JPH04218382A - 新規な宿主−ベクター系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な宿主−ベクター
系に関し、さらに詳しくは、カビの一種であるリゾープ
ス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ）を宿
主とし、藻菌類のプラスミドをベクターとする新規な宿
主−ベクター系に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターフェロン、インターロイキンと
いった有用タンパク質をバクテリアを形質転換すること
により製造する方法は確立されつつある。それと同時に
バクテリアを用いた場合の問題点も明らかになってきて
いる。例えばバクテリアは目的とする有核生物のタンパ
ク質（例えばホルモン、酵素）の生産量が少なく、かつ
該タンパク質が菌体外へ分泌されにくい。さらに、イン
ターフェロン及びインターロイキンを大腸菌を用いて作
った場合、これら人工のタンパク質と天然のタンパク質
との間では１次構造は同じであるが、２次構造が異なり
、その結果人工のタンパク質は人体内で異物（抗原）と
して認識されてしまう。そこで使用に際しては人工のタ
ンパク質をリネーチャーする必要がある。

【０００３】ところで「くものすカビ」、「けかび」の
ような藻菌類は、発酵工業において広く使用され、リゾ
ープスはその一種である。リゾープス等のカビは、体外
への酵素分泌力が高く（例えばアミラーゼの分泌量は液
体培養：２０ｇ／リットル、固体培養：３０ｇ／ｋｇで
ある）、かつ細胞外へ分泌するために得られる蛋白質は
１次構造のみならず２次構造も天然の蛋白質と同じであ
る。そこでカビを形質転換して蛋白質の製造に用いるこ
とが期待される。しかし、従来カビの形質転換法は確立
されているものが少なく、リゾープスについては全くな
かった。

【０００４】そこで本発明者らは、先に種々検討した結
果カビの一種であるリゾープスの形質転換法を提供する
ことに成功した〔特開平２─５３４８０号〕。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、酵素をリゾー
プスを宿主として用いて生産するに適したベクターはこ
れまでのところ知られていない。そこで本発明の目的は
、酵素の菌体外分泌量が大きいリゾープスを宿主として
用い、酵素を生産するに適した宿主−ベクター系を提供
することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、リゾープス・
ニベウスの染色体中及び／又は細胞質内に藻菌類のプラ
スミドを含む宿主−ベクター系に関する。

【０００７】以下本発明について説明する。本発明にお
いては、宿主として糸状菌リゾープス・ニベウス（Ｒｈ
ｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ）（ＩＦＯ４８１０）を用
いる。

【０００８】一方、ベクターとしては、藻菌類のプラス
ミドを用いる。ベクターとして藻菌類のプラスミドを用
いることにより、初めて宿主であるリゾープス・ニベウ
スを形質転換することができる。藻菌類としては、例え
ば、ムコール属〔Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉ
ｄｅｓ，　Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ　〕、フィ
コミセス属〔Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ　ｂｌａｋｅｓｌｅ
ｅａｎｕｓ，　Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ　ｎｉｔｅｎｓ　
〕、アブシディア属〔Ａｂｓｉｄｉａ　ｇｌａｕｃａ，
　Ａｂｓｉｄｉａ　ｃｏｅｒｕｌｅａ，　Ａｂｓｉｄｉ
ａ　ｍｅｇａｓｐｏｒａ　〕等を例示できる。

【０００９】また藻菌類のプラスミドとしては、例えば
、プラスミドｐＬｅｕ４、ｐＰＳ１１、ｐＭＡ６７、ｐ
ＪＬ１、ｐＪＬ２、ｐＭＣＬ１３０２、ｐＭＣＬ００２
、ｐＪＰＬｅｕ４、ｐＰＰＬｅｕ４、ｐＬｅｕ４１、ｐ
ＪＰＬｅｕ４１又はｐＰＰＬｅｕ４１等を例示できる。

【００１０】尚、上記プラスミドは、以下の方法により
入手できる。ｐＬｅｕ４は、ロンセロ（Ｒｏｎｃｅｒｏ
），Ｍ．Ｉ．Ｇ．ら、Ｇｅｎｅ，８４　　３３５−３４
３（１９８９）　に記載の方法により入手できる。ｐＰ
Ｓ１１は、Ｔ．スアレツ（Ｓｕａｒｅｚ）ら、Ｍｏｌ．
　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２１２，　１２０−１２３
，　１９８８　に記載の方法によりフィコミセス・ブラ
ケスリアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ　ｂｌａｋｅｓｌ
ｅｅａｎｕｓ）（ＮＲＲＬ１５５５株）から入手できる
。

【００１１】ｐＭＡ６７は、Ｌ．デッキンソン（Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ）　らの方法〔Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　５２，
　２４３−２５２，　１９８７　〕により、ｐＭＣＬ１
３０２から入手できる。ｐＪＬ１及びｐＪＬ２は、Ｊ．
Ｌ．レビュエッタ（Ｒｅｖｕｅｔｔａ）　らの方法〔Ｐ
ｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．
Ａ．８３，　７３４４−７３４７，　１９８６　〕によ
り、フィコミセス・ブラケスリアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙ
ｃｅｓ　ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ）（Ａ４５９株）
から入手できる。

【００１２】ｐＭＣＬ１３０２及びｐＭＣＬ００２は、
Ｒ．ファン・ヘースウィック（ｖａｎ　Ｈｅｅｓｗｉｊ
ｃｋ）の方法　　〔Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　５１，　４３３
−４４３，　１９８６　〕により、ムコール・シルシネ
ロイデス・エフ・ルシタニコス（Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃ
ｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｆ．　ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｓ
）（ＣＢＳ２２７．４９株）＝ムコール・ラセモサス（
Ｍｕｃｏｒ　ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）（ＡＴＣＣ１２１６
６株）から入手できる。

【００１３】ｐＪＰＬｅｕ４は、ｐＪＬ２の０．９ｋｂ
ｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片をｐＬｅｕ４のＳａｍＩ
に挿入することより得ることができる。ｐＪＰＬｅｕ４
１は、ｐＪＰＬｅｕ４をＡｖａＩとＳａｌＩで消化し、
７．２ｋｂｐの断片を自己連結して得られる。

【００１４】ｐＰＰＬｅｕ４は、ｐＰＳ１１の５．２ｋ
ｂｐのＢａｍＨＩ断片をｐＬｅｕ４のＳａｍＩに挿入す
ることより得ることができる。ｐＰＰＬｅｕ４１は、ｐ
ＰＰＬｅｕ４をＡｖａＩとＳａｌＩで消化し、１１．５
ｋｂｐの断片を自己連結して得られる。

【００１５】ｐＬｅｕ４１は、ｐＬｅｕ４をＡｖａＩと
ＳａｌＩで消化し、６．３ｋｂｐの断片を自己連結して
得られる。

【００１６】上記ベクターは、宿主であるリゾープス・
ニベウスの染色体中に挿入されているか、リゾープス・
ニベウスの細胞質内に含まれているか、あるいはリゾー
プス・ニベウスの染色体中に挿入され、かつ細胞質内に
も含まれている。宿主であるリゾープス・ニベウスの染
色体中に挿入されているベクターは、１つ又は２つ以上
である。また、細胞質内に含まれるベクターの数も１つ
又は２つ以上である。

【００１７】本発明の上記宿主−ベクター系は、特開平
２−５３４８０号に記載の方法により製造することがで
きる。即ち、リゾープス・ニベウスの胞子を培養して発
芽管を得、この発芽管又は胞子もしくは菌糸をノボザイ
ム２３４、キチナーゼ及びキトサナーゼで処理してプロ
トプラスト化細胞とし、この細胞を藻菌類のプラスミド
の存在下でポリエチレングリコールで処理して藻菌類の
プラスミドを含む融合細胞とし、得られた融合細胞を再
生することにより、本発明の宿主−ベクター系を得るこ
とができる。尚、上記製造方法において藻菌類のプラス
ミドは、環状のまま用いても、または適当な制限酵素で
切断した線状のものを用いても良い。一般的傾向として
、環状のまま用いた方が形質転換頻度は高く、線状のも
のを用いると、染色体中に挿入される割合が高くなる。

【００１８】

【実施例】以下本発明を実施例によりさらに説明する。

【００１９】実施例１ （栄養要求変異株の取得） リゾープス・ニベウスの胞子懸濁液１０６　〜１０７　
個／ｍｌ）１ｍｌにＵＶ照射（０．００３６Ｊ／ｃｍ２
　）をし、生存率を測定した後に平板完全寒天培地に塗
布した。３７℃で約２０日間培養した後に胞子を回収し
、生理食塩水で洗浄した。次いでこの胞子を３０℃で液
体最少培地中で静置培養し、Ｇ３ガラスフィルターでろ
過した。この操作を菌の生育が見られなくなるまで繰り
返し行った。得られた胞子を生理食塩水で懸濁し、平板
酸性完全寒天培地（２．４％ポテトデキストロース（Ｄ
ｉｆｃｏ），０．１％ＨＣｌ，１．５％寒天）に塗布し
、３０℃で２〜３日間培養した。培養後、各種アミノ酸
、核酸を添加した最少寒天培地（２％グルコース、０．
２％アスパラギン、０．０５％ＫＨ２　ＰＯ４　，０．
０２５％ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ，１．５％精製寒天
）にレプリカした。レプリカした胞子の中からｌｅｕ要
求性変異株を常法により選択し、Ｒ．ニベウスＭ３７株
を得た。

【００２０】（リゾープス・ニベウスの形質転換）先に
得られたｌｅｕ要求性変異株であるＲ．ニベウスＭ３７
株の胞子２〜５×１０７　個を水に懸濁し、Ｇ１ガラス
フィルターでろ過し、ろ液をＧ３ガラスフィルターでろ
過した。ろ液を２５００ｒｐｍで７分間遠心分離して沈
澱を５〜８ｍｌの１％グルコース、２０％酵母抽出物、
２％ポリペプトン、０．０１Ｍプロリン溶液に懸濁し、
３０℃で４．５〜５時間振盪培養（３００ｒｐｍのレシ
プロシェーカー）した。発芽管の形成を顕微鏡で確認し
た後にＧ１ガラスフィルターでろ過し、ろ液を３０００
ｒｐｍで３分間遠心分離した。沈澱を５ｍｌの緩衝液Ａ
（１３．２ｍＭクエン酸、３３ｍＭ　　Ｎａ２　ＨＰＯ
４　、０．３Ｍマンニトール）に懸濁し、３０００ｒｐ
ｍで３分間遠心分離した。沈澱を再度緩衝液Ａに懸濁し
、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。

【００２１】沈澱を２ｍｌの緩衝液Ａに懸濁し、ノボザ
イム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）２３４（ノボ社製）３５ｍｇ、
キチナーゼＡＢＣ（アドバンス　　バイオファクチャー
ズ社製）１４ｍｇ、キトサナーゼ（和光社製）１０ユニ
ットを５ｍｌのＡ液に懸濁したものを添加した。３０℃
で１．５〜２時間振盪培養（６０ｒｐｍのレシプロシェ
ーカー）し、プロトプラストの形成を顕微鏡で確認した
後Ｇ２ガラスフィルターでろ過した。ろ液を４５０ｒｐ
ｍで４分間遠心分離した。沈澱を５ｍｌの緩衝液Ｂ（１
０ｍＭ　　ＭＯＰＳ（ｐＨ６．３）、５０ｍＭ　　Ｃａ
Ｃｌ２、０．３Ｍマンニトール）に懸濁し、４５０ｒｐ
ｍで４分間遠心分離することを２回繰り返した。沈澱を
２００μｌの緩衝液Ｂにゆっくり懸濁し、プラスミドｐ
Ｌｅｕ４〔ロンセロ（Ｒｏｎｃｅｒｏ），Ｍ．Ｉ．Ｇ．
ら、Ｇｅｎｅ，８４３３５−３４３（１９８９）：プラ
スミドｐＬｅｕ４はムコール・サーシンロイズ（Ｍｕｃ
ｏｒ　ｃｉｒｃｉｅｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）のｌｅｕＡ遺
伝子とムコール・サーシンロイズ中でのＡＲＳ領域を有
する〕懸濁液（約１０〜２０μｇのｐＬｅｕ４を１０μ
ｌの１０ｍＭ　　ＭＯＰＳ（ｐＨ６．３）、５０ｍＭ　
　ＣａＣｌ２　、１ｍｇ／２０μｌヘパリン溶液に懸濁
）１０μｌと混合した。氷中で５分間放置し、１０μｌ
の緩衝液Ｃ（１０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ６．３）、５０ｍ
Ｍ　　ＣａＣｌ２　、４０％ＰＥＧ　　４０００溶液）
を添加した。氷中で２５分間放置した後１．２５ｍｌの
緩衝液Ｃをさらに添加して、室温で２５分間放置した。 １０ｍｌの緩衝液Ｂと混合し、６００ｒｐｍで３分間遠
心分離した。

【００２２】沈澱を１ｍｌの１％グルコース、２％酵母
抽出物、２％ポリペプトン、０．３Ｍマンニトール溶液
に懸濁し、この懸濁液をエッペンドルフチューブに移し
た。３０℃で３０分間静置培養し、１０００ｒｐｍで１
分間遠心分離した。沈澱を１ｍｌの０．４Ｍマンニトー
ル溶液に懸濁し、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離する
操作を２回繰り返した。沈澱を１００μｌの０．４Ｍマ
ンニトール溶液に懸濁し、５ｍｌの１％精製寒天を含む
Ｄ培地（ＳＩＶ最少培地＋０．３５Ｍマンニトール、０
．２％Ｈ２　ＳＯ４　を４８℃で溶解）と混合した。次
に、１．５％精製寒天を含む平板Ｄ培地状に重層し、３
０℃で２〜３日間培養した。各々の単集落をＳＩＶ最少
培地へレプリカして保存した。即ち、プラスミドｐＬｅ
ｕ４は、ｌｅｕ要求性変異株であるＲ．ニベウスＭ３７
株を相補し、プラスミドｐＬｅｕ４がＲ．ニベウスＭ３
７株内でベクターとして機能することが明らかになった
。

【００２３】ＳＩＶ最少培地 Ａ液 蒸留水・・・・・・・・・・４８０ｍｌ窒素源　　アス
パラギン・・・　　　　２ｇ５０倍濃縮液（注１）・・
・　　２０ｍｌ粉末寒天・・・・・・・・・　　１５ｇ
Ｂ液 蒸留水・・・・・・・・・・４９０ｍｌグルコース・・
・・・・・・　　２０ｇＡ液、Ｂ液を別個にオートクレ
ーブした後混合する。 注１：５０倍濃縮液 ＫＨ２　ＰＯ４　・・・・・・・・・２５０ｇＭｇＳＯ
４　−７Ｈ２　Ｏ・・・・・・・　　２５ｇ微量元素溶
液（注２）・・・　　　　５ｍｌ１４％（Ｗ／Ｗ）Ｃａ
Ｃｌ２　溶液・・・・　　１０ｍｌチアミン・ＨＣｌ　
・・・・・・１００ｍｇ蒸留水・・・・・・・・・１０
００ｍｌ保存のためクロロホルム２〜３ｍｌ添加する。 注２：微量元素溶液 クニン酸・Ｈ２　Ｏ・・・・・・　　　　２ｇＦｅ（Ｎ
Ｏ３　）３　・９Ｈ２　Ｏ　・・・・　　１．５ｇＺｎ
ＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　・・・・・・　　　　１ｇＭｎ
ＳＯ４　・Ｈ２　Ｏ　　・・・・・・３００ｍｇＣｕＳ
Ｏ４　・５Ｈ２　Ｏ　・・・・・・　　５０ｍｇＮａＭ
ｏＯ４　　・２Ｈ２　Ｏ　・・・・・　　５０ｍｇ

【０
０２４】得られた形質転換体について全ＤＮＡを抽出し
、サザン解析を行った結果、プラスミドｐＬｅｕ４は、
Ｒ．ニベウスＭ３７株の染色体上にタンデムに挿入して
いるか、または細胞質内に存在することが明らかとなっ
た。さらに、形質転換体の全ＤＮＡを用いて大腸菌を形
質転換したところプラスミドｐＬｅｕ４が完全な形で回
収された。このことから、プラスミドｐＬｅｕ４がＲ．
ニベウスＭ３７株内でＡＲＳ活性を有し、自己複製でき
ることが示された。

【００２５】実施例２ 実施例１で用いた環状のプラスミドｐＬｅｕ４（制限酵
素地図を図１に示す）を４種の制限酵素〔Ｐｓｔ　Ｉ　
、Ｂｇｌ　ＩＩ、Ｓａｌ　Ｉ　、Ｓｃａ　Ｉ　〕で切断
した断片を用いて、実施例１と同様にして形質転換を行
った。その結果、何れの断片を用いてもｌｅｕ栄養要求
性は相補された。尚、得られた形質転換体の全ＤＮＡを
サザン解析した結果、環状のプラスミドを用いた場合に
比べて染色体への挿入割合は高かった。

【００２６】実施例３ Ｒ．ニベウスをＰＤ培地または最小培地に植菌し、３０
℃で約１０日間培養し胞子を作らせた。菌糸ごとに胞子
嚢をかき取り、３０ｍｌの滅菌水に懸濁し、強攪拌して
胞子嚢に包まれた胞子を遊離させた。Ｇ３ガラスフィル
ターで懸濁液から胞子だけを集めた。胞子懸濁液は、室
温で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して胞子を集めた。 胞子を１回生理食塩水で洗浄した後、０．０１Ｍのプロ
リンを添加したＹＰＧ液体培地（１％グルコース、２％
ポリペプトン、２％酵母抽出物）に２〜５ｘ１０７　コ
／ｍｌの割合で胞子を懸濁した。滅菌した綿栓付試験管
に胞子懸濁液を入れ、胞子から発芽管が生じるまで、約
５時間３０℃、３００ｒｐｍで振盪培養した。その後、
Ｇ１ガラスフィルター発芽直後の胞子より過度に発芽し
た胞子を分離して除去した。濾過液は、遠心で集菌し、
０．３ｘＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（１３．３ｍＭクエ
ン酸、３３ｍＭ　　Ｎａ２　ＨＰＯ４　、ｐＨ５．６）
で２回洗浄し、緩衝液を交換した。

【００２７】発芽した胞子は、ノボザイム（Ｎｏｖｏｚ
ｙｍ）２３４（ノボ社製）５ｍｇ／ｍｌ、キチナーゼＡ
ＢＣ（アドバンス　　バイオファクチャーズ社製）２ｍ
ｇ／ｍｌ、キトサナーゼ（和光社製）１．５２ｍｇ／ｍ
ｌを含む７ｍｌの上記緩衝液に懸濁した。この懸濁液を
プラスチックチューブに入れ、３０℃、４０ｒｐｍで１
．５〜２時間震盪培養した。プロトプラスト懸濁液の残
さを除去し濾液を７０ｘｇ、４分間スィングロータで遠
心し集菌した。集菌したプロトプラストを緩衝液Ａで２
回ずつ洗浄し、４００μｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭＭＯＰ
Ｓ（ｐＨ６．３）、５０ｍＭ　　ＣａＣｌ２　、０．３
Ｍマンニトール）に懸濁した。この懸濁液１００μｌに
対して、あらかじめ１０μｌの緩衝液Ｃ（緩衝液Ａ＋ヘ
パリン（５０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加））に溶解し、氷
中に２０分以上放置しておいたプラスミドＤＮＡ溶液と
混合した。混合液を氷中で５分間放置し、４０％ＰＥＧ
溶液（４０％ＰＥＧ　　４０００、１０ｍＭＭＯＰＳ（
ｐＨ６．３）、５０ｍＭ　　ＣａＣｌ２　）１０μｌを
添加し、穏やかに混合し、さらに氷中で２５分間放置し
た。

【００２８】これに、１．２５ｍｌの４０％ＰＥＧ溶液
をさらに添加して、室温で２５分間放置した後、１０ｍ
ｌの緩衝液Ａで希釈し、５０ｘｇで４分間スウィングロ
ーターで遠心し集菌した。集菌したプロトプラストに０
．３Ｍマンニトールを含有するＹＰＧ液体培地１ｍｌを
加え、３０℃で３０分間静置した。静置後、０．４Ｍマ
ンニトールで２回プロトプラストを洗浄した後、最少培
地にプレーティングした。現れたコロニーの数を測定し
、使用したＤＮＡの量で割り算して１μｇ当たりのコロ
ニー数を求めた。結果を表１及び表２に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】

【表２】

【００３１】尚、上記実験で使用したＤＮＡ（プラスミ
ド）は、図２〜図４に示すフローチャートに従って、以
下に説明するようにして作製した。

【００３２】ｐＪＰＬｅｕ４：プラスミドｐＪＬ２より
０．９ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を単離し、Ｔ
４ポリメラーゼで末端を平滑化した。この断片と、Ｓａ
ｍＩ消化及びアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸
化したプラスミドｐＬｅｕ４をＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結してｐＪＰＬｅｕ４を得た。

【００３３】ｐＪＰＬｅｕ４１：プラスミドｐＪＰＬｅ
ｕ４をＡｖａＩとＳａｌＩで消化し、得られた７．２ｋ
ｂｐの断片をＴ４ポリメラーゼを用いて末端を平滑化し
た後、自己連結して得られた。

【００３４】ｐＰＰＬｅｕ４：プラスミドｐＰＳ１１よ
り５．２ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片を単離し、Ｔ４ポリメ
ラーゼで末端を平滑化した。この断片と、ＳａｍＩ消化
及びアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化したプ
ラスミドｐＬｅｕ４をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
してｐＰＰＬｅｕ４を得た。

【００３５】ｐＰＰＬｅｕ４１：プラスミドｐＰＰＬｅ
ｕ４をＡｖａＩとＳａｌＩで消化し、１１．５ｋｂｐの
断片をＴ４ポリメラーゼを用いて末端を平滑化した後、
自己連結して得られた。

【００３６】ｐＬｅｕ４１：プラスミドｐＬｅｕ４をＡ
ｖａＩとＳａｌＩで消化し、６．３ｋｂｐの断片をＴ４
ポリメラーゼを用いて末端を平滑化した後、自己連結し
て得られた。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　プラスミドｐＬｅｕ４の制限酵素地図であ
る。

【図２】　　プラスミドｐＪＰＬｅｕ４及びプラスミド
ｐＪＰＬｅｕ４１の作製方法を示す。

【図３】　　プラスミドｐＰＰＬｅｕ４及びプラスミド
ｐＰＰＬｅｕ４１の作製方法を示す。

【図４】　　プラスミドｐＬｅｕ４１の作製方法を示す
。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　リゾープス・ニベウスの染色体中及び
   ／又は細胞質内に藻菌類のプラスミドを含む宿主−ベク
   ター系。
2. 【請求項２】　　プラスミドがｐＬｅｕ４、ｐＪＰＬｅ
   ｕ４、ｐＰＰＬｅｕ４、ｐＬｅｕ４１、ｐＪＰＬｅｕ４
   １又はｐＰＰＬｅｕ４１である請求項１記載の宿主−ベ
   クター系。