CN117362452B - 一种表达包含全能核酸酶的融合蛋白的工程菌或其衍生产物在核酸降解中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种表达包含全能核酸酶的融合蛋白的工程菌或其衍生产物在核酸降解中的应用以及提供了一种核酸降解方法，所述的工程菌表达包含全能核酸酶和促溶表达标签的融合蛋白，且该融合蛋白或全能核酸酶无需进行纯化，即可降解核酸，可将其应用于例如蛋白产品纯化中，通过降解核酸可以降低宿主菌裂解液的粘度，便于后续操作，并降低了宿主DNA、RNA残留，有效降低生产成本，节约纯化时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种表达包含全能核酸酶的融合蛋白的工程菌或其衍生产物在核酸降解中的应用。
背景技术
核酸残留量是重组蛋白药物质量的一个重要评价指标，如何去除宿主核酸残留是重组蛋白类生物药物制备过程中亟待解决的关键问题。在细胞内重组表达目的蛋白的过程中，核酸就是一类常见的杂质分子，它不仅能增加裂解液的粘度，影响下游的纯化层析；过量的核酸还将导致纯化产品的核酸污染。所以在重组蛋白生产过程中，控制核酸的含量至关重要。
核酸酶是一种能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，核酸酶属于水解酶，作用于磷酸二酯键的P-O位置。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNase），有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此被称为全能核酸酶或者非特异性核酸酶。根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶（Exonuclease）和核酸内切酶（Endonuclease）。
目前市面上主流的商业化核酸酶主要为Benzonase (粘质沙雷菌Serratiamarcescens核酸酶，全能核酸酶)、Omnicleave (Epicentre)或DNA酶I。其中，Benzonase和Omnicleave是全能核酸酶，可以消化DNA和RNA，而DNA酶I只能消化DNA。核酸酶具有广泛的用途，例如Benzonase核酸酶是来自Serratia marcescens,经基因工程改进的核酸内切酶。Benzonase核酸酶能降解所有形式(包括单链，双链，线性和环状)的DNA和RNA而没有蛋白裂解活性，在广泛条件范围具有很高的特异性。它将核酸完全消化成3-5碱基长度（杂交限度以下）的5’-单磷酸寡核苷酸，最适合从重组蛋白中去除核酸的操作。Benzonase核酸酶迅速水解核酸的能力使该酶成为降低粘度以减少处理时间和增加蛋白产量的最佳选择。该酶与BacReady-ProteinExtractionSolution和RIPALysisBuffer等蛋白抽提试剂配合使用，从而消除粗提物中的核酸，降低粘度。
利用核酸酶可以高效的去除生物制品中的核酸残留，而市售核酸酶一般为酵母表达或者大肠杆菌上清表达，生产、纯化工艺复杂，成本较高。因此，利用全能核酸酶开发一种更高效的去除生物样品中宿主核酸残留的工艺具有重要的意义。
发明内容
为克服现有技术中存在的不足，本发明提供了表达包含全能核酸酶的融合蛋白的工程菌或其衍生产物在纯化中的应用。具体的，
本发明的第一方面，提供了一种工程菌或其衍生产物在降解核酸中的应用，所述工程菌表达一种融合蛋白，所述融合蛋白包括全能核酸酶和促溶表达标签。
优选的，所述的促溶表达标签包括TrxA、SUMO、NusA、MBP、GST、DsbA或ArsC。
优选的，所述工程菌的衍生产物不包括纯化的融合蛋白或纯化的全能核酸酶。
优选的，所述工程菌的衍生产物包括工程菌的菌液和/或工程菌粗提物。
优选的，所述工程菌粗提物包括工程菌裂解后的上清液。
优选的，所述的核酸选自双链DNA，单链DNA，或RNA。
优选的，所述的全能核酸酶为灵杆菌非特异性核酸酶，所述的全能核酸酶融合蛋白包含灵杆菌非特异性核酸酶的全部或部分，进一步优选的，所述的灵杆菌非特异性核酸酶的部分氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在一个具体实施方式中，所述的促溶表达标签氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在一个具体实施方式中，所述的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
本发明的第二方面，提供了一种核酸降解方法，所述的核酸降解方法包括加入工程菌或其衍生产物对包含核酸的样品进行降解，所述工程菌表达一种融合蛋白，所述融合蛋白包括全能核酸酶和促溶表达标签。
优选的，所述的工程菌可以是大肠杆菌。进一步优选的，所述的大肠杆菌未进行改造或改造后的大肠杆菌内部为还原环境可以使融合蛋白以包涵体形式表达。
优选的，所述的促溶表达标签包括TrxA、SUMO、NusA、MBP、GST、DsbA或ArsC。
优选的，所述工程菌的衍生产物不包括纯化的融合蛋白或纯化的全能核酸酶。
优选的，所述工程菌的衍生产物包括工程菌的菌液和/或工程菌粗提物。
优选的，所述工程菌粗提物包括工程菌裂解后的上清液。
优选的，所述的核酸选自双链DNA，单链DNA，或RNA。
优选的，所述的全能核酸酶为灵杆菌非特异性核酸酶，所述的全能核酸酶融合蛋白包含灵杆菌非特异性核酸酶的全部或部分，进一步优选的，所述的灵杆菌非特异性核酸酶的部分氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在一个具体实施方式中，所述的促溶表达标签氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在一个具体实施方式中，所述的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
优选的，所述的核酸降解方法不包含融合蛋白和/或全能核酸酶纯化步骤。
优选的，所述的核酸降解方法包括：
（1）合成编码融合蛋白的基因，构建表达载体，并将表达载体转入工程菌中；
（2）培养工程菌，表达融合蛋白；
（3）将工程菌或其衍生产物，加入到样品中，对样品中的核酸进行降解。
优选的，所述的步骤（2）包括将过夜培养后工程菌的菌液转接到培养基中培养，然后加入诱导剂过夜培养。
优选的，所述的步骤（2）中菌液：培养基的转接比例为1：（50-200），例如1：（50、70、100、120、150、170、200）。更优选的，所述比例为质量比。
优选的，所述的步骤（2）中培养条件为24-37℃（例如24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37℃）、100-200rpm（例如100、130、150、180、200 rpm）。
优选的，所述的菌液培养至OD600为1.0-2.0（例如1.0、1.3、1.5、1.7、1.9、2.0）后加入诱导剂。
优选的，所述的诱导剂包括但不限于IPTG、AHL、四环素或阿拉伯糖。
优选的，所述的诱导剂浓度为0.1-1.0 mM（例如0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mM）。
优选的，所述的步骤（3）包括收集包含工程菌的菌液。
优选的，所述的步骤（3）包括将包含工程菌的菌液加入到样品后对工程菌进行裂解。
优选的，所述包含工程菌的菌液和样品添加比例为1:（50-200），例如1：（50、70、100、120、150、170、200）。更优选的，所述比例为质量比。
优选的，所述步骤（3）还包括对菌液中的工程菌进行裂解，然后加入到样品中。
优选的，所述的裂解工程菌的方式包括超声裂菌、搅拌裂菌、共均质匀浆裂菌中的一种或两种以上，所述的裂解工程菌的方式使用次数为1次或2次以上。
优选的，裂解之前将包含工程菌的菌液重悬，和/或裂解工程菌后进行温浴。
优选的，所述的步骤（3）中包括将工程菌菌液重悬于包含Tris和NaCl的缓冲液中，进一步优选的，所述的缓冲液中Tris浓度为10-30 mM（例如10、15、20、25、30 mM），NaCl浓度为0.05-0.20 M（例如0.05、0.10、0.15、0.20M）。
优选的，所述的缓冲液pH值为7-9（例如7、7.5、8、8.5、9）。
优选的，所述的步骤（3）中的温浴包括在室温下温浴20-40（例如20、25、30、35、40）分钟。
优选的，所述（3）中的样品来自目的蛋白在宿主菌或非宿主菌中表达的样品。
优选的，所述表达融合蛋白的工程菌与表达目的蛋白的宿主菌相同。进一步优选的，所述工程菌和宿主菌均为大肠杆菌。
本发明的目的蛋白包括蛋白质，也可以包括多肽，例如，短肽等氨基酸残基数量小于等于100的多肽。
本发明的第三方面，提供了一种工程菌的衍生产物，所述工程菌的衍生产物包括工程菌的菌液和/或工程菌粗提物，所述工程菌表达一种融合蛋白，所述融合蛋白包括全能核酸酶和促溶表达标签。
优选的，所述融合蛋白在工程菌中表达，进一步优选的，所述的工程菌未进行改造或改造后的工程菌内部为还原环境可以使融合蛋白以包涵体形式表达。
优选的，所述的促溶表达标签包括TrxA、SUMO、NusA、MBP、GST、DsbA或ArsC。
优选的，所述工程菌的衍生产物不包括纯化的融合蛋白或纯化的全能核酸酶。
优选的，所述工程菌的衍生产物包括工程菌的菌液和/或工程菌粗提物。
优选的，所述工程菌粗提物包括工程菌裂解后的上清液。
优选的，所述的核酸选自双链DNA，单链DNA，或RNA。
优选的，所述的全能核酸酶为灵杆菌非特异性核酸酶，所述的全能核酸酶融合蛋白包含灵杆菌非特异性核酸酶的全部或部分，进一步优选的，所述的灵杆菌非特异性核酸酶的部分氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在一个具体实施方式中，所述的促溶表达标签氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在一个具体实施方式中，所述的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
优选的，所述的工程菌可以是大肠杆菌。进一步优选的，所述的大肠杆菌未进行改造或改造后的大肠杆菌内部为还原环境可以使全能核酸酶融合蛋白以包涵体形式表达。
本发明的第四方面，提供了上述的核酸降解方法或上述的工程菌或其衍生产物在产品纯化中的应用。
优选的，所述的产品包括以核酸作为杂质或者核酸浓度低的产品。
优选的，所述的核酸选自双链DNA，单链DNA，或RNA。
本发明术语“粗提物” 指的是由生物原材料得到的未经纯化的制品，包括匀浆过的组织或破碎细胞的制品。
本发明术语“全能核酸酶” 指的是可以降解（消化）DNA和RNA的核酸酶。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明的有益效果：
本申请创造性的发现，利用包含全能核酸酶的工程菌或其衍生产物即可对样品中的核酸进行降解。融合蛋白包含促溶表达标签，增加该标签后，重组表达的融合蛋白可以更好以可溶性蛋白形式在细胞内存在，使得包含表达该融合蛋白的工程菌的菌液在裂菌处理后即可对核酸进行降解。可以直接应用包含表达该融合蛋白的工程菌的菌液加入到样品后对工程菌进行裂解。也可以将菌液中的工程菌裂解后，再对该样本中的核酸进行裂解，而不需要将融合蛋白或全能核酸酶纯化，省去了融合蛋白纯化、去除标签蛋白的步骤，降低了成本、节约时间。
本申请的包含全能核酸酶的融合蛋白在胞内还原环境中无活性，破菌过程中暴露于空气中，可以自动获得内切核酸酶活性。将融合蛋白与生产用高密度发酵表达目的蛋白的宿主菌的菌液共离心，破菌均质，能降解细胞裂解液中的核酸浓度，从而降低裂解液粘度，便于后续操作，并降低了纯化目的蛋白中宿主菌DNA、RNA残留。
附图说明
图1：SDS-PAGE检测smNuclease（箭头所指条带）表达结果。其中，1为未加融合标签的smNuclease，2 为MBP-smNuclease, M为Marker，S为上清液及可溶性蛋白，P为沉淀及非可溶性蛋白。
图2：1％琼脂糖电泳检测反应中DNA相对含量，1-6分别对应组1-6。
图3：组1-5的SDS-PAGE电泳检测结果。
图4A：GelAnalyzer软件分析图3中匀浆1次的泳道相对核酸浓度及分布结果。
图4B：GelAnalyzer软件分析图3中匀浆2次的泳道相对核酸浓度及分布结果。
图4C：GelAnalyzer软件分析图3中室温搅拌30分钟的泳道相对核酸浓度及分布结果。
图5：1％琼脂糖电泳检测组1-5中核酸残留结果，其中，P<0.05, />P<0.01,P<0.001。
图6：SDS-PAGE电泳检测蛋白peptideG（箭头所指条带）表达量，其中，S为上清液及可溶性蛋白，P为沉淀及非可溶性蛋白，1-5分别为组1-5。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 包含全能核酸酶的融合蛋白的表达
1）包含全能核酸酶的融合蛋白的序列
本研究首先确定了融合蛋白的组成，该融合蛋白在全能核酸酶的基础上添加了促溶表达标签。具体地，使用smNuclease野生型全能核酸酶以及MBP作为促溶表达标签。其中，smNuclease的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，MBP的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。融合蛋白中还添加有酶切位点以及tag标签，所添加的His tag（氨基酸序列SEQ ID NO：3）和牛肠激酶酶切位点（氨基酸序列SEQ ID NO：4）的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，融合蛋白（MBP-smNuclease）的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
2）表达质粒的构建
根据表达MBP-smNuclease蛋白序列进行大肠杆菌表达密码子优化，密码子优化及基因合成委托中美泰和生物技术（北京）有限公司完成。将合成相应基因插入表达载体pET11中，得到表达质粒pET11-MBP-smNuclease，通过热激法将表达质粒转化如大肠杆菌BL21(DE3)中，然后经氨苄抗性筛选得到BL21(DE3)+pET11-MBP-smNuclease表达菌株。
3）融合蛋白的表达
将过夜培养表达菌株的LB菌液按照菌液：培养基为1:100的比例转接到含有氨苄抗性的2L TB培养基中，37℃、180rpm培养至OD600为2.0时，加入终浓度为0.5 mM的IPTG，37℃、180rpm培养过夜。收集菌液。使用SDS-PAGE检测MBP-smNuclease表达，结果如图1所示，在此条件下MBP-smNuclease约有60%以可溶形式（S）表达（参见图1中的组2）。进一步使用超高效液相色谱（UPLC）定量计算MBP-smNuclease表达量，其总表达量为770mg/L。作为对照，若无促溶标签MBP，smNclease完全以非可溶性包涵体形式表达（参见图1中的组1）。
4）表达菌株裂解液酶活性检测
收集包含BL21(DE3)+pET11-MBP-smNuclease表达菌株的菌液，重悬于20 mM Tris ,pH 8.0 , 0.15 M NaCl缓冲液，超声裂解上述菌株，收集裂解液。加入到含有4μg 质粒DNA的反应体系中（组5-6，两次重复）。室温温浴30分钟后，使用1％琼脂糖电泳检测反应中DNA相对含量。以市售Benzonase作为阳性对照（组2），BL21(DE3)+pET11（empty vector）菌株作为阴性对照（组3和4）。
具体分组可参见表1：
表1 实验分组
结果见图2。由图2可知，BL21(DE3)+pET11-MBP-smNuclease表达菌株的裂解液具有较高核酸酶活性，可完全降解质粒DNA和RNA，在组5和6中检测不到DNA和RNA片段，而在阴性对照组（组3和4）可见到多个大小不等的DNA及RNA片段。
同时，本发明的表达菌株的裂解液对DNA/RNA的降解效果和市售纯化的Benzonase（组2）效果基本相同，也进一步表明本发明获得融合蛋白表达含量高，菌株裂解后融合蛋白活性高，不需要进一步纯化，即可达到与市售纯化的Benzonase基本相同的技术效果。
实施例2 MBP-smNuclease菌株在目的多肽生产中降解核酸的应用
该实施例以peptideG作为目的蛋白/多肽的示例，peptideG为N端连接促表达标签的GLP1(7-37)，其中GLP1(7-37)多肽氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，核苷酸序列如SEQ IDNO：10所示。通过高密度流加发酵表达生产多肽peptideG，表达宿主菌同为BL21(DE3)，表达质粒为BL21(DE3)+pET11-peptideG。收集发酵菌液，其OD600为200。按照不同比例加入BL21(DE3)+pET11-MBP-smNuclease表达菌株的菌液（OD600为20），共均质匀浆裂解菌株（如表2中组1-4）或在均质过程中加入BL21(DE3)+ pET11-MBP-smNuclease表达菌株的裂解液上清可溶部分（如表2中的组5），具体反应体系如表2所示。
表2 反应体系
在匀浆1次、2次以及在室温时搅拌30分钟后三个时间节点取样，使用1％琼脂糖电泳检测核酸残留，SDS-PAGE检测蛋白表达量。
SDS-PAGE电泳检测结果如图3所示。从图3可以看出：组2-5均可对核酸进行一定程度的降解，而未经处理的组1残留较多核酸。
进一步使用GelAnalyzer软件分析上述组1，2和5中每条泳道相对核酸浓度及分布，结果如图4A至图4C所示。根据图4A至图4C中的图像纵向比较可以看出，增加匀浆或搅拌，可以通过机械剪切部分较大的核酸（即同一组中i，ii，iii的比较），但这种方式远不如MBP-smNuclease的效果（例如将2-i和5-i与1-iii比较，2-i和5-i的DNA/RNA降解效率远大于1-iii）。从组2和组5的结果看，无论是将BL21(DE3)+ pET11-MBP-smNuclease表达菌株先裂解（组5）还是和表达目的蛋白的菌株一起匀浆裂解（组2）均可有效的降解DNA/RNA，相对于组1具有显著性的差异。
对上述各组进一步检测相对核酸浓度也可以证实这一点，结果如图5及表3所示，从图5及表3中可以看出，组2-5相比组1均具有极显著性差异，组3-4等未进行裂解的反应与组5进行裂解加入上清的反应相比，核酸降解程度不具有显著性差异。但组5与组2有显著性的差异，表明在相同剂量下，裂解后的粗提液相对于非裂解的菌液具有更好的核酸降解效果。
表3 组1-5不同处理方式后的相对核酸浓度
最终使用SDS-PAGE检测peptideG的表达量如图6所示，结果显示MBP-smNuclease的加入并不会影响peptideG的表达。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种工程菌或其衍生产物在降解核酸中的应用，其特征在于，所述工程菌表达一种融合蛋白，所述融合蛋白包括全能核酸酶和促溶表达标签，所述的全能核酸酶为灵杆菌非特异性核酸酶，所述的灵杆菌非特异性核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的灵杆菌非特异性核酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的促溶表达标签为MBP，所述的MBP的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述MBP的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；融合蛋白中还添加有tag标签和牛肠激酶酶切位点，所述tag标签的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述牛肠激酶酶切位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述牛肠激酶酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述工程菌的衍生产物不包括纯化的融合蛋白或纯化的全能核酸酶，所述的工程菌为大肠杆菌；所述工程菌的衍生产物包括工程菌的菌液和/或工程菌粗提物，所述的工程菌粗提物包括工程菌裂解后的上清液；所述工程菌的培养过程包括将过夜培养后工程菌的菌液转接到培养基中培养至OD600为2.0，然后加入诱导剂过夜培养。
2.一种核酸降解方法，其特征在于，所述的核酸降解方法包括加入工程菌或其衍生产物对包含核酸的样品进行降解，所述工程菌表达一种融合蛋白，所述融合蛋白包括全能核酸酶和促溶表达标签，所述的全能核酸酶为灵杆菌非特异性核酸酶，所述的灵杆菌非特异性核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的灵杆菌非特异性核酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的促溶表达标签为MBP，所述的MBP的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述MBP的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；融合蛋白中还添加有tag标签和牛肠激酶酶切位点，所述tag标签的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述牛肠激酶酶切位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述牛肠激酶酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO： 7所示，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述工程菌的衍生产物不包括纯化的融合蛋白或纯化的全能核酸酶，所述的工程菌或其衍生物在降解核酸时不需纯化步骤，所述工程菌为大肠杆菌；所述工程菌的衍生产物包括工程菌的菌液和/或工程菌粗提物，所述的工程菌粗提物包括工程菌裂解后的上清液；所述的核酸降解方法包括：
（1）合成编码融合蛋白的基因，构建表达载体，并将表达载体转入工程菌中；
（2）培养工程菌，表达融合蛋白；
（3）将工程菌或其衍生产物，加入到样品中，对样品中的核酸进行降解；
所述的步骤（2）包括将过夜培养后工程菌的菌液转接到培养基中培养至OD600为2.0，然后加入诱导剂过夜培养；
所述的步骤（3）包括收集包含工程菌的菌液；所述的步骤（3）还包括将包含工程菌的菌液加入到样品后对工程菌进行裂解或对菌液中的工程菌进行裂解，然后加入到样品中。
3.根据权利要求2所述的核酸降解方法，其特征在于，所述的步骤（2）中菌液：培养基的转接比例为1：（50-200），所述的培养条件为24-37℃、100-200rpm。
4.根据权利要求2或3所述的核酸降解方法，其特征在于，所述（3）中的样品包括来自目的蛋白在宿主菌或非宿主菌中表达的样品。
5.根据权利要求4所述的核酸降解方法，其特征在于，所述表达融合蛋白的工程菌与表达目的蛋白的宿主菌相同。
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| 杨海艳.灵杆菌非特异性核酸酶的原核表达、纯化及活性分析.《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》.2015,(第08期),摘要、第三章、第四章. * |
| 灵杆菌非特异性核酸酶的原核表达、纯化及活性分析;杨海艳;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》(第08期);摘要、第三章、第四章 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117362452A (zh) | 2024-01-09 |
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