CN117683758A - α-酮酸脱羧酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

α-酮酸脱羧酶突变体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN117683758A CN202311709298.9A CN202311709298A CN117683758A CN 117683758 A CN117683758 A CN 117683758A CN 202311709298 A CN202311709298 A CN 202311709298A CN 117683758 A CN117683758 A CN 117683758A
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张雅萍
吴计划
杨尚彤
王婕
张永振
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Abstract

本发明公开了α‑酮酸脱羧酶突变体及其制备方法和应用。所述α‑酮酸脱羧酶突变体的氨基酸序列包括以下序列中任意一种：(1)在SEQ ID NO:3所示序列基础上发生R75S和/或I249T突变的序列；或，(2)由如(1)所述序列经取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列；或，(3)与(1)或(2)所述序列具有至少90％序列同一性，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列。本发明在野生型α‑酮酸脱羧酶中引入突变，提高了α‑酮酸脱羧酶催化活性，进而能够提高丙二酸的产量，降低分离成本，具有较高的工业应用价值。

Description

α-酮酸脱羧酶突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及α-酮酸脱羧酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
丙二酸是一种三碳二元酸，为一种无色无味的晶体，易吸湿；丙二酸是在分离苹果酸的氧化产品中首先发现，因此又称为缩苹果酸。丙二酸中间位的亚甲基化学活性较高，易于被取代且容易进行脱羧，被广泛地应用在医药、农药、香精香料及维生素的中间体。目前丙二酸的生产方法主要为以氯乙酸和氰化钠为原料经化学合成得到丙二酸，生产过程三废较多，污染较大，而且副产难以进行处理。除化学法之外，使用生物发酵生产丙二酸值得关注，该生产过程绿色环保，相较于其他方法，产生的废物较少。
自然界中并没天然的丙二酸合成途径，目前已报道的丙二酸合成途径大多为人工设计，在一些报道中虽然已经达到了克级的水平，但远远未达到工业化生产的要求。例如CN113832087A公开一种利用大肠杆菌全生物合成丙二酸的方法，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，将大肠杆菌自身的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶共表达，将来自谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸-α-脱氢酶基因单独进行表达，将大肠杆菌自身的琥珀酸半醛脱氢酶基因和来自铜绿假单胞菌的异源基因β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因共表达，构建了经由草酰乙酸-天冬氨酸的丙二酸全生物合成途径，产量达到0.74g/L，虽然有所突破，但经由草酰乙酸-天冬氨酸的丙二酸全生物合成途径较长，产量有待进一步的提升。
此外，有报道构建了一种新的丙二酸生物合成的途径，该途径经由草酰乙酸-丙二酸半醛-丙二酸途径合成丙二酸，生物合成途径较短，具有较大的应用潜力。针对目前的丙二酸合成途径，提高产量的重点在于使用催化活性较高的α-酮酸脱羧酶，因此，挖掘、设计高活性的α-酮酸脱羧酶具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供α-酮酸脱羧酶突变体及其制备方法和应用，设计改造获得活性较高α-酮酸脱羧酶突变体，以期促进丙二酸的生产。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供α-酮酸脱羧酶突变体，所述α-酮酸脱羧酶突变体的氨基酸序列包括以下序列中任意一种：
(1)在SEQ ID NO:3所示序列基础上发生R75S和/或I249T突变的序列；或，
(2)由如(1)所述序列经取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列；或，
(3)与(1)或(2)所述序列具有至少90％序列同一性，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列。
本发明中，基于来源于酒香酵母属(Brettanomyces bruxellensis)的野生型α-酮酸脱羧酶进行设计改造，引入R75S和/或I249T突变，能够提高催化活性，进而提高丙二酸的产量。
本发明中，在野生型α-酮酸脱羧酶中引入特定突变，获得α-酮酸脱羧酶突变体，能够提高其催化活性，可以理解，在所述α-酮酸脱羧酶突变体基础上，本领域技术人员能够利用本领域通用技术手段进行取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得功能相同或相似的其他序列。
在本发明一些具体实施方案中，除了引入R75S和/或I249T突变之外，还可以进一步在其他位点上进行氨基酸的保守取代，使得突变后的α-酮酸脱羧酶具有更加优异的底物特异性。优选地，所述氨基酸的保守取代保留本发明α-酮酸脱羧酶突变体的底物特异性。对于本领域的技术人员而言很明显，这种取代可以在上述位点以外的区域发生，而仍保留相应活性。优选地，保守取代变体具有至少一个位置的氨基酸保守取代。保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。最常见的氨基酸互换有氨基酸G至A；A至G，S；V至I，L，A，T或S；I至V，L或M；L至I，M或V；M至L，I或V；P至A，S或N；F至Y，W或H；Y至F，W或H；W至Y，F或H；R至K，E或D；K至R，E或D；H至Q，N，S；D至N，E，K，R或Q；E至Q，D，K，R或N；S至T或A；T至S，V或A；C至S，T或A；N至D，Q，H或S；Q至E，N，H，K或R的互换，以及它们的相反的互换。与上述α-酮酸脱羧酶突变体的氨基酸序列具有一定的氨基酸同源性的α-酮酸脱羧酶突变体，优选地同源性为70％-99％之间，更优选地同源性为80％-99％之间，更优选地同源性为90％-99％之间，最优选地同源性为99％，也应属于本发明的保护范围。
SEQ ID NO:3：
MAPIALSSSKEENRISLSEYVFRRIASLGVHSVFGVPGDFNLEFLDFIYNVPELKWYGTCNELNGAYAADGYSKRSGKLGVLVTTMGVGELSAMNGISGSYAEYVPILSIVGTTPTTAKMQGLPSHHLITQLNPLEKNDHYVYQKMAASISCNVTSIDDPFEAPDMVDNLIRDILKEKKPGYLYIPCNLASVPVSDLNLRTTSGKFFFEKELCCDQVMVQNLAAKILDLIYMSHKPFVLSDCLVDRLRISHEIQEFVDKAKLPNSCTQMGKSTLNEQSSYYIGDYSGDETSIKTMNYVSSCDLMIHMGNFDNETNSGHFSIHKEFDDKKSGKTLIILNHKYIKIGSELFYGYSILDVLPEMLRMLDTSKLPQVPAPCIQNIIPAHKSSTPISETDVLKGIQTLLKPNDTLIVDTGSILYGISDIRLPKGCKVLTQPFYLSIGMGLPCSFGASVANRELGNKGRIILVEGDGAAQMTIQEFSNFNREGLNPLILLLNNEGYTVERAIKGPTRGYNDIRPNWKWTQLFDTFGMKDYKCQRVDTPDELSKTLKEFGSDNSCSRMIEIGLAKLDVPWRINGMVSHKK。
第二方面，本发明提供核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的α-酮酸脱羧酶突变体。
本发明中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列，或与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9杂交且编码所述α-酮酸脱羧酶突变体的序列，或与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有90％以上的同一性且编码所述α-酮酸脱羧酶突变体的序列。
SEQ ID NO:7：
atggcacctatcgcactgagcagctctaaagaagaaaaccgcatctccctgagcgaatacgttttccgccgtatcgcgtccctgggtgtacactctgtgttcggcgttccgggcgattttaacctggaatttctggatttcatttataacgtgccggaactgaaatggtacggtacgtgcaacgaactgaacggtgcttacgcggcggacggttatagcaagagtagcggcaaactgggtgttctggttacgactatgggtgttggcgaactgtctgcaatgaacggtatttccggcagctacgcagaatacgttccaatcctgtctattgttggcactaccccgaccactgcaaaaatgcagggtctgccgtctcaccacctgatcactcagctgaacccactggagaaaaacgatcactacgtgtaccagaaaatggctgctagcatttcctgtaacgttacgtctatcgatgacccgttcgaagcgccggatatggtggacaacctgatccgtgacattctgaaagaaaaaaaaccgggctatctgtacatcccgtgtaacctggcctctgttccggtatctgacctgaacctgcgcaccacttccggcaaattcttcttcgaaaaagagctgtgctgcgatcaggtgatggtgcagaacctggctgcaaagatcctggacctgatctatatgagccacaaaccgttcgtgctgtctgactgcctggtagatcgtctgcgtatttctcacgaaatccaggagtttgtggacaaagcgaaactgccaaactcctgcacccagatgggtaagtctactctgaacgaacagagctcttactacatcggtgattactccggcgacgaaacctccatcaagaccatgaactacgtttcctcttgcgacctgatgatccacatgggcaatttcgacaacgaaaccaactctggccacttttctatccacaaagagttcgatgacaaaaagtctggtaaaacgctgatcatcctgaaccacaaatacatcaaaatcggcagcgaactgttctatggctactctatcctggatgttctgccggaaatgctgcgcatgctggacacctccaaactgccacaagttcctgcaccgtgcatccagaatatcatcccagcgcataaaagctccacgccgatctccgaaaccgacgtcctgaaaggtattcagaccctgctgaaaccaaacgataccctgattgtggatactggcagcattctgtacggtatctccgatattcgtctgcctaaaggctgtaaagttctgacccagccattctacctgtccatcggtatgggtctgccgtgtagctttggcgcatccgtagcgaaccgtgaactgggtaacaaaggtcgcattatcctggtcgaaggtgatggcgctgcgcagatgactattcaggagttctccaacttcaatcgtgaaggtctgaacccgctgatcctgctgctgaacaatgaaggttatactgtggaacgtgctatcaaaggtccaactcgtggttacaacgatatccgtccgaattggaaatggacccagctgttcgacaccttcggcatgaaagactataaatgccaacgtgtcgataccccagacgaactgtctaagactctgaaggagttcggttctgataactcctgttcccgcatgatcgaaatcggtctggcaaagctggacgttccgtggcgcatcaatggtatggtaagccacaaaaaa。
SEQ ID NO:8：
atggcacctatcgcactgagcagctctaaagaagaaaaccgcatctccctgagcgaatacgttttccgccgtatcgcgtccctgggtgtacactctgtgttcggcgttccgggcgattttaacctggaatttctggatttcatttataacgtgccggaactgaaatggtacggtacgtgcaacgaactgaacggtgcttacgcggcggacggttatagcaagcgtagcggcaaactgggtgttctggttacgactatgggtgttggcgaactgtctgcaatgaacggtatttccggcagctacgcagaatacgttccaatcctgtctattgttggcactaccccgaccactgcaaaaatgcagggtctgccgtctcaccacctgatcactcagctgaacccactggagaaaaacgatcactacgtgtaccagaaaatggctgctagcatttcctgtaacgttacgtctatcgatgacccgttcgaagcgccggatatggtggacaacctgatccgtgacattctgaaagaaaaaaaaccgggctatctgtacatcccgtgtaacctggcctctgttccggtatctgacctgaacctgcgcaccacttccggcaaattcttcttcgaaaaagagctgtgctgcgatcaggtgatggtgcagaacctggctgcaaagatcctggacctgatctatatgagccacaaaccgttcgtgctgtctgactgcctggtagatcgtctgcgtacttctcacgaaatccaggagtttgtggacaaagcgaaactgccaaactcctgcacccagatgggtaagtctactctgaacgaacagagctcttactacatcggtgattactccggcgacgaaacctccatcaagaccatgaactacgtttcctcttgcgacctgatgatccacatgggcaatttcgacaacgaaaccaactctggccacttttctatccacaaagagttcgatgacaaaaagtctggtaaaacgctgatcatcctgaaccacaaatacatcaaaatcggcagcgaactgttctatggctactctatcctggatgttctgccggaaatgctgcgcatgctggacacctccaaactgccacaagttcctgcaccgtgcatccagaatatcatcccagcgcataaaagctccacgccgatctccgaaaccgacgtcctgaaaggtattcagaccctgctgaaaccaaacgataccctgattgtggatactggcagcattctgtacggtatctccgatattcgtctgcctaaaggctgtaaagttctgacccagccattctacctgtccatcggtatgggtctgccgtgtagctttggcgcatccgtagcgaaccgtgaactgggtaacaaaggtcgcattatcctggtcgaaggtgatggcgctgcgcagatgactattcaggagttctccaacttcaatcgtgaaggtctgaacccgctgatcctgctgctgaacaatgaaggttatactgtggaacgtgctatcaaaggtccaactcgtggttacaacgatatccgtccgaattggaaatggacccagctgttcgacaccttcggcatgaaagactataaatgccaacgtgtcgataccccagacgaactgtctaagactctgaaggagttcggttctgataactcctgttcccgcatgatcgaaatcggtctggcaaagctggacgttccgtggcgcatcaatggtatggtaagccacaaaaaa。
SEQ ID NO:9：
atggcacctatcgcactgagcagctctaaagaagaaaaccgcatctccctgagcgaatacgttttccgccgtatcgcgtccctgggtgtacactctgtgttcggcgttccgggcgattttaacctggaatttctggatttcatttataacgtgccggaactgaaatggtacggtacgtgcaacgaactgaacggtgcttacgcggcggacggttatagcaagagtagcggcaaactgggtgttctggttacgactatgggtgttggcgaactgtctgcaatgaacggtatttccggcagctacgcagaatacgttccaatcctgtctattgttggcactaccccgaccactgcaaaaatgcagggtctgccgtctcaccacctgatcactcagctgaacccactggagaaaaacgatcactacgtgtaccagaaaatggctgctagcatttcctgtaacgttacgtctatcgatgacccgttcgaagcgccggatatggtggacaacctgatccgtgacattctgaaagaaaaaaaaccgggctatctgtacatcccgtgtaacctggcctctgttccggtatctgacctgaacctgcgcaccacttccggcaaattcttcttcgaaaaagagctgtgctgcgatcaggtgatggtgcagaacctggctgcaaagatcctggacctgatctatatgagccacaaaccgttcgtgctgtctgactgcctggtagatcgtctgcgtacttctcacgaaatccaggagtttgtggacaaagcgaaactgccaaactcctgcacccagatgggtaagtctactctgaacgaacagagctcttactacatcggtgattactccggcgacgaaacctccatcaagaccatgaactacgtttcctcttgcgacctgatgatccacatgggcaatttcgacaacgaaaccaactctggccacttttctatccacaaagagttcgatgacaaaaagtctggtaaaacgctgatcatcctgaaccacaaatacatcaaaatcggcagcgaactgttctatggctactctatcctggatgttctgccggaaatgctgcgcatgctggacacctccaaactgccacaagttcctgcaccgtgcatccagaatatcatcccagcgcataaaagctccacgccgatctccgaaaccgacgtcctgaaaggtattcagaccctgctgaaaccaaacgataccctgattgtggatactggcagcattctgtacggtatctccgatattcgtctgcctaaaggctgtaaagttctgacccagccattctacctgtccatcggtatgggtctgccgtgtagctttggcgcatccgtagcgaaccgtgaactgggtaacaaaggtcgcattatcctggtcgaaggtgatggcgctgcgcagatgactattcaggagttctccaacttcaatcgtgaaggtctgaacccgctgatcctgctgctgaacaatgaaggttatactgtggaacgtgctatcaaaggtccaactcgtggttacaacgatatccgtccgaattggaaatggacccagctgttcgacaccttcggcatgaaagactataaatgccaacgtgtcgataccccagacgaactgtctaagactctgaaggagttcggttctgataactcctgttcccgcatgatcgaaatcggtctggcaaagctggacgttccgtggcgcatcaatggtatggtaagccacaaaaaa。
第三方面，本发明提供重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。
本发明中，所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关序列，所述表达载体用于表达相关基因，其中构建表达载体时用到的载体可以为pRSFDuet-1。
在一些实施方案中，所述重组载体为将所述核酸分子替换pRSFDuet-1的NcoI和EcoRI酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。
第四方面，本发明提供重组细胞，所述重组细胞含有第三方面所述的重组载体。
在一些实施方案中，所述重组细胞经诱导(如IPTG诱导)生产所述α-酮酸脱羧酶突变体。
在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括：将所述重组载体转化到宿主细胞中。
进一步地，所述宿主细胞为原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，具体如大肠杆菌BL21(DE3)，Rosetta(DE3)，BL21(DE3)plysS，M15或Top10f等，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
第五方面，本发明提供第一方面所述的α-酮酸脱羧酶突变体的制备方法，所述制备方法包括：
将编码第一方面所述的α-酮酸脱羧酶突变体的核酸分子插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞，进行培养和分离纯化，得到所述α-酮酸脱羧酶突变体。
优选地，所述表达载体包括pRSFDuet-1载体、pETDuet-1载体、pACYCDuet-1载体、pTrc99a载体或pET28a载体等。
优选地，所述宿主细胞包括大肠杆菌、酿酒酵母、谷氨酸棒状杆菌或解脂耶式酵母等。
优选地，所述大肠杆菌包括大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rosetta(DE3)，大肠杆菌BL21(DE3)plysS，大肠杆菌M15或大肠杆菌Top10f等。
优选地，编码α-酮酸脱羧酶突变体的核酸的制备方法包括：对野生型α-酮酸脱羧酶的基因(SEQ ID NO:1)进行密码子优化，得到SEQ ID NO:2所示基因，以提高该基因的表达效率，将SEQ ID NO:2所示基因插入表达载体中，以插入后载体为模板在SEQ ID NO:2所示基因上引入突变R75S和/或I249T。
优选地，引入突变的方法可以使用Mut Express MultiS Fast Mutagenesis KitV2试剂盒。
本发明中，对重组细胞进行诱导培养的方法、从培养物中分离α-酮酸脱羧酶的方法均可采用本领域的常规方法。重组细胞表达α-酮酸脱羧酶时使用的培养基可以是本领域可使该重组细胞生长并产生本发明的α-酮酸脱羧酶突变体的培养基，例如LB培养基。
本发明中，培养方法与培养条件没有特殊要求，只要能够使重组细胞正常生长，并表达α-酮酸脱羧酶突变体即可。
SEQ ID NO:1：
atggcacctatagctttgtcatcttccaaggaggaaaacagaatctccttatccgagtatgtctttagaaggattgcttctcttggggtgcactccgtttttggagttcccggagatttcaatttggagtttttggatttcatttacaatgttccagaactcaaatggtacggaacatgcaacgaattaaatggtgcctatgctgcagatggctactcaaaaagaagtgggaagctaggtgttcttgttaccacgatgggagtgggagaattgagtgccatgaatggaatcagtggtagctatgcagaatacgttccaatccttagcatagttggtacaacaccaacaaccgcaaaaatgcaaggtcttccaagtcatcacctcattacacaattgaatccattggaaaaaaacgatcattatgtttatcaaaagatggccgcaagcatttcttgtaatgttaccagtattgatgacccatttgaagcaccagatatggttgataacttgatacgtgatatattgaaagaaaagaagcctggctatctttatataccatgcaatctggcaagtgttcctgtttctgatttgaacttgagaacaacatctggaaaattcttcttcgagaaagaattgtgctgtgaccaggtcatggttcaaaatcttgccgcaaagattttagatctgatttatatgtcacataaaccatttgttttatctgattgtctagtggacagattgcgcatttcacatgaaattcaggagtttgtggacaaagcaaaattaccaaattcatgtacacaaatgggaaagtccacattgaatgagcagagttcatattatattggagattatagcggagatgaaacttcaataaagacaatgaactatgtctcttcttgtgatttgatgattcacatgggaaattttgacaatgaaacgaactctgggcattttagtattcataaggaattcgatgacaagaaatcaggaaagactcttattattcttaatcacaagtatattaaaattggatcagagcttttctatgggtattcaattttagacgtgctaccagaaatgcttcgaatgttggatacttcaaaacttcctcaagtaccagcaccatgtatccagaatataattccagcacataaatcatcgacaccgatttcagaaactgatgtattgaaagggattcaaactcttttaaagccaaatgacacgttgatcgttgataccggttcaattttgtacggaatttcagacattaggttaccaaaaggatgtaaggttctcacacagccattttatctttctattggaatgggactaccttgctcatttggagcaagtgtagccaatagagagctcggaaataagggaagaatcattcttgttgaaggagacggagctgctcagatgactattcaagagttttcaaacttcaacagagaagggttgaacccacttattcttctattgaacaacgaaggttacacggttgagagagcaattaagggaccgacaagaggttataatgatattagaccaaattggaagtggacacagctttttgacactttcggcatgaaagattataaatgccaaagagttgatacaccagatgaactatcaaaaaccttaaaagaatttggcagtgacaactcatgctctagaatgatcgaaatcggtctagctaagttggatgttccatggagaatcaacggtatggtttctcacaagaaatag。
SEQ ID NO:2：
atggcacctatcgcactgagcagctctaaagaagaaaaccgcatctccctgagcgaatacgttttccgccgtatcgcgtccctgggtgtacactctgtgttcggcgttccgggcgattttaacctggaatttctggatttcatttataacgtgccggaactgaaatggtacggtacgtgcaacgaactgaacggtgcttacgcggcggacggttatagcaagcgtagcggcaaactgggtgttctggttacgactatgggtgttggcgaactgtctgcaatgaacggtatttccggcagctacgcagaatacgttccaatcctgtctattgttggcactaccccgaccactgcaaaaatgcagggtctgccgtctcaccacctgatcactcagctgaacccactggagaaaaacgatcactacgtgtaccagaaaatggctgctagcatttcctgtaacgttacgtctatcgatgacccgttcgaagcgccggatatggtggacaacctgatccgtgacattctgaaagaaaaaaaaccgggctatctgtacatcccgtgtaacctggcctctgttccggtatctgacctgaacctgcgcaccacttccggcaaattcttcttcgaaaaagagctgtgctgcgatcaggtgatggtgcagaacctggctgcaaagatcctggacctgatctatatgagccacaaaccgttcgtgctgtctgactgcctggtagatcgtctgcgtatttctcacgaaatccaggagtttgtggacaaagcgaaactgccaaactcctgcacccagatgggtaagtctactctgaacgaacagagctcttactacatcggtgattactccggcgacgaaacctccatcaagaccatgaactacgtttcctcttgcgacctgatgatccacatgggcaatttcgacaacgaaaccaactctggccacttttctatccacaaagagttcgatgacaaaaagtctggtaaaacgctgatcatcctgaaccacaaatacatcaaaatcggcagcgaactgttctatggctactctatcctggatgttctgccggaaatgctgcgcatgctggacacctccaaactgccacaagttcctgcaccgtgcatccagaatatcatcccagcgcataaaagctccacgccgatctccgaaaccgacgtcctgaaaggtattcagaccctgctgaaaccaaacgataccctgattgtggatactggcagcattctgtacggtatctccgatattcgtctgcctaaaggctgtaaagttctgacccagccattctacctgtccatcggtatgggtctgccgtgtagctttggcgcatccgtagcgaaccgtgaactgggtaacaaaggtcgcattatcctggtcgaaggtgatggcgctgcgcagatgactattcaggagttctccaacttcaatcgtgaaggtctgaacccgctgatcctgctgctgaacaatgaaggttatactgtggaacgtgctatcaaaggtccaactcgtggttacaacgatatccgtccgaattggaaatggacccagctgttcgacaccttcggcatgaaagactataaatgccaacgtgtcgataccccagacgaactgtctaagactctgaaggagttcggttctgataactcctgttcccgcatgatcgaaatcggtctggcaaagctggacgttccgtggcgcatcaatggtatggtaagccacaaaaaa。
第六方面，本发明提供第一方面所述的α-酮酸脱羧酶突变体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组载体、第四方面所述的重组细胞或第五方面所述的α-酮酸脱羧酶突变体的制备方法在制备丙二酸中的应用。
第七方面，本发明提供一种制备丙二酸的方法，所述制备丙二酸的方法包括：利用第一方面所述的α-酮酸脱羧酶突变体催化底物葡萄糖，得到丙二酸。
优选地，所述制备丙二酸的方法具体包括：
将编码第一方面所述的α-酮酸脱羧酶突变体的核酸分子插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞，进行发酵和丙二酸分离纯化，得到丙二酸。
优选地，所述发酵包括好氧发酵阶段和产酸阶段。
优选地，所述好氧发酵阶段的发酵条件包括：溶氧值(DO)大于30％，温度为35～42℃(例如可以是36℃、37℃、38℃、39℃、40℃或41℃等)，pH为6.0～7.2，包括但不限于6.2、6.4、6.6、6.8、7或7.1等。
在一些实施方案中，初始时，转速100r/min，通风量为0.5VVM，温度为37℃，pH值为7.0；在发酵的过程中使用氨水将pH维持到7.0；由于菌体的不断生长，会使得溶氧不断的下降，在这期间将通风量和转速与DO进行关联，使得DO维持在30％以上，通风量的最高值为3VVM，转速的最高值为1000r/min。
优选地，所述产酸阶段的发酵条件包括：OD600达到10～20时(例如可以是11、12、13、15、16、17、18或19等)，加入IPTG诱导蛋白表达，培养液中葡萄糖的浓度为20～30g/L(例如可以是21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L或29g/L)，溶氧值大于15％，温度为35～42℃(例如可以是36℃、37℃、38℃、39℃、40℃或41℃等)，pH为6.0～7.2，包括但不限于6.2、6.4、6.6、6.8、7或7.1等。
例如，待OD600达到15以后，加入终浓度为0.5mM的IPTG，将pH值调节剂氨水换成氢氧化钠，向发酵罐中补加葡萄糖溶液，使得发酵罐中葡萄糖的浓度在的20-30g/L之间，DO维持到20％以上，温度为35-42℃，pH为6.0-7.2。
在一些实施方案中，发酵时所用的发酵培养基的组成为：葡萄糖5-60g/L(分消)，Na2HPO4·12H2O 15-16g/L，KH2PO42.5-3.5g/L，NH4Cl 0.8-1.2g/L，NaCl 0.4-0.6g/L，在发酵开始之前加入0.01-0.1％(体积比)的MgSO4(1mol/L)和0.01-0.1％(体积比)的微量元素；例如可以为：葡萄糖40g/L(分消)，Na2HPO4·12H2O 15.11g/L,KH2PO43 g/L，NH4Cl1g/L，NaCl 0.5g/L，121℃灭菌20min，在发酵开始之前加入千分之一体积的MgSO4(1mol/L)和千分之一体积的微量元素。
所述微量元素可以为：FeCl3·6H2O 2-3g/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.4g/L，CuCl2·2H2O 0.1-0.2g/L，ZnCl20.2-0.4g/L，Na2MO4·2H2O 0.2-0.4g/L，H3BO30.07-0.08g/L，MnCl2·4H2O 0.49-0.5g/L；例如可以为：FeCl3·6H2O 2.4g/L，CoCl2·6H2O 0.3g/L，CuCl2·2H2O 0.15g/L，ZnCl20.3g/L，Na2MO4·2H2O 0.3g/L，H3BO30.075 g/L，MnCl2·4H2O0.495g/L。
在一些实施方案中，发酵时的种子液的接种量为5％(v/v)，初始OD600为0.5。
在一些实施方案中，所述种子液培养时所用的培养基为LB培养基。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过理性设计，在来源于酒香酵母属的野生型α-酮酸脱羧酶中引入R75S和/或I249T突变，提高了α-酮酸脱羧酶的底物特异性、催化活性，能够提高丙二酸的产量，降低分离成本，具有较高的工业应用价值。
附图说明
图1为丙二酸标准品液相色谱图；
图2为含有野生型α-酮酸脱羧酶重组菌的丙二酸检测液相色谱图；
图3为含有R75S突变的重组菌的丙二酸检测液相色谱图；
图4为含有I249T突变的重组菌的丙二酸检测液相色谱图；
图5为含有R75S和I249T突变的重组菌的丙二酸检测液相色谱图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
本发明中，“同一性”可以用肉眼或计算机软件(比如Ausubel et al.eds.(2007)在Current Protocols in Molecular Biology中所述的软件程序)进行评价。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同一的。两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。多聚核苷酸序列或氨基酸序列与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基或氨基酸相同。
实施例1
本实施例构建α-酮酸脱羧酶质粒。
酒香酵母属(Brettanomyces bruxellensis)来源的野生型α-酮酸脱羧酶的基因PDC1的密码子优化及全合成：根据大肠杆菌的密码子偏好性，对酒香酵母属来源的野生型α-酮酸脱羧酶的基因PDC1的(SEQ ID NO:1)进行密码子优化，合成SEQ ID NO:2所示的DNA片段。将SEQ ID NO:2所示的DNA片段替换pRSFDuet-1(Novagen公司，目录号为71341-3)的NcoI和EcoRI酶切位点间序列，其余序列保持不变，得到重组质粒pRSF-PDC1。将重组质粒pRSF-PDC1送测序，结果与预期一致。将来源于大肠杆菌的yneI基因插入到质粒pRSF-PDC1的NdeI和KpnI酶切位点之间，其余序列保持不变，得到重组质粒pRSF-PDC1-yneI。将重组质粒pRSF-PDC1-yneI送测序，结果与预期一致
实施例2
本实施例进行α-酮酸脱羧酶突变。
以pRSF-PDC1-yneI为模板，使用Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2试剂盒(诺唯赞，产品目录号C215-01)在实施例1中合成的SEQ ID NO:2所示的PDC1基因上引入定点突变，使得野生型Α-酮酸脱羧酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)发生R75S或I249T的单点突变以及其两者的组合突变。
所使用的引物如表1所示。
表1
引物名称 序列(5’-3’) SEQIDNO:
R75S-F TAGCAAGagtAGCGGCAAACTGGGTGTTCTGG 10
R75S-R TGCCGCTactCTTGCTATAACCGTCCGCCGCG 11
I249T-F TCTGCGTactTCTCACGAAATCCAGGAGTTTGT 12
I249T-R CGTGAGAagtACGCAGACGATCTACCAGGCAG 13
将pRSF-PDC1-yneI和单点突变后的重组质粒分别转化Top10菌株，涂板，挑取转化子，测试正确之后，培养并提取质粒，转化到BL21(DE3)菌株当中，涂布含有50μg/mL浓度的Kan的平板，生长之后，挑取4个菌落进行测序，以筛选到正确的突变。含有两个以及两个以上的突变位点的重组菌可以经过多轮突变得到。
SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列是对野生型α-酮酸脱羧酶进行R75S突变后的序列，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列是对野生型α-酮酸脱羧酶进行I249T突变后的序列，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列是对野生型α-酮酸脱羧酶进行R75S、I249T突变后的序列，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
SEQ ID NO:4：
MAPIALSSSKEENRISLSEYVFRRIASLGVHSVFGVPGDFNLEFLDFIYNVPELKWYGTCNELNGAYAADGYSKSSGKLGVLVTTMGVGELSAMNGISGSYAEYVPILSIVGTTPTTAKMQGLPSHHLITQLNPLEKNDHYVYQKMAASISCNVTSIDDPFEAPDMVDNLIRDILKEKKPGYLYIPCNLASVPVSDLNLRTTSGKFFFEKELCCDQVMVQNLAAKILDLIYMSHKPFVLSDCLVDRLRISHEIQEFVDKAKLPNSCTQMGKSTLNEQSSYYIGDYSGDETSIKTMNYVSSCDLMIHMGNFDNETNSGHFSIHKEFDDKKSGKTLIILNHKYIKIGSELFYGYSILDVLPEMLRMLDTSKLPQVPAPCIQNIIPAHKSSTPISETDVLKGIQTLLKPNDTLIVDTGSILYGISDIRLPKGCKVLTQPFYLSIGMGLPCSFGASVANRELGNKGRIILVEGDGAAQMTIQEFSNFNREGLNPLILLLNNEGYTVERAIKGPTRGYNDIRPNWKWTQLFDTFGMKDYKCQRVDTPDELSKTLKEFGSDNSCSRMIEIGLAKLDVPWRINGMVSHKK。
SEQ ID NO:5：
MAPIALSSSKEENRISLSEYVFRRIASLGVHSVFGVPGDFNLEFLDFIYNVPELKWYGTCNELNGAYAADGYSKRSGKLGVLVTTMGVGELSAMNGISGSYAEYVPILSIVGTTPTTAKMQGLPSHHLITQLNPLEKNDHYVYQKMAASISCNVTSIDDPFEAPDMVDNLIRDILKEKKPGYLYIPCNLASVPVSDLNLRTTSGKFFFEKELCCDQVMVQNLAAKILDLIYMSHKPFVLSDCLVDRLRTSHEIQEFVDKAKLPNSCTQMGKSTLNEQSSYYIGDYSGDETSIKTMNYVSSCDLMIHMGNFDNETNSGHFSIHKEFDDKKSGKTLIILNHKYIKIGSELFYGYSILDVLPEMLRMLDTSKLPQVPAPCIQNIIPAHKSSTPISETDVLKGIQTLLKPNDTLIVDTGSILYGISDIRLPKGCKVLTQPFYLSIGMGLPCSFGASVANRELGNKGRIILVEGDGAAQMTIQEFSNFNREGLNPLILLLNNEGYTVERAIKGPTRGYNDIRPNWKWTQLFDTFGMKDYKCQRVDTPDELSKTLKEFGSDNSCSRMIEIGLAKLDVPWRINGMVSHKK。
SEQ ID NO:6：
MAPIALSSSKEENRISLSEYVFRRIASLGVHSVFGVPGDFNLEFLDFIYNVPELKWYGTCNELNGAYAADGYSKSSGKLGVLVTTMGVGELSAMNGISGSYAEYVPILSIVGTTPTTAKMQGLPSHHLITQLNPLEKNDHYVYQKMAASISCNVTSIDDPFEAPDMVDNLIRDILKEKKPGYLYIPCNLASVPVSDLNLRTTSGKFFFEKELCCDQVMVQNLAAKILDLIYMSHKPFVLSDCLVDRLRTSHEIQEFVDKAKLPNSCTQMGKSTLNEQSSYYIGDYSGDETSIKTMNYVSSCDLMIHMGNFDNETNSGHFSIHKEFDDKKSGKTLIILNHKYIKIGSELFYGYSILDVLPEMLRMLDTSKLPQVPAPCIQNIIPAHKSSTPISETDVLKGIQTLLKPNDTLIVDTGSILYGISDIRLPKGCKVLTQPFYLSIGMGLPCSFGASVANRELGNKGRIILVEGDGAAQMTIQEFSNFNREGLNPLILLLNNEGYTVERAIKGPTRGYNDIRPNWKWTQLFDTFGMKDYKCQRVDTPDELSKTLKEFGSDNSCSRMIEIGLAKLDVPWRINGMVSHKK。
实施例3
本实施例进行催化活性检测。
LB固体培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L，pH7.0。121℃灭菌20min。
LB培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。121℃灭菌20min。
微量元素：FeCl3·6H2O 2.4g/L，CoCl2·6H2O 0.3g/L，CuCl2·2H2O 0.15g/L，ZnCl20.3 g/L，Na2MO4·2H2O 0.3g/L，H3BO30.075 g/L，MnCl2·4H2O 0.495g/L。121℃灭菌30min。
发酵培养基：葡萄糖40g/L(分消)，Na2HPO4·12H2O 15.11g/L,KH2PO43 g/L，NH4Cl1g/L，NaCl 0.5g/L，121℃灭菌20min，在发酵开始之前加入千分之一体积的MgSO4(1mol/L)和千分之一体积的微量元素。
1、菌种活化：取保藏于-80℃的实施例2构建的各重组菌在LB固体培养基上进行平板划线，而后放置于37℃的培养箱中活化培养12h后，挑取单菌落接种到种子培养基中。
2、种子液培养：种子培养基为LB培养基，将接种之后的种子培养基在220r/min、37℃的摇床中培养10h，使得种子培养基的OD600达到2以上。此时的种子液可以接种到发酵培养基中。
3、3L发酵罐培养：3L发酵罐的装液量为1.5L，已灭菌的发酵培养基的pH为7左右。在发酵之前，将发酵罐中的DO值标定为100％。此时将种子液接种到发酵培养基中，接种量为5％(v/v)，初始OD600为0.5。初始时，条件设置为：转速100r/min，通风量为0.5VVM，温度为37℃，pH值为7.0。在发酵的过程中使用氨水将pH维持到7.0。由于菌体的不断生长，会使得溶氧不断的下降，在这期间将通风量和转速与DO进行关联，使得DO维持在30％以上，通风量的最高值为3VVM，转速的最高值为1000r/min。待OD600达到15以后，加入终浓度为0.5mM的IPTG，将pH值调节剂氨水换成氢氧化钠，向发酵罐中补加600g/L的葡萄糖，使得发酵罐中葡萄糖的浓度在的20-30g/L之间，DO维持到20％以上。此后发酵进入产酸阶段开始发酵丙二酸30小时。
葡萄糖的测量：将发酵液离心以后取上清，稀释到0-1g/L范围内，使用生物传感仪SBA-40D进行测量。
OD的测量：在好氧生长阶段，取发酵液用纯水稀释到合适的倍数使用紫外分光光度计进行测量即可，波长为600nm。在厌氧阶段，取发酵液使用稀盐酸将发酵液稀释到合适的倍数使用紫外分光光度计进行测量即可，波长为600nm。
丙二酸测量：取发酵液1mL，13000r/min离心10min，取上清液通过0.22μm的滤膜。采用紫外检测器进行分析，检测参数如下：色谱柱为Aminex HPX-87H organic acidanalysis column，流动相为5mM硫酸，流动相流速为1mL/min，柱温为40℃，运行时间为1h。
如上利用各重组菌对突变前和突变后的α-酮酸脱羧酶进行发酵，并测量发酵液中的丙二酸，丙二酸标准品液相色谱图如图1所示，各重组菌丙二酸检测液相色谱图如图2-图5所示，结果如表2所示。
表2
重组菌 丙二酸产量(g/L)
含有pRSF-PDC1-yneI的重组菌 1.2
含有R75S突变的重组菌 1.6
含有I249T突变的重组菌 1.5
含有R75S和I249T突变的重组菌 2.0
由表2可知，通过对野生型α-酮酸脱羧酶进行R75S或I249T突变，能够提高丙二酸的产量，且进行组合R75S、I249T突变，能够进一步提高丙二酸的产量，减少下游分离的成本，从而降低丙二酸的生产成本。
综上所述，本发明根据大肠杆菌的密码子偏好性对来源于酒香酵母属的野生型α-酮酸脱羧酶的基因进行密码子优化，以提高该基因的表达效率；并通过基因突变的方法在该基因中引入单点突变或多点突变，使改造之后的α-酮酸脱羧酶具有催化活性，提高丙二酸的产量，利于下游丙二酸的分离，促进丙二酸的生产及应用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.α-酮酸脱羧酶突变体，其特征在于，所述α-酮酸脱羧酶突变体的氨基酸序列包括以下序列中任意一种：
(1)在SEQ ID NO:3所示序列基础上发生R75S和/或I249T突变的序列；或，
(2)由如(1)所述序列经取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列；或，
(3)与(1)或(2)所述序列具有至少90％序列同一性，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列。
2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的α-酮酸脱羧酶突变体。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括SEQ ID NO:7、SEQID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列。
4.重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2或3所述的核酸分子。
5.重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求4所述的重组载体。
6.权利要求1所述的α-酮酸脱羧酶突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将编码权利要求1所述的α-酮酸脱羧酶突变体的核酸分子插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞，进行培养和分离纯化，得到所述α-酮酸脱羧酶突变体。
7.根据权利要求6所述的α-酮酸脱羧酶突变体的制备方法，其特征在于，所述表达载体包括pRSFDuet-1载体、pETDuet-1载体、pACYCDuet-1载体、pTrc99a载体或pET28a载体；
优选地，所述宿主细胞包括大肠杆菌、酿酒酵母、谷氨酸棒状杆菌或解脂耶式酵母；
优选地，所述大肠杆菌包括大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rosetta(DE3)、大肠杆菌BL21(DE3)plysS、大肠杆菌M15或大肠杆菌Top10f。
8.权利要求1所述的α-酮酸脱羧酶突变体、权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的重组细胞或权利要求6或7所述的α-酮酸脱羧酶突变体的制备方法在制备丙二酸中的应用。
9.一种制备丙二酸的方法，其特征在于，所述制备丙二酸的方法包括：利用权利要求1所述的α-酮酸脱羧酶突变体催化底物葡萄糖，得到丙二酸。
10.根据权利要求9所述的制备丙二酸的方法，其特征在于，所述制备丙二酸的方法具体包括：
将编码权利要求1所述的α-酮酸脱羧酶突变体的核酸分子插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞，进行发酵和丙二酸分离纯化，得到丙二酸；
优选地，所述发酵包括好氧发酵阶段和产酸阶段；
优选地，所述好氧发酵阶段的发酵条件包括：溶氧值大于30％，温度为35～42℃，pH为6.0～7.2；
优选地，所述产酸阶段的发酵条件包括：OD600达到10～20时，加入IPTG诱导蛋白表达，培养液中葡萄糖的浓度为20～30g/L，溶氧值大于15％，温度为35～42℃，pH为6.0～7.2。
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