CN115851794A - 一种乙肝病毒x蛋白质的制备方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及乙肝病毒X蛋白质的制备方法。更具体地说，本公开涉及制备乙肝病毒X蛋白质,其包括如下歩骤：(a)构建表达融合蛋白的重组表达载体；(b)将重组表达载体转入宿主细胞培养，得到融合蛋白；(c)提取融合蛋白；(d)对提取到的融合蛋白进行亲和纯化；(e)对纯化后的融合蛋白进行酶切，得到乙肝病毒X蛋白质。

Description

一种乙肝病毒X蛋白质的制备方法

技术领域

本公开涉及蛋白质制备领域，尤其是一种乙肝病毒X蛋白质的制备方法。

背景技术

DNA是遗传信息的携带载体，蛋白质则是生物功能的执行者，所以对蛋白质的功能结构的研究有助于对病毒全面认识，并开发对应的预防和治疗方案。目前蛋白质研究通常需要先重组表达和纯化，制备大量正确折叠、足够纯度的蛋白质样品，再做后续相应的科学研究(比如三维空间结构研究)。目前除了核心抗原蛋白质能够通过重组表达制备，满足科学研究需求的蛋白质样品之外，其他3个蛋白质目前都很难通过重组表达方式得到合格的蛋白质样品。

乙肝病毒是一种小型的DNA病毒，全长约3200核苷酸碱基对，编码4个蛋白质：表面抗原蛋白质，核心抗原蛋白质和聚合酶蛋白质和X蛋白质。乙肝病毒的X蛋白质含有154个氨基酸残基，不同来源病毒的X蛋白质序列稍有不同。X蛋白质虽然分子不大，但在病毒繁殖致病过程中充当重要的角色，是乙肝病毒的多功能触发因子，能够与宿主细胞的许多蛋白质相互作用，进而触发一系列下游的生物学功能(刘剑平,等.乙肝病毒X蛋白结合蛋白最新研究进展[J].基因组学与应用生物学,2012(2)：192-196)。X蛋白质含有9个半胱氨酸，个别来源序列有10个半胱氨酸，文献报道X蛋白质能够形成4对内部二硫键(Yin,C.Y.(2002).OverExpression,Purification and Characterization Of Hepatitis B Virus X Protein(HBx)And Its Interacting Partner HBx-Interacting Protein(XIP)(Doctoraldissertation,The Chinese University of Hong Kong)，此类含有内部二硫键的蛋白质在传统原核表达系统(如大肠杆菌)进行重组表达容易形成不可溶的包涵体。

蛋白质重组表达难度具有很大的个体差异性，没有通用的万能方法，乙肝病毒X蛋白质的个体特性导致其重组表达困难：容易形成包涵体，导致无法得到足量的可溶性的蛋白质样品供后续科学研究。

因此，有必要研究一种大量制备可溶性乙肝病毒X蛋白质的方法。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本公开提供了一种乙肝病毒X蛋白质的制备方法，其包括如下歩骤：

(a)构建表达融合蛋白的重组表达载体，其中，所述融合蛋白包含MDH和乙肝病毒X蛋白质；

(b)将重组表达载体转入宿主细胞培养，得到融合蛋白；

(c)提取融合蛋白；

(d)对提取到的融合蛋白进行纯化；

(e)对纯化后的融合蛋白进行酶切，得到乙肝病毒X蛋白质。

具体地，构建所述重组载体的方法包括把大肠杆菌苹果酸脱氢酶(MDH)基因序列放置在X蛋白质基因的上游，MDH核苷酸序列和X蛋白质核苷酸序列用Precission Protease(简称pp蛋白酶)识别切割位点序列(CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC，SEQ ID NO.5) 通过由商业公司全合成的方式完成连接，然后把融合基因片段连接在Pet-28a载体的BamH I 和XhoI之间，得到重组载体经过测序验证正确，然后转化进入大肠杆菌BL21(De3)，得到重组菌。

进一步地，通过诱导表达使重组菌表达融合蛋白质，诱导表达的方法包括：于第一天下午，将重组菌接种于含有10mL LB培养基的试管，其中卡那抗生素的终浓度为50μg/mL，放置摇床过夜培养，培养条件是37摄氏度和200转/分钟。第二天上午，取生长正常的过夜培养物10ml接种于含有1000mL LB培养基的2L摇瓶，其中卡那抗生素的终浓度为50μg/mL，然后放置摇床培养，培养条件是37摄氏度和200转/分钟。在大约3-6小时，当培养液的OD_600nm为约0.6-0.8时，摇床开始降温到16摄氏度，然后添加终浓度为0.2mM的诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，继续过夜培养16小时。

具体地，所述制备方法还包括：提取融合蛋白，将得到的融合蛋白进行纯化；进一步地，所述制备方法还包括对纯化后的融合蛋白进行酶切，得到乙肝病毒X蛋白质。

本公开提供了一种乙肝病毒X蛋白质的制备方法，可以大量表达可溶的乙肝病毒X蛋白自。通过在重组表达载体启动子和目标基因序列之间添加一个已验证过的表达性能很好的辅助蛋白质序列，增加了后续目的基因的表达量和可溶性。

附图的简要说明

图1是说明转入重组表达载体的重组大肠杆菌加入诱导物前后融合蛋白表达量的示意图，诱导后融合蛋白有明显的可溶性表达。

图2是说明重组蛋白质亲和纯化后“20mM后介质样品”、“40mM后介质样品”和“洗脱液”中蛋白质分子量的示意图。

图3是说明融合蛋白被pp酶切割成X蛋白质和MDH两个独立蛋白质的示意图。

具体实施方式

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。

如本文使用的和除非另作说明，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”、包括其语法上的等同形式，通常应当理解为开放式且非限制性的，例如，不排除其他未列举的要素或步骤。

术语“融合蛋白”是指具有通过共价键相互结合的两个部分的多肽，各部分具有不同的特性。该特性例如可以是体外或体内活性等生物学性质。此外，该特性甚至还可以是单一的化学或物理性质、例如与对象抗原的结合、反应的催化等。这两个部分可以通过单一的肽键直接结合、或者经由包含1个或多个氨基酸残基的肽接头进行结合。通常，这两个部分和接头存在于相同的读取框中。优选多肽的两个部分由异种或不同的多肽获得。

在一方面，本公开提供了一种乙肝病毒X蛋白质的制备方法，其包括以下歩骤：(a)构建表达融合蛋白的重组表达载体，其中，所述融合蛋白包含MDH和乙肝病毒X蛋白质；(b)将重组表达载体转入宿主细胞培养，得到融合蛋白；(c)提取融合蛋白；(d)对提取到的融合蛋白进行纯化；(e)对纯化后的融合蛋白进行酶切，得到乙肝病毒X蛋白质。

根据前一方面，其中步骤(a)所述重组表达载体为原核生物表达载体或真核生物表达载体；

在一些实施方式中，所述原核表达载体选自pET-28a、pET-30a、pET-31b、pET-34b、pET-35b、 pET22b或pET-43.1；

在一些实施方式中，所述真核表达载体选自pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pPIC9、pHIL-S1、pPIC9K。

根据前一方面，其中步骤(a)所述乙肝病毒X蛋白质的氨基酸序列包含与SEQ IDNO 1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述乙肝病毒X蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

在一些实施方式中，所述乙肝病毒X蛋白质的编码核酸包含与SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述乙肝病毒X蛋白质的编码核酸如SEQ ID NO.2所示。

在一些实施方式中，所述MDH的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.3所示氨基酸序列具有 80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述MDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

在一些实施方式中，所述MDH的编码核酸包含与SEQ ID NO.4所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述MDH的编码核酸如SEQ ID NO.4所示。

根据前一方面，其中步骤(a)中所述融合蛋白还包含Precission蛋白酶识别位点和/或组氨酸标签；

优选地，所述Precission蛋白酶识别位点的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；

优选地，所述Precission蛋白酶识别位点的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.8所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述乙肝病毒X 蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；

优选地，所述融合蛋白的编码核酸包含与SEQ ID NO.7所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述乙肝病毒X蛋白质的编码核酸如SEQ ID No.7所示。

根据前一方面，其中步骤(b)中所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞或昆虫细胞；

在一些实施方式中，所述原核细胞选自芽孢杆菌属，梭菌属，肠球菌属，土芽孢杆菌属，乳杆菌属，乳球菌属，海洋芽孢杆菌属，葡萄球菌属，链球菌属，链霉菌属，弯曲杆菌，大肠杆菌，黄杆菌属，梭杆菌属，螺杆菌属，泥杆菌属，奈瑟氏菌属，假单胞菌属，沙门氏菌属和脲原体属；更优选地，所述原核细胞是大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌是BL21(De3)；

在一些实施方式中，所述真核细胞选自酵母细胞，例如，假丝酵母属，汉逊酵母属，克鲁维酵母属，毕赤酵母属，酵母属，裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母，卡尔酵母，酿酒酵母，糖化酵母，道格拉氏酵母，克鲁弗酵母，诺地酵母，卵形酵母或解脂耶氏酵母细胞；

优选地，所述昆虫细胞选自sf9细胞，sf21细胞，Hi5细胞。

根据前一方面，在步骤(b)所述培养的过程中通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂来诱导宿主细胞表达融合蛋白，诱导表达的温度为10℃～17℃，诱导表达的时间为 10h～16h。

根据前一方面，在步骤(c)中所述提取之前先对步骤(b)中所述宿主细胞进行离心，

在一些实施方式中，使用5000g离心力对所述宿主细胞离心10分钟后离弃上清，用50mL 缓冲液重悬所述宿主细胞，所述缓冲液包括50mM Tris，100mM NaCl，其pH为8.0。

根据前一方面，在步骤(c)中所述提取包括冰浴超声波破碎、反复冻融、裂解液处理，

在一些实施方式中，所述冰浴超声波破碎的功率为200W，4秒破碎4秒间隔休息，总破碎时间30分钟。

根据前一方面，其中在步骤(d)中，所述纯化是亲和纯化；优选地，所述亲和纯化所使用的洗脱液包括0～300mM咪唑，50mM Tris，100mM NaCl，其pH为8.0。

根据前一方面，其中在步骤(e)所述酶切是通过加入pp酶酶切所述融合蛋白，从而得到乙肝病毒X蛋白质。

为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本公开的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。

实施例

实施例1：重组蛋白质的可溶性表达

本实施例构建了融合蛋白的表达载体，并将表达载体进行蛋白表达。其中，所述融合蛋白从N端至C端依次包含以下片段：MDH、Precission蛋白酶识别位点、X蛋白质以及组氨酸标签，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.8所示

步骤1.重组载体构建

在商业载体Pet-28(a)的BamH I和Xho I之间依次连接MDH的基因序列(SEQ IDNO. 4)、PP酶切割识别序列(CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC，SEQ ID NO.5)和X蛋白质的基因序列(SEQ ID NO.2)，重组载体经过全长核苷酸序列测序正确后转化进入大肠杆菌 BL21(DE3)，得到重组菌。

步骤2.重组菌的蛋白质表达

第一天下午，将重组菌接种到含有10mL LB培养基的试管，其中，卡那抗生素的终浓度为50μg/mL，放置摇床过夜培养，培养条件是37摄氏度和200转/分钟。第二天上午，取生长正常的过夜培养物10ml接种于含有1000mL LB培养基的2L摇瓶，卡那抗生素的终浓度为50μg/mL，然后放置摇床培养，培养条件是37摄氏度和200转/分钟。大约3-6小时后，当培养液的OD_600nm为约0.6-0.8时，取1mL培养液作为“诱导前样品”，同时摇床降温到16摄氏度，再添加终浓度为0.2mM的诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，过夜培养16小时，取1mL作为“诱导后样品”。

步骤3：蛋白质表达的可溶性确定

菌体通过离心收集，5000g离心力10分钟，丢弃上清。用50mL缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，pH＝8.0)进行菌体重悬。之后再冰浴超声波破碎，功率200w，4秒破碎4秒间隔休息，总破碎时间30分钟。为了验证重组菌蛋白质表达的可溶性，取200μl破碎液用 16000g离心力离心30分钟后，取全部上清(体积约180μl)标记为“上清样品”；沉淀部分用500μl缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，pH＝8.0)轻柔冲洗并丢弃，然后再用180μl缓冲液(50mMTris，100mM NaCl，pH＝8.0)重悬沉淀物，标记为“沉淀样品”。然后把上述“诱导前”、“诱导后”、“沉淀”和“上清”4个样品进行常规的蛋白质变性电泳胶实验，结果如图1所示，5是蛋白质marker，分子量由大到小分别是70、60、50、42、29和22千道尔顿。图1中的1、2、3和4分别是上述“诱导前”、“诱导后”、“沉淀”和“上清”4个样品，图1中黑色箭头所示就是目标蛋白质，目标X蛋白质得到很好的可溶性表达。

实施例2：重组蛋白质纯化

将实施例1中充分超声破碎的细胞液用16000g离心力离心30分钟，上清液进行常规的 6个组氨酸标签的亲和纯化。装有3mL镍介质的重力柱用tris缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，pH＝8.0)预平衡后，将上清液导入柱中，由于重力驱动上清液流经镍介质，含有6个组氨酸标签的X蛋白质被镍介质吸附，其他杂蛋白质流穿。然后再用不同咪唑浓度(0mM， 20mM和40mM)的tris缓冲液梯度洗脱，具体操作如下：用50mL含20mM咪唑的缓冲液冲洗，封住下端堵头后再添加2mL缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，pH＝8.0)并重悬镍介质，然后取出50μL悬浮介质作为“20mM后介质样品”。然后再用50mL含40mM咪唑的缓冲液冲洗，封住下端堵头后再添加2mL缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，pH＝8.0)并重悬镍介质，然后取出50μL悬浮介质作为“40mM后介质样品”。最后再用30mL含300mM 咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白质，从前面30mL洗脱液中取50μl样品，标记为“洗脱液”，把上述3个样品(20mM后介质样品、40mM后介质样品、洗脱液)进行常规的蛋白质变性电泳胶实验，结果见图2。图2中“4”是蛋白质Marker，分子量由大到小分别是95、70、60、 50、42、29/和道尔顿。图中的“1”、“2”和“3”分别是“20mM后介质样品”、“40mM后介质样品”和“洗脱液”。图中2中黑色箭头所示就是纯化后的MDH-X融合蛋白质。

实施例3：纯化后重组蛋白质的蛋白酶酶切

收集实施例2中含300mM咪唑的缓冲液洗脱下来的样品，用30Kd截留值浓缩管浓缩到较小体积，比如1mL，然后添加10mL没有咪唑的缓冲液(50Mm Tris,100Mm NaCl,Ph＝8.0)，再浓缩至1ml，循环3次换液操作，最后定容到2ml体积。添加约100μg precissionprotease (简称pp酶)进行16摄氏度过夜静止酶切。切割前后各取50μl样品进行常规的蛋白质变性电泳实验。结果如图3所示，“1”是蛋白质Marker，分子量由大到小分别是95,70、60、50、 42和29千道尔顿。“2”是切割前，“3”是切割后，结果显示切割后融合X蛋白质被切割成 X蛋白质和MDH两个独立的蛋白质条带，图中箭头是切割后得到的目的蛋白质(X蛋白质)。

序列表

<110> 中国科学院生物物理研究所

<120> 一种乙肝病毒X蛋白质的制备方法

<130> MTI21211

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 154

<212> PRT

<213> Hepatitis B virus

<400> 1

Met Ala Ala Arg Met Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu

1 5 10 15

Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Val Ser Gly

20 25 30

Ala Phe Gly Thr Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ala Val Pro Thr Asp

35 40 45

His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala Arg Arg Met Ala

65 70 75 80

Thr Thr Val Asn Ala His Gln Val Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg

85 90 95

Thr Leu Gly Leu Ala Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe

100 105 110

Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Thr Arg

115 120 125

Leu Met Ile Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val Cys Ser

130 135 140

Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Thr Ser Ala

145 150

<210> 2

<211> 462

<212> DNA

<213> Hepatitis B virus

<400> 2

atggcggcgc gcatgtgctg ccagctggat ccggcgcgcg atgtgctgtg cctgcgcccg 60

gtgggcgcgg aaagccgcgg ccgcccggtg agcggcgcgt ttggcaccct gccgagcccg 120

agcagcagcg cggtgccgac cgatcatggc gcgcatctga gcctgcgcgg cctgccggtg 180

tgcgcgttta gcagcgcggg cccgtgcgcg ctgcgcttta ccagcgcgcg ccgcatggcg 240

accaccgtga acgcgcatca ggtgctgccg aaagtgctgc ataaacgcac cctgggcctg 300

gcggcgatga gcaccaccga tctggaagcg tattttaaag attgcctgtt taaagattgg 360

gaagaactgg gcgaagaaac ccgcctgatg atttttgtgc tgggcggctg ccgccataaa 420

ctggtgtgca gcccggcgcc gtgcaacttt tttaccagcg cg 462

<210> 3

<211> 332

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 3

Met Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Ala Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Lys Thr Gln Leu Pro Ser Gly Ser Glu Leu Ser Leu

20 25 30

Tyr Asp Ile Ala Pro Val Thr Pro Gly Val Ala Val Asp Leu Ser His

35 40 45

Ile Pro Thr Ala Val Lys Ile Lys Gly Phe Ser Gly Glu Asp Ala Thr

50 55 60

Pro Ala Leu Glu Gly Ala Asp Val Val Leu Ile Ser Ala Gly Val Ala

65 70 75 80

Arg Lys Pro Gly Met Asp Arg Ser Asp Leu Phe Asn Val Asn Ala Gly

85 90 95

Ile Val Lys Asn Leu Val Gln Gln Val Ala Lys Thr Cys Pro Lys Ala

100 105 110

Cys Ile Gly Ile Ile Thr Asn Pro Val Asn Thr Thr Val Ala Ile Ala

115 120 125

Ala Glu Val Leu Lys Lys Ala Gly Val Tyr Asp Lys Asn Lys Leu Phe

130 135 140

Gly Val Thr Thr Leu Asp Ile Ile Arg Ser Asn Thr Phe Val Ala Glu

145 150 155 160

Leu Lys Gly Lys Gln Pro Gly Glu Val Glu Val Pro Val Ile Gly Gly

165 170 175

His Ser Gly Val Thr Ile Leu Pro Leu Leu Ser Gln Val Pro Gly Val

180 185 190

Ser Phe Thr Glu Gln Glu Val Ala Asp Leu Thr Lys Arg Ile Gln Asn

195 200 205

Ala Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Gly Gly Ser Ala Thr

210 215 220

Leu Ser Met Gly Gln Ala Ala Ala Arg Phe Gly Leu Ser Leu Val Arg

225 230 235 240

Ala Leu Gln Gly Glu Gln Gly Val Val Glu Cys Ala Tyr Val Glu Gly

245 250 255

Asp Gly Gln Tyr Ala Arg Phe Phe Ser Gln Pro Leu Leu Leu Gly Lys

260 265 270

Asn Gly Val Glu Glu Arg Lys Ser Ile Gly Thr Leu Ser Ala Phe Glu

275 280 285

Gln Asn Ala Leu Glu Gly Met Leu Asp Thr Leu Lys Lys Asp Ile Ala

290 295 300

Leu Gly Glu Glu Phe Val Asn Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly

305 310 315 320

Gly Gly Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Gly

325 330

<210> 4

<211> 996

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 4

atgaaagtcg cagtcctcgg cgctgctggc ggtattggcc aggcgcttgc actactgtta 60

aaaacccaac tgccttcagg ttcagaactc tctctgtatg atatcgctcc agtgactccc 120

ggtgtggctg tcgatctgag ccatatccct actgctgtga aaatcaaagg tttttctggt 180

gaagatgcga ctccggcgct ggaaggcgca gatgtcgttc ttatctctgc aggcgtagcg 240

cgtaaaccgg gtatggatcg ttccgacctg tttaacgtta acgccggcat cgtgaaaaac 300

ctggtacagc aagttgcgaa aacctgcccg aaagcgtgca ttggtattat cactaacccg 360

gttaacacca cagttgcaat tgctgctgaa gtgctgaaaa aagccggtgt ttatgacaaa 420

aacaaactgt tcggcgttac cacgctggat atcattcgtt ccaacacctt tgttgcggaa 480

ctgaaaggca aacagccagg cgaagttgaa gtgccggtta ttggcggtca ctctggtgtt 540

accattctgc cgctgctgtc acaggttcct ggcgttagtt ttaccgagca ggaagtggct 600

gatctgacca aacgcatcca gaacgcgggt actgaagtgg ttgaagcgaa ggccggtggc 660

gggtctgcaa ccctgtctat gggccaggca gctgcacgtt ttggtctgtc tctggttcgt 720

gcactgcagg gcgaacaagg cgttgtcgaa tgtgcctacg ttgaaggcga cggtcagtac 780

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atcggtaccc tgagcgcatt tgaacagaac gcgctggaag gtatgctgga tacgctgaag 900

aaagatatcg ccctgggcga agagttcgtt aataaggacg acgacgacaa aggatcaggt 960

ggtggtctgg aagttctgtt ccagggtccg ggtgga 996

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctggaagttc tgttccaggg gccc 24

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro

1 5

<210> 7

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaaagtcg cagtcctcgg cgctgctggc ggtattggcc aggcgcttgc actactgtta 60

aaaacccaac tgccttcagg ttcagaactc tctctgtatg atatcgctcc agtgactccc 120

ggtgtggctg tcgatctgag ccatatccct actgctgtga aaatcaaagg tttttctggt 180

gaagatgcga ctccggcgct ggaaggcgca gatgtcgttc ttatctctgc aggcgtagcg 240

cgtaaaccgg gtatggatcg ttccgacctg tttaacgtta acgccggcat cgtgaaaaac 300

ctggtacagc aagttgcgaa aacctgcccg aaagcgtgca ttggtattat cactaacccg 360

gttaacacca cagttgcaat tgctgctgaa gtgctgaaaa aagccggtgt ttatgacaaa 420

aacaaactgt tcggcgttac cacgctggat atcattcgtt ccaacacctt tgttgcggaa 480

ctgaaaggca aacagccagg cgaagttgaa gtgccggtta ttggcggtca ctctggtgtt 540

accattctgc cgctgctgtc acaggttcct ggcgttagtt ttaccgagca ggaagtggct 600

gatctgacca aacgcatcca gaacgcgggt actgaagtgg ttgaagcgaa ggccggtggc 660

gggtctgcaa ccctgtctat gggccaggca gctgcacgtt ttggtctgtc tctggttcgt 720

gcactgcagg gcgaacaagg cgttgtcgaa tgtgcctacg ttgaaggcga cggtcagtac 780

gcccgtttct tctctcaacc gctgctgctg ggtaaaaacg gcgtggaaga gcgtaaatct 840

atcggtaccc tgagcgcatt tgaacagaac gcgctggaag gtatgctgga tacgctgaag 900

aaagatatcg ccctgggcga agagttcgtt aataaggacg acgacgacaa aggatcaggt 960

ggtggtctgg aagttctgtt ccagggtccg ggtggactgg aagttctgtt ccaggggccc 1020

atggcggcgc gcatgtgctg ccagctggat ccggcgcgcg atgtgctgtg cctgcgcccg 1080

gtgggcgcgg aaagccgcgg ccgcccggtg agcggcgcgt ttggcaccct gccgagcccg 1140

agcagcagcg cggtgccgac cgatcatggc gcgcatctga gcctgcgcgg cctgccggtg 1200

tgcgcgttta gcagcgcggg cccgtgcgcg ctgcgcttta ccagcgcgcg ccgcatggcg 1260

accaccgtga acgcgcatca ggtgctgccg aaagtgctgc ataaacgcac cctgggcctg 1320

gcggcgatga gcaccaccga tctggaagcg tattttaaag attgcctgtt taaagattgg 1380

gaagaactgg gcgaagaaac ccgcctgatg atttttgtgc tgggcggctg ccgccataaa 1440

ctggtgtgca gcccggcgcc gtgcaacttt tttaccagcg cgcatcatca tcatcatcat 1500

<210> 8

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Ala Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Lys Thr Gln Leu Pro Ser Gly Ser Glu Leu Ser Leu

20 25 30

Tyr Asp Ile Ala Pro Val Thr Pro Gly Val Ala Val Asp Leu Ser His

35 40 45

Ile Pro Thr Ala Val Lys Ile Lys Gly Phe Ser Gly Glu Asp Ala Thr

50 55 60

Pro Ala Leu Glu Gly Ala Asp Val Val Leu Ile Ser Ala Gly Val Ala

65 70 75 80

Arg Lys Pro Gly Met Asp Arg Ser Asp Leu Phe Asn Val Asn Ala Gly

85 90 95

Ile Val Lys Asn Leu Val Gln Gln Val Ala Lys Thr Cys Pro Lys Ala

100 105 110

Cys Ile Gly Ile Ile Thr Asn Pro Val Asn Thr Thr Val Ala Ile Ala

115 120 125

Ala Glu Val Leu Lys Lys Ala Gly Val Tyr Asp Lys Asn Lys Leu Phe

130 135 140

Gly Val Thr Thr Leu Asp Ile Ile Arg Ser Asn Thr Phe Val Ala Glu

145 150 155 160

Leu Lys Gly Lys Gln Pro Gly Glu Val Glu Val Pro Val Ile Gly Gly

165 170 175

His Ser Gly Val Thr Ile Leu Pro Leu Leu Ser Gln Val Pro Gly Val

180 185 190

Ser Phe Thr Glu Gln Glu Val Ala Asp Leu Thr Lys Arg Ile Gln Asn

195 200 205

Ala Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Gly Gly Ser Ala Thr

210 215 220

Leu Ser Met Gly Gln Ala Ala Ala Arg Phe Gly Leu Ser Leu Val Arg

225 230 235 240

Ala Leu Gln Gly Glu Gln Gly Val Val Glu Cys Ala Tyr Val Glu Gly

245 250 255

Asp Gly Gln Tyr Ala Arg Phe Phe Ser Gln Pro Leu Leu Leu Gly Lys

260 265 270

Asn Gly Val Glu Glu Arg Lys Ser Ile Gly Thr Leu Ser Ala Phe Glu

275 280 285

Gln Asn Ala Leu Glu Gly Met Leu Asp Thr Leu Lys Lys Asp Ile Ala

290 295 300

Leu Gly Glu Glu Phe Val Asn Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly

305 310 315 320

Gly Gly Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Gly Leu Glu Val Leu

325 330 335

Phe Gln Gly Pro Met Ala Ala Arg Met Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala

340 345 350

Arg Asp Val Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg

355 360 365

Pro Val Ser Gly Ala Phe Gly Thr Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ala

370 375 380

Val Pro Thr Asp His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val

385 390 395 400

Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala

405 410 415

Arg Arg Met Ala Thr Thr Val Asn Ala His Gln Val Leu Pro Lys Val

420 425 430

Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ala Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu

435 440 445

Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly

450 455 460

Glu Glu Thr Arg Leu Met Ile Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys

465 470 475 480

Leu Val Cys Ser Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Thr Ser Ala His His

485 490 495

His His His His

500

Claims (10)

1.一种乙肝病毒X蛋白质的制备方法，其包括以下歩骤：(a)构建表达融合蛋白的重组表达载体，其中，所述融合蛋白包含MDH和乙肝病毒X蛋白质；(b)将重组表达载体转入宿主细胞培养，得到融合蛋白；(c)提取融合蛋白；(d)对提取到的融合蛋白进行纯化；(e)对纯化后的融合蛋白进行酶切，得到乙肝病毒X蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)所述重组表达载体为原核生物表达载体或真核生物表达载体；

优选地，所述原核表达载体选自pET-28a、pET-30a、pET-31b、pET-34b、pET-35b、pET22b或pET-43.1；

优选地，所述真核表达载体选自pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pPIC9、pHIL-S1、pPIC9K。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(a)中，所述乙肝病毒X蛋白质的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述乙肝病毒X蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

优选地，所述乙肝病毒X蛋白质的编码核酸包含与SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述乙肝病毒X蛋白质的编码核酸如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述MDH的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.3所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述MDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述MDH的编码核酸包含与SEQ ID NO.4所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述MDH的编码核酸如SEQID NO.4所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述融合蛋白还包含Precission蛋白酶识别位点和/或组氨酸标签；

优选地，所述Precission蛋白酶识别位点的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；

优选地，所述Precission蛋白酶识别位点的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.8所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述乙肝病毒X蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；

优选地，所述融合蛋白的编码核酸包含与SEQ ID NO.7所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述乙肝病毒X蛋白质的编码核酸如SEQ ID No.7所示。

5.根据权利要求1-4所述的方法，其中步骤(b)中所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞或昆虫细胞；

优选地，所述原核细胞选自芽孢杆菌属，梭菌属，肠球菌属，土芽孢杆菌属，乳杆菌属，乳球菌属，海洋芽孢杆菌属，葡萄球菌属，链球菌属，链霉菌属，弯曲杆菌，大肠杆菌，黄杆菌属，梭杆菌属，螺杆菌属，泥杆菌属，奈瑟氏菌属，假单胞菌属，沙门氏菌属和脲原体属；更优选地，所述原核细胞是大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌是BL21(De3)；

优选地，所述真核细胞选自酵母细胞，例如，假丝酵母属，汉逊酵母属，克鲁维酵母属，毕赤酵母属，酵母属，裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母，卡尔酵母，酿酒酵母，糖化酵母，道格拉氏酵母，克鲁弗酵母，诺地酵母，卵形酵母或解脂耶氏酵母细胞；

优选地，所述昆虫细胞选自sf9细胞，sf21细胞，Hi5细胞。

6.根据权利要求1-5所述的方法，在步骤(b)所述培养的过程中通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂来诱导宿主细胞表达融合蛋白，诱导表达的温度为10℃～17℃，诱导表达的时间为10h～16h。

7.根据权利要求1-6所述的方法，在步骤(c)中所述提取之前先对步骤(b)中所述宿主细胞进行离心，

优选地，使用5000g离心力对所述宿主细胞离心10分钟后离弃上清，用50mL缓冲液重悬所述宿主细胞，所述缓冲液包括50mM Tris，100mM NaCl，其pH为8.0。

8.根据权利要求1-7所述的方法，在步骤(c)中所述提取包括冰浴超声波破碎、反复冻融、裂解液处理，

优选地，所述冰浴超声波破碎的功率为200W，4秒破碎4秒间隔休息，总破碎时间30分钟。

9.根据权利要求1-8所述的方法，其中在步骤(d)中，所述纯化是亲和纯化；优选地，所述亲和纯化所使用的洗脱液包括0～300mM咪唑，50mM Tris，100mM NaCl，其pH为8.0。

10.根据权利要求1-9所述的方法，其中在步骤(e)所述酶切是通过加入pp酶酶切所述融合蛋白，从而得到乙肝病毒X蛋白质。

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