CN111733152A - 一种表达酪氨酸酚裂解酶活性包涵体的大肠杆菌及其应用 - Google Patents

一种表达酪氨酸酚裂解酶活性包涵体的大肠杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达酪氨酸酚裂解酶活性包涵体的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明以大肠杆菌BL21作为宿主，表达重组质粒pET‑28(a)‑TPL及9个分别与酪氨酸酚裂解酶羧基端融合的功能性短肽，得到了生产L‑DOPA的重组大肠杆菌，利用获得的重组菌全细胞转化生产L‑DOPA，其中菌株TPL‑ELP10,TPL‑EAK16,TPL‑18A,TPL‑GFIL16全细胞反应的L‑DOPA产量分别为37.8±1.5g/L,53.8±2.1g/L,37.5±0.5g/L,29.1±1.9g/L,相比于对照菌株分别提高111％,201％,109％,62.6％。

Description

一种表达酪氨酸酚裂解酶活性包涵体的大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种表达酪氨酸酚裂解酶活性包涵体的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技 术领域。
背景技术
左旋多巴(L-DOPA)是氨基酸的一种衍生物，也是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生 化代谢途径过程中的重要中间产物，又称3,4-二羟基苯基丙氨酸，是一种重要的活性物质。 L-DOPA是新型的生化药品，在食品、医药和保健品等领域都具有广泛应用。L-DOPA的衍生 物——多巴胺是一种重要的神经递质，由于多巴胺不能透过血脑屏障进入脑组织，所以不能 通过补充多巴胺来治疗帕金森氏病，而L-DOPA可以通过血脑屏障，并在脑组织中脱羧形成 多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加而达到治疗的目的。
Birkmayser于1961年用L-DOPA治疗帕金森氏病获得明显疗效。L-DOPA及复方L-DOPA (如美多芭)已成为治疗常见老年病——帕金森氏病的主要药物。L-DOPA还可用来治疗弱 视；利用酪氨酸酶将L-酪氨酸转化，经L-DOPA形成黑色素，可用于毛发染色；此外，人们 还发现L-DOPA有抗衰老的功效。基于L-DOPA在医药卫生、保健美容等诸多领域的显著功效，L-DOPA的生产很早就被人们所关注。
L-DOPA在自然界中主要存在于蚕豆、毛豆等植物中，提取法中免去了与手性异构体 D-DOPA的拆分工艺，并且L-DOPA的提取得率也相应得到了一些提高，但由于受到原料来源少、产量低的限制，因而生产成本高，从植物中提取L-DOPA难以大规模生产，远不能满 足市场需求。化学合成法虽然被广泛应用于L-DOPA的商业化生产，但化学合成过程中需要 大量的铅等金属作为催化剂，并且过程繁杂，产物的转化效率和对映选择性均较低，同时具有成本高、环境污染严重等问题。以酪氨酸酶、对羟基苯乙酸酯3-羟化酶和酪氨酸酚裂解酶为主要生物催化剂的酶转化法能够有效克服化学法带来的环境问题，上述酶法转化合成L-DOPA的路线中以酪氨酸酚裂解酶活性最高，最接近工业化应用，但当反应底物之一邻苯二酚浓度高于0.1M时，其对酪氨酸酚裂解酶活性具有抑制作用，对细胞也具有一定的毒性，目前主要采用底物流加补料策略，因此，解除邻苯二酚的抑制作用和毒性是实现酪氨酸酚裂 解酶酶法制备L-DOPA产业化的关键。
大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，它作为一种模式微生物已经应用于诸多氨基酸的工业化 发酵生产中，如谷氨酸、缬氨酸等。近年来学者们开始研究利用大肠杆菌全细胞转化法生产 非氨基酸物质。大肠杆菌具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌体污染的概率较 低等优点，因此它在生物技术领域发挥着重要作用。在大肠状杆菌中因为不存在酪氨酸酚裂 解酶，不存在通过丙酮酸钠、邻苯二酚和铵盐为底物合成L-DOPA的途径。因此，提供一种 能够高效表达外源酪氨酸酚裂解酶基因的大肠杆菌，对于左旋多巴的生产应用具有重要的意 义。
发明内容
本发明通过同源臂重组方法将合成的短肽基因无缝克隆至酪氨酸酚裂解酶的羧基端，再 在大肠杆菌中表达融合功能性短肽的酪氨酸酚裂解酶，在不影响大肠杆菌生长情况的同时提 高了其全细胞反应L-DOPA的合成量。
本发明的第一个目的是提供融合功能短肽的酪氨酸酚裂解酶；所述酪氨酸酚裂解酶的C 端融合SEQ ID NO.1～9任一所示的短肽。
在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶为如下(a)或(b)：
(a)由SEQ ID NO.10所示的氨基酸组成的蛋白质，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酪氨酸酚 裂解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
在一种实施方式中，所述的表达酪氨酸酚裂解酶的基因来源于柠檬酸杆菌。
本发明的第二个目的是提供融合功能短肽的酪氨酸酚裂解酶的编码基因。
本发明的第三个目的是提供连接有所述基因的表达载体。
在一种实施方式中，所述表达载体是在pET系列载体上连接编码所述融合功能短肽的酪 氨酸酚裂解酶的基因。
本发明的第四个目的是提供一种重组大肠杆菌，含有所述表达载体。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是将融合功能性短肽的酪氨酸酚裂解酶基因连接 至质粒pET-28(a)+上，再转化至大肠杆菌细胞中，以启动子T7控制酪氨酸酚裂解酶基因的表 达。
本发明的第五个目的是提供构建所述重组大肠杆菌的方法，具体方法如下:
(1)以连接有酪氨酸酚裂解酶基因的表达载体pET-28(a)-TPL为基础，质粒 pET-28(a)-TPL的构建参考公开号为CN109897845A的专利申请，利用同源臂重组方法将SEQ IDNO.11～19所示的短肽基因分别无缝克隆至酪氨酸酚裂解酶的羧基端，获得重组表达载体；(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入宿主菌大肠杆菌BL21，最终得到生产L-DOPA的 大肠杆菌。
本发明的第六个目的是提供一种细胞催化剂，含有前述构建的重组大肠杆菌。
在一种实施方式中，所述细胞催化剂还含有细胞保护剂。
本发明的第七个目的是提供一种全细胞转化生产L-DOPA的方法，所述方法以丙酮酸钠 和邻苯二酚为底物，利用所述细胞催化剂或所述重组大肠杆菌细胞进行发酵生产。
在一种实施方式中，所述发酵是先在35-38℃下发酵2-4h，再加入诱导剂0.2-0.5mM的 IPTG并降温至20-25℃，继续发酵10-12h。
在一种实施方式中，所述的发酵培养基含有酵母粉22-26g/L，蛋白胨10-15g/L，甘油 4-6g/L，KH2PO4 2-4g/L，K2HPO4 12-14g/L。
在一种实施方式中，所述全细胞转化液含有丙酮酸钠15-18g/L，邻苯二酚8-10g/L，乙 酸铵25-30g/L，Na2SO3 2-4g/L，EDTA 1-2g/L，5-磷酸吡哆醛30-50μM，氨水调节pH为8.0-8.5。
在一种实施方式中，所述转化反应条件为15-20℃，180-200rpm，避光，反应0-5h丙酮 酸钠的补加速率14g/L/h，邻苯二酚在反应0-2h、2-4h、4-5h三个阶段的补加速率分别为12-14g/L/h、6-8g/L/h、3-4g/L/h。
本发明的第八个目的是提供一种生产酪氨酸酚裂解酶活性包涵体的方法，是先在35-38℃ 下发酵2-4h，再加入诱导剂0.2-0.5mM的IPTG并降温至20-25℃，继续发酵10-14h，获得 含酪氨酸酚裂解酶的活性包涵体。
在本发明的一种实施方式中，所述的发酵培养基含有酵母粉22-26g/L，蛋白胨10-15g/L， 甘油4-6g/L，KH2PO4 2-4g/L，K2HPO4 12-14g/L。
本发明还要求保护所述重组大肠杆菌在制备含左旋多巴的产品方面的应用。
有益效果：本发明通过在酪氨酸酚裂解酶的羧基端融合功能性短肽，在不影响细胞生长 的情况下，能够改变蛋白的形态，有助于形成包涵体。
此外，本发明提供的重组大肠杆菌可实现L-DOPA的胞外积累，经20℃避光反应8h其 浓度最高可达54.9g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L-DOPA奠定了基础。本发明 提供的重组大肠杆菌构建方法简单，操作简便，具有很好地应用前景。
附图说明
图1为融合功能性短肽的酪氨酸酚裂解酶。
图2为不同菌株胞内蛋白表达的SDS-PAGE，其中，A图中，泳道1、2分别为菌株TPL胞内上清和沉淀中的蛋白表达；泳道3、4分别为菌株TPL-ELK16胞内上清和沉淀中的蛋白表达；泳道5、6分别为菌株TPL-DLK6胞内上清和沉淀中的蛋白表达；泳道7、8分别为菌 株TPL-L6KD胞内上清和沉淀中的蛋白表达；泳道9、10分别为菌株TPL-ELP10胞内上清 和沉淀中的蛋白表达；B图中，泳道11、12分别为菌株TPL-ELP20胞内上清和沉淀中的蛋 白表达；泳道13、14分别为菌株TPL-L6K2胞内上清和沉淀中的蛋白表达；泳道15、16分 别为菌株TPL-EAK16胞内上清和沉淀中的蛋白表达；泳道17、18分别为菌株TPL-18A胞内 上清和沉淀中的蛋白表达，泳道19、20分别为菌株TPL-GFIL16胞内上清和沉淀中的蛋白表 达；5、6分别为含有质粒pET-28(a)-TPL(18A-TPL)菌株表达的胞内上清蛋白和纯化的酪氨 酸酚裂解酶。
图3为表达酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌生长状况。
图4为pH对酪氨酸酚裂解酶催化活性的影响。
图5为胞内酪氨酸酚裂解酶上清和沉淀的相对活性。
图6为pH对酪氨酸酚裂解酶催化活性的影响。
图7为20℃条件下酪氨酸酚裂解酶的热稳定性。
图8为40℃条件下酪氨酸酚裂解酶的热稳定性。
图9为不同菌株全细胞反应的L-DOPA产量。
图10为不同菌株表达的酪氨酸酚裂解酶的形态。
具体实施方式
表1.短肽的核苷酸和氨基酸序列
Figure BDA0002471649040000041
表2构建融合短肽的酪氨酸酚裂解酶的引物
Figure BDA0002471649040000051
注：划线碱基表示同源臂。
表3以L-DOPA为底物的酶学参数.
Figure BDA0002471649040000052
Figure BDA0002471649040000061
注：-表示未检测到。
(一)L-DOPA的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260,UV检测器，NX-C18柱(4.6×250mm)，流动 相:含有0.08％甲酸的水/乙腈＝92.4％/7.6％，流速0.8mL/min，柱温40℃，进样体积为10μL。
(二)培养基
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0。
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，营养琼脂15.0-20.0。
TB(发酵)培养基(g/L)：酵母粉24，蛋白胨12，甘油4，KH2PO4 2.31，K2HPO4 12.54，pH 7.5。
灭菌条件：115℃，15min，所有培养基用于转化子检出或用于重组菌培养时加入50mg/L 硫卡那霉素。
实施例1融合功能性短肽的重组质粒pET-28(a)-TPL-peptide的构建。
使用表2所示的引物pET-28-TPL-F/R，通过聚合酶链式反应(PCR)将质粒pET-28(a)-TPL (构建方法参考公开号为CN109897845A的专利申请)进行线性化扩增，PCR条件为：95℃ 预变性3min；98℃变性30s；55℃退火15s；72℃延伸6min，反应30个循环；最后72℃ 延伸5min，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用DNA纯化试剂盒回收。九个短肽 (表1所示)ELK16,DLK6,L6KD,Linker-ELP10,ELP20,L6K2,EAK16,18A和GFIL16由无 锡天霖生物技术公司合成，使用表2所示的带有同源臂的引物TPL-ELK16-F/R, TPL-DLK6-F/R,TPL-L6KD-F/R,TPL-ELP10-F/R,TPL-ELP20-F/R,TPL-L6K2-F/R, TPL-EAK16-F/R,TPL-18A-F/R和TPL-GFIL16-F/R分别对合成的短肽基因进行扩增，PCR条 件为：95℃预变性3min；98℃变性30s；55℃退火15s；72℃延伸6min，反应30个循环； 最后72℃延伸5min，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用DNA纯化试剂盒回收。
采用连接试剂盒，将载体和插入片段按1∶4的摩尔比混合，16℃下采用T4连接酶连接8h，获得重组质粒。然后转化E.coli.BL21(DE3)感受态细胞，感受态制备方法详见Takara大肠杆菌感受态试剂盒(货号：9139)说明书。分别将构建的重组质粒pET-TPL-ELK16, pET-TPL-DLK6,pET-TPL-L6KD,pET-TPL-ELP10,pET-TPL-ELP20,pET-TPL-L6K2, pET-TPL-EAK16,pET-TPL-18A和pET-TPL-GFIL16转化到BL21感受态细胞，挑选菌落PCR 正确的转化子，获得九株表达融合短肽的酪氨酸酚裂解酶菌株，分别命名为TPL-ELK16, TPL-DLK6,TPL-L6KD,TPL-ELP10,TPL-ELP20,TPL-L6K2,TPL-EAK16,TPL-18A和 TPL-GFIL16。
实施例2重组大肠杆菌的酪氨酸酚裂解酶表达情况
将实施例1构建的重组大肠杆菌TPL-ELK16,TPL-DLK6,TPL-L6KD,TPL-ELP10,TPL-ELP20,TPL-L6K2,TPL-EAK16,TPL-18A和TPL-GFIL16分别在TB培养基中培养3h， 再加入诱导剂0.2mM的IPTG，并降低温度至20℃,继续发酵10h。将发酵液于8000rpm离 心3min收集菌体，使用PB缓冲液(pH 8.5，50mM KH2PO4-K2HPO4)洗涤细胞2-3次，超 声破碎至菌液完全破碎呈透明状，9000rpm离心3min，分别收集上清和沉淀。将胞内上清 破碎液采用镍柱Ni-NTA Superflow Cabridge(5mL)和AKTA纯化仪进行蛋白纯化，收集纯化 获得的蛋白液，采用脱盐柱Sephadex-G(2mL)和AKTA纯化仪进行脱盐纯化，采用Enhanced BCA ProteinAssay Kit蛋白定量试剂盒(购于碧云天，货号：P0009)检测蛋白浓度，通过 SDS-PAGE分析胞内蛋白表达及蛋白纯化情况，如图2所示，与含有质粒pET-28(a)-TPL的原 始菌株相比，菌株TPL-ELK16,TPL-DLK6,TPL-L6K2,TPL-18A和TPL-GFIL16的酪氨酸酚裂 解酶主要以包涵体的形式表达。
对菌株的生长情况进行测定，结果显示，重组大肠杆菌TPL-ELK16,TPL-L6K2,TPL-18A 和TPL-GFIL16的生长状态受到一定的抑制，在诱导11h后的其OD600分别为18.7±0.31，19.6±0.53，18.4±0.45，19.2±0.94，与表达TPL的原始菌株相比OD600值分别降低了4.8，3.9，5.1，4.4(图3)。
实施例3不同菌株表达的TPL学性质与热稳定性
对实施例2构建的重组菌表达的酶在不同pH环境下的催化活性进行测定，通过酪氨酸 的消旋反应来测定TPL酶活，定义一个酶活单位为每分钟分解产生1μmol丙酮酸钠的量， 采用50mM磷酸二氢钾-磷酸氢二钾(pH 6-8)和50mM甘氨酸-氢氧化钠(pH 8-10)缓冲液配制反应底物溶液，100μmol的酪氨酸溶液，向900μL反应底物中加入100μL纯酶液(含 有30μmol辅因子PLP)激活酶催化反应开始，反应pH范围为6-10，反应温度为20℃，避 光，反应10min后向反应液中加入100μL的2M盐酸终止反应。如图4所示，TPL在pH 8.5 条件下表现出最高的催化活性，而且碱性环境更有利于TPL，TPL-ELK16,TPL-DLK6, TPL-L6KD,TPL-ELP10,TPL-ELP20,TPL-L6K2,TPL-EAK16,TPL-18A和TPL-GFIL16的催化 活性。
测定胞内可溶性上清与包涵体沉淀的相对活性，通过酪氨酸的消旋反应来测定TPL酶活， 配制过量的反应底物溶液，100μmol的酪氨酸溶液，向900μL反应底物中加入100μL纯酶 液(含有30μmol辅因子PLP)激活酶催化反应开始，反应pH为8，反应温度为20℃，避光，反应10min后向反应液中加入100μL的2M盐酸终止反应。定义原始的酪氨酸酚裂解 酶上清液的催化活性为100％参考值，如图5所示，原始的TPL沉淀部分几乎不具有催化活 性，经过融合短肽的修饰，TPL-DLK6，TPL-ELP10，TPL-EAK16，TPL-18A和TPL-GFIL16 的包涵体沉淀表现出40.9±2.6％，50.7±1.2％，48.9±2.3％，86.6±6.2％，97.9±3.5％的催化活性。
测定酶在不同温度条件下的催化活性，通过酪氨酸的消旋反应来测定TPL酶活，定义一 个酶活单位为每分钟分解产生1μmol丙酮酸钠的量，配制100μmol的酪氨酸溶液作为反应 底物溶液，向900μL反应底物中加入100μL纯酶液(含有30μmol辅因子PLP)激活酶催化反应开始，反应pH为8，反应温度分别为10，20，30，40，50℃，避光，反应10min后 向反应液中加入100μL的2M盐酸终止反应。如图6所示，TPL在10℃条件下表现出较高 的催化活性，酶活达5.1±0.33IU/ml，而随着温度的升高其催化活性大幅度下降，在20℃其 催化活性降低了55.8％。而TPL-ELP10,TPL-EAK16,TPL-18A and TPL-GFIL16在20℃条件 下表现出最高酶活，分别为5.0±0.3IU/ml，5.36±0.29IU/ml，4.7±0.1IU/ml，3.9±0.21IU/ml 相对于原始TPL，分别提高了117.4％,133.0％,104.3％,69.5％。
测定酶在不同温度条件下的热稳定性，将纯酶液分别于20℃，40℃水浴中分别保温10 min，20min，30min，40min，50min，60min后，通过酪氨酸的消旋反应来测定酪氨酸酚裂解酶催化活性，向900μL反应底物中加入100μL纯酶液(含有30μmol辅因子PLP)激 活酶催化反应开始，反应温度为20℃，避光，反应10min后向反应液中加入100μL的2M 盐酸终止反应，将保存0min的酪氨酸酚裂解酶的酶活定义为100％参考值。如图7、图8所 示，与原始TPL相比，TPL-EAK16，TPL-18A和TPL-GFIL16的热稳定性有所提高，经计算 TPL-DKL6在20℃，40℃条件下的半衰期分别是14.8min，12.0min，TPL-EAK16在20℃， 40℃条件下的半衰期分别是14.2min，13.9min，TPL-18A在20℃，40℃条件下的半衰期分 别是14.1min，11.6min，TPL-GFIL16在20℃，40℃条件下的半衰期分别是15.8min，13.9 min，而原始的TPL在40℃条件下保持10min，其剩余酶活为29.6％，其在20℃，40℃条 件下的半衰期分别是13.8min，6.3min。
测定以L-DOPA为底物的TPL酶学参数，配制浓度范围为0.1-6mmol的L-DOPA底物，向900μL反应底物中加入100μL纯酶液(含有30μmol辅因子PLP)激活酶催化反应开始， 反应温度为20℃，避光，反应10min后向反应液中加入100μL的2M盐酸终止反应。经计 算，原始TPL的Vmax和Km值分别为0.041mM/min/mg和2.19mmol，相对于原始TPL， TPL-DKL6，TPL-ELP10，TPL-EAK16，TPL-18A，TPL-GFIL16的Vmax分别提高了24.4％， 24.4％，12.2％，9.8％，17％(表3)。
实施例4重组大肠杆菌全细胞转化法生产L-DOPA
将表达酪氨酸酚裂解酶的原始大肠杆菌菌株与表达融合功能性短肽的酪氨酸酚裂解酶的 重组大肠杆菌TPL-ELK16,TPL-DLK6,TPL-L6KD,TPL-ELP10,TPL-ELP20,TPL-L6K2, TPL-EAK16,TPL-18A和TPL-GFIL16接种到LB平板(添加硫卡那霉素50mg/L)中，划线，37℃倒置培养12h左右长出大量菌落。
接种一环单菌落至LB培养基进行种子培养，37℃条件下220rpm培养12h左右。按2％ 的接种量将种子培养液接种至TB发酵培养基中，37℃，220rpm培养2h后加入诱导剂0.4mM 的IPTG并降温至20℃继续发酵10h，不同菌株摇瓶发酵的细胞生长情况相似，OD600均在 23-25。
将各菌株的发酵液于6000rpm离心10min，收集湿菌体。将制备获得的湿菌体加入到 转化液中，装液量50mL每500mL三角瓶，转化液中湿菌体的终浓度为60g/L，转化液含 有丙酮酸钠18g/L，邻苯二酚10g/L，乙酸铵30g/L，Na2SO3 4g/L，EDTA 2g/L，5-磷酸吡 哆醛30μM，氨水调节pH至8.5。反应条件为20℃，180rpm，避光。在反应0-5h阶段，丙 酮酸钠的流加速率为12g/L/h；在反应0-2h阶段，邻苯二酚的流加速率为10g/L/h，在反应 2-4h阶段，邻苯二酚的流加速率为8g/L/h，在反应4-5h阶段，邻苯二酚的流加速率为4g/L/h。 反应每隔1h进行取样，向反应液中按50％体积量加入2M的盐酸，制备获得的反应液10000 rpm离心3min，收集上清。
以含有质粒pET-28(a)-TPL的重组菌为对照，在相同条件下培养、发酵、全细胞转化，5 h后L-DOPA产量为17.9±1.4g/L，而在9个表达融合功能性短肽酪氨酸酚裂解酶的重组菌株 中，菌株TPL-ELP10,TPL-EAK16,TPL-18A,TPL-GFIL16全细胞反应的L-DOPA产量分别 为37.8±1.5g/L,53.8±2.1g/L,37.5±0.5g/L,29.1±1.9g/L,相比于对照菌株分别提高111％,201％, 109％,62.6％(图9)。
通过透射电子显微镜分析不同菌株表达的TPL的形态，TPL-ELK16，TPL-DKL6，TPL-L6KD，TPL-ELP10呈球形蛋白形状，TPL-L6K2，TPL-EAK16为不规则蛋白形状， TPL-18A为椭球形蛋白形状，TPL-GFIL16蛋白体积较大呈不规则形状(图10)。在TPL的 羧基端融合功能性短肽对其蛋白形态产生了影响，使大体积的蛋白更容易沉降聚集有利于包 涵体的分离。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种表达酪氨酸酚裂解酶活性包涵体的大肠杆菌及其应用
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Asp Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Lys Asp
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Val Gly
20
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Lys Lys
1 5
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu
1 5 10 15
Leu Phe
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Gly Phe Ile Leu Gly Phe Ile Leu Gly Phe Ile Leu Gly Phe Ile Leu
1 5 10 15
<210> 10
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Asn Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val Glu Thr Val
1 5 10 15
Ser Met Ile Pro Arg Asp Glu Arg Leu Lys Lys Met Gln Glu Ala Gly
20 25 30
Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ile Asp Leu Leu
35 40 45
Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp Ala Gly Met
50 55 60
Met Met Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Glu Asn Phe Tyr His Leu
65 70 75 80
Glu Arg Thr Val Gln Glu Leu Phe Gly Phe Lys His Ile Val Pro Thr
85 90 95
His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gln Leu Ala Ile Lys
100 105 110
Pro Gly Gln Tyr Val Ala Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Tyr
115 120 125
His Gln Glu Lys Asn Gly Ala Val Phe Val Asp Ile Val Arg Asp Glu
130 135 140
Ala His Asp Ala Gly Leu Asn Ile Ala Phe Lys Gly Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asp Glu Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala
165 170 175
Tyr Ile Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Val
180 185 190
Ser Met Ala Asn Met Arg Ala Val Arg Glu Leu Thr Ala Ala His Gly
195 200 205
Ile Lys Val Phe Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn Ala Tyr Phe
210 215 220
Ile Lys Glu Gln Glu Gln Gly Phe Glu Asn Lys Ser Ile Ala Glu Ile
225 230 235 240
Val His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met Ser Gly Lys
245 250 255
Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met Asn Asp Asp
260 265 270
Glu Met Phe Ser Ser Ala Lys Glu Leu Val Val Val Tyr Glu Gly Met
275 280 285
Pro Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Met Ala Ile
290 295 300
Gly Leu Arg Glu Ala Met Gln Tyr Glu Tyr Ile Glu His Arg Val Lys
305 310 315 320
Gln Val Arg Tyr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Ala Ala Gly Val Pro Ile
325 330 335
Val Glu Pro Val Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Arg Phe
340 345 350
Cys Glu His Leu Thr Gln Asp Glu Phe Pro Ala Gln Ser Leu Ala Ala
355 360 365
Ser Ile Tyr Val Glu Thr Gly Val Arg Ser Met Glu Arg Gly Ile Ile
370 375 380
Ser Ala Gly Arg Asn Asn Val Thr Gly Glu His His Arg Pro Lys Leu
385 390 395 400
Glu Thr Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Tyr Ala His
405 410 415
Met Asp Val Val Ala Asp Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Gln His Lys Glu
420 425 430
Asp Ile Arg Gly Leu Lys Phe Ile Tyr Glu Pro Lys Gln Leu Arg Phe
435 440 445
Phe Thr Ala Arg Phe Asp Tyr Ile
450 455
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctggaactgg aattgaaact gaagctggaa cttgagctta aactgaaa 48
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gataagctgc ttttgttgtt actg 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttgcttctgc tgttactgaa agat 24
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gttcctggcg taggtgtacc tggggttggt 30
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gtacctggtg taggtgtgcc cggtgtaggc gttccaggag taggagttcc tggcgttgga 60
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ttactgttgt tgcttctgaa aaaa 24
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gccgaggcag aagccaaggc caaagctgaa gctgaagcaa aagccaag 48
<210> 18
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gaatggttaa aagcatttta cgagaaagtg ctggagaagt tgaaggaact tttt 54
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gggtttatct taggttttat cttgggattc atcttgggtt ttattctg 48

Claims (10)

1.重组氨酸酚裂解酶，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶的C端融合SEQ ID NO.1～9任一所示的短肽。
2.根据权利要求1所述的酪氨酸酚裂解酶，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶为如下(a)或(b)：
(a)由SEQ ID NO.10所示的氨基酸组成的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酪氨酸酚裂解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述的酪氨酸酚裂解酶的基因。
4.连接有权利要求3所述基因的表达载体。
5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，含有权利要求4所述的表达载体。
6.一种构建权利要求5所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，将融合功能性短肽的酪氨酸酚裂解酶基因连接至质粒pET-28(a)+上，再转化至大肠杆菌细胞中，以启动子T7控制酪氨酸酚裂解酶基因的表达。
7.一种细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求5构建的重组大肠杆菌。
8.一种生产L-DOPA的方法，其特征在于，以丙酮酸钠和邻苯二酚为底物，利用权利要求5所述的重组大肠杆菌细胞或权利要求7所述的细胞催化剂进行转细胞转化生产。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸钠的初始浓度为15-18g/L，邻苯二酚为8-10g/L；所述转化反应条件为15-20℃；转化反应第0-5h按14g/L/h的速率补加丙酮酸钠；反应第0-2h、第2-4h和4-5h分别按12-14g/L/h、6-8g/L/h、3-4g/L/h的速率补加邻苯二酚。
10.权利要求5所述的重组大肠杆菌在制备含左旋多巴的产品方面的应用。
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