JP2521240B2 - プロモ―タ― - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はサッカロマイセス・オレ
アギノーサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｏｌｅａｇ
ｉｎｏｓｕｓ）より抽出したα−ガラクトシダーゼ遺伝
子のプロモーターに関するものである。

【０００２】本発明は、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の
構造解明にも成功したものであって、本発明に係るプロ
モーター配列とともに分泌配列及び構造遺伝子をベクタ
ーに導入し、得られた組換えプラスミドを用いることに
より、α−ガラクトシダーゼの大量生産はもとより他の
異種蛋白を効率よく分泌させる技術にも応用することが
できるものである。

【０００３】

【従来の技術】α−ガラクトシダーゼは、メリビオース
やラフィノースの様なα−ガラクトシドに作用して糖鎖
の非還元末端のα−ガラクトシドを分解する酵素であっ
て、甜菜糖製造工業においては糖液中に含有するラフィ
ノースが蔗糖の結晶作用を阻害するなど製糖作業に有害
物となっていることより、アブシディアあるいはモルチ
ェレラ等の糸状菌菌体含有のα−ガラクトシダーゼを利
用して糖液中のラフィノースの分解除去を行い、製糖作
業の改善、砂糖収量歩留りの向上を図っている。

【０００４】一方、製パン業におけるパン用酵母に使用
されているサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）の培養に用いる糖質源は甘蔗糖蜜、甜
菜糖蜜などの糖蜜が用いられているが、甜菜糖蜜にあっ
ては、その中に非発酵性糖分を含むため、含有する全糖
質分を発酵原料に利用することができない。

【０００５】また近年の製糖技術の発達に伴いこれら糖
蜜中の発酵性糖分は減少傾向にあり、パン用酵母の培養
には好ましくない無機、有機化合物の濃度が高くなって
いる。

【０００６】前記甜菜糖蜜中における非発酵性糖分は主
にラフィノースであるが、パン用酵母サッカロマイセス
・セレビシエはこれを資化できないため、甜菜糖蜜を使
用する場合、ラフィノースの糖分利用について、１／３
発酵といわれているものしか行われていない。すなわ
ち、ラフィノースはガラクトース、グルコース、フラク
トースからなる３糖類であるが、これに対してサッカロ
マイセス・セレビシエは、グルコースとフラクトースの
結合は切るがガラクトースとグルコースからなるメリビ
オースを残しているものである。

【０００７】本発明は、このような技術の現状におい
て、α−ガラクトシド結合を切断する酵素であるα−ガ
ラクトシダーゼの効率的利用を遺伝子レベルでとらえ且
つそれにはじめて成功したものである。

【０００８】α−ガラクトシダーゼまたはメリビアーゼ
の遺伝子に関し、サッカロマイセス・カールスベルゲン
シス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒ
ｇｅｎｓｉｓ）由来のものは最近になってその構造が解
明されてはいるが（特表昭６２−５０２０２５号）、本
発明に係るサッカロマイセス・オレアギノーサス（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ）由
来のα−ガラクトシダーゼ遺伝子とは、後記するところ
からも明らかなようにその構造が相違しており、両者は
全く別異のものである。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記酵母由
来のα−ガラクトシダーゼ遺伝子の解明を目的としてな
されたものであるが、その最終目標のひとつは、ラフィ
ノースを含有する糖蜜を充分に発酵資化しうるパン酵母
の開発、つまり特にビート糖蜜培地を用いても充分に培
養しうるパン酵母の開発である。

【００１０】またそれに関連して、本発明は、ビート糖
液中に存在するラフィノースを分解してビート糖の収率
を高めるために従来用いられていた糸状菌に代りうる新
しい菌体を開発することもその最終目標とするものであ
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記最終目標
を達成するのに適した微生物を遺伝子工学的手法によっ
て創製することとし、その過程において、上記目的を達
成するのに成功したものである。

【００１２】そこで先ず、本発明者らは、上記のような
糖資源として、糖蜜中に含まれている非発酵性糖分、特
にラフィノースについて注目し、パン酵母と同属の酵母
中より抽出したα−ガラクトシダーゼ発現に関与してい
る遺伝子をプラスミドベクターに挿入した組換えＤＮＡ
を得、この組換えＤＮＡをサッカロマイセス・セレビシ
エに導入して形質転換すれば非発酵性糖分のラフィノー
スも資化し得るパン用酵母となし得るので、本発明者ら
は、先ずはじめに、このパン用酵母に導入し得るプラス
ミドを開発することとした。

【００１３】そして酵母におけるα−ガラクトシダーゼ
遺伝子を求めて、本発明者らは酵母中よりラフィノース
発酵性の強い菌株について順次スクリーニングを行った
結果、サッカロマイセス・オレアギノーサス（Ｓ．ｏｌ
ｅａｇｉｎｏｓｕｓ）にその存在を認め、α−ガラクト
シダーゼ遺伝子を抽出する菌株としてサッカロマイセス
・オレアギノーサスＩＦＯ １９９８を選択した。以下
本発明について詳細に説明する。

【００１４】まずα−ガラクトシダーゼの発現に関与し
ている遺伝子を含有するＤＮＡの調製について述べる
と、サッカロマイセス・オレアギノーサスは通常の酵母
培養法により培養して培養物を得ることができる。培養
する培地としてはＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプト
ン２％、グルコース２％）などが使用できる。

【００１５】このようにして得られた培養物は、通常３
０００ｒｐｍで３分間程度遠心集菌し、サッカロマイセ
ス・オレアギノーサスの菌体を得る。

【００１６】得られた菌体から、例えばロドリゲスらの
方法第１６７頁〜第１６９頁（Ｒｏｄｏｒｉｇｕｅｚ
ａｎｄ Ｔａｉｔ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅ
ｙ Ｐｕｂ．Ｃｏ．）（１９８３））により、染色体Ｄ
ＮＡを得ることができる。

【００１７】ついでこの染色体ＤＮＡは、突出末端を生
じさせる製限酵素Ｂａｍ ＨＩ（日本ジーン製）または
Ｂａｍ ＨＩとアイソシゾマーである制限酵素Ｓａｕ
３ＡＩ（日本ジーン製）で部分分解し、部分分解ＤＮＡ
を得る。

【００１８】このようにして得た部分分解ＤＮＡは、調
製用電気泳動装置ＥＬＦＥシステム（Ｇｅｎｏｆｉｔ
製）を使用し、アガロース電気泳動法により分画して、
サッカロマイセス・オレアギノーサスより抽出したα−
ガラクトシダーゼの発現に関与している遺伝子を含む分
画した部分分解ＤＮＡを得る。

【００１９】次に本発明において用いることができるベ
クターＤＮＡとしては、酵母と大腸菌の両方を形質転換
できるシャトルベクターを使用するもので、例えばプラ
スミドベクターＹＥｐ １３（Ｊａｍｅｓ，Ｒ．Ｂｒｏ
ａｃｈ ｅｔ．ａｌ．：ＧＥＮＥ Ｖｏｌ．８ １２１
−１３３（１９７９））などが好ましい。

【００２０】上記シャトルベクターＹＥｐ １３のテト
ラサイクリン耐性遺伝子部位に唯一存在する制限酵素Ｂ
ａｍ ＨＩ切断部位を、制限酵素Ｂａｍ ＨＩ（日本ジ
ーン製）を用い、酵素濃度２〜３ｕｎｉｔｓ／ベクター
１μｇ、温度３７℃で１時間以上作用させて切断し、ベ
クターＤＮＡを得る。次いでＤＮＡリガーゼを作用させ
た場合、ベクター自身での自己環状化を防ぐため、切断
したベクターをアルカリフォスファターゼで処理し、Ｄ
ＮＡの５′末端の燐酸基を除去する。使用できるアルカ
リフォスファターゼには、ＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）あるい
はＣＩＰ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅ）がある。

【００２１】ＣＩＰ（ベーリンガーマンハイム製）を、
切断したベクターＤＮＡに酵素濃度０．００３ｕｎｉｔ
ｓ／ベクター１μｇ、温度４５℃で１時間作用させた
後、同量の酵素を再添加し、温度４５℃で１時間作用さ
せ、５′末端の脱燐酸を行なったベクターＤＮＡを得
る。

【００２２】次いで先に述べたサッカロマイセス・オレ
アギノーサスより抽出したα−ガラクトシダーゼの発現
に関与する遺伝子を含有する部分分解ＤＮＡ（以下パッ
センジャーＤＮＡという）とベクターＤＮＡを混合し
て、ＤＮＡリガーゼを用いて組換え体ＤＮＡを作成す
る。例えばＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）を
使用した場合、ＤＮＡ混合溶液１容に対し４〜５倍容の
Ａ液と１容のＢ液を添加混合し、温度１６℃で３０分か
ら１２時間保温して作用させ、反応後にイソプロパノー
ル沈殿として組換え体ＤＮＡを回収する。

【００２３】この組換え体ＤＮＡを用いて、大腸菌ＡＧ
ＩあるいはＳＣＳ１（いずれもフナコシ薬品より購入）
等の形質転換を塩化カルシウム／塩化ルビジウム法によ
り行い、組換え体ＤＮＡの増幅を行い、増幅した組換え
体ＤＮＡはアルカリＳＤＳ法により抽出する。

【００２４】この組換え体ＤＮＡを用いてサッカロマイ
セス・セレビシエ例えばＤＢＹ ７４６株の形質転換を
行い、形質転換した菌体はグルコース１％、ラウシル、
トリプトファン、ヒスチジンを各々２４ｐｐｍ含むＭＭ
寒天培地に塗沫し、通常３０℃、好ましくは２５℃でコ
ロニーが形成するまで培養した後α−ガラクトシダーゼ
生産株を検出し得ることができる。

【００２５】この組換え体ＤＮＡによる酵母の形質転換
はプロトプラスト法、アルカリ金属法等によって行うこ
とができる。

【００２６】また、α−ガラクトシダーゼ生産株の検出
には指示薬を用いる方法が適宜使用される。例えば指示
薬としては、Ｘ−α−ｇａｌ（５‐ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）を用
い、このＸ−α−ｇａｌ（和光純薬製）を２００ｐｐｍ
含む軟寒天ＭＭ培地を重層すれば、コロニーが染色され
るので目的菌株を検出することができる。

【００２７】上記の様にして得られたサッカロマイセス
・オレアギノーサスより抽出したα−ガラクトシダーゼ
の発現に関与する遺伝子を含有するパッセンジャーＤＮ
ＡをベクターＤＮＡに挿入した組換え体ＤＮＡにより形
質転換されてα−ガラクトシダーゼを生産する酵母につ
いて、これを培養することにより酵素を発現せしめる。

【００２８】そしてこの発現したα−ガラクトシダーゼ
について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行っ
た後、ニトロセルロース膜にブロッティングし、抗α−
ガラクトシダーゼ血清と結合したものをプロテインＡ法
により分子量を測定したところ、６２，０００付近と検
出され、サッカロマイセス・オレアギノーサスの生産す
るα−ガラクトシダーゼの分子量と一致し、他の生化学
的性質も一致した。

【００２９】また、α−ガラクトシダーゼを発現した酵
母を形質転換したサッカロマイセス・オレアギノーサス
より抽出したパッセンジャーＤＮＡを組込んだＹＥｐ
１３組換え体ベクターは、発現した酵母よりこれを抽出
して大腸菌に導入し、大腸菌形質転換体を得たが、それ
らの菌株は後記するように微生物工業技術研究所（現生
命工学工業技術研究所）にそれぞれ寄託されている。

【００３０】上記したように、本発明によれば大腸菌形
質転換体が作成できるだけでなく、本発明のサッカロマ
イセス・オレアギノーサスより抽出したα−ガラクトシ
ダーゼの発現に関与する遺伝子を含有するパッセンジャ
ーＤＮＡを含むＤＮＡは、サッカロマイセス・セレビシ
エを始めＹＥｐ １３の持つ２μｍ ＤＮＡ複製開始点
を利用しプラスミドの複製を行える酵母及びその他の微
生物に導入して形質転換することができ、それぞれの形
質転換体を得ることができる。

【００３１】そして本発明においては、これらの形質転
換体には、単離した形質転換体自体のほか、それを培養
して得た培養液及び／又は菌体含有物等の培養物、これ
らを濃縮、乾燥、又は希釈した処理物が広く包含され
る。

【００３２】これらの形質転換体を適宜培養すれば、α
−ガラクトシダーゼが菌体外及び／又は菌体内に産生さ
れるので、酵素製法における常法にしたがって、酵素含
有物、酵素液、粗製酵素等としてこれを採取し、必要あ
れば精製して純粋な酵素として分離すれば、α−ガラク
トシダーゼが得られる。

【００３３】このように本発明に係る形質転換体は、α
−ガラクトシダーゼ産生能にすぐれているので、ラフィ
ノースやメリビオースを分解ないし発酵せしめることが
でき、ガラクトース及びグルコースとすることができ
る。また、例えばＳ．セレビシエ等にあっては、グルコ
ースとフラクトースの結合も本来切断しうるものである
ので、この形質転換体を用いた場合には、メリビオース
はもとよりラフィノースも完全に３種類の単糖に分解す
ることができる。換言すればメリビオース、ラフィノー
スからガラクトース、グルコース、更にはフラクトース
を製造することができるのである。

【００３４】上記のほか、この形質転換体の有用な応用
としては特にビート糖液の処理が挙げられる。ビート糖
液には砂糖の結晶作用を阻害する有害物質としてラフィ
ノースが含有されているのであるが、糖液をこの形質転
換体で処理すれば、それが産生するα−ガラクトシダー
ゼの作用によってラフィノースが分解除去されるため、
製糖作業が向上し砂糖の収率も大幅に増加する。

【００３５】また、従来、ビート廃糖蜜やビート糖洗液
その他ビート工場からの廃水にはラフィノースといった
難発酵性ないしは非発酵性糖が含まれているが、本発明
を利用すれば上記したような形質転換体を用いて廃糖
蜜、又はそれを含んだ廃水を処理することが可能とな
り、公害防止技術としても本発明はすぐれている。もち
ろん、ビート糖蜜やその関連廃水のみでなく、ラフィノ
ースやメリビオース等α−ガラクトシド結合を有する糖
類を含有する廃水であればすべての廃水も本発明によっ
て有効に処理することができる。

【００３６】そのうえ、廃糖蜜は、バイオテクノロジー
や発酵工業において培地として多用されるものである
が、従来、パン酵母はラフィノースを１／３しか発酵す
ることができないため、ラフィノースを含有する甜菜糖
蜜はパン酵母の培養には適していなかった。しかしなが
ら、本発明に係る形質転換体で廃糖蜜を予じめ処理して
おいたり、あるいは本発明にしたがって形質転換したパ
ン酵母を使用したりすれば、甜菜糖蜜もパン酵母用の好
適培地として充分に使用することができる。このように
して甜菜糖蜜を処理しておけば、パン酵母のみならずα
−ガラクトシダーゼを有しない微生物であっても、これ
を甜菜糖蜜で充分効率的に生育、培養することができる
のである。

【００３７】更にまた本発明においては、上記のように
してＳ．オレアギノーサスＩＦＯ１９９８よりクローニ
ングしたα−ガラクトシダーゼ遺伝子について、ディレ
ーションプラスミドを用いる方法を利用してその構造を
解明し、塩基配列を決定するのに成功したものである。

【００３８】すなわち、先ずはじめにＤＮＡ発現用のベ
クター（ＹＥｐ １３等）に挿入されているＤＮＡ断片
をシークエンス用ベクターにつなぎ換える。ここに、シ
ークエンス用ベクターは、外来ＤＮＡを組み込むために
そのベクターをただ１ヶ所切断する制限酵素の切断点を
複数個連ねた構造（マルチクローニングサイト）を持
ち、挿入された外来ＤＮＡをＭ１３ファージ粒子に組み
込ませて培地中に放出するためのＤＮＡ配列と、外来Ｄ
ＮＡを鋳型としてシークエンス反応を行うための相補鎖
の合成開始部位（プライマー）等を備えたベクターであ
る。

【００３９】シークエンス用ベクターとしては、ｐＵＣ
１１８、ｐＵＣ１１９といったｐＵＣ系ベクターのほか
に、ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ等が知られているが、本発
明における塩基配列の決定には後者のベクターを用い
た。

【００４０】塩基配列の決定はシークエンス用ベクター
につなぎかえられたＤＮＡ断片の一端から順に行うが、
一度に読み取れる範囲は最大で４００ベースなので、読
み取るＤＮＡを一端から順に３００ベース程度ずつ何段
階か欠失させたプラスミド（ディレーションプラスミ
ド）を作成しなければならない。

【００４１】このようにして多数のディレーションプラ
スミドを作成した後、オートシークエンサーでデータを
読み取りこれらをつなぎ合わせて、α−ガラクトシダー
ゼ遺伝子のプロモーター、分泌配列、構造遺伝子のすべ
てを含む塩基配列を決定し、図３、図４、図５に示すよ
うな結果を得た。

【００４２】これらの塩基配列は、Ｓ．カールスベルゲ
ンシス由来のメリビアーゼ遺伝子のそれとは異なること
も明らかにされ（図６〜図１２、図１４）、本発明に係
るα−ガラクトシダーゼ遺伝子が新規物質であることも
確認された。

【００４３】本発明にしたがってα−ガラクトシダーゼ
遺伝子を利用することによって、前記したようにα−ガ
ラクトシダーゼ関連の各種の有効利用の途が拓けるほ
か、この遺伝子には菌体外に蛋白質を分泌するためのシ
グナル配列が含有されているので、この分泌能力を利用
した異種蛋白分泌ベクターも構築することができ、各種
の蛋白質の大量生産に本発明を利用することも可能であ
る。

【００４４】

【実施例】以下実施例を挙げて、本発明をさらに具体的
に説明する。

【００４５】（１）酵母染色体ＤＮＡ（パッセンジャー
ＤＮＡの調製） サッカロマイセス・オレアギノーサスＩＦＯ １９９８
株をＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グル
コース２％）５００ｍｌに接種し、温度３０℃で約３６
時間振とう培養し、培養物を得た。この培養物を３，０
００ｒｐｍで３分間遠心分離処理し、得られた湿潤菌体
を２０ｍｌのＳＢ液（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ． Ｃｌ、１
Ｍ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ
２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、ｐＨ７．５）
に懸濁し、これに細胞壁溶解酵素ザイモリエース２０−
Ｔ（生化学工業製）をＴＥＮ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ
７．５）に３ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した物を１ｍｌ加
え、３０℃で時々攪拌して１時間保温する。

【００４６】これを遠心集菌し、再びこの菌体に２０ｍ
ｌのＳＢ液を加え均一に混合し、次いで、この混合物に
ＴＥＮ液２０ｍｌ、リボヌクレアーゼ溶液（０．１Ｍ
Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ、０．３Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ
４．８にリボヌクレアーゼＡ（シグマ製）を１０ｍｇ／
ｍｌ溶解し、沸とう水中で１０分間加熱したもの）０．
２５ｍｌ及び界面活性剤ＳＤＳ（和光純薬）の２０％水
溶液２ｍｌを加え２時間静かに振とう処理し、さらにプ
ロナーゼ溶液（ＴＥＮ液にプロナーゼＥ（科研化学製）
を２ｍｇ／ｍｌ溶解し、３７℃で１５分間保温したも
の）を０．５ｍｌ添加し、３７℃で時々攪拌しながら２
時間保温した。ついで、これを６５℃に昇温し、３０分
間静置し、ついで室温まで冷却する処理で溶液中のＲＮ
Ａ、蛋白質の分解を行った。次にフェノール処理、クロ
ロホルム処理を行った後、液量の２．５倍のエタノール
を加え混合、氷中に静置し糸状に沈殿したＤＮＡを採取
した。採取したＤＮＡは、再びＴＥＮ液２５ｍｌに溶解
してリボヌクレアーゼ溶液０．０５ｍｌ加え３７℃で１
時間処理し残存したＲＮＡを分解し、フェノール処理、
クロロホルム処理を行い、リボヌクレアーゼを除いた
後、前記同様のエタノール沈殿によって酵母染色体ＤＮ
Ａを得た。

【００４７】次いで制限酵素Ｂａｍ ＨＩとアイソシゾ
マーである制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩを用いた部分分解に
よるパッセンジャーＤＮＡの調製条件は、モレキュラー
・クローニング第２８２頁〜第２８５頁記載の段階希釈
法（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ｅｔ．ａｌ．：Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８２）によ
り、酵素添加量をＤＮＡ １μｇ当り Ｂａｍ ＨＩは
２．３１ ｕｎｉｔｓ、Ｓａｕ ３ＡＩは０．１２７ｕ
ｎｉｔｓと決定し、３７℃で１時間作用させ、各々の認
識部位を切断させた後、反応液を常法通りフェノール処
理、クロロホルム処理、エタノール沈殿処理し、部分分
解ＤＮＡを３３０μｇ調製し、これを分取用電気泳動装
置ＥＬＦＥシステム（Ｇｅｎｏｆｉｔ製）により分画し
た。

【００４８】分画後、４フラクションおきに５μｌずつ
採取し、アガロース電気泳動を行い分画された大きさを
確認し、適当なＤＮＡの長さごとにまとめてフェノール
処理、クロロホルム処理の後、エタノール沈殿処理を行
い、部分分解ＤＮＡを回収し、パッセンジャーＤＮＡと
した。分画した長さと収量を下記表１に第１表として示
す。

【００４９】

【表１】

【００５０】（２） ベクターＤＮＡの調製とベクター
ＤＮＡとパッセンジャーＤＮＡのライゲーション シャトルベクターＹＥｐ １３に対して、ベクター１μ
ｇ当り２ｕｎｉｔｓのＢａｍ ＨＩを３７℃で１晩作用
させてＹＥｐ １３の制限酵母Ｂａｍ ＨＩ部位を完全
に切断し、常法通りフェノール処理、クロロホルム処
理、エタノール沈殿処理した後、このＢａｍ ＨＩで切
断されたＤＮＡ断片の自己環状化を防止するため、 モ
レキュラー・クローニング第１３３頁〜第１３４頁記載
の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ｅｔ．ａｌ．：Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ｃｌｒｎｉｎｇ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８
２）により、ＣＩＰ処理を行いベクターＤＮＡを調製し
た。

【００５１】さらにこのベクターＤＮＡは、前記（１）
において得たパッセンジャーＤＮＡとともにＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造製）を使用してライゲーショ
ンを行い、２つのＤＮＡを反応連結させた。ついで反応
液１容に対し５Ｍ塩化ナトリウム０．２５容とイソプロ
パノール０．７５容を添加しイソプロパノール沈殿によ
って組換え体ベクターを得た。

【００５２】（３）組換え体ベクターの調製 上記ライゲーションにより作成した組換え体ベクター
は、大腸菌ＡＧ１（フナコシ薬品（株）により入手）を
使い、モレキュラー・クローニング第２５２頁〜第２５
３頁記載の塩化カルシウム／塩化ルビジウム法（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ Ｔ．ｅｔ．ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８２）により、形質転
換菌ＡＧ１とした。

【００５３】ついで、この形質転換菌をアンピシリン
（シグマ製）４０ｐｐｍを添加したＬＢ培地（トリプト
ン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム２％、ｐ
Ｈ７．５）５ｍｌで３７℃で１晩培養した後、この１ｍ
ｌを４０ｐｐｍのアンピシリンを含むＬＢ培地１Ｌに接
種し、３７℃で３〜４時間攪拌しつつ、ＯＤ₅₅₀＝０．
５〜０．６まで培養した後、クロラムフェニルコール
（シグマ製）を２００ｐｐｍ添加して再び３７℃で１４
〜１５時間攪拌しつつ培養を続けたあと、３０００ｒｐ
ｍ、１０分の遠心で集菌し、モレキュラー・クローニン
グ第３６８頁〜３６９頁記載のアルカリＳＤＳ法（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ Ｔ．ｅｔ．ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｃｌｏｎｉｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８２）の試薬量を５０
倍に変更して粗組換え体ベクターを抽出した。

【００５４】これを超遠心機で精製した後、セントリコ
ン１０（アミコン社製）で脱塩し、エタノール沈殿を行
い精製組換えべクターを得た。増幅し超遠心で精製した
組換え体ベクターの種類と使用したパッセンジャーＤＮ
Ａの対応関係を、下記表２に第２表として示す。

【００５５】

【表２】

【００５６】（４）酵母の形質転換及びα−ガラクトシ
ダーゼ生産株の検出 サッカロマイセス・セレビシエＤＢＹ７４６（α接合
型、ｔｒｐｌ ｈｉｓ３ｌｅｕ２ ｕｒａ３）をＹＰＤ
培地５０ｍｌ中で５×１０⁷個／ｍｌとなるまで振とう
培養し３，０００ｒｐｍ、３分間で遠心集菌を行い、Ｔ
Ｅ緩衝液で洗浄した。

【００５７】ついで菌体を４ｍｌの酢酸リチウム中に懸
濁し３０℃で４５分振とうした後１．５ｍｌのエッペン
ドルフチューブに１００μｌずつ分注し、これに（３）
記載の精製したサッカロマイセス・オレアギノーサスに
より抽出したα−ガラクトシダーゼの発現に関与する遺
伝子を含む部分分解ＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクタ
ーを１０μｇ添加して３０℃で３０分振とうし、ついで
７０％ＰＥＧ４０００を１１０μｌ添加し１時間静置し
た後、４２℃で５分間熱処理して、サッカロマイセス・
セレビシエ内に組換え体ベクターを導入した。次いで室
温で放冷し、上澄を遠心分離で除き、菌体は滅菌水で洗
浄して形質転換を終了した。

【００５８】次いで形質転換酵母菌体は、グルコース１
％、ウラシル、トリプトファン、ヒスチジンを２４ｐｐ
ｍ添加したＭＭ寒天培地に適宜希釈して塗沫して３０℃
で培養を行い、生育してきたコロニーに２００ｐｐｍの
Ｘ−α−ｇａｌと１％のメリビオースを含む軟寒天ＭＭ
を５ｍｌ重層すると、α−ガラクトシダーゼを生産する
菌株は、Ｘ−α−ｇａｌを分解しコロニーが青色に染色
したことによって検出した。α−ガラクトシダーゼを発
現させることのできた組換え体ベクターの菌株名と得ら
れた発現株数を、下記表３に第３表として示す。

【００５９】

【表３】

【００６０】前記により検出したＸ−α−ｇａｌを分解
する菌株は、各プレートより各１株を釣菌し、単コロニ
ーに分離して２０ｍｌのＭＭ培地で３０℃、２日間振と
う培養し、遠心によって集菌し、一旦滅菌水で洗浄後、
ＳＭバッファー（１Ｍ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、０．１Ｍ
２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）５ｍｌに懸濁
し、３７℃で１０分間振とうして遠心集菌してこれをｌ
ｙｓｉｓバッファー（１Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌ、５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
５、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ ２０−Ｔ １００ｕｎｉｔｓ
／ｍｌ）５ｍｌに懸濁してスフェロプラストが生成する
まで３７℃に保温し、その後Ｓｏｌ．II（０．２Ｎ Ｎ
ａＯＨ、１％ＳＤＳ）２００μｌを加えて溶菌し、３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を１５０μｌを添加混合
して−２０℃に１０分置いた後１５，０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離した。

【００６１】上澄液にはα−ガラクトシダーゼを発現す
るために必要なＤＮＡ配列をパッセンジャーＤＮＡとし
て持つ組換え体ベクターが抽出されているのでフェノー
ル処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿処理によっ
て回収する。

【００６２】上記によって得た組換え体ベクターを使用
し、大腸菌ＳＣＳ１（フナコシ薬品より購入）の形質転
換を行い８処理について形質転換体を得ることができた
ので、その結果を下記表４に第４表として示す。

【００６３】

【表４】

【００６４】また、上記形質転換体はアンピシリン耐性
を持つ物であったことで、形質転換で導入された組換え
体ベクターはＹＥｐ １３を作用した組換えベクターで
あることが確認できた。

【００６５】この結果、サッカロマイセス・オレアギノ
ーサスより抽出のα−ガラクトシダーゼの発現に関与す
る遺伝子を含むパッセンジャーＤＮＡを組み入れた組換
え体ベクター名は、その発現した酵母名をとってＹＥＢ
８−１と命名し、それによって形質転換した大腸菌形質
転換体は、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ８−１（微工研
菌寄第１０８１１号）、同様にＥ．ｃｏｌｉ Ｂ６−１
（ＹＥＢ６−１形質転換体）（微工研菌寄第１０８０８
号）、同様にＥ．ｃｏｌｉ Ｓ４−１（ＹＥＳ４−１形
質転換体）（微工研菌寄第１０８０７号）、同様にＥ．
ｃｏｌｉ Ｓ７−１（ＹＥＳ７−１形質転換体）（微工
研菌寄第１０８０９号）、同様にＥ．ｃｏｌｉ Ｓ７−
２（ＹＥＳ７−２形質転換体）（微工研菌寄第１０８１
０号）として微生物工業技術研究所（現 生命工学工業
技術研究所）に寄託してある。

【００６６】なお、酵母菌株Ｂ８−１、Ｂ８−１１、Ｂ
８−１３、Ｂ８−１４は同一の組換えプラスミドによる
形質転換体であったのでＹＥＢ８−１による大腸菌形質
転換体Ｅ．ｃｏｌｉＢ８−１を代表とした。

【００６７】これら形質転換体に挿入されているパッセ
ンジャーＤＮＡの制限酵素地図を図１に示した。図中の
Ｂ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、Ｘは、それぞれの次の制限酵素による
切断位置を示す。 Ｂ：Ｂａｍ ＨＩ，Ｅ：Ｅｃｏ ＲＩ，Ｐ：Ｐｓｔ
Ｉ，Ｓ：Ｓａｕ ３ＡＩ，Ｘ：Ｘｂａ Ｉ

【００６８】（５）形質転換体によるα−ガラクトシダ
ーゼの生産、及びこのα−ガラクトシダーゼとサッカロ
マイセス・オレアギノーサスの生産するα−ガラクトシ
ダーゼの同一性の確認。 組換え体ベクターにより形質転換した酵母を用いてα−
ガラクトシダーゼを生産せしめ、この酵母が生産したα
−ガラクトシダーゼとサッカロマイセス・オレアギノー
サスの生産したα−ガラクトシダーゼが同一であること
を確認するため、ウェスタンブロッティングを行い、プ
ロテインＡ法で検出した。試料には（４）項においてα
−ガラクトシダーゼの発現のあった形質転換酵母の培養
を行った上清とサッカロマイセス・オレアギノーサスを
形質転換体と同様にして培養したものをセントリコン１
０（アミコン製）で約４００倍に脱塩濃縮したものを使
用した。

【００６９】これらの試料の蛋白質をローリー法（Ｅ．
Ｆ．Ｈａｒｔｒｅｅ：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，４２２−４２７（１９７
２））により求め、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動を行った。泳動は２０穴のコームを使ったゲル
の右端から分子量マーカー（オリエンタル酵母製）、形
質転換酵母培養液８点、サッカロマイセス・オレアギノ
ーサス培養液の順に１レース当り２μｇ添加し、同じサ
ンプルを同じ順番に残りの穴に添加した。泳動終了後ゲ
ルを半分に切り、一方を通常通り染色し、他の一方はエ
レクトロブロッティングを行いニトロセルロースメンブ
レンに蛋白を転写した。その結果を図２に示す。図中の
数字はそれぞれ次のことを表わす。 １：分子量マーカー、２：Ｂ８−１、３：Ｂ８−１１、
４：Ｂ８−１３、５：Ｂ８−１４、６：Ｓ４−１、７：
Ｓ７−１、８：Ｓ７−１、９：Ｂ６−１、１０：Ｓ．ｏ
ｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ ＩＦＯ １９９８

【００７０】上記の結果から明らかなように、通常の染
色を行ったものは多数のバンドが検出されたが抗α−ガ
ラクトシダーゼ血清と反応したものはただ１つのバンド
のみが検出され、両者を比較した結果同一のものと判定
された。

【００７１】（６）形質転換酵母の醗酵力試験 形質転換酵母として（４）項で述べた組換えベクターＹ
ＥＢ８−１を組み込んだサッカロマイセス・セレビシエ
ＤＢＹ ７４６を使用し、次の条件で発酵力試験を行っ
た。

【００７２】好気的培養の結果 ０．５％グルコース、０．５％メリビオースを炭素源と
したＭＭ培地を使用し、サッカロマイセス・セレビシエ
ＤＢＹ ７４６に組換えベクターＹＥＢ８−１を組み込
んだ場合と、組み込まない場合で振とう培養を行い収量
と残存糖分の分析を行った。この際、それぞれの菌株の
要求する核酸、アミノ酸は２４ｐｐｍ添加した。結果は
下記表５に第５表として示す。

【００７３】

【表５】

【００７４】上記の結果からも明らかなように、パン酵
母を、ビート糖蜜等ラフィノース、メリビオース含有糖
液を使用して培養しても、これらの糖を充分に資化し、
培養、増殖できることが判る。

【００７５】発酵試験の結果 前記において好気的培養した菌体を使用して発酵試験を
行った。

【００７６】発酵培地Ｉ：ビート糖蜜１０％（発酵性糖
分）、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ
５．５）２００ｍｌ 発酵培地II：ビート糖蜜１０％（発酵性糖分）、要求す
るアミノ酸、核酸を添加したＭＭ培地２００ｍｌ 接種菌体量：形質転換体〜１．３７×１０⁵個 非転換体〜１．３７×１０⁵個

【００７７】発酵試験は２週間行い、炭酸ガス発生量と
残存糖分組成を分析した。その結果及び使用した糖蜜の
糖分組成、発酵終了時の残存糖分組成、炭酸ガス発生量
（ＣＯ₂ ｇ）を下記表６に第６表として示す。この表
のとおり、形質転換酵母にあっては、明らかにα−ガラ
クトシダーゼによりメリビオース発酵が行われ、炭酸ガ
ス発生量も多く、非形質転換酵母に比べ高い発酵力を示
した。

【００７８】

【表６】

【００７９】したがって、本発明によれば、メリビオー
スやラフィノース等α−ガラクトシド含有物、例えばビ
ート廃糖蜜、ビート糖洗液その他ビート糖製造工場やビ
ート処理工場からの廃液、を有利に処理することができ
る。また、ビート廃糖蜜に予じめ本発明に係る形質転換
体を作用せしめてガラクトースとグルコースの結合を切
断しておけば、ケーン廃糖蜜と同様に使用することがで
き、各種発酵培地として有効に利用することができる。

【００８０】（７）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の構造 ｉ）ディレーションプラスミドの作成 シークエンス用ベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
を用い、先に得たα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を再クローニングした。

【００８１】このようにして再クローニングしたｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔを制限酵素ＮｏｔＩ及びＳａｃＩで処
理した。次いで、Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用ディレ
ーションキット（宝酒造製）を利用して、先ずＥｘｏII
Iで処理した。ＥｘｏIIIは、ＤＮＡの５′末端側が平滑
末端もしくは突出末端の場合にのみ、相補ＤＮＡ鎖を
３′から５′末端側へ削り取って行く。したがって、制
限酵素ＮｏｔＩ及びＳａｃＩでプラスミドを二重切断し
ておけばＳａｃＩは５′陥没末端を形成するので、５′
突出末端を形成するＮｏｔＩ側のみが削り取られた。

【００８２】次にＭＢヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ Ｂｅａ
ｎ ヌクレアーゼ）で処理し、１本鎖ＤＮＡ部分を切除
し平滑末端にした。しかしＭＢヌクレアーゼだけでは完
全に平滑化できない場合があるので、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆ
ｒａｇｍｅｎｔで完全に平滑な２本鎖に修復し、ライゲ
ーションを行い閉環状のプラスミドとした。ここでＥｘ
ｏIIIの作用時間を段階的に変えることにより、適当な
ディレーションを持ったプラスミドを作成した。

【００８３】これらのプラスミドで大腸菌を形質転換
し、得られたコロニーから抽出したプラスミドの大きさ
を電気泳動で確認し、ディレーションプラスミドのスク
リーニングを行い、ディレーション系列を作成した。

【００８４】ii）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の構造 上記によって作成したディレーションプラスミドにより
読み取ったデータをつなぎ合わせて、α−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子のプロモーター、分泌配列、構造遺伝子の全
てを含む塩基配列を決定した。このデータは、図３、図
４、図５に示した。

【００８５】シークエンスデータの解析は、個々のディ
レーションプラスミドからオートシークエンサーで得ら
れたデータの接続を含め、ＤＮＡ塩基配列の解析はＤＮ
Ａ解析用ソフトＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＤＣ製）を使用して
行った。 iii）ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の検索 シークエンスしたＤＮＡ配列の中からＤＮＡの遺伝情報
がメッセンジャーＲＮＡへ転写され蛋白へと翻訳される
部分であるＯＲＦを検索した。

【００８６】ＤＮＡコードでは、メッセンジャーＲＮＡ
の転写開始部分はＡＴＧ、転写停止部分は、ＴＡＧ、Ｔ
ＧＡ、ＴＡＡのいずれかであるので、開始コード、停止
コードの検索を行ないＯＲＦ決定を行った。

【００８７】精製したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の分
子量は６２，５００ダルトンであった。１ｋｂＤＮＡは
アミノ酸３３３個をコードでき、そのアミノ酸の分子量
はおよそ３７，０００ダルトンなので、およそ１，５０
０塩基のＯＲＦが存在すると考えられた。

【００８８】検索の結果、転写開始コードは図３〜図５
に示した塩基配列において５２１番目のＡＴＧであり、
転写停止コードは１９３４番目のＴＡＡであること、そ
の長さは１４１３塩基でアミノ酸で翻訳された場合４７
１残基であることが分かった。

【００８９】iv）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の相同性
の比較 すでに決定されているＳ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉ
ｓ及び今回決定したＳ． ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓのα
−ガラクトシダーゼ遺伝子のＯＲＦ部分を比較し、両者
の相同性を調べた。

【００９０】ＤＮＡレベルでは９４．３％の相同性（全
塩基に占める同一塩基の割合）があり、蛋白質レベルで
は４７１アミノ酸中１７個が異なったアミノ酸で、相同
性は９６．４％であった。アミノ酸組成と、それらから
推定される蛋白質の分子量は、下記の表７に第７表とし
て示した。

【００９１】

【表７】

【００９２】また、Ｓ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの１番
目から２８５０番目までをＳ． ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅ
ｎｓｉｓのものと比較した結果は、図６〜図１２として
示した。なお図中、上段（ファイル名：ＴＡＭＥＬ
５）はＳ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ及び下段（ファイル
名：ＳＣＭＥＬＩＣＡ）はＳ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎ
ｓｉｓのα‐ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列をそれ
ぞれ示した。同一の塩基はアステリクスで示し、またエ
クスクラメーションマークの下に示した数字はシークエ
ンスされた塩基の端からの番号である。

【００９３】これらの結果から明らかなように、両者の
遺伝子は明らかに相違しており、本発明に係るα‐ガラ
クトシダーゼ遺伝子が新規な構造を有していることが確
認された。

【００９４】ｖ）α−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモ
ーターの構造 Ｓ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓとＳ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇ
ｅｎｓｉｓのα−ガラクトシダーゼ遺伝子のホモロジー
解析をプロモーター部分及び、ＯＲＦの一部ではあるが
シグナル配列部分について詳しく行った。

【００９５】ｍ−ＲＮＡへの転写を促進するとされるＵ
ＡＳ領域（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅの略）に特徴的な塩基配列（図１３の
ＵＡＳの下に記載した配列のうち四角で囲った部分）が
開始コード（ＡＴＧのＡを起点０ベースとする）より上
流−２５９から−２０６にかけて存在し、Ｓ．ｃａｒｌ
ｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓのＵＡＳより８ベース下流に存在
していた。

【００９６】また、ＲＮＡポリメラーゼIIが転写開始部
位を認識するためのＴＡＴＡボックスは、Ｓ．ｃａｒｌ
ｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓと同位置の−１１９、−１１０、
−６３に存在していた。プロモーターの全塩基配列を図
１８に示す。

【００９７】vi）分泌配列（シグナル配列）の構造 蛋白を菌体外に分泌されるには、細胞膜の脂質の層を通
過する際の先導役の働きをする１５〜３０残基の疎水性
の蛋白質が、分泌される蛋白のＮ末端側に付着している
必要がある。

【００９８】シークエンシングの結果、蛋白を分泌生産
するためのシグナル配列はＳ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎ
ｓｉｓのシグナル配列（下段に示した）と比較して塩基
で４個、アミノ酸で２個の違いがあった。

【００９９】図１４には両者を並記し、同一塩基はアス
テリスク印で示した。

【０１００】両者のシグナル配列を構成している１８個
のアミノ酸とα−ガラクトシダーゼのＮ末端側１２アミ
ノ酸を次に示したアミノ酸の親水性、疎水性のパラメー
ター（下記表８に示す第８表、正の値が大きくなる程、
疎水的である。）を用い、隣り合う５アミノ酸間の相加
平均をプロットしたのが図１５である。図中、実線は
Ｓ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ、破線はＳ．ｃａｒｌｓｂ
ｅｒｇｅｎｓｉｓを示し、双方重なり合う部分は実線で
示した。

【０１０１】

【表８】

【０１０２】Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓでＩｌ
ｅ（イソロイシン：疎水性）Ｓｅｒ（セリン：親水性）
の部分がＳ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓでは２個のＴｈｒ
（スレオニン：親水性）に置換されていることから疎水
性は低くなっている可能性はあるが、両者の分泌能力の
差はこのデータからは分からない。

【０１０３】vii）蛋白分泌用ベクターの構築 Ｓ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓのα−ガラクトシダーゼに
は菌体外に蛋白質を分泌するためのシグナル配列が付加
しているので、本遺伝子のプロモーター、シグナル配列
以後に異種遺伝子を接続することで、異種遺伝子に由来
する蛋白質を分泌生産することが可能である。

【０１０４】以下に、この分泌能力を利用した異種蛋白
分泌ベクターを設計した。

【０１０５】図１６にはプロモーター領域、転写終結領
域に存在する各種制限酵素による切断地図を示した。

【０１０６】異種遺伝子産物を分泌発現させるには、α
−ガラクトシダーゼ遺伝子のＯＲＦ中のシグナル配列以
後の構造遺伝子部分に異種遺伝子を組み込む必要があ
る。

【０１０７】そのためにはα−ガラクトシダーゼの構造
遺伝子を除去しなければならないので、シグナル配列の
中程に存在するＳｐｈＩと停止コード部分に存在するＡ
ｆｌIIで切断した。

【０１０８】次いで、切除されたシグナル配列の修復と
異種遺伝子の挿入部位としての制限酵素切断部位の導入
及び、各導入部位に停止コードを対応させるためＴＡＡ
を１塩基ずつずらして設けた合成ＤＮＡを作成した（図
１７）。

【０１０９】この合成ＤＮＡを構造遺伝子を切除したベ
クターにライゲーションし、異種蛋白分泌用ベクターを
構築した。このベクターを用いることにより異種遺伝子
で発現させることができる。

【０１１０】なお本明細書において各種操作を行うに当
り、その参考とした文献例は次のとおりである。 参考文献 ◎酵母のα−ガラクトシダーゼ遺伝子シークエンシング
に関して ・Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ Ｐ．Ｌ．：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１３ ７２５７−７２６８（１９８５） ・Ｓｕｍｎｅｒ−Ｓｍｉｔｈ Ｍ ｅｔ．ａｌ．：Ｇｅ
ｎｅ ３６ ３３３−３４０（１９８５） ◎一般的な遺伝子組換え技術に関して ・Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ ｅｔ．ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏ −ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） ・村松正実：実験医学（羊土社）５（１１） ◎遺伝子シークエンシングに関して ・Ｍｅｓｓｉｎｇ Ｊ．：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｄ
ＮＡ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０１（１９８３） ・Ｍ１３ファージによるクローニングとＤｉｄｅｏｘｙ
シークエンス法（アマシャムジャパン） ◎蛋白質の親−疎水性について ・Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ．Ｆ．ｅｔ．ａｌ．：Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７１０５−１３２（１９８２）

【０１１１】

【発明の効果】本発明にしたがってサッカロマイセス・
オレアギノーサスより抽出したα−ガラクトシダーゼの
発現に関与する遺伝子を含有するパッセンジャーＤＮＡ
を含むＤＮＡは、サッカロマイセス・セレビシエを始め
ＹＥｐ １３の持つ２μｍＤＮＡ複製開始点を利用しプ
ラスミドの複製を行える酵母でα−ガラクトシダーゼ生
産能のない酵母に導入し形質転換した場合に、その形質
転換体にα−ガラクトシダーゼ生産能を付与することが
できる。

【０１１２】したがって本発明によれば、α−ガラクト
シダーゼの工業生産が可能となるばかりでなく、メリビ
オース、ラフィノースの発酵ないし分解も可能となり、
そのためにこれらの糖を含有する廃液処理も有利に行
え、また、ビート糖蜜を工業用培地として自由に使用す
ることもできる。

【０１１３】本発明によってα−ガラクトシダーゼ遺伝
子の構造が新たに解明されたので、本発明に係るプロモ
ーターを利用すれば、上記効果が更に増進されるだけで
なく、例えば上記したシグナル配列を利用すれば異種蛋
白分泌用ベクターも構築することができるので、各種の
異種蛋白の効率的製造も可能となる。

【０１１４】したがって本発明は、この面からしてもバ
イオテクノロジーに大きく貢献するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】各組換え体プラスミドに挿入されているパッセ
ンジャーＤＮＡの制限酵素地図を示す。

【図２】形質転換体の生産するα−ガラクトシダーゼと
サッカロマイセス・オレアギノーサスの生産するα−ガ
ラクトシダーゼの比較図である。

【図３】α−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列を示
す。

【図４】同上続きを示す。

【図５】同上続きを示す。

【図６】Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓのα−ガラ
クトシダーゼ遺伝子の塩基配列（下段）との相同性を比
較した図面である。

【図７】同上続きを示す。

【図８】同上続きを示す。

【図９】同上続きを示す。

【図１０】同上続きを示す。

【図１１】同上続きを示す。

【図１２】同上続きを示す。

【図１３】Ｓ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓサッカロマイセ
ス・オレアギノーサスＳ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉ
ｓのα−ガラクトシダーゼプロモーターの構造を図示し
たものである。

【図１４】そのシグナル配列（上段）を図示するととも
に、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓのシグナル配列
の塩基配列（下段）とを比較したものである。

【図１５】親水−疎水プロット図である。

【図１６】α−ガラクトシダーゼ構造遺伝子周辺部分の
制限酵素地図を示す。

【図１７】合成ＤＮＡによる分泌ベクターの作成図であ
る。

【図１８】本発明に係るプロモーターの全塩基配列を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ２１Ｄ 8/04 Ａ２１Ｄ 8/04 (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 1:85） Ｃ１２Ｒ 1:85） ） (72)発明者 後藤 邦康 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税 庁醸造試験所内 (72)発明者 小幡 孝之 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税 庁醸造試験所内 (72)発明者 原 昌道 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税 庁醸造試験所内

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図１８に示す塩基配列を有する、サッカ
   ロマイセス・オレアギノーサスより抽出したα−ガラク
   トシダーゼ遺伝子のプロモーター。
2. 【請求項２】 ＴＡＴＡボックスの少なくとも１つ及び
   ／又はＵＡＳ領域を含んでなることを特徴とする請求項
   １に記載のプロモーター。