脯氨酸；或

利用以下多肽催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸；

(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成，并且具有(a1)所述多肽的功能，和

2)任选地，从1)的培养体系或催化体系中分离获得反式-4-羟基-L-脯氨酸。

在另一优选例中，所述方法能够提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。

在另一优选例中，所述的方法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，产量提高20-500％。

在另一优选例中，所述的方法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，产量提高20％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、400％或500％。

在另一优选例中，所述的方法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，30h产量≥10g/L，较佳地≥20g/L，更佳地≥30g/L，最佳地≥35g/L。

本发明的第四方面，提供了一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的构建方法，所述方法包括：

使得所述菌株包含表达以下多肽的表达载体或使得所述菌株的基因组中整合有表达以下多肽的基因，所述多肽是：

在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述方法还包括：使得所述菌株解除谷氨酸激酶的L-脯氨酸的反馈抑制。

在另一优选例中，所述方法还包括：使得所述菌株增强谷氨酸激酶和/或谷氨酸半醛脱氢酶的活性。

在另一优选例中，所述方法还包括：使得所述菌株过表达ProB74谷氨酸激酶和/或ProA谷氨酸半醛脱氢酶。

在另一优选例中，所述方法还包括测定所得菌株的转化率和/或反式-4-羟基-L-脯氨酸产量。

在另一优选例中，所述的生产菌株是细菌。

在另一优选例中，所述基因的序列选自下组：

(i)SEQ ID NO:2所示的序列；

(ii)与(i)限定的序列互补的多核苷酸；或

(iii)与(i)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。

在另一优选例中，所述基因构建在表达载体上。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1脯氨酸4-羟化酶的可溶性表达及纯酶1:可溶性表达；2:纯酶。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现一种多肽，其具有脯氨酸4-羟化酶的活性，在大肠杆菌中可实现很好的可溶性表达；本发明脯氨酸4-羟化酶粗酶的比酶活>75U/mg(例如75.8U/mg)，纯酶的比酶活>210U/mg(例如212.69U/mg)；表达本发明多肽的菌株(例如大肠杆菌Rossetta(pSWP1))能够以L-脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸；表达本发明多肽的菌株(例如E.coli MG1655(pSWP2)菌株，其过表达ProB74谷氨酸激酶、ProA谷氨酸半醛脱氢酶)可以葡萄糖等糖类原料直接发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，发酵(5L发酵罐)30h反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量达35.1g/L，与报道的最高水平发酵99h产25g/L(CN97117929.8)相比，发酵时间大大缩短(例如缩短了69h)，产量显著提高(例如提高了1.4倍)。在此基础上，完成了本发明。

术语定义

本文所用的术语“多肽”或“本发明多肽”或“本发明的多肽”或“脯氨酸4-羟化酶”具有相同的意义，在本文可以互换使用，均是指具有催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸活性的蛋白。大肠杆菌中天然不存在此多肽，其属于外源性蛋白。

基于现有技术的知识，本领域普通技术人员不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。

因此，在具体的实施方式中，本发明的多肽可以是：(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽，并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能；或(b1)从SEQID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成，并且具有(a1)所述多肽的功能。

在优选的实施方式中，所述多肽是从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽，由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在两端的任意一端经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成，并且具有(a1)所述多肽的功能。

在优选的实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在具体的实施方式中，本发明多肽表示氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质，其编码序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明中，本发明多肽包括与氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的多肽相比，有至多20个、较佳地至多10个，再佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的突变体。这些保守性变异的突变体可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。

初始残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是80％以上，优选90％以上，更优选95％-98％，最优选99％以上。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

多肽的用途

本发明人出乎意料的发现本发明多肽具有脯氨酸4-羟化酶的活性(粗酶的比酶活≥50U/mg，纯酶的比酶活≥80U/mg)，能够用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物。

在具体的实施方式中，所述多肽是：

在优选的实施方式中，所述以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物是碳青霉烯类抗生素侧链。

反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株

本发明人出乎意料的发现表达本发明多肽的菌株生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，发酵时间大大缩短(例如缩短了69h)，产量显著提高(例如提高了1.4倍)。

在具体的实施方式中，所述菌株表达以下多肽：

在另一优选的实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选的实施方式中，所述生产菌株本身具有L-脯氨酸和/或反式-4-羟基-L-脯氨酸合成能力。

在另一优选例中，所述的生产菌株是细菌。

在另一优选的实施方式中，所述的生产菌株选自下组：大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

在另一优选的实施方式中，所述的生产菌株为解除谷氨酸激酶的L-脯氨酸的反馈抑制的菌株(例如proB74突变体)。

典型地，所述的生产菌株为E.coli MG1655(pSWP2)菌株。

典型地，所述的生产菌株发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，30h产量高达35.1g/L。

生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法

本发明提供了一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，所述方法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，时间大大缩短(例如缩短了69h)，产量显著提高(例如提高了1.4倍)。

在具体的实施方式中，所述方法包括：

1)培养本发明的生产菌株，从而生产反式-4-羟基-L-脯氨酸；

2)任选地，从1)的培养体系中分离获得反式-4-羟基-L-脯氨酸。

在具体的实施方式中，所述的方法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，产量提高20-500％。

在具体的实施方式中，所述的方法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，30h产量≥10g/L。

反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的构建方法

发明人出乎意料地发现通过使得所述菌株包含表达本发明多肽的表达载体或使得所述菌株的基因组中整合有表达本发明多肽的基因，可构建具有高转化率的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株。

在具体的实施方式中，所述方法还包括：使得所述菌株解除谷氨酸激酶的L-脯氨酸的反馈抑制，例如proB74突变体。

在另一具体的实施方式中，所述方法还包括：使得所述菌株增强谷氨酸激酶和/或谷氨酸半醛脱氢酶的活性，例如过表达proB74谷氨酸激酶和/或proA谷氨酸半醛脱氢酶。

在另一具体的实施方式中，所述方法还包括测定所得菌株的转化率和/或反式-4-羟基-L-脯氨酸产量以验证所得菌株。

反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物

“反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物”例如包含：碳青霉烯类抗生素侧链，包括美罗培南侧链、厄他培南侧链和帕尼培南侧链等，以及雷米普利、福森普利、N-乙酰羟脯氨酸等，但不限于以上化合物。

本发明的应用与优点：

1.本发明多肽具有脯氨酸4-羟化酶的活性，可以在大肠杆菌中高效可溶性表达；

2.应用本发明的多肽进行反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产，与现有技术相比，发酵时间大大缩短(例如缩短了69h)，产量显著提高(例如提高了1.4倍)。

3.本发明构建的反式-4-羟基-L-脯氨酸高产菌株无论在表观上，还是在实质上都产生了降低企业运营成本、提升经济效益的技术效果，因而具备重大的经济意义和社会意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1.脯氨酸4-羟化酶的全基因合成及克隆表达

首先，发明人通过全基因合成了序列如SEQ ID NO:2所示的基因。随后，通过NdeI和HindIII酶切位点将全基因合成的该基因(序列如SEQ ID NO:2所示)克隆至pET21a质粒(购自Novagen公司)，获得的重组质粒命名为pSWP1，其表达的蛋白在C端带有6个his标签，再将重组质粒导入大肠杆菌Rossetta菌株(购自北京全式金生物技术有限公司)，获得大肠杆菌Rossetta(pSWP1)菌株。大肠杆菌Rossetta(pSWP1)用于诱导表达序列SEQ ID NO:1所示蛋白，采用LB培养基，1％接种，加50ug/mL的氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素，37℃220rpm培养2-3h，OD₆₀₀长至0.6-0.8，加入0.5mM IPTG，16℃220rpm诱导表达15h。收集45mL菌体，4℃离心后MES缓冲液(pH 6.5)洗两次，重悬至5mLMES缓冲液(pH 6.5)，超声破壁，4℃离心30min上清进行SDS-PAGE电泳，检测脯氨酸4-羟化酶的可溶性表达情况,其余部分上清作为粗酶液用作粗酶活测定。SDS-PAGE电泳结果如图1所示，其显示上清中有明显的约30KD的目标蛋白，说明克隆的脯氨酸4-羟化酶基因可以直接在大肠杆菌中实现很好的可溶性表达。

实施例2.脯氨酸4-羟化酶的粗酶活测定

实施例1中制备的粗酶液，以及用相同方法制备大肠杆菌Rossetta(pET21a)空质粒对照菌株的粗酶液。利用BCA蛋白定量分析试剂盒(购自伯乐公司，货号：23227)进行粗酶液的总蛋白定量。酶活测定体系：240mM MES(pH6.5)，6mM FeSO₄，24mMα-酮戊二酸，8mM L-抗坏血酸，12mM L-脯氨酸及适量的粗酶，35℃反应10min后终止酶活，测定反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。反式-4-羟基-L-脯氨酸的检测方法参考国标GB/T 9695.23-2008。1个酶活力单位U定义为每分钟催化生成1nmol反式-4-羟基-L-脯氨酸所需酶量。大肠杆菌Rossetta(pSWP1)及对照菌株的粗酶液比酶活如下表所示，说明大肠杆菌Rossetta(pSWP1)菌株表达目标蛋白具有较高的脯氨酸4-羟化酶活性，而对照没有检测到活性。

表1脯氨酸-4-羟基化酶的粗酶活

菌株	比酶活(U/mg)
		大肠杆菌Rossetta(pET21a)	未检出活性
大肠杆菌Rossetta(pSWP1)	75.8

实施例3.脯氨酸4-羟化酶纯化及酶活测定

实施例1中制备的粗酶液，采用His SpinTrap columns(购自GE公司，产品货号28-4013-53)通过组氨酸标签进行镍柱纯化，具体方法参照产品说明书，纯化后的酶进行SDS-PAGE电泳检测(如图1所示)证明为纯度较高的目标蛋白，将其定义为纯酶。纯化所得的纯酶采用实施例2相同的方法进行酶活和蛋白浓度测定，结果显示纯酶的比酶活为212.69U/mg，进一步证明我们所筛选到的酶具有很高的脯氨酸4-羟化酶活性。

实施例4.以L-脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸

参照实施例1的方法诱导表达脯氨酸4-羟化酶，采用诱导表达的菌体直接以L-脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。催化体系：将诱导表达的菌收集OD＝2的菌10ml，重悬在10ml的催化体系中(80mM MES，6mMFeSO₄，200mMα-酮戊二酸，6mM L-抗坏血酸，200mM脯氨酸及1％NoidetP-40)，35℃200rpm催化20h，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量如下表，结果显示能够表达脯氨酸4-羟化酶的大肠杆菌Rossetta(pSWP1)菌株能够以L-脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。

表2以L-脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸

本实施例通过全细胞催化证明，能够表达本发明多肽的宿主细胞具有产生催化L-脯氨酸前体生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的活性。

实施例5.以葡萄糖为原料从头发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸

根据文献(Gene.1988Apr 29；64(2):199-205.Nucleotide sequence of amutation in the proB gene of Escherichia coli that confers prolineoverproduction and enhanced tolerance to osmotic stress)报道，大肠杆菌的ProB(NCBI-GI:16128228)的107位Asp突变为Asn，即ProB74突变体可以解除L-脯氨酸对ProB的反馈抑制。根据文献(Shibasaki T,Hashimoto S,Mori H等,Construction of a novelhydroxyproline-producing recombinant Escherichia coli by introducing aproline4-hydroxylase gene.[J].J Biosci Bioeng.2000,90 5:522-525)报道，在大肠杆菌中过表达proB74谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)、proA谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehyde dehydrogenase)(NCBI-GI:16128229)和来源于指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟基化酶基因可以生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。因此发明人按照上述文献的相同策略，在一个P15A复制原点并具有四环素抗性的质粒上基础上构建了proB74(谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase))、proA(谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehydedehydrogenase))和序列如SEQ ID NO:2基因的过表达质粒pSWP2，pSWP2质粒上的基因所表达的蛋白都不带有任何标签。pSWP2质粒导入E.coli MG1655获得E.coli MG1655(pSWP2)菌株。

E.coli MG1655(pSWP2)菌株进行5L发酵罐测试生产性能。种子培养基为LB培养基；发酵罐培养基为起始葡萄糖(20g/L)、酵母粉(5g/L)、蛋白胨(5g/L)、磷酸二氢钾(10g/L)、氯化钠(5g/L)、柠檬酸(3g/L)、氯化铵(8g/L)、硫酸镁(0.5g/L)、硫酸亚铁(0.2g/L)、氯化钙(0.05g/L)，VB1(200ug/L)。100mL的LB过夜培养的种子液，接入2L的发酵培养基，控制温度33℃，pH6.5，溶氧30％，流加葡萄糖控制葡萄糖浓度10g/L左右。OD₆₀₀采用分光光度计检测，反式-4-羟基-L-脯氨酸的检测参照实施例2。E.coli MG1655(pSWP2)菌株5L罐发酵结果如表2所示，发酵30h反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量达35.1g/L。

表3E.coli MG1655(pSWP2)菌株5L罐发酵的产量

从上表所示的结果可以看出，E.coli MG1655(pSWP2)菌株能够生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，从而说明本发明的脯氨酸4-羟化酶可以应用于以葡萄糖等糖类原料直接发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。而且应用本发明的脯氨酸4-羟化酶进行反式-4-羟基-L-脯氨酸生产可以实现发酵30h产量达35.1g/L，与报道的最高水平发酵99h产25g/L(CN97117929.8)相比，发酵时间缩短69h，产量提高1.4倍。因此，本发明的脯氨酸4-羟化酶具有非常好的工业化应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法

<130> P2017-0935

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ile Asp Val Asp Leu Ile Val Asn Gln Ile Gln Glu Asn Gly Phe

1 5 10 15

Cys Val Val Lys Asn Val Ile Ser His Asn Lys Ile Ile Glu Ile Asn

20 25 30

Lys Cys Val Glu Arg Leu Ser Val Glu Arg Ser Glu Gly Val Thr Phe

35 40 45

Glu Lys Asp Gly Lys Ser Ile Arg Ala Ile His Gly Leu His Leu Asn

50 55 60

Glu Ser Leu Phe Glu Glu Leu Phe Cys Glu Lys Ser Phe Leu Asp Ile

65 70 75 80

Thr Gln Ser Phe Leu Asn Ser Gly Cys Tyr Val His Gln Ser Lys Leu

85 90 95

Asn Phe Lys Lys Ala Met Thr Gly Glu Ala Trp Pro Trp His Gln Asp

100 105 110

Phe Ile Phe Trp Lys Asn Gly Asp Gly Ile Glu Gln Pro Lys Leu Leu

115 120 125

Asn Val Ala Ile Phe Leu Ser Asp Val Glu Met Leu His Gly Pro Leu

130 135 140

Cys Phe Ile Pro Lys Ser His Lys Phe Gly Asn Leu Cys Glu Arg Tyr

145 150 155 160

Val Ser Glu Thr Asp Trp Glu His Asp Leu Ala Asn Asn Leu Ser Tyr

165 170 175

Gln Ile Asn Ser Asp Val Leu Lys Ser Leu Ile Lys Glu Asn Glu Val

180 185 190

Ser Phe Ile Thr Gly Ser Ala Gly Asp Ile Val Phe Phe Asp Ser Leu

195 200 205

Val Ala His Ser Ser Thr Gly Asn Leu Ser Pro Phe Asp Arg Pro Ile

210 215 220

Leu Ile Val Thr Tyr Asn Ser Val Cys Asn Leu Pro Lys Pro Ser Leu

225 230 235 240

Gly Lys Asn Arg Pro Glu Phe Leu Cys Ala His Glu Thr Arg Pro Leu

245 250 255

Leu Ser Ser Asn

260

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgattgatg tagatttgat tgtgaatcag attcaagaaa acggcttctg tgtcgtgaag 60

aatgtaatta gtcacaataa aattattgaa attaataagt gtgtagaaag actgagtgtg 120

gagcgttcag agggtgtgac tttcgaaaaa gacggtaaat caattcgggc aattcatggt 180

ctgcatttga atgagtcgct gtttgaagag ctcttctgcg aaaaatcgtt tctggatatt 240

actcagtcat ttttaaatag cggttgctat gttcatcagt ccaaactcaa ttttaaaaaa 300

gccatgactg gtgaagcatg gccttggcac caagatttca ttttctggaa aaatggtgat 360

ggcatcgagc aaccaaaatt gttgaacgtc gccatattcc tctctgacgt tgaaatgctg 420

catggaccat tgtgttttat acctaaaagt cacaagtttg gaaatctatg tgaacgatat 480

gtaagtgaaa cggattggga acacgatctt gccaacaacc ttagctatca gataaatagt 540

gacgtgttaa aatcgttgat aaaagaaaat gaagtaagtt ttattacggg ttcggccggc 600

gatattgttt tttttgattc cttggtagcg cacagctcaa caggtaactt atcaccattt 660

gacagaccaa ttctaattgt aacctacaat tctgtctgca atcttcccaa accatcccta 720

ggtaaaaaca ggccagaatt tttgtgtgcg catgaaacgc gaccgttgtt gagctcaaat 780

taa 783

Claims

1.一种多肽在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物中的用途，其特征在于，所述多肽是：

(a1)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽，并且具有催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的功能；或

(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽，由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在C端带有6个his标签而形成，并且具有(a1)所述多肽的功能。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多肽具有脯氨酸-4-羟化酶活性，粗酶比酶活为≥50U/mg。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脯氨酸4-羟化酶纯酶比酶活为≥80U/mg。

5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述多肽用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。

6.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物是碳青霉烯类抗生素侧链。

7.一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株表达以下多肽：

8.如权利要求7所述的生产菌株，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

9.如权利要求7所述的生产菌株，其特征在于，所述的生产菌株是细菌或真菌。

10.如权利要求7所述的生产菌株，其特征在于，所述的生产菌株选自下组：大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

11.如权利要求7所述的生产菌株，其特征在于，所述生产菌株为解除谷氨酸-5-激酶的L-脯氨酸的反馈抑制的菌株。

12.如权利要求7所述的生产菌株，其特征在于，所述的生产菌株为增强谷氨酸-5-激酶和/或谷氨酸半醛脱氢酶的活性的菌株。

13.如权利要求7所述的生产菌株，其特征在于，所述的生产菌株为过表达ProB74谷氨酸-5-激酶和/或ProA谷氨酸半醛脱氢酶的菌株。

14.如权利要求7所述的生产菌株，其特征在于，所述的生产菌株为转染了pSWP2质粒的E.coli MG1655菌株。

15.如权利要求7所述的生产菌株，其特征在于，所述的生产菌株发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，30h产量≥20g/L。

16.一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)培养权利要求7所述的生产菌株，从而产生反式-4-羟基-L-脯氨酸；或

利用以下多肽催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸；

(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽，由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在C端带有6个his标签而形成，并且具有(a1)所述多肽的功能，和

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的方法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，产量提高20-500％。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的方法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，30h产量≥10g/L。

19.一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述基因的序列选自下组：

(i)SEQ ID NO:2所示的序列；

或

(ii)SEQ ID NO:2的简并序列。

22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述基因构建在表达载体上。