JP3833725B2 - 選択マーカー遺伝子を含まない組換え体株、その作製方法及びその株の使用 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、選択マーカー遺伝子を含まない組換え体株、その作製方法及びその使用を開示するものである。更に、本発明の方法は、菌株を改良するのに用いられる。
【0002】
【従来の技術】
組換えDNA技術の使用について社会的関心が増加している。組換えDNA技術の有望な適用領域の1つが菌株の改良である。初期の発酵生産法から始まって、生産に用いられる菌株の生産性の改良が必要とされた。
工業的に使用された微生物の古典的な菌株改良研究は、主としてランダム突然変異誘発に基づき、その後選択するものである。変異誘発法は多く記載されており、突然変異原として紫外線、NTG又はEMSの使用が挙げられている。これらの方法は、“Biotechnology : a comprehensive treatise in 8 vol.”Volume I, Microbial fundamentals, Chapter 5b, Verlag Chemie GmbH, Weinheim, Germany 等多くに記載されている。
選択法は、一般に適切なアッセイについて開発され、主に野生型と突然変異株との識別において重要である。
これらの古典的な方法は改良の可能性が限定されることが判明している。一般的には、減少している収量を菌株改良すると所望の生産物の収量が増加する。これは、使用された突然変異誘発法のランダム性のために少なくとも部分的なものである。所望の突然変異とは別に、これらの方法は好ましくなくかつ菌株の他の特徴に否定的に影響する突然変異も生じる。
【0003】
これらの欠点のために、組換えDNA法を使用すると著しく改良されたことが理解される。一般に、菌株改良研究において用いられる組換えDNA法は所望の遺伝子産物の発現を増大する。
遺伝子産物はそれ自体興味深いタンパク質であり、一方コードされた遺伝子産物が他の産物の合成において調節タンパク質として働くことも可能である。
所望のタンパク質コーディング遺伝子の多数のコピーを特定の宿主生物に導入することにより、菌株を改良することができる。しかしながら、調節遺伝子を導入することにより発現レベルを増大させることも可能である。
遺伝子は、遺伝子を導入するために伝達体として働くベクターを用いて導入される。かかるベクターは、プラスミド、コスミド又はファージとすることができる。ベクターは遺伝子を発現することができ、その場合、ベクターは通常自己複製することができる。しかしながら、ベクターは組込むことができるだけでもよい。発現産物が改変表現型特性に基づいて容易に選択することができない場合、ベクターのもう1つの特徴は、ベクターが容易に選択することができるマーカーを備えていることである。
【0004】
ベクターを生物内に見ることができないのであるいは他の生物から利用できるベクターをほとんど又は全く修飾せずに用いることができるので、ベクターは既知のすべての微生物から単離されていない。同じことが選択マーカー遺伝子にも当てはまる。
最近、特定のマーカー遺伝子の広範囲な使用及びその後の展開が検討されるようになった。これは特に、抗生物質及び抗生物質選択マーカーを使用すると、抗生物質耐性になった菌株が望ましくない展開を生じるという発見によるものである。これにより、さらに強力な新規な抗生物質を継続して開発することが必要である。
従って、大量生産において、抗生物質耐性遺伝子を全く含まないか又はより一般には外来DNAをできるだけわずかしか含まない組換え微生物を用いる一般的傾向があることは驚くべきことではない。
形質転換微生物は、遺伝子内に所望の遺伝子、そのフラグメント又は修飾のみ含み、更にクローニングに用いられる残りのDNAをできるだけわずかしか含まないか又は全く含まないことが理想的である。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、組換え体宿主微生物から容易に欠失することができる選択マーカー遺伝子を開示するものである。該マーカー遺伝子の欠失は優性選択に基づくものである。
マーカーは、細菌、糸状菌(filamenfous fungi)及び酵母のような異なった種で用いられる。
本明細書で用いられる選択マーカーの有利な活性は、下記2段階原理に基づいている:
a)遺伝子が宿主生物のゲノムに組込まれ、組換え体細胞が選択される、
b)形質転換細胞が基質上で発育され、気質がマーカー遺伝子をコードした活性によってその細胞に致命的な生産物に変換される。
選択された細胞は組換え体であり、選択マーカー遺伝子を欠失している。
一般的には、本発明は、ゲノムに修飾を有する動物又は植物細胞及び微生物である細胞であって、amdS遺伝子又はそれから誘導されたcDNAを用いて改変が導入されることを特徴とする上記細胞を開示するものである。
【0006】
このようにして用いられる選択マーカー遺伝子の例はアセトアミダーゼ遺伝子である。本遺伝子は、好ましくは糸状菌、更に好ましくはコウジカビ属 (Aspergillus)、最も好ましくはアスペルギルスニドゥランス (Aspergillus nidulans) 由来である。
本発明は、更にマーカーとしてアセトアミダーゼ(amdS)遺伝子を用いて選択する宿主生物における所望の異種又は同種遺伝子又はDNA分子の導入、欠失又は修飾を示すものである。引き続きamdSが欠失される。amdS及び所望の遺伝子は部位特異的に導入されることが好ましい。
本発明は、下記のものを含むベクターを開示するものである:
a)宿主ゲノムに導入するために予定された所望のDNAフラグメント、
b)場合によってはベクターを宿主株のゲノムに組込む(部位特異的に)ことを可能にするDNA配列、
c)DNA反復間のアセトアミダーゼ(例えばA.ニドゥランス由来のamdS)をコードする遺伝子。
【0007】
本発明は、更に該ベクターで形質転換された宿主生物を開示するものである。本発明は、更に選択マーカー遺伝子を含まない組換え体微生物を開示するものである。
詳細には、本発明は、外来DNAを更に存在させずに部位特異的に導入した遺伝子を含む生物を開示するものである。従って、本方法は、宿主ゲノムの反復修飾、例えば所定の遺伝子座に多重遺伝子コピーを連続導入するのにも適する。
本発明は、下記段階を含む選択マーカー遺伝子を含まない組換え体株を作製する方法を提供するものである:
a)菌株のゲノムに所望のDNAフラグメント及び選択マーカーを組込む、
b)組換え体を選択する、
c)好ましくは選択マーカーが隣接する反復間に内部組換えを用いて選択マーカーを欠失する、
d)選択マーカーが存在しないことに対して逆選択(counter-selection) する。
【0008】
これは選択マーカー遺伝子を含まない組換え体株を作製する好ましい方法であるが、本発明はこの方法の変更、例えば:所望のDNAフラグメント及び選択マーカーが2種類のDNA分子に存在してもよく同時形質転換される。選択マーカーは必ずしも菌株のゲノムに組込まず、キュアされるエピソームDNA分子に存在してもよい。
本発明は、本マーカー遺伝子が微量、即ちクローニングに用いたDNAを残さずに形質転換された生物のゲノムから欠失されることも説明するものである。
本発明は、「宿主」生物の染色体から所望の遺伝子を欠失するためにamdS遺伝子の使用も開示するものである。このような修飾技術は糸状菌、酵母及び細菌にも当てはまる。個々の実施態様においては、次の菌株、アスペルギルス (Aspergillus)、トリコデルマ (Trichoderma)、ペニシリウム (Penicillium)、バシラス (Bacillus) 、E.コリ (E.coli) 、クルイベロミセス (Kluyveromyces)及びサッカロミセス (Saccharomyces)が用いられる。
本発明の方法は、同じ又は他のベクターを用いて手順を反復することにより得られたゲノム修飾を含む組換え体株を提供するものである。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明は、形質転換宿主株を選択するマーカーの使用を開示するものである。選択マーカー遺伝子は、エピソームDNAベクター上で用いることができる。しかしながら、本発明においては、マーカー遺伝子を宿主株のゲノムに組込むことが好ましい。本発明の選択マーカーの利点は、優性非抗生物質選択マーカーであることである。本発明の選択マーカーの別の利点は、形質転換宿主生物から容易に欠失することができることである。マーカーの欠失は、優性選択に基づいている。本発明の選択マーカーはそれだけで優性かつ二方向選択マーカーである。知る限りでは、これは二方向及び両方向に優性である唯一の有効な選択マーカーである。
本発明の説明においては、「選択マーカー遺伝子」という用語が用いられる。この用語は、それが実際の遺伝子かあるいはそれから誘導されたcDNAであるかに無関係な機能上の形でマーカータンパク質をコードするDNAを意味する。遺伝子又はcDNAは、宿主生物及びスプライシングの予想される問題点によって用いられる。
【0010】
本発明においては、「ベクター」という用語が用いられる。これは、ベクターが宿主細胞のゲノムに組込むかあるいはエピソームを維持するかに無関係な選択宿主に導入することができる任意のDNA分子を意味する。ベクターは、選択宿主において機能する選択性マーカー遺伝子を含むか又はそのような選択マーカー遺伝子を含む別のDNAで同時形質転換することができる。
本発明の説明には、「所望の相同又は非相同遺伝子又はDNAフラグメント」という用語が用いられる。これは、宿主株又は別の種もしくは株から得られるDNAフラグメントを意味する。所望のDNAフラグメントは、遺伝子(一部又は完全な遺伝子座をコードする)、cDNA、プロモーター、ターミネーター、イントロン、シグナル配列、DNA結合タンパク質の調節DNA配列又は認識配列のような遺伝要素、その一部又はその組合わせを含むことができる。そのフラグメントは、修飾されている、即ち1種以上のヌクレオチド改変(例えば、挿入、欠失、置換)を含むDNA配列であってもよい。
本発明の説明には、更に、所望の遺伝子又はDNAフラグメントの「導入」という用語が用いられる。これは、選択宿主細胞における挿入、欠失、置換を意味する。
【0011】
本発明で用いられる「遺伝的修飾」という用語は、上記所望のDNAフラグメントのいずれか1種を宿主細胞に、好ましくは形質転換又は同時形質転換によって導入する結果である選択宿主細胞におけるDNA配列の任意の修飾を意味する。
一般に、これらの遺伝的修飾はすべて本発明の方法を用いて行われ、引き続き選択マーカー遺伝子を欠失することができる。そのような遺伝的修飾を含む組換え体株が選択マーカー遺伝子を含有しない事実のために、本発明の手順を反復することができ、上記で示した修飾が組換え体株に組合わせられる。結局、本発明の手順は、望ましくないすべての活性が対応する遺伝要素の欠失又は不活性化によって除去されておりかつ所望のコピー数、好ましくは所望のかつ特定された遺伝子座の対応する所望のDNAフラグメントを引き続き導入することにより所望レベルの所望活性を含む組換え体株が得られる点まで反復して用いることができる。
【0012】
A.ニドゥランスアセトアミダーゼ(amdS)遺伝子であると、A.ニドゥランスは単独のN源としてアセトアミド上で発育する。単独のN源としてアセトアミドを用いる可能性がないか又は極めて限定された能力しかない微生物の場合、アセトアミドが細胞によって吸収されるならばアセトアミダーゼ遺伝子は理論上選択マーカーとして用いることができる。amdS遺伝子は、アスペルギルス(Kelly, Hynes (1985) EMBO J. 4, 475-479; Christensenら, (1988) Bio/technology 6, 1419-1422) 、ペニシリウム(Beri and Turner (1987) Curr. Genet. 11, 639-641) 及びトリコデルマ(Pentillaeら (1987) Gene 61, 155-164) においてマーカー遺伝子として巧く用いられている。
【0013】
本発明は、糸状菌以外の生物において選択マーカーとしてA.ニドゥランス由来のamdS遺伝子の使用を初めて開示するものである。この選択マーカーの使用は、細菌及び酵母において開示される。詳細には、S.セレビシエ (S.cerevisiae) 、K.ラクチス (K.lactis) 、B.サチリス (B.subtilis) 、B.リケニホルミス( B.licheniformis)及びE.コリ (E.coli) における使用が示される。真菌、酵母及び細菌のような異なった群より選ばれた種における選択マーカーの適用が開示されているために、マーカーはこれらの群に属する他の種にも適用できることが予想される。従って、本マーカーの使用は、開示されている種に限定されない。
A.ニドゥランス由来のamdS遺伝子は、アセトアミドをアンモニア及び酢酸に変換することができる。この特性のため、A.ニドゥランスは単独のN源又はC源としてアセトアミドを含有する培地上で発育することが可能である。
【0014】
amdS遺伝子の別の特性は、フルオロアセトアミドをアンモニア及びフルオロ酢酸にも変換することができることである。しかしながら、フルオロ酢酸は、細胞に有毒である。本発明のもう1つの態様、即ちマーカー遺伝子を含まない組換え体株作製の根拠をなすのがこの特性である。フルオロアセトアミド変換特性により、形質転換細胞の逆選択が可能である。amdS遺伝子は宿主株に導入され、相同的組換えによりゲノムに組込まれる。単独のN源としてアセトアミドを含有する培地上にこの形質転換菌株が選択される。引き続きこの選択された菌株が単独のN源としてフルオロアセタミド及び尿素(又は他の好ましい特定N源)を含有する培地上で発育される。生存菌株は、amdS遺伝子を欠失している。
【0015】
本発明は、アセトアミドマーカー遺伝子としてA.ニドゥランスamdS遺伝子を使用するものである。A.ニドゥランスamdS遺伝子がコードされたアセトアミダーゼによって生じる適切な特性、即ちアセトアミドのアンモニア及び酢酸塩への加水分解能及びフルオロ酢酸のフルオロアセトアミドからの遊離能も他の起源からのアセトアミダーセによって生じる。従って、アセトアミダーゼマーカー遺伝子の使用は、機能アセトアミダーゼをコードするDNA配列を含む以外はA.ニドゥランスamdS遺伝子に限定されない。
マーカー欠失の頻度は、染色体内相同的組換えに対する遺伝子の能力を増加することにより実質的に増加する。本amdS遺伝子を達成するためにはDNA反復間に配置することが好ましい。これらの反復は、単一交差組込みによって作られる以外は必ずしもベクター内に共に存在しない。また、隣接反復を取り除き、マーカー遺伝子の除去又は不活性化のための他のメカニズムによるものである。しかしながら、その場合結果は予想できなくなり、マーカー遺伝子を除去せずむしろ単に不活性化する結果となる。
【0016】
ベクターは、マーカー遺伝子の欠失後、無関係の外来DNA(問題のDNA以外)が宿主株の染色体内に残らないようにして構築される。本発明は、下記のものを含むベクターを開示するものである:
a)宿主ゲノムに導入されることになる所望のDNA配列、
b)任意によりベクターを宿主株のゲノムに組込ませる(部位特異的)DNA配列、
c)DNA反復間でアセトアミダーゼ(例えばA.ニドゥランス由来のamdS遺伝子)をコードする遺伝子。
宿主ゲノムに導入されることになるDNAフラグメント及び選択可能なマーカー遺伝子(例えばアセトアミダーゼ遺伝子)が同時形質転換される2種類のDNA分子に存在する場合にも同一の結果が得られ、その場合選択可能なマーカーを含むDNA分子は必ずしも宿主ゲノムに組込まずキュアすることができるエピソームDNA分子に存在させてもよい。
【0017】
b)によって言及される組込みに用いられる配列は、部位特異的(遺伝子座特異的の方が良い)組込みが所望される場合に用いられる。そのような配列が存在しない場合にもベクターはゲノムに組込むことができる。これにより、選択マーカー遺伝子の欠失能に影響されない。
上記の優性逆選択は、種々の方法で工業生産株の開発に用いることができる。優性逆選択を使用すると、これらの菌株がしばしば二倍体又は倍数体であるという事実のために改良された生産株の開発に特に有利である。
amdS遺伝子の組込みに用いられるベクターは問題の他の遺伝子を含むことが好ましい。即ち、本発明は、更にマーカーとしてamdS遺伝子を用いて選択する宿主生物において所望の外来もしくは相同遺伝子又はDNA要素の導入が可能である。引き続きamdS遺伝子が欠失される。amdS及び所望の遺伝子又はDNA要素を部位特異的に導入し、その後amdS遺伝子を欠失させることが好ましい。
【0018】
詳細には、本発明は、外来DNAを更に存在させずに部位特異的に導入された遺伝子を含む生物を開示するものである。本発明は、所定のゲノム遺伝子座の所望の遺伝子又はDNA要素の多重コピーを組込むのに用いられる。
本発明は、下記の段階を含むマーカー遺伝子を含まない組換え体株を選択する方法を提供するものである:
− 所望の遺伝子又はDNA要素及び選択マーカーを、発現カセットに取込まれた配列と宿主染色体上の配列の間の相同的組換えによって組込む、
− 優性の選択マーカー遺伝子を用いて選択する、
− 選択マーカー遺伝子隣接領域を用いて選択マーカー遺伝子を欠失する、
− 選択マーカー遺伝子が存在しないことに対して選択する(逆選択)。
本発明は、更に、本マーカー遺伝子が微量、即ちクローニングに用いたDNAを残さずに形質転換生物の染色体から欠失することができることを示すものである。更に、本発明は、所望の遺伝子又はDNA要素及び選択マーカーが同時形質転換される2種類のDNA分子に存在すると同一の結果を得ることができなくても似ていることを示すものである。
【0019】
最後に、本発明は、「宿主」生物の染色体から所望の遺伝子を欠失するamdS遺伝子の使用を開示するものである。
上記の観点から、本発明は、理想的には、食品、飼料又は医薬用途に用いられるタンパク質をコードする遺伝子又は抗生物質及び他の生活性化合物の生合成、即ち厳密な記載に要求される組換え体タンパク質及び/又は宿主生物に関与する遺伝子のクローニング及び発現に適しているがこれらに限定されない。
このようなタンパク質の例は当該技術において周知であり、キモシン、フィターゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及びヘミセルラーゼ、サイトカイン及び他の医薬タンパク質等が挙げられる。
【0020】
同様の方法が、ゲノム内にマーカー遺伝子を残さずに所望のタンパク質の生産レベルに影響するタンパク質をコードする遺伝子の欠失に用いられる。このようなタンパク質としては、宿主株内で高度に発現され、従って所望のタンパク質の生産及び/又は分泌の可能性が減少した所望の生産物を活発に消化するプロテアーゼがある。ある遺伝子を欠失するのに好ましい方法は、5′〜3′の順序の次の要素:欠失されるべき配列5′遺伝子、直接融合された欠失されるべき配列3′遺伝子、下流に続く機能上の選択マーカー遺伝子(好ましくはアセトアミダーゼ遺伝子)、下流に続く欠失されるべき配列3′遺伝子を含有するDNA構築物を使用する。この場合、欠失されるべき3′遺伝子の両配列を選択して選択マーカー遺伝子に隣接する反復を形成する。このDNA構築物を形質転換し、引き続き欠失されるべき遺伝子の染色体コピーを欠失されるべき配列5′及び3′遺伝子に交差点を有するDNA構築物で置き換えると、ある遺伝子を欠失することになる。引き続き選択マーカー遺伝子に隣接する反復間の染色体内組換え及びこれらの組換えに対する逆選択により、最後にある遺伝子が欠失した選択マーカーを含まない菌株を生じる。この欠失に用いられるDNA構築物は、欠失のある菌株内に外来DNA又は他の微量の遺伝的修飾が残らないように構築することができる。
【0021】
本発明は、選択マーカー遺伝子を含まない組換え体微生物を開示するものである。その微生物は、開示した技術を使用した後、所望の遺伝子(相同あるいは非相同)の過剰コピーを含有する生物とすることができる。同じ技術を連続して用いることにより、その微生物を何度も再形質転換して問題の同じ又は他の遺伝子のコピーを更に挿入又は欠失することができる。
これらの微生物は、また、所定の遺伝子が所望の方法で欠失又は改変されていることを特徴とするものである。
本発明の方法は、所望のタンパク質の生産を微細調整することを可能にするものである。この可能性は、挿入及び欠失を反復することができる容易さに基づくものである。本方法は、所望の遺伝子コピー数の挿入又は欠失を可能にするものである。即ち、タンパク質が所望量及び所望比で生産される。これは、タンパク質又は酵素の混合物の生産に特に有効である。
アセトアミダーゼ遺伝子がアスペルギルスにおいて単独のN源としてアセトアミドを変換することができることは既知であるが、アセトアミダーゼ遺伝子が形質転換アスペルギルスのゲノムから容易に欠失されることはここに示されている。これを達成するために、amdS遺伝子を直列反復間でクローン化する。原則として内部組換えができる直列反復を用いることができる。本発明の実施例において、これは3′アミログルコシダーゼ(glaA)非コーディングDNA配列間でamdS遺伝子をクローン化することにより示される。
【0022】
amdS遺伝子は、N源としてフルオロアセトアミド及び尿素を含有する培地上のプレーティングで組込み及び欠失されることが示されている。
更に、アミログルコシダーゼ遺伝子をアスペルギルスのゲノムから欠失することができることも証明される。glaAプロモーターの一部、全部で3個の読み枠に停止コドンを含む合成DNA配列、A.ニドゥランスグリセロアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーターの調節によるA.ニドゥランス由来の3′glaA非コーディング配列が隣接するamdS遺伝子を含む置換ベクターが構築される。A.ニガー (A.niger)の形質転換後、二重交差によりベクターを組込み、そのことによりアミログルコシダーゼ遺伝子が効果的に置換される。amdS活性の選択後、形質転換株をフルオロアセトアミド及び尿素に塗布する。選択によりamdS遺伝子が欠失した菌株が得られた。
本実施例は、アスペルギルス株のゲノムから所望の遺伝子を欠失するamdS遺伝子を使用する可能性を具体的に説明するものである。他の遺伝子は、同様の方法で除去又は修飾することができる。
【0023】
更に実施例において、遺伝子がゲノム内の所定部位にマーカーを含まない遺伝子を挿入することができることが示されている。A.ニガーglaA遺伝子座及び3′glaA非コーディング2反復が隣接したamdS遺伝子を含む組込みベクターが構築される。
この構築物はアミログルコシダーゼ遺伝子座に組込むことが示されている。フルオロアセトアミドで選択した後、amdSが欠失される。このようにして、マーカーDNAを残さずに特定の遺伝子座に遺伝子コピーが組込まれる。
上記のことから、本明細書に記載される手順により、当業者が後に選択マーカーDNAを残さずに所定の遺伝子座に所望の遺伝子を組込むかあるいは欠失することができることは明らかである。
本方法は、遺伝子増幅及び遺伝子置換に用いることができる。
特に重要な適用は、所望の遺伝子を組込むことである。菌株を古典的に改良した後、古典的菌株改良によって逆に影響する遺伝子を問題の遺伝子の影響されない新しいコピーに発現レベルのロスなしで置き換える。
【0024】
上記アスペルギルスについて記載した系は、単独のN源としてアセトアミド上で発育することができないことが知られている真菌の他の菌株を用いる場合に同様の結果を得ることが予想される。選択マーカーとしてamdS遺伝子を使用することが特にペニシリウム及びトリコデルマに記載されている。更に、amdS遺伝子は、不十分にもかかわらず単独のN源としてアセトアミドを使用することができる糸状菌においてさえも使用することができる。この場合、選択培地にCsClを含めることにより、発育の不十分な形質転換されない細胞の背景を抑制することができる(Tilburn, J.ら (1983) Gene, 26, 205-221)。従って、この系は、一般に糸状菌に適用できることが予想される。
本明細書の1実施態様においては、驚くべきことにA.ニドゥランスamdS遺伝子がK.ラクチスにおいて選択マーカーとして用いることができることが示されている。本実施例においては、2種類のK.ラクチス株が単独のN源としてのアセトアミド上で発育することができないことが示されている。K.ラクチス2株は、a)N源を含まない以外は完全である、
b)アセトアミドを含む以外はa)として、
c)硫酸アンモニウムを含む以外はa)としてYCB培地上に塗布される。
【0025】
これらの菌株はb)の培地上で発育しないがc)の培地上で発育することが示されている。従って、アセトアミドが酵母細胞によって吸収されかつamdS遺伝子がK.ラクチス内で発現することができれば、この系は少なくとも選択マーカーとしても酵母内で適用することができる。フルオロアセトアミドを用いる逆選択に関して、更に若干の要求を満たさねばならない。酵素アセチル−CoA−シンテターゼによって活性化される場合、フルオロアセテートは有毒である。従って、amdS+ 酵母に作用するフルオロアセトアミド逆選択に対する必要条件は次のことである:
1)フルオロアセトアミドがamdS酵母に有毒であってはならない、
2)酵母細胞壁及び原形質膜がフルオロアセトアミドに対して透過性でなければならない及び
3)酵素アセチル−CoA−シンテターゼが活性でなければならない。
【0026】
これを試験するために、amdS遺伝子をK.ラクチス内でクローン化した。
K.ラクチスにおいてA.ニドゥランスamdS遺伝子のスプライシングの問題の可能性を避けるために、A.ニドゥランス由来のamdScDNAを実験の項に示されているようにクローン化した。
引き続き、別のマーカー(ホスホトランスフェラーゼ−G418)を含むベクターの酵母プロモーター(LAC4、ADH1、K1EF)の下流にamdSをクローン化した。このクローニングは実施例8に記載されている。G418マーカー及びamdS遺伝子を共に含有するベクターをG418マーカーを用いて選択し、次いでamdS+表現型の選択条件を最適化するために用いた。
K.ラクチスの直接選択は、本発明の別の実施態様において示されており、S.セレビシエの場合実施例11に直接選択が示されている。
【0027】
引き続き、形質転換酵母菌に逆選択を用いてamdS遺伝子を除去することが示されている。
amdS遺伝子系は、酵母内遺伝子のマーカー遺伝子を含まない挿入及びマーカー遺伝子を含まない欠失の双方に用いられる。
更に実施態様においてはラクターゼ遺伝子がK.ラクチスから欠失されるが、実施例14においてはキモシン遺伝子のコピーがK.ラクチスゲノムに挿入される。挿入及び欠失にここで用いられる遺伝子は、例として用いられているにすぎない。他の遺伝子又はDNA要素を用いて同様の技術を当てはめることができる。前述のように挿入又は欠失に用いられるDNAフラグメントは、突然変異遺伝子、プロモーター配列、調節配列等とすることができる。すべての場合において、これらの配列を所望のゲノム部位及び所望の数で後にマーカー遺伝子を残さずに挿入又は欠失することが可能である。
【0028】
他の酵母菌において本系の使用が可能であることは明らかである。
本発明の系を細菌に使用する第1段階として、バシラスサチリス (Bacillus subtilis)及びE.コリが単独のN源としてのアセトアミド上で発育することができないことが実施例15に示されている。
実施例16には、バシラス及びE.コリで使用するために構築されているベクターが記載されている。
実施例17及び18にはバシラス及びE.コリにおいてamdS遺伝子を選択マーカーとして効果的に用いることができることが示され、実施例19には細菌のamdS+ 形質転換細胞のフルオロアセトアミド逆選択が示される。
本発明の系の利点は多数である。最も注目すべき利点を下記に示す:
− amdS系は普遍的に適用でき(植物細胞、動物細胞、酵母、細菌及び糸状菌等)、問題の宿主が単独のC又はN源としてアセトアミド上で発育することができないか又は十分に発育することができないが単独のC又はN源として各々酢酸塩あるいはアンモニアを使用することができることだけを必要とすることが示される。
【0029】
− amdS系は、二方向及び優性選択系のみを表すものである。天然単離物及び/又は工業的菌株によくあるこの特徴は、倍数体又は異数体菌株で用いるのに便利である。
− 菌株を古典的に改良した後、所望の遺伝子が十分に特定された遺伝子座に組込まれている事実により、所望の遺伝子の突然変異コピーを非突然変異コピーに遺伝子置換により容易に置き換えることができる。即ち、それらの遺伝子が非突然変異遺伝子に発現レベルに影響せずに置き換えられる。
− 十分に特定された従って非ランダム遺伝子座に多数の組込みを導入することができる能力のために、好ましくない特徴が遺伝子増幅の際に菌株内に生じないことは確かである。
− 環境における種々の選択マーカーの解離に関する成長は提示した系によって克服される。所望の遺伝子又は他の遺伝的修飾を導入した後、選択マーカー遺伝子又は他の不要な又は所望されないDNA配列は生産株内に存在させることを必要としない。
【0030】
実験
一般分子クローニング技術
本明細書に記載される実施例において、核酸の単離及び精製、核酸の電気泳動酵素的修飾、核酸の切断及び/又は増幅、E.コリの形質転換等の分子クローニング標準法を文献 (Sambrookら (1989) “Molecular Cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New York; Innisら (eds.)(1990) “PCR Protocols, a guide to methods and applications" Academic Press, San Diego) に記載されているように行った。オリゴデオキシヌクレオチドの合成及びDNA配列分析は、製造業者によって備えられたユーザーマニュアルに従って各々Applied Biosystems 380B DNAシンセサイザー及び 373A DNAシークエンサーで行った。
【0031】
A. ニガーの形質転換
A.ニガーの形質転換を Tilburn, J.ら (1983) Gene 26, 205-225及び Kelly, J. & Hynes, M. (1985) EMBO J., 4, 475-479 に記載されている方法を下記のように変更して行った:
− 胞子をアスペルギルス最少培地で回転振盪器中300 rpm,30℃で16時間発育させる。アスペルギルス最少培地は、次の成分からなる:1リットル当たり6gのNaNO3 ;0.52gのKCl;1.52gのKH2 PO4 ;1.12mlの4M KOH;0.52gのMgSO4 ・7H2 O;10gのグルコース;1gのカザアミノ酸;22mgのZnSO4 ・7H2 O;11mgのH3 BO3 ;5mgのFeSO4 ・7H2 O; 1.7mgのCoCl2 ・6H2 O;1.6mgのCuSO4 ・5H2 O;5mgのMnCl2 ・4H2 O;1.5mgのNa2 MoO4 ・2H2 O;50mgのEDTA;2mgのリボフラビン;2mgのチアミン・HCl;2mgのニコチンアミド;1mgのピリドキシン・HCl;0.2mgのパントテン酸;4μg のビオチン;10mlのペニシリン(5000IU/ml)/ストレプトマイシン(5000IU/ml)溶液(Gibco) 。
【0032】
− Novozym 234(Novo Industri)のみをヘリカーゼなしでプロトプラストの形成に用いた;
− プロトプラスト形成(60−90分)後、KCバッファー(0.8M KCl,9.5mMクエン酸,pH6.2)を45ml量まで加え、プロトプラスト懸濁液をスインギング−バケットローターで2500g,4℃で10分間遠心した。プロトプラストを20mlのKCバッファーに再懸濁した。次いで、25mlのSTCバッファー(1.2M ソルビトール,10mMトリスHClpH7.5,50mMCaCl2)を加え、次にプロトプラスト懸濁液をスインギング−バケットローターで2500g,4℃で10分間遠心し、STCバッファーで洗浄し、STCバッファーに108 プロトプラスト/ml の濃度で再懸濁した;
− 200μl のプロトプラスト懸濁液にDNAフラグメントをTEバッファー(10mMトリスHClpH7.5,0.1mMEDTA)中10μl 量で加え、次に100μl のPEG溶液(20%PEG4000(Merck),0.8M ソルビトール,10mMトリスHClpH7.5,50mMCaCl2)を加えた;
【0033】
− DNAプロトプラスト懸濁液を室温で10分間インキュベートした後、1.5mlのPEG溶液(60%PEG4000(Merck),10mMトリスHClpH7.5,50mMCaCl2)を徐々に試験管を繰り返し混合しながら加えた。室温で20分間インキュベートした後、懸濁液を5mlのSTCバッファーで希釈し、転化により混合し、2000g,室温で10分間遠心した。プロトプラストを1mlの1.2M ソルビトールに穏やかに再懸濁し、リボフラビン、チアミン・HCl、ニコチンアミド、ピリドキシン・HCl、パントテン酸、ビオチン、カザアミノ酸及びグルコースを含まないが単独の窒素源としてアセトアミド、1M スクロースを含む2%細菌学的寒天 #1 (Oxoid, England)で固化したアスペルギルス最少培地からなる再生選択培地に塗布した。30℃で6−10日間発育させた後、プレートをスクロースの代わりに2%グルコース及び寒天の代わりに1.5%アガロースを含むアスペルギルス再生選択培地からなるアセトアミド選択プレート上にレプリカ培養した。30℃で5−10日間発育させた後、単一形質転換細胞を単離した。
【0034】
A. オリゼ (A.oryzae) の形質転換
Christensen, T.らの欧州特許出願第0 238 023 A2号に記載されている方法に従って、A.オリゼを形質転換した。
T. リーサイ (T.reesei) の形質転換
Penttillae M., Knowles, J. (1987) Gene 61 155-164 に記載されている方法に従って、T.リーサイを形質転換した。
P. クリソゲナム (P.chrysogenum) の形質転換
Ca−PEG仲介プロトプラスト形質転換手順を用いる。プロトプラストの調製及びP.クリソゲナムの形質転換を Goukaら, Journal of Biotechnology 20(1991), 189-200に記載されている方法をを下記のように変更して行った:
− 形質転換した後、プロトプラストを単独の窒素源として0.1%アセトアミドを含む1.2M スクロースで浸透的に安定化しかつ1.5%細菌学的寒天 #1 (Oxoid, England)で固化したアスペルギルス最少培地からなる再生選択培地に塗布した。
− 25℃で5−8日間インキュベートした後、形質転換細胞が出現した。
【0035】
K. ラクチスの形質転換細胞
Ito H.ら (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168に記載されている酢酸リチウム法を次のように変更して酵母K.ラクチスを形質転換した:
− 形質転換の場合、K.ラクチス培養物をOD610 0.5〜1.0 で用いた。
− 5分後、熱ショック形質転換細胞懸濁液、1mlのYEPD/YNB(1%酵母エキス、2%バクトペプトン、2%グルコース及び0.17%酵母窒素塩基w/oアミノ酸(YNB;Difco)を加え、細胞懸濁液を振盪インキュベーターで30℃で150−180分間インキュベートした。
− 上記のインキュベーション(30℃で150−180分間)後、細胞懸濁液を2000g,室温で5分間遠心し、2%バクト寒天 (Difco)で固化したYEPD/G418二重層培地に塗布した。YEPD/G418二重層プレートを次のように調製した:細胞懸濁液を塗布する10分前に、G418を含まない15mlのYEPD寒天(2%バクト寒天 (Difco)で固化した1%酵母エキス、2%バクトペプトン、2%グルコース)を50μg のG418/mlを含めた15mlのYEPD寒天に注ぎ入れた。これにより、抗生物質の拡散後25μg のG418/mlを含むYEPD/G418二重層プレートを得る。このYEPD/G418二重層プレートは、K.ラクチス株 CBS 683又は CBS 2360 の場合各々25μg G418/ml又は100μg G418/mlを含有した。
【0036】
アスペルギルス、トリコデルマ、ペニシリウム及び酵母由来DNAの単離
アスペルギルス及びトリコデルマ由来DNAは、Yeltonら (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474 に記載されている手順に従って単離した。
ペニシリウム由来DNAは、 Kolarら, Gene 62 (1988), 127-134 に記載されている手順に従って単離した。K.ラクチス又はS.セレビシエ由来DNAは、Fujimura, Sakuma (1993), Biotechniques 14, 538に記載されている手順に従って単離した。
【0037】
バシラス形質転換及びDNA単離
Bron (1990)“Plasmids": Molecular Biological Methods for Bacillus, Harwood, CR, Cutting, SM, eds., series Modern Microbiological Methods, John Wiley & Sons, Chichester, UKに記載されているように、異種バシラス種の形質転換及びこれらの種由来プラスミド又は染色体DNAの単離を行った。
B.サチリス BS-154 (CBS 363.94)の形質転換の場合受容能力をもつ細胞を用い、B.リケニホルミス T5 (CBS 470.83)の形質転換の場合プロトプラスト形質転換を用いた。ネオマイシン選択の場合には、濃度20μg/mlを用いた。B.サチリス形質転換細胞のアセトアミド選択の場合、カザアミノ酸及び酵母エキスが20mMアセトアミドに置き換えられた最少培地寒天を用いた。B.リケニホルミス形質転換細胞のアセトアミド選択の場合、硫酸アンモニウムが20mMアセトアミドに置き換えられたプロトプラスト再生培地を用いた。
【0038】
amdS選択マーカーの除去
アスペルギルス、トリコデルマ及びペニシリウムに関するほとんどの例におけるamdSマーカーをアミログルコシダーゼ遺伝子の3′非コーディング領域の一部からなる反復間でクローン化する。amdS選択マーカーに隣接する3′glaA非コーディング反復間での内部組換えあるいは単一交差結果による組込みによって生じる反復間での相同的組換えにより、amdS選択マーカーを除去する。amdS選択マーカーを消失した細胞は、フルオロアセトアミドを含有するプレート上で発育させることにより選択する。amdS遺伝子がある細胞は、フルオロアセトアミドを細胞に有毒なアンモニウム及びフルオロアセテートに代謝する。従って、amdS遺伝子を消失した細胞のみがフルオロアセトアミドを含有するプレート上で発育することができる。
【0039】
アスペルギルス形質転換細胞からamdSマーカーを除去する場合には、これらの形質転換細胞の胞子を10mMアセトアミドの代わりに32mMフルオロアセトアミド及び5mM尿素、1M スクロースの代わりに1.1%グルコース及び2%細菌学的寒天 #1 (Oxoid, England)の代わりに1.1%を含有する再生選択培地(上記)に塗布した。35℃で7−10日間発育させた後、単一コロニーを回収し、0.4%ジャガイモデキストロース寒天(Oxoid, England)上に塗布した。トリコデルマ形質転換細胞からamdSマーカーを除去する場合には、これらの形質転換細胞の胞子を10mMフルオロアセトアミドで補足した非選択最少培地プレート(1リットル当たり:20gのグルコース、5gの(NH4)2 SO4 、15gのKH2 PO4 、0.6gのMgSO4 、0.6gのCaCl2 、0.005gのFeSO4 ・7H2 O、0.0016gのMnSO4 ・H2 O、0.0014gのZnSO4 ・7H2 O、0.002gのCoCl2 ;pH5.5)に塗布した。30℃で5−10日後、コロニーを収集し、0.4%ジャガイモデキストロース寒天(Oxoid, England)に塗布した。
ペニシリウム形質転換細胞からamdSを除去する場合には、これらの形質転換細胞の胞子を1.5%細菌学的寒天 #1 (Oxoid, England)で固化した10mMフルオロアセトアミド及び5%グルコースを含むアスペルギルス最少培地からなる選択培地プレート上に塗布した。25℃で5−10日発育させた後、耐性コロニーが出現した。
【0040】
A. ニガー形質転換細胞によるグルコアミラーゼ生産の決定
胞子又は菌糸を製造業者の説明書に従って調製したPDAプレート(ジャガイモデキストロース寒天, Oxoid)上に塗布して、組換え体及び対照A.ニガー株の胞子を集めた。30℃で3−7日間発育させた後、プレートに0.01%トリトン X-100を加えて胞子を集めた。滅菌水で洗浄した後、約107 胞子の選択形質転換細胞及び対照菌株を1リットル当たり30gのマルトース・H O;5gの酵母エキス;10gの加水分解カゼイン;1gのKH2 PO4;0.5gのMgSO4 ・7H2 O;3gのトゥイーン 80;10mlのペニシリン(5000IU/ml)/ストレプトマイシン(5000UG/ml);pH5.5を含有する20mlの液状予備培養基を含む振盪フラスコに植菌した。これらの培養物を34℃で20−24時間発育させた。5−10mlのこの培養物を1リットル当たり70gのマルトデキストリン;25gの加水分解カゼイン;12.5gの酵母エキス;1gのKH2 PO4;2gのK2 SO4;0.5gのMgSO4 ・7H2 O;0.03gのZnCl2;0.02gのCaCl2;0.01gのMnSO4 ・4H2 O;0.3gのFeSO4 ・7H2 O;10mlのペニシリン(5000IU/ml)/ストレプトマイシン(5000UG/ml)を含有し4N H2 SO4 でpH5.6に調整した100mlの発酵培地に植菌した。これらの培養物を34℃で5−10日間発育させた。発酵中種々の時点でグルコアミラーゼ生産を分析するために、試料を採取した。この発酵ブイヨン試料を遠心(10分,10,000×g)し、上清を集めた。
【0041】
0.032M NaAC/HACpH4.05中10μl の6倍希釈試料の培養上清を0.032M NaAC/HACpH4.05中115μl の0.2%(w/v) p-ニトロフェニルα−D−グルコピラノシド (Sigma)とインキュベートすることにより、グルコアミラーゼ活性を求めた。室温で30分インキュベートした後、50μl の0.3M Na2 CO3 を加え、波長405nmの吸収を測定した。A405nm は、AG生産の尺度である。
【0042】
amdScDNAのクローニング
A.ニドゥランスamdS遺伝子は、3種の小さなイントロンを含んでいる(Corrickら (1987) Gene 53, 63-71) 。これらのイントロンの酵母内スプライシングの不正確さ又は細菌内スプライシングの欠如に起因する問題を避けるために、酵母及び細菌において発現するamdScDNAを用いた。A.ニドゥランスポリA+ RNA標品由来amdS遺伝子のクローニングは、 Corrickら((1987), Gene 53, 63-71)に記載されている。本実施例においては、A.ニガー NRRLL 3135 形質転換細胞 #4 を用い、プラスミドpAF2−2Sを含むA.ニドゥランスamdS遺伝子の多重コピーによって形質転換した (van Hartingsveldら (1993) Gene 127, 87-94)。 Auffrayら((1980) Eur.J.Biochem. 107, 303-314)を変更した方法による直接LiCl沈降で全RNAを単離した。A.ニガー胞子が発芽し、炭素源としてグルコース及び単独の窒素源としてアセトアミドで補足した最少培地(Cove (1966) Biochim. Biophys. Acta 113, 51-56) 中37℃で一晩発育させた。
【0043】
菌糸が得られ、ろ過で乾燥し、次に基礎とされるべき液体窒素で凍結した。この粉末を0℃で3M LiCl、6M 尿素に分散し、4℃で一晩維持した。16,000gで30分間遠心しフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(50:48:2)で2連続抽出した後、全細胞RNAを得た。RNAをエタノールで沈降し、1mlの10mMトリスHCl(pH7.4) 、0.5%SDSに溶解した。ポリA+ 選択の場合、全RNA試料を65℃で5分間加熱し、次にオリゴ(dT)セルロースカラムに加えた。10mMトリスHClpH7.4、0.5%SDS及び0.5M NaClを含有する溶液で数回洗浄した後、ポリA+ RNAを10mMトリスHClpH7.4及び0.5%SDSで溶離して集め、エタノールで沈降した。約5μg のポリA+ mRNAをオリゴ(dT)プライマーで開始される逆転写の鋳型として用いた。反応混合液(50mMトリスHClpH7.6、10mMDTT、6mMMgCl2 、80mMKCl、0.2mM各dNTP及び0.1mgBSA/ml)を500単位のマウスMLV逆転写酵素(BRL)及び75単位のTNaseインヒビター (Promega)と100μl 量で37℃で30分間インキュベートした。
【0044】
別の200単位の逆転写酵素を加え、この反応を30分間続けた。この混合液をクロロホルムで抽出し、0.25M 酢酸アンモニウムの存在下にエタノールで沈降した。この第一鎖cDNAの混合物を次のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の鋳型として用いてamdScDNAを増幅した。このゲノムamdS配列を用いて2合成オリゴヌクレオチドを設計し、このPCRのプライマーとして用いた:
AB3100 (配列番号1):
5′- CTAATCTAGAATGCCTCAATCCTGAA - 3′(XbaI部位が前にあるヌクレオチド−3〜+16及び他の4ヌクレオチドのamdS特異的配列)。
AB3101 (配列番号2):
5′- GACAGTCGACAGCTATGGAGTCACCACA - 3′(別のSalI部位が隣接したヌクレオチド1911〜1884のamdS停止コドンの下流に位置したamdS特異的配列)。
【0045】
PCR反応は、鋳型として10%のcDNA混合液及びプライマーとして各々0.1μg のオリゴ AB3100(配列番号1)及び AB3101(配列番号2)を用いて行った。変性(100℃で7分)及び1.3単位Taqポリメラーゼを加えた後、反応混合液を25増幅サイクル(各サイクル:94℃で2分、55℃で2分及び72℃で3分)に供した。最後のサイクルでは、伸長段階が長く(7分)全長フラグメントを合成した。得られたDNAフラグメントをXbaI及びSalIで消化し、pUC18のXbaI/SalI部位にサブクローン化した。得られたプラスミドをpamdS−1と称した(図1参照)。プラスミドpamdS−1を制限分析すると、amdScDNAにおいてイントロンの不在及びエキソンの正しい融合が確認された。
【0046】
【実施例1】
amdS遺伝子を用いることによる A. ニガー遺伝子のマーカー遺伝子を含まない欠失
本実施例においては、二重交差相同的組換えによりA.ニガーゲノムに組込む置換ベクターでA.ニガーを形質転換することにより、A.ニガーにおけるゲノム標的遺伝子を置換する。置換ベクターは、DNA反復が隣接した選択可能なマーカー遺伝子によって分断された標的遺伝子座に相同なDNA領域を含んでいる。
本実施例において、プラスミドpGBDEL4LはglaAコーディング領域及びglaAプロモーター領域の一部を欠失するために用いられる。本ベクターはA.ニガーglaAゲノム遺伝子座の一部を含んでおり、ここでglaAコーディング配列及びglaAプロモーター配列の一部は直列反復として3′非翻訳glaA配列が隣接した選択マーカーとしてA.ニドゥランスgpdAプロモーターの調節によってA.ニドゥランスamdS遺伝子に置換される。A.ニガーを本ベクターで形質転換すると、glaA遺伝子がamdSマーカー遺伝子に置き換えられる。実験法で記載されているようにこれらの形質転換細胞でフルオロアセタミド逆選択を行うことにより、amdSマーカー遺伝子は3′glaADNA反復間の内部組換え結果により適切に欠失され、マーカー遺伝子を含まないΔglaA組換え体株を生じ、最後には外来DNA配列を全く有しない(模式図として図2参照)。
【0047】
glaA遺伝子置換ベクターpGBDEL4Lの簡単な説明
遺伝子置換ベクターpGBDEL4Lは、5′部分のA.ニガーアミログルコシダーゼ(glaA)プロモーター領域、全部で3種類の読み枠内に停止コドンを生じる16bpの合成DNA配列、A.ニドゥランスグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gpdA)プロモーターの調節によるA.ニドゥランスアセトアミダーゼ(amdS)遺伝子を含み、両側に3′glaA非コーディング配列が隣接する。
【0048】
pGBDEL4Lの構築経路
最終欠失ベクターpGBDEL4Lを得るために、まずglaA遺伝子座のサブクローンを誘導した。模式図は図3及び4に示されている。A.ニガーのglaA遺伝子座は分子クローン化されており、以前に記載されている(欧州特許第0 463 706 A1号)。プラスミドpAB6−1は、pUC19のHindIII部位でクローン化された15.5kbのHindIIIフラグメント上にA.ニガー由来の全glaA遺伝子座を含んでいる (Yanisch-Perronら, Gene 33 (1985) 103-119及び例えばBoehringer Mannheim, Germanyから入手できる)。pAB6−1をEcoRIで消化し、glaA遺伝子のすぐ上流の1.8kbのEcoRIDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、EcoRIで消化したpUC19に連結し、次にE.コリに移して分子クローン化した。得られたプラスミドはpAB6−3と称した(図3)。pAB6−1の別のサブクローンであるプラスミドpAB6−4を構築するために、pAB6−1をHindIII及びBglIIで消化した。glaAプロモーター及びglaAコーディング配列の一部を含む4.6kbサイズのDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、HindIII及びBglIIで前に消化したpUC19に連結した(図4)。結果としてpAB6−4内のBamHI及びBglII部位は本クローニング操作で適切に破壊された。
【0049】
引き続き、プラスミドpAB6−4をHindIII及びEcoRIで消化しかつE.コリDNAポリメラーゼを用いて5′付着末端を挿入した後、1.8kbのglaAプロモーターDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、EcoRIで部分的に消化しかつE.コリDNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作成したpAB6−3に連結し、その連結混合物を分子クローニングのためにE.コリに移した。誘導プラスミド(pAB6−31と称する)は、中間のEcoRI部位が破壊された3.6kbのglaAプロモーターフラグメントを含むが、glaAATG開始部位のすぐ上流になお(本DNAフラグメントにおいてユニークな)EcoRI部位を有する(図5)。
本明細書で用いられるA.ニドゥランスamdS遺伝子は、プラスミドpGW325内の約4kbサイズのEcoRI−KpnIフラグメント上に位置する(Wernarsら, thesis (1986) Agricultural University, Wageningen, The Netherlands) 。amdS遺伝子を含みそれ自体の調節配列が隣接したこのEcoRI−KpnIDNAフラグメントを Verdoesら(Transgenic Res. 2 pp 84-92, 1993)に記載されているpUC19の適切な部位に分子クローン化して、pAN4−1を得る。pAN4−1をEcoRI及びKpnIで消化し、amdS遺伝子を含む4kbサイズのDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、EcoRI及びKpnIで消化したpAB6−31に連結し、連結混合物を分子クローニングのためにE.コリに移した。得られたプラスミドをpAB6Sと称し(図6)、3.8kbglaAプロモーターDNAフラグメント及び4kbamdSフラグメントを含んでいる。
【0050】
プラスミドpAB6SをまずSalIで部分的に消化し、下記配列を有する合成誘導オリゴヌクレオチド TN0001(配列番号3)に連結し、次いでEcoRIで消化した。
TN0001 (配列番号3): 5′TCGATTAACTAGTTAA 3′
pUC19、glaAプロモーター及びamdS遺伝子配列を含むDNAフラグメントを精製し、アガロースゲル電気泳動で単離した。SalIで消化したプラスミドpAB6−1から2.2kb3′隣接glaADNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で同様に単離し、T4ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、次にEcoRIで消化し、pAB6Sの上記単離DNAフラグメントに連結した上記合成オリゴヌクレオチドに連結した。DNA連結混合物をE.コリに移し、分子クローン化した。この誘導プラスミドをpGBDEL1と称し、図7に示されている。この手順によって同時にSalI制限部位が破壊され、全読み枠に停止コドンが導入された。
【0051】
glaA遺伝子の停止コドンのすぐ下流に位置した3′glaA非コーディングDNA配列を含み適切な制限部位が隣接した約1kbの大きなDNAフラグメントを得るために、PCR増幅を行った。本PCR増幅においては、プラスミドpAB6−1を鋳型として、下記の2種類の合成誘導オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた:
オリゴ AB2154 (配列番号4):
5′AACCATAGGGTCGACTAGACAATCAATCCATTTCG 3′
(停止コドンのすぐ下流に3′glaA非コーディング配列)及び
オリゴ AB2155 (配列番号5):
5′GCTATTCGAAAGCTTATTCATCCGGAGATCCTGAT 3′
(停止コドンの約1kb下流EcoRI部位の前後に3′glaA非コーディング配列)。
【0052】
Saikiら(Science 239,487-491, 1988) に記載され、TAQポリメラーゼ(Cetus) の製造業者に従ってPCRを行った。DNAアンプリファイア(Perkin-Elmer/Cetus)で25増幅サイクル(各々55℃で2分;72℃で3分及び94℃で2分)を行った。1kb増幅DNAフラグメントをHindIII及びSalIで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、次にpGBDEL1のHindIII及びSalI制限部位にクローン化した。このようにして得られたプラスミドをpGBDEL2と称した(図8及び9)。
【0053】
最終glaA遺伝子置換ベクターpGBDEL4Lを得るために、pGBDEL2のamdSプロモーター領域を強力なA.ニドゥランスgpdAプロモーターで交換した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法により、gpdAプロモーター配列をamdS遺伝子のコーディング配列に融合した。本PCR融合の場合、2種類の鋳型を用いた:A.ニドゥランスgpdAプロモーター及びA.ニドゥランスtrpCターミネーターの調節によってE.コリhph遺伝子を含むプラスミドpAN7−1 (Puntら, Gene 56, 117-124, 1987) 及びそれ自体の調節配列の調節によってA.ニドゥランスamdS遺伝子を含むプラスミドpAN4−1。プライマーとして4種の合成オリゴヌクレオチドを用い、下記配列を有した:
オリゴ AB2977 (配列番号6):
5′TATCAGGAATTCGAGCTCTGTACAGTGACC 3′
(E.コリhph遺伝子のATG開始コドンの下流約880bpに位置した5′gpdAプロモーター特定オリゴヌクレオチド)
オリゴ AB2992 (配列番号7):
5′GCTTGAGCAGACATCACCATGCCTCAATCCTGGGAA 3′
オリゴ AB2993 (配列番号8):
5′TTCCCAGGATTGAGGCATGGTGATGTCTGCTCAAGC 3′
(両配列は相互に相補的であり、18bpの3′端のgpdAプロモーター及び18bpの5′部分のamdSコーディング領域を含む)
オリゴ AB2994 (配列番号9):
5′CTGATAGAATTCAGATCTGCAGCGGAGGCCTCTGTG 3′
(ATG開始コドンの約175bp下流のBglII部位にamdS特定配列)
【0054】
880bpgpdAプロモーター領域にamdSコーディング配列に融合するために、2つの別個のPCRを行った:鋳型としてpAN7−1及びプライマーとしてオリゴヌクレオチド AB2977(配列番号6)及び AB2993(配列番号8)を用いた5′端のamdS遺伝子に相補的な18ヌクレオチドが3′周辺に隣接したgpdAプロモーターを含む880bpDNAフラグメントを増幅する第1増幅及び鋳型としてpAN4−1及びプライマーとしてオリゴヌクレオチド AB2992(配列番号7)及び AB2994(配列番号9)を用いた3′端のgpdAプロモーターに相補的な18ヌクレオチドが5′周辺に隣接した5′部分のamdS遺伝子を含む200bpサイズのDNAフラグメントを増幅する第2PCR反応。これらの増幅の模式図は図10に示されている。引き続き作成した2フラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、プライマーとしてオリゴヌクレオチド AB2977(配列番号6)及び AB2994(配列番号9)を用いた第3PCR反応における鋳型として用いた。得られたDNAフラグメントをEcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、pTZ18R(United States Biochemicals)のEcoRI部位にクローン化した。得られたプラスミドをpGBGLA24と称した(図11)。
pGBDEL2のamdSプロモーターをgpdAプロモーター配列に交換するために、適切な制限酵素で消化した後pGBGLA24の約1kbサイズのEcoRI/BglIIDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、pGBDEL2のEcoRI及びBglII部位に連結した。得られたglaA遺伝子置換ベクターをpGBDEL4Lと称した(図12)。
【0055】
A. ニガーにおけるglaAプロモーター及びコーディング配列の欠失
A.ニガーをpGBDEL4Lで形質転換する前に、E.コリ配列をHindIII及びXhoI消化及びアガロースゲル電気泳動で除去した。A.ニガー株 CBS 513.88(1988年10月10日寄託)を選択プレートにおいて単独のN源としてアセトアミドを用いる実験法で記載した手順で2.5、5又は10μg DNAフラグメントで形質転換した。A.ニガー単一形質転換細胞をアセトアミド含有選択最少プレート上で数回精製した。個々の形質転換細胞を0.4%ジャガイモデキストロース(Oxoid, England)上30℃で約5日間発育させることにより胞子を集めた。切断型glaA遺伝子座の存在を証明するためにサザン分析を行った。数個の形質転換細胞の高分子量DNAを単離し、BamHI及びKpnIで消化し、次に0.7%アガロースゲル電気泳動で分別した。ニトロセルロースフィルターに移した後、ハイブリッド形成を2種の32P標識プローブ:プラスミドpAB6−4(上記図3)から単離したXhoI/SalIglaAプロモーターフラグメント及びキシラナーゼ内在配列(欧州特許出願第 0 463 706 A号) を認識するプローブを用いて標準手順に従って行った。4種の形質転換細胞(#19、#23 、#24 、#41)及び対照株A.ニガー CBS 531.88 の結果が例として図13及び14に示されている。このオートラジオグラフィーを更に良く理解するために、模式図が図17に示され、自然型及び切断型glaA遺伝子座におけるハイブリッド形成フラグメントのサイズが示されている。
【0056】
自然型glaA遺伝子座の特徴はBamHI消化物中3.5kbのハイブリッド形成フラグメント及びKpnI消化物中4.5kbのハイブリッド形成フラグメントである(図15参照)。切断型glaA遺伝子座においては、3.5kbのBamHIハイブリッド形成フラグメント及び4.5kbのKpnIハイブリッド形成フラグメントが存在せず、5.5kbのBamHIハイブリッド形成フラグメント及び6.3kbのKpnIハイブリッド形成フラグメントに置き換えられる。図13及び14でわかるように本実施例においては、形質転換細胞 #19が切断型glaA遺伝子座の予想されたパターンを示している(図16)。本形質転換細胞をGBA−102と称した。
glaA遺伝子の置換は他の形質転換細胞では起きなかった。不十分なハイブリッド形成バンド:KpnI消化物中4、8及び15kb及びBamHI消化物中7及び12kbは、内部対照としてのキシラナーゼ配列を意味する。
【0057】
フルオロアセトアミド含有プレート上逆選択による A. ニガーGBA−102からamdS遺伝子の除去
形質転換細胞A.ニガーGBA−102内amdS遺伝子を実験の項で記載されているように除去した。染色体DNAのサザン分析により、2生存組換え体株にのみamdS選択マーカー遺伝子の除去が証明された。高分子量DNAを単離し、BamHI及びKpnIで消化し、次に0.7%アガロースゲル電気泳動で分離した。ニトロセルロースに移した後、前項で記載したプローブを用いて標準手順に従ってハイブリッド形成した。ハイブリッド形成フラグメントの模式図は図17に示されている。サザン分析の結果は、図16に示されている。5.2kbのハイブリッド形成BamHIフラグメント及び3.4kbのハイブリッド形成KpnIフラグメントの存在及び5.5kbのBamHIフラグメント及び6.3kbのハイブリッド形成KpnIフラグメントのロスは、amdS選択マーカーが存在しないことに特異的である。ハイブリッド形成の弱いBamHI消化物中7及び12kbフラグメント及び4、8及び15kbKpnIはキシラナーゼ内在遺伝子座を意味する。両株は予想されたパターンを示している。GBA−107及びGBA−108と称されるこれらの組換え体株においては、好ましいglaA配列が正しく除去され、最後に選択マーカー遺伝子を全く有しない。同種のベクターを用いることにより他の遺伝子又はDNA要素を欠失又は挿入するために両株を用いることもできる。
【0058】
【実施例2】
A. ニガーGBA−107における切断型glaA遺伝子座の3′glaA非コーディング領域で標的にしたglaA遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入
本実施例においては、A.ニガーのゲノムへの遺伝子の導入は、上記実施例で記載されたほぼ同様の方法及び手順を用いて記載される。所望の遺伝子又はDNA要素の他に、ベクターは単一交差結果によって宿主の予め特定されたゲノム遺伝子座のベクターを標的にする宿主ゲノムに相同なDNA配列を含んでいる。この種類のベクターは、同様にDNA反復が隣接した選択マーカー遺伝子を含んでいる。本ベクターで誘導された形質転換細胞内選択マーカー遺伝子は、抵抗選択法を用いることによっても適切に除去することができる。例としてglaA遺伝子コピーの導入が記載され、実施例1で誘導した組換え体ΔglaAA.ニガーGBA−107株における切断型glaA遺伝子座に組込まれる(模式図として図18及び19参照)。
【0059】
glaA組込みベクター:pGBGLA30の説明
組込みベクターpGBGLA30は、3′glaA非コーディング配列が隣接した未変性プロモーターの調節によるA.ニガーアミログルコシダーゼ(glaA)遺伝子及びA.ニドゥランスgpdAプロモーターの調節によるA.ニドゥランスamdS遺伝子からなり、3′glaA非コーディング領域に組込みかつ逆選択によりamdS選択マーカー遺伝子を除去する。
組込みベクターの構築
pAB6−1由来の1.8kbXhoI/EcoRIglaAプロモーターフラグメント(図20)をpTZ19R(United States Biochemicals)のSmaI及びEcoRI部位にサブクローン化した。glaAプロモーターフラグメントのXhoI部位の突出5′端をE.コリDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを用いて挿入した後、pTZ19Rでクローン化した。このクローニング操作によってSmaI部位が破壊され、XhoI部位が回復する。このようにして得られたプラスミドをpGBGLA5と称した(図20)。
【0060】
適切な制限部位(AatII、SnaBI、AsnI及びNotI)を導入しかつglaAプロモーターのXhoI部位を破壊するために、下記の2種のオリゴヌクレオチド AB3657(配列番号10)及び AB3658(配列番号11)からなる合成フラグメントをpGBGLA5のHindIII及びXhoI部位に挿入した:
5′AGCTTGACGTCTACGTATTAATGCGGCCGCT 3′AB3657
3′ ACTGCAGATGCATAATTACGCCGGCGAAGCT 5′AB3658
このようにして得られたプラスミドをpGBGLA26と称した(図21)。
【0061】
次いで、glaAプロモーターの残りの3′部分、glaAコーディング配列及び3′glaA非コーディング配列の一部を含むpAB6−1由来の3.4kbのEcoRIフラグメントをpGBGLA26のEcoRI部位にクローン化した。この新しいプラスミドをpGBGLA27と称した(図15)。このプラスミドをEcoRIで消化し、下記オリゴヌクレオチド AB3779(配列番号12)及び AB3780(配列番号13)からなる合成フラグメントをglaA遺伝子の3′gl aA非コーディング配列の端のEcoRI部位に挿入した:
5′AATTGGGGCCCATTAACTCGAGC 3′AB3779
3′ CCCCGGGTAATTGAGCTCGTTAA 5′AB3780
本クローニング段階により、EcoRI部位が破壊され、ApaI及びXhoI制限部位が導入された。得られたプラスミドをpGBGLA42と称した(図16)。
2.2kbの3′glaA非コーディング配列の増幅及び適切な制限部位の付随した調整をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって行った。
【0062】
これらのPCR反応においては、鋳型として全glaA遺伝子座を含むプラスミドpAB6−1を用い、プライマーとして下記配列を有する4種の合成オリゴヌクレオチドが設計された:
オリゴ AB3448 (配列番号14):
5′GTGCGAGGTACCACAATCAATCCATTTCGC 3′
(glaA遺伝子の停止コドンのすぐ下流に3′glaA非コーディング特定配列)
オリゴ AB3449 (配列番号15):
5′ATGGTTCAAGAACTCGGTAGCCTTTTCCTTGATTCT 3′
(停止コドンの約1kb下流のKpnI部位に3′glaA非コーディング特定配列)
オリゴ AB3450 (配列番号16):
5′AGAATCAAGGAAAAGGCTACCGAGTTCTTGAACCAT 3′
(停止コドンの約1kb下流のKpnI部位に3′glaA非コーディング特定配列)
オリゴ AB3520 (配列番号17):
5′ATCAATCAGAAGCTTTCTCTCGAGACGGGCATCGGAGTCCCG 3′
(停止コドンの約2.2kb下流に3′glaA非コーディング特定配列)
【0063】
glaA遺伝子の停止コドンの約1kb下流のKpnI部位を破壊しかつglaA遺伝子の停止コドンの約2.2kb下流のSalI部位をXhoI部位に変えるために、2つの別個のポリメラーゼ連鎖反応を行った:プライマーとしてオリゴヌクレオチド AB3448 (配列番号14)及び AB3449 (配列番号15)を用いてglaA遺伝子の停止コドンのすぐ下流に約1kbのDNAフラグメントを増幅する第1反応及びプライマーとしてオリゴヌクレオチド AB3450 (配列番号16)及び AB3520 (配列番号17)を用いて鋳型としてpAB6−1を共に用いて3′glaA非コーディング領域のKpnI部位のすぐ下流に約1.2kbのDNAフラグメントを増幅する第2反応。これらの増幅の模式図は図24に示されている。PCRは実施例1に記載されているように行った。25増幅サイクル(各々55℃で1分;72℃で1.5分及び94℃で1分)を行った。
【0064】
2つの作成したPCRDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、引き続きプライマーとしてオリゴヌクレオチド AB3448 (配列番号14)及び AB3520 (配列番号17)を用いる第3PCRの鋳型として用い融合フラグメントを作成した。DNAアンプリファイア(Perkin-Elmer/Cetus)において25増幅サイクル(各々55℃で2分;72℃で3分及び94℃で2分)を行った。増幅したDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、引き続きpTZ18RのSmaI部位でサブクローン化した。得られたプラスミドをpGBGTLA17と称した(図25)。
この調整した3′glaA非コーディング領域をamdS遺伝子に融合するために、amdS遺伝子の一部をpGBDEL4LからpSP73 (Promega)にサブクローン化した。この構築の場合、pGBDEL4LをBglII及びHindIIIで消化し、3.4kbのamdS/3′glaA非コーディングフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、pSP73 (Promega)の適切な部位にサブクローン化した。得られたプラスミドをpGBGLA21と称した(図26)。
【0065】
このプラスミドの約1kbサイズの3′glaA非コーディング領域をpGBGLA21の2.2kbの3′glaA非コーディング領域に交換した。pGBGLA17及びpGBGLA21をKpnI及びHindIIIで消化した。pGBGLA17の2.2kbの3′glaA非コーディング領域DNAフラグメント及びpGBGLA21の4.9kbのDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、連結し、引き続き連結混合物をE.コリに移すことにより分子クローン化した。このようにして誘導されたプラスミドをpGBGLA22と称した(図27)。
伸長した3′glaA非コーディング領域を有するamdS遺伝子をgpdAプロモーターで完了し、amdS遺伝子の残りの部分に融合した。pGBGLA22をBglII及びHindIIIで消化し、4.4kbのamdS/3′glaA非コーディング領域DNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、引き続きBglII及びHindIIIで消化したプラスミドpGBGLA24で消化し、E.コリに移した。このようにして誘導されたプラスミドをpGBGLA25と称した(図28)。
【0066】
pGBGLA25をEcoRIで部分的に消化し、gpdAプロモーターのEcoRI部位において下記の2種のオリゴヌクレオチド AB3781 (配列番号18)及び AB3782 (配列番号19)からなる合成フラグメントを挿入した:
5′AATTGGGGCCCAGCGTCC 3 ′AB3781
3′ CCCCGGGTCGCAGGTTAA 5 ′AB3782
この新しいプラスミドをpGBGTLA43と称した(図29)。このクローニング段階のために、gpdAプロモーターのすぐ前のEcoRI制限部位がApaI制限部位の導入によって破壊された。
プラスミドpGBGLA43をApaI及びXhoIで消化し、gpdAプロモーター/amdS遺伝子/3′glaA非コーディング領域を含む5.3kbのDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、引き続きApaI及びXhoIで消化したpGBGLA42と連結し、E.コリに移した。この誘導プラスミドをpGBGLA28と称した(図30)。
【0067】
クローニングの前に、3′glaA非コーディング領域DNAフラグメント(glaA遺伝子の停止コドンの約2.2kb下流に位置し、3″glaA非コーディング領域を示す)を増幅し、PCR法を用いて適切な制限部位を設けた。
このPCR反応の場合、鋳型としてプラスミドpAB6−1を用い、プライマーとして下記配列を有する2種のオリゴヌクレオチドを設計した:
オリゴ AB3746 (配列番号20):
5′TGACCAATAAAGCTTCTCGAGTAGCAAGAAGACCCAGTCAATC 3 ′
(glaA遺伝子の停止コドンの約2.2kb下流に位置したSalI部位に部分的3″glaA非コーディング特定配列)
オリゴ AB3747 (配列番号21):
5′CTACAAACGGCCACGCTGGAGATCCGCCGGCGTTCGAAATAACCAGT3′
(glaA遺伝子の停止コドンの約4.4kb下流に位置したXhoI部位に部分的3″glaA非コーディング特定配列)
【0068】
DNAアンプリファイア(Perkin-Elmer/Cetus)において25増幅サイクル(各々55℃1分;72℃1.5分;94℃1分)を行った。この増幅の模式図は、図31に示されている。このようにして得られたDNAフラグメントをHindIIIで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、pTZ19RのHindIII部位に両方向でサブクローン化した。得られたプラスミドをpGBGLA29A及びpGBGLA29Bと称した(図31及び32)。
最終段階は、pGBGLA29Aの3″glaA非コーディング配列をプラスミドpGBGLA28に挿入することを含んでいる。これを達成するために、pGBGLA29AをHindIII及びNotIで消化した。2.2kbサイズの3′glaA非コーディング領域フラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、引き続きHindIII及びNotIで消化したpGBGLA28に連結し、E.コリに移した。この誘導組込みベクターをpGBGLA30と称した(図33)。
【0069】
組込みベクターpGBGLA30による A. ニガー GBA-107 の形質転換
形質転換の前に、XhoI消化及びアガロースゲル電気泳動により組込みベクターpGBGLA30からE.コリ配列を除去した。A.ニガー株 GBA-107を実験の項で記載された手順により5又は10μg DNAフラグメントで形質転換した。A.ニガー単一形質転換細胞をアセトアミド含有選択プレートで数回精製した。個々の形質転換細胞を0.4%ジャガイモデキストロース(Oxoid, England)上30℃で約5日間発育させることにより胞子を集めた。内在切断型glaA遺伝子座の3′glaA非コーディング領域への組込みが生じたかを証明するためにサザン分析を行った。数個の形質転換細胞の高分子量DNAを単離し、KpnI又はBglIIで消化し、引き続き0.7%アガロースゲル電気泳動で分別した。ニトロセルロースフィルターに移した後、標準法に従ってハイブリッド形成した。プローブとしてプラスミドpAB6−4(上記実施例1)から単離した32P標識約0.7kbのXhoI/SalIglaAプロモーターフラグメントを用いた。3種の形質転換細胞(#107-5 、#107-9及び#107-7) 及び対照菌株A.ニガーGBA107及びその祖先A.ニガーCBS 531.88の結果が例として図34に示されている。このオートラジオグラフィーを更に良く理解するために、模式図が図35、36及び37に示され、自然型glaA遺伝子座、切断型glaA遺伝子座及び単一pGBGLA30コピーが予め特定された3′glaA非コーディング領域に組込まれた切断型glaA遺伝子座のハイブリッド形成フラグメントのサイズが示されている。
【0070】
自然型glaA遺伝子座の特徴はKpnI消化物中4.5kbのハイブリッド形成フラグメント及びBglII消化物中10kbのハイブリッド形成フラグメントである。A.ニガー GBA-107の切断型glaA遺伝子座の特徴は、KpnI消化物中3.4kbのハイブリッド形成フラグメント及びBglII消化物中13kbのハイブリッド形成フラグメントである。pGBGLA30ベクターを切断型glaA遺伝子座の3′領域に組込む場合には、KpnI消化物中3.4kbのハイブリッド形成フラグメントの他に6.7kbのハイブリッド形成フラグメントが予想され、BglII消化物中13kbのハイブリッド形成フラグメントが存在せず、14.5kbのハイブリッド形成フラグメントに置き換えられる。図34でわかるように、形質転換細胞 #107-5 及び #107-9 が切断型glaA遺伝子座の予め特定された3′非コーディング領域に組込まれた単一pGBGLA30コピーの予想されたハイブリッド形成パターンを示している。形質転換細胞 #107-7 のハイブリッド形成パターンは、pGBGLA30コピーを別のA.ニガー GBA-107のゲノムに組込むことを示している。pGBGLA30コピーが正しく組込まれた形質転換細胞を GBA-119及び GBA-122と称し、amdS選択マーカー遺伝子を引き続き適切に除去するために用いた。
【0071】
フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択による A. ニガー GBA-119 及び GBA-122 由来amdS遺伝子の除去
形質転換細胞A.ニガー GBA-119及び GBA-122内amdS選択マーカー遺伝子を実験の項で記載されているように除去した。染色体DNAのサザン分析により、若干の生存組換え体菌株にamdS選択マーカー遺伝子の除去が証明された。高分子量DNAを単離し、KpnI及びBglIIで消化し、引き続き0.7%アガロースゲル電気泳動で分離した。ニトロセルロースに移した後、標準手順に従ってハイブリッド形成した。プローブとしてプラスミドpGBGLA29A(上記図33)から単離した32P標識2.2kbのHindIII/NotI3″glaA非コーディングフラグメントを用いた。
【0072】
ハイブリッド形成フラグメントの模式図は図35〜38に示されている。A.ニガー GBA-119 (#AG5-5、#AG5-6及び#AG5-7) 由来の3生存組換え体菌株及びA.ニガー GBA-122 (#AG9-1、#AG9-2及び#AG9-4) 由来の3生存組換え体菌株及び対照菌株A.ニガー CBS 531.88 及びA.ニガー GBA-107の結果が図39及び40に示されている。
菌株A.ニガー CBS 531.88 においては、KpnI消化物中に6.9kbのハイブリッド形成フラグメントが存在し、BglII消化物中に6.9kbのハイブリッド形成フラグメントが存在する。A.ニガー GBA-107株においては、KpnI消化物中に6.9kbのハイブリッド形成フラグメントが存在し、BglII消化物中に13kbのハイブリッド形成フラグメントが存在する。3′glaA非コーディング領域に組込まれたpGBGLA30単コピーを有するA.ニガー株 GBA-119及び GBA-122においては、KpnI消化物中に8kb及び6.7kbのハイブリッド形成バンドが存在し、BglII消化物中には、14.5kb及び7.6kbのハイブリッド形成バンドが存在する。
【0073】
KpnI消化物中6.7kb及び8.5kbのハイブリッド形成フラグメントの存在及び8kbのハイブリッド形成フラグメントの付随したロスはamdS選択マーカー遺伝子の正しい除去に特異的である。BglII消化物中、14.5kb及び6.7kbのハイブリッド形成フラグメント及び7.6kbのハイブリッド形成フラグメントの付随したロスはamdS選択マーカー遺伝子が存在しないことに特異的である。図39及び40でわかるように、#AG5-7、#AG5-5、#AG9-1及び#AG9-4は、正しく除去されたamdS選択マーカー遺伝子の予想されたハイブリッド形成パターンを示している。これらの菌株を各々 GBA-120、 GBA-121、 GBA-123及び GBA-124と称した。#AG5-6及び#AG9-2株のハイブリッド形成パターンは全pGBGLA30コピーのロスを示し、切断型glaA遺伝子座のみ有するA.ニガー GBA-107親株を生じる。
振盪フラスコ発酵においてA.ニガー GBA-120、 GBA-121、 GBA-123及び GBA-124株のグルコアミラーゼ生産能を試験した。対照株としてA.ニガー CBS 531.88 、GBA-107 、GBA-119 及び GBA-122を試験した。振盪フラスコ発酵及びグルコアミラーゼアッセイを実験の項で記載されているように行った。 GBA-119〜 GBA-124株においては、150−200U/mlで変動するレベルが測定された。これらのグルコアミラーゼレベルは予想され、形質転換されない野生型親株A.ニガー CBS 531.88 で得られたレベルに匹敵するものであった。
【0074】
【実施例3】
A. ニガー GBA-107 における切断型glaA遺伝子座の3′glaA非コーディング領域で標的にしたフィターゼ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入
本実施例においては、A.ニガーゲノムへの遺伝子の導入が上記実施例で記載されたほぼ同様の方法及び手順を用いて記載される。主な違いは、問題の遺伝子及び選択マーカー遺伝子が2種類のベクター上に位置しかつこれらのベクターがA.ニガーに同時形質転換することである。問題の遺伝子あるいはマーカー遺伝子の他に、ベクターは単一交差結果によって宿主の予め特定されたゲノム遺伝子座でベクターを標的にする宿主ゲノムに相同なDNA配列を含んでいる。これらの(同時)形質転換細胞でフルオロアセトアミド逆選択を行うことにより(実験手順に記載されているように)、amdSマーカー遺伝子は単一交差結果による組込みで生じるDNA反復間の内部組換え結果により適切に欠失される。
【0075】
同時形質転換に用いられるベクターの説明
問題の遺伝子を有するpGBGLA53は、3′glaA非コーディング配列が隣接したA.ニガーグルコアミラーゼ(glaA)プロモーターの調節によるA.ficuumフィタ遺伝子からなり、3′glaA非コーディング領域に組込まれる。選択マーカー遺伝子を有するベクターpGBGLA50は、3′glaA非コーディング配列が隣接したA.ニドゥランスgpdAプロモーターの調節によるA.ニドゥランスamdS遺伝子からなり、3′glaA非コーディング領域に組込まれる。
pGBGTLA50の構築経路
pGBGLA50の構築は、1クローニング段階を含んでいる。プラスミドpGBGLA29AをHindIIIで消化し、付着端をE.コリDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを用いて挿入した。次いで、2.2kbの3″glaA非コーディング領域フラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、次にApaIで消化しかつT4DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作成したpGBGLA43に連結し、E.コリに移した。正しい方向の3″glaA非コーディング領域DNAフラグメントを有するこの誘導プラスミドをpGBGLA50と称した(図41)。
【0076】
pGBGLA53の構築経路
pGBGLA53の構築経路における第1段階は、A.ficuumフィターゼE.coliのほぼ全コーディング配列に融合したglaAプロモーターを含む2フラグメントのサブクローニングである。これを達成するために、プラスミドpGBGLA42をHindIII及びEcoRIで消化し、1.8kbのHindIII/EcoRI5′glaAプロモーターフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離した。プラスミドpFYT3(欧州特許第0 420 358 A1号) をEcoRI及びBglIIで消化し、フィターゼ遺伝子の5′部分に融合したglaAプロモーターの3′部分を含む1.6kbのEcoRI/BglIIフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、pGBGLA42から単離した1.8kbのHindIII/EcoRI5′glaAプロモーターフラグメントと共にpSp73(Promega) のHindIII及びBglII部位に連結した。得られたプラスミドをpGBGLA49と称した(図42)。
【0077】
次の段階は、pGBGLA49への3′glaA非コーディング領域DNAフラグメントのクローニングである。クローニングの前に、本3′glaA非コーディング領域DNAフラグメント(glaA遺伝子の停止コドンの約2.2kb下流に位置する)を増幅し、PCR法を用いる適切な制限部位を設けた。
これらのPCR反応の場合、鋳型としてプラスミドpAB6−1を用い、プライマーとして下記配列を有する2種の合成オリゴヌクレオチドが設計された:
オリゴ AB4234 (配列番号22):
5′GAAGACCCAGTCAAGCTTGCATGAGC 3′
(glaA遺伝子の停止コドンの約2.2kb下流に位置した3′glaA非コーディング配列)
オリゴ AB4235 (配列番号23):
5′TGACCAATTAAGCTTGCGGCCGCTCGAGGTCGCACCGGCAAAC 3′
(glaA遺伝子の停止コドンの約4.4kb下流に位置した3′glaA非コーディング配列)
【0078】
DNAアンプリファイア(Perkin-Elmer)において25増幅サイクル(各々94℃1分;55℃1分;72℃1.5分)を行った。この増幅の模式図は、図43に示されている。このようにして得られたDNAフラグメントをHindIIIで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、pTZ19RのHindIII部位にサブクローン化した。得られたプラスミドをpGBGLA47と称した(図44)。
プラスミドpGBGLA47をHindIII及びNotIで消化し、2.2kbの3′glaA非コーディングDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、pGBGLA47のHindIII及びNotI部位にクローン化した。得られたプラスミドをpGBGLA51と称した(図45)。
【0079】
pGBGLA53の構築経路の最終段階は、glaA遺伝子の停止コドンのすぐ下流に位置する3′glaA非コーディングDNAフラグメントに融合したフィターゼコーディング配列の残りの部分を含むDNAフラグメントのクローニングである。クローニングの前に、フィターゼ遺伝子の残りの部分とglaA遺伝子の停止コドンのすぐ下流に位置する3′glaA非コーディングDNAフラグメントを融合し、PCR法に用いる適切な制限部位を設けた。PCR反応においては、鋳型としてプラスミドpAB6−1を用い、プライマーとして下記配列を有する2種の合成オリゴヌクレオチドを用いた:
オリゴ AB4235 (配列番号24):
5′TGACCAATAAAGCTTAGATCTGGGGGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCTT
AGACAATCAATCCATTTCGC 3′
(BglII部位で開始するフィターゼコーディング配列からglaA遺伝子の停止コドンのすぐ下流で開始する3′glaA非コーディング領域に融合した停止コドンまでの36bp)
オリゴ AB4233 (配列番号25):
5′TGACCAATAGATCTAAGCTTGACTGGGTCTTCTTGC 3′
(glaA遺伝子の停止コドンの約2.2kb下流に位置した3′glaA非コーディング配列)
【0080】
DNAアンプリファイア(Perkin-Elmer)において25増幅サイクル(各々94℃1分;55℃1分;72℃1.5分)を行った。この増幅の模式図は、図46に示されている。このようにして得られたDNAフラグメントをHindIIIで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、pTZ19RのHindIII部位に両方向でサブクローン化した。得られたプラスミドをpGBGLA48及びpGBGLA52と称した(図44)。
プラスミドpGBGLA52をBglIIで消化し、BamHIで部分的に消化し、2.2kbのフィターゼ/3′glaA非コーディングDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、pGBGLA51のBglII部位にクローン化した。この正しい方向に2.2kbのフィターゼ/3′glaA非コーディングDNAフラグメントを有する誘導プラスミドをpGBGLA53と称した(図48)。
【0081】
ベクターpGBGLA50及びpGBGLA53による A. ニガー GBA-107 の形質転換
形質転換の前に、XhoI又はHindIII消化及びアガロースゲル電気泳動によりベクターpGBGLA50及びpGBGLA53からE.コリ配列を除去した。A.ニガー GBA-107株を実験の項で記載された形質転換手順を用いて1μg pGBGLA50フラグメント及び1μg pGBGLA53フラグメント、1μg pGBGLA50フラグメント及び5μg pGBGLA53フラグメント又は1μg pGBGLA50フラグメント及び10μg pGBGLA53フラグメントで形質転換した。
【0082】
実施例2と同様の消化物及びプローブを用いて、単一形質転換細胞を単離、精製し、サザン分析を行ってpGBGLA50及びpGBGLA53の両組込みを証明した。分析した形質転換細胞の約10−20%で両pGBGLA50及びpGBGLA53がA.ニガー GBA-107宿主株のゲノムに組込まれた。切断型glaA遺伝子座の予め特定された3′glaA非コーディング領域に共に組込まれた単コピーpGBGLA50及び単コピーpGBGLA53の正しい組込みパターンを示す形質転換細胞を用いて、amdS選択マーカー遺伝子を除去した。
フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択によるamdSマーカー遺伝子の除去
フルオロアセトアミド逆選択を行うことにより(実験手順に記載されるように)、単一交差結果による組込みによって生じるDNA反復間の内部組換え結果によってamdSマーカー遺伝子を欠失した(即ち3′glaA非コーディング配列)。実施例2と同様の消化物及びプローブを用いたサザン分析により、amdSマーカー遺伝子のみの適切な除去を証明した。
【0083】
【実施例4】
A.オリゼにおけるglaA遺伝子及びフィターゼ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入
本実施例は、A.オリゼ NRRL3485 におけるglaA遺伝子又はフィターゼ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入を記載するものである。実施例2及び3と同様のベクター及び方法を用いて実験の項で記載されているように、A.オリゼ NRRL3485 を形質転換した。単一形質転換細胞を単離、精製し、数種の形質転換細胞の染色体DNAのサザン分析を行ってpGBGLA30ベクター又はpGBGLA50及びpGBGLA53ベクターの各々の組込みを証明した。サザン分析においては、実施例2と同様の消化物及びプローブを用いた。
【0084】
フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択によるamdS遺伝子の除去
pGBGLA30ベクターの組込みの場合、宿主株A.オリゼ NRRL3485 のゲノムに組込まれたpGBGLA30の単コピーを有する形質転換細胞を用いてamdS遺伝子を適切に除去した。フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択を実験の項で記載されているように行った。数種のフルオロアセトアミド耐性株の染色体DNAのサザン分析により、amdS遺伝子の正しい除去を証明した。実施例2と同様の消化物及びプローブを用いた。
pGBGLA50及びpGBGLA53ベクターの組込みの場合、宿主ゲノムに組込まれたpGBGLA50及びpGBGLA53の双方の単コピーを有する形質転換細胞を用いてamdSマーカー遺伝子を適切に除去した。フルオロアセトアミドプレートを用いた逆選択を実験の項で記載されているように行った。実施例2と同様の消化物及びプローブを用いた数種のフルオロアセトアミド耐性株の染色体DNAのサザン分析により、amdSマーカー遺伝子(例えばpGBGLA50ベクター)の正しい除去を証明した。。
【0085】
【実施例5】
T. リーサイにおけるglaA遺伝子及びフィターゼ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入
本実施例は、T.リーサイ株 QM9414 (ATCC 26921)におけるglaA遺伝子又はフィターゼ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入を記載するものである。実施例2及び3と同様のベクター及び方法を用いて実験の項で記載されているように、T.リーサイ QM9414 を形質転換した。単一形質転換細胞を単離、精製し、形質転換細胞の染色体DNAのサザン分析を行ってpGBGLA30ベクター又はpGBGLA50及びpGBGLA53ベクターが各々組込まれるかを証明した。サザン分析においては、実施例2と同様の消化物及びプローブを用いた。
【0086】
フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択によるamdS遺伝子の除去
pGBGLA30ベクターの組込みの場合、宿主株T.リーサイ QM9414 のゲノムに組込まれたpGBGLA30の単コピーを有する形質転換細胞を用いてamdS遺伝子を適切に除去した。フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択を実験の項で記載されているように行った。フルオロアセトアミド耐性株の染色体DNAのサザン分析により、amdS遺伝子の正しい除去を証明した。実施例2と同様の消化物及びプローブを用いた。
pGBGLA50及びpGBGLA53ベクターの組込みの場合、宿主ゲノムに組込まれたpGBGLA50及びpGBGLA53の双方の単コピーを有する形質転換細胞を用いてamdSマーカー遺伝子を適切に除去した。フルオロアセトアミドプレートを用いた逆選択を実験の項で記載されているように行った。実施例2と同様の消化物及びプローブを用いた数種のフルオロアセトアミド耐性株の染色体DNAのサザン分析により、amdSマーカー遺伝子(例えばpGBGLA50ベクター)の正しい除去を証明した。。
【0087】
【実施例6】
選択マーカーとしてamdS遺伝子を用いた同時形質転換による P. クリストゲナム (P.chrysogenum) 遺伝子の P. クリストゲナムへのマーカー遺伝子を含まない導入
本実施例には、同時形質転換によりP.クリストゲナムのゲノムへ遺伝子をマーカー遺伝子を含まずに導入することが記載される。
同時形質転換法においては、2種類のDNAがプロトプラストに与えられ、1つが実験の項で記載されているようにその存在で第1形質転換細胞選択が起こるamdS選択マーカーであり、1つは問題の具体的な酵素をコードする別の種類の問題のDNAである。多数の形質転換細胞においては、両種のDNAが染色体に組込み、安定に維持され、発現される。
次いで、実験の項で記載されているように逆選択手順を用いることによりamdS選択マーカー遺伝子を精製形質転換細胞から選択的に除去することができ、もう1つのDNAは形質転換細胞の染色体に安定に組込まれたままである。この方法の一般応用性を説明する例として、niaD遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入が記載され、単独窒素源として硝酸塩上でniaD宿主を発育させることが可能である。
【0088】
この同時形質転換用宿主は、硝酸塩レダクターゼがなく従って単独の窒素源として硝酸塩を含有するプレート上で発育させることができないP.クリストゲナムniaD株である。これらの菌株は、周知の方法により容易に得ることができる(Goukaら, Journal of Biotechnology 20(1991), 189-200及びその中の参考文献) 。
同時形質転換(実験の項で記載されている手順)で、2種類のDNAが同時にプロトプラストに与えられる:amdS選択マーカー遺伝子を含むpGBGLA28の7.6kbのEcoRI制限フラグメント及びP.クリストゲナムniaD遺伝子を含むpPC1−1の6.5kbのEcoRI制限フラグメント。形質転換前に、両フラグメントはアガアロースゲル電気泳動でE.コリベクター配列から分離されており、電子溶離によりアガロースゲルから精製されている。実験の項で記載されているように、単独の窒素源としてアセトアミドを含有する選択プレート上で形質転換細胞の第1選択が起こる。
形質転換細胞の中で、同時形質転換細胞は単独の窒素源として硝酸塩を含有するプレートで精製形質転換細胞の胞子をレプリカ培養することにより見出される。典型的にはレプリカ培養形質転換細胞の約20−60%がこの培地上で発育させることができ、これらの形質転換細胞においてamdS選択マーカー遺伝子だけでなくniaD遺伝子もゲノムに組込まれており、発現される。
【0089】
フルオロアセトアミド含有プレート上での逆選択によるamdS遺伝子の除去
引き続きフルオロアセトアミドの逆選択により同時形質転換細胞からamdS選択マーカー遺伝子を除去する。
amdS- /niaD+ 表現型の直接選択の場合、用いられる培地は10mMフルオロアセトアミドを含有した。1プレートにつき104 胞子の濃度で胞子を塗布した。25℃で5−7日間インキュベートした後、フルオロアセトアミド耐性コロニーがぼんやりした背景と明らかに異なる固形コロニーとして確認することができた。組換え体のniaD+ 表現型は単独の窒素源として硝酸塩を含有するフルオロアセトアミド培地上で発育することにより証明される。組換え体のamdS表現型は、単独の窒素源としてアセトアミドを含有するプレート上で組換え体の発育がないことで確認された。典型的には、塗布した胞子の最初の数の0.1−2%が所望の表現型を示した。
フルオロアセトアミド耐性株由来の染色体DNAのサザン分析により、amdS選択マーカー遺伝子がP.クリソゲナムゲノムから除去されたことを確認した。
【0090】
【実施例7】
酵母クルイベロミセスラクチスのamdSマイナス表現型の試験
K.ラクチスにおけるamdS選択系使用の必要条件は、本酵母がアセトアミダーゼ活性を含まないことである。これを試験するために、下記の3種類の固形培地にK.ラクチス株 CBS 683及び CBS 2360 を塗布した:
I 窒素源を除くすべての必須栄養分及びビタミンを含む酵母炭素ベース(YCB, Difco)。
II 5mMアセトアミドで補足したYCB。
III 0.1%(w/v) NH4(SO4)2 で補足したYCB。
3培地はすべて1.2%(w/v) Oxoid 寒天(Agar No.1) 及びpH7.0の30mMリン酸ナトリウムバッファーを含有した。Difco YCBは1.17%(w/v) で用いた。十分に増殖したK.ラクチスコロニーは窒素源としてアンモニウムを含有する培地にのみ認められた。窒素源なし又は単独の窒素源としてアセトアミドを含むプレートでは、増殖が全く見られないかあるいは時にわずかなバックグラウンド増殖が見られ、これは微量の窒素が混入している寒天又は他の培地成分に起因すると思われる。K.ラクチス株は共に単独の窒素源としてのアセトアミド上で発育を維持する十分なアセトアミド活性がないことが結論される。
【0091】
【実施例8】
amdS遺伝子を酵母において使用するためのプラスミドの構築
pGBamdS1の構築
以前には、K.ラクチスにおけるヒト血清アルブミン(HSA)の発現にpGBHSA20が用いられている (Swinkelsら 1993, Antonie van Leeuwenhoek 64, 187-201) 。pGBHSA20において、HSAcDNAはK.ラクチスLAC4プロモーターから誘導される(プラスミドpGBHSA20の物理的地図として図49)。HSAcDNAは3′端にLAC4ターミネーターが隣接される。形質転換細胞の選択の場合、pGBHSA20はS.セレビシエADH1プロモーター(Bennetzen, Hall (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025)で誘導された抗生物質G418(Geneticin, BRL)(Reissら (1984) EMBO J. 3, 3317-3322) に対する耐性を付与するTn5ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含んでいる。LAC4プロモーターのユニークなSstII部位においては、pGBHSA20はE.コリでの増幅に用いられるE.コリベクターpTZ19Rを含んでいる。K.ラクチスに形質転換する前に、SstII消化及びアガロースゲル精製によりpGBHSA20からpTZ19Rを除去する。LAC4プロモーターのSstII部位で線状のpGBHSA20をK.ラクチスに形質転換すると、相同的組換えによりゲノムLAC4プロモーターに組込まれることになる。pGBamdS1は、HSAcDNAをpamdS1のamdScDNAに置き換えることによりpGBHSA20誘導される。PCRを用いて、amdScDNAの5′及び3′端にSalI部位を導入した。このPCRにおいては、鋳型としてpamdS1を用い、プライマーとしてオリゴ AB3514 (配列番号26)及び AB3515 (配列番号27)を用いた。
【0092】
オリゴ AB3514 (配列番号26):
5′CTGCGAATTCGTCGACATGCCTCAATCCTGGG 3 ′
(導入したSalI部位を有する5′端amdS特定配列)
オリゴ AB3515 (配列番号27):
5′ GGCAGTCTAGAGTCGACCTATGGAGTCACCACATTTC 3′(導入したSalI部位を有する3′端amdS特定配列)
このようにして得られたPCRフラグメントをSalIで消化し、pGBHSA20のSalI/XhoI部位にクローン化した。制限分析で判定される2方向のいずれかのamdScDNAを含む数種のクローンを得た。正しい向きのamdScDNAを有するクローンの1種がpGBamdS1であり、その物理的地図が図49に示されている。
【0093】
pGBamdS3の構築
S.セレビシエ延長因子1−α遺伝子(EF1−α;Nagataら (1984) EMBO J. 3, 1825-1830) から誘導されたプローブを用いて異種ハイブリッド形成することにより、K1EF1と呼ばれるEF1−α遺伝子のK.ラクチス相同染色体を含むゲノムクローンを単離した。本実施例においては、K1EF1プロモーターを含む813bpフラグメントを用いてamdScDNAをK.ラクチスで発現した。オリゴヌクレオチド AB3701 (配列番号28)及び AB3700 (配列番号29)を用いて、鋳型としてK.ラクチス株 CBS 683由来のゲノムDNAを用いるPCRにおいて本フラグメントを増幅した。 AB3700 (配列番号29)は、K1EFプロモーターの21ヌクレオチド及びamdS遺伝子のATG開始コドンの上流に38ヌクレオチドを含むように設計される。 AB3701 (配列番号28)及び AB3700 (配列番号29)の配列を示す:
オリゴ AB3701 (配列番号28):
5′CTGCGAATTCGTCGACACTAGTGGTACCATTATAGCCATAGGACAGCAAG 3′ (プロモーターの5′端に他の制限部位EcoRI、SalI、SpeI及びKpnIを有する5′K1EF1特定プロモーター配列)
オリゴ AB3700 (配列番号29):
5′GCTCTAGAGCGCGCTTATCAGCTTCCAGTTCTTCCCAGGATT-
GAGGCATTTTTAATGTTACTTCTCTTGC 3′
(制限部位BssH2及び他の部位XbaIを有するamdScDNAの5′配列に融合した3′K1EF1特定プロモーター配列)。
【0094】
標準条件を用いてPCRを行い、得られたPCRフラグメントをEcoRI及びXbaIで消化し、EcoRI/XbaI消化pTZ19Rにサブクローン化した。得られたプラスミドpTZK1EF1の物理的地図は図50に示されている。amdScDNAの残りの部分及びLAC4ターミネーター配列の部分をpGBamdS1からBssH2及びSphIで消化することにより得た。本BssH2−SphIフラグメントをBssH2及びSphI消化pTZK1EF1にクローン化し、得られたプラスミドをpGBamdS2と称した(図50)。最終段階のpGBamdS3の構築において、pGBamdS2及びpTY75LAC4(Das, Hollenberg (1982) Current Genetics 6, 123-128)を共にSphI及びHindIIIで消化した。残りのLAC4ターミネーター配列を含むpGBamdS2の5.7kbDNAフラグメント及びpTY75LAC4の1.2kbDNAフラグメントをアガロースゲルで精製した後、分別し、次に連結し、E.コリを形質転換するために用いた。amdScDNAがK.ラクチスK1EF1プロモーターから誘導された得られた発現ベクターをpGBamdS3と称した(図51)。
【0095】
pGBamdS5の構築
鋳型としてpGBHSA20を用いるPCRにおいて、S.セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼI(ADH1)プロモーターをamdScDNAに融合した。プライマーの1つ(AB3703; 配列番号31)は、amdScDNAの配列に融合される3′端のADH1−プロモーター配列に相補的な配列を含んでいる。もう1つのプライマー(AB3702; 配列番号30)は、5′端のADH1プロモーターを含んでいる:
オリゴ AB3702 (配列番号30):
5′CTGCGAATTCGTCGACACTAGTGGTACCATCCTTTTGTTGTTTCCGGGTG 3′ (プロモーターの5′端に他の制限部位EcoRI、SalI、SpeI及びKpnIを有する5′ADH1特定プロモーター配列)
オリゴ AB3703 (配列番号31):
5′GCTCTAGAGCGCGCTTATCAGCGGCCAGTTCTTCCCAGGAT-
TGAGGCATTGTATATGAGATAGTTGATTG 3′
(他の制限部位BssH2及びXbaIを有する5′amdS配列に融合した3′ADH1特定プロモーター配列)。
【0096】
『タッチダウン』プロトコール(Donら, (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4008) を用いてPCR反応を行った。反応混合物を30増幅サイクルに供し、アニーリング温度を2サイクル毎に2℃下げ、55℃を40℃の『タッチダウン』まで下げ、この温度で10サイクル以上を行った(サイクル:94℃で2′、アニーリング2′、72℃で3′)。得られたPCRフラグメントをEcoRI及びXbaIで消化し、pTZ19Rにサブクローンした。得られたプラスミドpTZs.c.ADH1は図52に示されている。pTZs.c.ADH1及びpGBamdS3をKpnI及びBssH2で消化した。pGBamdS3の6.8kbフラグメント及びpTZs.c.ADH1の750bpフラグメントをゲル電気泳動で精製し、連結し、E.コリ JM109を形質転換するために用いた。得られた発現ベクターをpGBamdS5と称した(図37)。
【0097】
pGBamdS5の構築
プラスミドpGBamdS3は、K1EF1プロモーターの調節による3′端に1.5kbのLAC4ターミネーター配列が隣接したamdScDNAを含んでいる(図51)。pGBamdS6は、LAC4プロモーターとpGBamdS3のamdS発現カセットの上流のターミネーター配列の融合を含むフラグメントをクローン化することにより構築される(図53)。LAC4プロモーターとターミネーター配列を融合するために、まずpPTLAC4を構築した(図54)。PCRを用いて、更に600bpのLAC4ターミネーターフラグメントの5′及び3′端に導入する。PCRにおいては、K.ラクチス CBS 683染色体DNAを用い、プライマーとしてオリゴヌクレオチド AB3704 (配列番号32)及び AB3705 (配列番号33)を用いた:
オリゴ AB3704 (配列番号32):
5′GCTCTAGAAGTCGAC ACTAGTCTGCTACGTACTCGAGAATTTATACTTAGA-
TAAG 3′
(他の制限部位XbaI、SalI、SpeI、SnaBI及びXhoIを有するLAC4停止コドンで開始するLAC4ターミネーター特定配列)
オリゴ AB3705 (配列番号33):
5′ TGCTCTAGATCTCAAGCCACAATTC 3 ′
(他の制限部位XbaIを有する3′LAC4ターミネーター特定配列)。
【0098】
標準条件を用いてPCRを行い、得られたPCRフラグメントをXbaIで消化し、pTZ19RのXbaI部位にサブクローン化してpTLAC4を得た(図54)。LAC4プロモーター配列は、pKS105 (van den Bergら (1990) Bio/Technology 8, 135-139)をXbaI及びSnaBIで消化することにより得られる。XbaI−SnaBILAC4プロモーターフラグメントをpRLAC4のSpeI/SnaBI部位にクローン化し、pPTLAC4と称した(図54)。最終段階のpGBamdS6の構築において、pGBamdS4をXbaIで消化した。pPTLAC4の4.1kbのDNAフラグメントをアガロースゲルで精製し、pGBamdS3のSpeI部位にクローン化した。得られた遺伝子置換ベクターをpGBamdS6と称した(図53)。
【0099】
pGBamdS8の構築
プラスミドpGBamdS7は、LAC4プロモーターの一部及びキモシン発現カセットを含むフラグメントをLAC4プロモーターとpGBamdS6との間にクローン化することにより構築した(図55)。プラスミドpKS105は、LAC4プロモーター (van den Bergら (1990) Bio/Technology 8, 135-139)の調節によるS.セレビシエα因子のプレプロ領域に融合したプロキモシンcDNAを含んでいる。PCRを用いて、更に制限部位を融合LAC4プロモーターとキモシン発現カセットの5′及び3′端に導入した。PCRにおいては、鋳型としてpKS105DNAを用い、プライマーとしてオリゴヌクレオチド AB3965 (配列番号34)及び AB3966 (配列番号35)を用いた:
オリゴ AB3965 (配列番号34):
5′CTGCTACGTAATGTTTTCATTGCTGTTTTAC 3′
(制限部位SnaBIで開始するLAC4プロモーター特定配列)
オリゴ AB3966 (配列番号35):
5′ CCGCCCAGTCTCGAGTCAGATGGCTTTGGCCAGCCCC 3′
(他の制限部位XhoIを有するキモシン特定配列)。
【0100】
標準条件を用いてPCRを行い、得られたPCRフラグメントをSnaB1及びXhoIで消化した。プラスミドpGBamdS6をXhoIで消化し、次にSnaBIで消化し、10.9kbのDNAフラグメントを単離し、ゲル電気泳動で精製した。SnaBI−XhoI融合フラグメントLAC4プロモーター/キモシン発現カセットをpGBamdS6のSnaBI/XhoI部位にクローン化した。得られたプラスミドをpGBamdS7と称した(図55)。
キモシン遺伝子から開始コドンの約66bp上流のHindIII部位を破壊するために、pGBamdS7をHindIIIで部分的に消化し、E.コリDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントで処理して平滑末端を作成し、引き続き連結し、分子クローニングのためにE.コリに移した。この誘導プラスミドをpGBamdS8と称し、破壊されたHindIII部位を有するLAC4プロモーターフラグメントを含んでいる。
【0101】
【実施例9】
酵母 K. ラクチスにおけるLAC4プロモーターからamdScDNAの発現
発現ベクターpGBamdS1は、amdScDNAとは別に抗生物質G418に対する耐性を付与する第2選択マーカーを含んでいる。これにより十分に確立された方法であるG418耐性を用いて形質転換細胞をまず選択することができる(Sreekrishnaら (1984) Gene 28, 73-81) 。このようにして得られた形質転換細胞は引き続きamdScDNAの発現を証明しかつK.ラクチスのamdS+ 選択の条件を最適化するために用いることができる。これらの条件が確立されると、amdS+ 形質転換細胞が例えば発現カセットを用いて選択マーカーなしに直接選択することができる。
【0102】
pGBamdS1(図49)をSstII消化によりLAC4プロモーターで線状にした。分別及びアガロースゲルでの精製によりpTZ19R配列を除去した。本DNAフラグメントの15μg を用いてIto H.ら (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168を実験の項で記載された変更をしてK.ラクチス株 CBS 2360 及び CBS 683に形質転換した。形質転換プレートを30℃で3日間インキュベートした。引き続き両菌株の数個の独立形質転換細胞及び野生型菌株を別の固形培地を含むプレートに線状に塗布した(表1参照)。YEPD及びYEPD/G418は実験の項で記載されている。YCB、YCB/NH4 及びYCB/アセトアミドは各々培地I、II及びIIIとして実施例7に記載されている。YCB/NH4 及びYCB−lac/アセトアミドは各々1%(w/v) ラクトース、pH7.0の30mMリン酸ナトリウムバッファー及び0.1%(w/v) NH4(SO4)2 あるいは5mMアセトアミドで補足した0.17%(w/v) 酵母窒素ベース w/oアミノ酸及び硫酸アンモニウム(Difco) を含んでいる。
【0103】
CBS 683/pGBamdS1形質転換細胞のamdS+ 表現型はYCB/アセトアミド上で明瞭であった(表1参照)。しかしながら、同様の発現ベクターを含む CBS 2360 形質転換細胞は、YCB/アセトアミド上で増殖を示さなかった。種々のK.ラクチス株間のLAC4プロモーターの調節における炭素源依存差が記載されている(Breunig (1989) Mol.Gen. Genet. 216, 422-427) ので、これはラクトース又はガラクトースが存在しないときのamdScDNAを進めるLAC4プロモーターの誘導の欠如によるものであると推論された。表1は、実際に単独の炭素源としてラクトース及び単独の窒素源としてアセトアミドを含有する培地上で CBS 2360 形質転換細胞が増殖することができることを示すものである。従って、用いられる炭素源に依存してこれらの形質転換細胞は単独の窒素源としてアセトアミド上で酵母K.ラクチスの増殖を維持するためにA.ニドゥランスamdScDNAを十分に発現することが結論される。
【0104】
LAC4プロモーターに組込まれたかを証明するためにサザン分析を行った。CBS 2360及び CBS 683形質転換細胞の高分子量DNAを単離し、HindIIIで消化し、次に0.7%アガロースゲルの電気泳動で分別した。ニトロセルロースに移した後、標準手順に従ってハイブリッド形成を行った。プローブとして、プラスミドpGBHSA20(図49)から単離した32P標識約1.5kbSacII/HindIIILAC4プロモーターフラグメントを用いた。LAC4遺伝子座に組込まれた単一pGBamdS1発現カセットを含む CBS 683及び CBS 2360 形質転換細胞が確認され、各例が図56に示されており、各々をKAM−一1及びKAM−2と称する。pGBamdS1をLAC4プロモーターに単コピーを組込むと4.2及び8.6kbの2つの新しいHindIIIフラグメントを作製し、共に形質転換細胞KAM−1及びKAM−2内に存在する。 CBS 683が2LAC4遺伝子座を含みかつpGBamdS1がKAM−1でそれらの1つだけに組込まれているので、KAM−1の消化物は第2の妨害されないLAC4遺伝子座から誘導された5.6kbのHindIIIフラグメントも示している。
【0105】
【表1】
【0106】
【実施例10】
単独の窒素源としてアセトアミドを用いる K. ラクチス CBS 683 及び CBS 2360 形質転換細胞の直接選択
SstII線状pGBamdS1(15μg )をIto H.ら((1983) J. Bact. 153, 163-168)に記載されている標準手順を次のように変更してK.ラクチス CBS 683及び CBS 2360 に形質転換した。
− K.ラクチス培養物をOD610 =0.5−1.0で形質転換用に収集した。
− DNA細胞懸濁液を5分間熱ショック処理した後、平板培養前に30℃で150−180分1ml量で表現型発現を行った。種々の培地を両株に用いた。 CBS 683の場合、YEPD/YNB液(1*YNB(酵母窒素ベース,Difco)、1%バクトペプトン、1%酵母エキス及び2%グルコース)又はYNB−glu(1%(w/v) グルコース及びpH7.0の30mMリン酸ナトリウムバッファーで補足した1*YNB(酵母窒素ベース w/oアミノ酸及び硫酸アンモニウム,Difco)) を用いた。このインキュベーション後、細胞を2000g、室温で5分間遠心し、次にYCB/アセトアミドに塗布した(実施例7参照)。 CBS 2360 の場合、YNB−lac(1%(w/v) ラクトース及びpH7.0の30mMリン酸ナトリウムバッファーで補足した1*YNB(酵母窒素ベース w/oアミノ酸及び硫酸アンモニウム,Difco)) を用いた。このインキュベーション後、細胞を2000g、室温で5分間遠心し、次にYCB−lac/アセトアミドに塗布した(実施例9参照)。
【0107】
30℃で3日間発育させた。両株にamdS+ 形質転換細胞が得られた。見られる形質転換頻度は、G418選択を用いる場合に見られるものに匹敵した。形質転換細胞の正しい同定は、次のG418を含むYEPDプレートの平板培養及びサザン分析により確認された。
amdScDNAがK1EF1プロモーターから進むpGBamdS3(図51)をXhoIによる消化でLAC4ターミネーターで線状とし、次に15μg のゲル単離フラグメントを上記pGBamdS1の CBS 683への形質転換で記載したYCB/アセトアミドプレートの直接選択を用いてK.ラクチス株 CBS 683に形質転換した。得られた形質転換細胞の若干をサザンブロッティングで分析した。高分子量DNAを単離し、BamHIで消化し、次に0.7%アガロースゲルの電気泳動で分離した。ニトロセルロースに移した後、標準手順に従ってハイブリッド形成した。プローブとしてプラスミドpTY75LAC4ターミネーター(実施例8に記載されている)から単離した32P標識1.2kbSphI/HindIIILAC4ターミネーターフラグメントを用いた。pGBamdS3プラスミドを含む CBS 683形質転換細胞及びpGBamdS3プラスミドを含む形質転換細胞の結果は各々図57及び58に示されている。対照株 CBS 683は図58に示されている。 CBS 683形質転換細胞においては、自然型LAC4ターミネーターの3.7kbハイブリッド形成フラグメントの他に6.8kbサイズのハイブリッド形成フラグメントが存在する。これは、LAC4ターミネーター領域へのプラスミドの正しい組込みを意味する。
【0108】
これらの形質転換細胞のすべてにおいて、LAC4ターミネーターに1コピー以上で組込まれた(6.8kbのハイブリッド形成フラグメントの強さはベクターの組込まれたコピー数に示される)。構成的K1EF1プロモーターが選択マーカーとして有用なamdScDNAを進めることができることも結論される。同様の結果がpGBamdS5(図52)で得られ、amdScDNAがS.セレビシエADH1プロモーターから進められる。
【0109】
【実施例11】
アセトアミド直接選択による S. セレビシエのpGBamdS5による形質転換
本実施例においては、amdScDNAが他の酵母、例えばS.セレビシエ内で選択マーカーとして用いることができるかを試験した。まず、実施例7のK.ラクチスと同様の培地及び手順を用いて、S.セレビシエ株 D237-10B のamdS- 表現型及び単独の窒素源としてアンモニウムの使用能が確立された。K.ラクチスの場合に認められたように、窒素源としてアンモニウムを含むプレートにのみ十分に増殖されたS.セレビシエが見られた。窒素源なし又は単独の窒素源としてアセトアミドを含むプレートにおいては、全く発育しないか又はときどきわずかなバックグラウンド増殖が見られた。SphIで部分的に消化することによりADH1プロモーターでプラスミドpGBamdS5を線状にした。pGBamdS1をK.ラクチスに形質転換した実施例10の形質転換手順を用いて、S.セレビシエ株 D273-10B(ATCC 25657) を15μg のゲル単離線状pGBamdS5フラグメントで形質転換した。形質転換後、この細胞をYCB/アセトアミドプレート(実施例9参照)に塗布し、30℃で3日間発育させた。この形質転換でamdS+ 形質転換細胞が得られた。引き続きamdS形質転換細胞のサザン分析により、amdScDNAがS.セレビシエゲノムに安定に組込まれたことが確認された。
【0110】
高分子量DNAを単離し、BamHIで消化し、次に0.7%アガロースゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロースでブロットした。プローブとしてpGBamdS1から単離した32P標識750bpEcoRVamdSフラグメントを用いた。D273-10B/pGBamdS5形質転換細胞及び対照株D273-10B(ATCC 25657)の結果は図59に示されている。2ハイブリッド形成フラグメント、各々多コピーフラグメントを表す6.6kbフラグメント及びフランキングを表す不明サイズのハイブリッド形成フラグメントは、D273-10B形質転換細胞内に存在する。予想されるように対照株D273-10B(ATCC 25657)はハイブリッド形成フラグメントを示さない。
【0111】
【実施例12】
フルオロアセタミド逆選択を用いる K. ラクチス及び S. セレビシエamdS + 形質転換細胞からamdSマーカーの除去
上記実施例においては、単一交差相同的組換えによりamdS含有発現カセットがK.ラクチス及びS.セレビシエゲノムに組込まれる。これは、これらのamdS酵母形質転換細胞のゲノムの直列反復がamdScDNAに隣接することを意味する。従って、amdScDNAは、cDNAを隣接する直列反復間に低頻度で生じる染色体内有糸分裂組換え結果により形質転換細胞集団の小部分で欠失する。A.ニドゥランスについてHynes, Pateman((1970) Mol. Gen. Genet. 108, 107-116)によって示されているように、amdS+ 細胞に有毒でありamdS- に有毒でない化合物、フルオロアセトアミドを含む培地を用いてこれらの結果を選択することが可能でなければならない。amdS+ 細胞においては、フルオロアセトアミドがアンモニア及びフルオロアセテートに変換され、後者は酵素アセチル−CoA−シンテターゼによって活性化される。従って、amdS+ 酵母にも作用するフルオロアセタミド逆選択の必要条件は、1)フルオロアセタミドはamdS- に有毒であってはならない、2)酵母細胞壁及び原形質膜がフルオロアセタミドに対して透過性でなければならない及び3)酵素アセチル−CoA−シンテターゼが活性でなければならないである。
【0112】
これを試験するために、KAM−1と称するLAC4プロモーターに組込まれたpGBamdS1の単コピーを含むK.ラクチス CBS 683形質転換細胞及びKAM−2と称するADH1プロモーターに組込まれたpGBamdS5の単コピーを含むS.セレビシエ D273-10B 形質転換細胞を用いた。KAM−1及びKAM−2双方を選択培地(YCB/アセトアミド)で少なくとも3回遺伝的精製に供し、amdS- 親株による混入を排除した。KAM−1及びSAM−1を各々10mMフルオロアセトアミドで補足したYCB/NH4 に1プレート当たり約103 CFU の濃度で塗布した。両KAM−1及びSAM−1の場合、30℃で3〜6日後にフルオロアセトアミド耐性コロニーが現れた。独立したKAM−1及びSAM−1誘導amdS- コロニーの染色体DNAによるサザン分析から、フランキング直列反復間で相同的組換えによりK.ラクチス及びS.セレビシエゲノムからamdScDNAが正しく除去されたことが確認された。事実、KAM−1amdS- 組換え体の1種には組換えの交差点が多型性HindIII部位及びamdScDNA間に位置した。
【0113】
この多型性HindIIIはpGBamdS1のLAC4プロモーターのLAC4読み枠の92bp上流に存在するが、この部位はCBS 683 LAC4プロモーターに存在しない。組換え結果は、この具体的なKAM−1組換え体のゲノムにHindIII部位が残り、親株 CBS 683と区別することができなかった(図56、レーン6の4.2kbの余分なフラグメント参照)。従って、このKAM−1組換え体は、KAM−1amdS- 組換え体の代わりにCBS 683 混入物を単離する可能性を排除する。上記のことから、フルオロアセトアミド逆選択を用いて並列反復が隣接した場合の酵母ゲノムからamdScDNAを除去することができることが結論される。本実施例においては、amdS- K.ラクチス及びS.セレビシエ組換え体が約0.1%の頻度で生じる。
若干の酵母株の場合、おそらくアセチルCoA−シンテターゼの強力な炭素カタボライト抑制のために、YCB/NH4 でフルオロアセタミドによる効率のよい逆選択を行うことができないことは特に言及される。これらの場合には、逆選択用に10mMフルオロアセトアミドで補足したYCB−ガラクトース/NH4(この培地は1%ラクトースの代わりに1%ガラクトースを含む以外は実施例9に記載されるYCB−lac/NH4 と同じものである)が巧く用いられる。
【0114】
【実施例13】
amdSマーカーを用いる K. ラクチス遺伝子のマーカー遺伝子を含まない欠失
酵母ゲノムの操作にしばしば用いられる手法は「一段遺伝子破壊」であり、この方法は単一形質転換段階で遺伝子を破壊(又は修飾)することができる(Rothsteinら (1983) Methods Enzymol. 101, 202-211)。本方法においては、酵母選択性マーカーによって破壊された標的遺伝子のコピーを有する形質転換プラスミドが二重交差相同的組換えにより酵母ゲノムに組込み、野生型標的遺伝子が破壊コピーに置き換えられる。実施例12に記載されている『一段遺伝子破壊』とフルオロアセトアミド逆選択の組合わせは、選択性マーカーを残さずに酵母ゲノムから遺伝子を欠失させなければならない。本実施例においては、K.ラクチス CBS 2360 ゲノムからLAC4遺伝子を欠失させるためにこの組合わせが用いられる。K.ラクチスLAC4遺伝子の一段遺伝子交換の場合、pGBamdS6(図53)が構築され、LAC4プロモーター及びターミネーター配列が隣接したamdS発現カセットを含んでいる。更にamdS発現カセットに並列反復が隣接し、これらの並列反復間の染色体内組換えによりK.ラクチスゲノムからamdS配列が除去されるように、LAC4ターミネーターフラグメントがamdS発現カセットのすぐ上流に存在する。プラスミドpGBamdS6をSpeI及びHindIIIで消化し、ゲル電気泳動後6.6kbのDNAフラグメントを単離した。実施例10に記載されている形質転換手順を用いてK.ラクチス CBS 2360 を形質転換するために、遺伝子置換ベクターを含むこのSpeI−HindIIIフラグメントを用いた。交換されたLAC4遺伝子を有する形質転換細胞をスクリーンするために、amdS+ 形質転換細胞を0.008%X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−D−ガラクトピラノシド)を含むYEPDプレートに塗布した。
【0115】
amdS+ 形質転換細胞をサザンブロットで分析した。高分子量DNAを単離し、HindIIIで消化し、次に0.7%アガロースゲルによる電気泳動で分離し、ニトロセルロースにブロットした。プローブとしてプラスミドpPTLAC4(実施例8)から単離した32P標識600bpXbaILAC4ターミネーターフラグメントを用いた。交換したLAC4遺伝子及び対照株 CBS 2360 を有するamdS+ CBS 2360形質転換細胞の結果は図44に示されている。amdS+ CBS 2360形質転換細胞の場合には、正しく交換されたLAC4遺伝子を意味する7.4kbハイブリド形成フラグメントが存在する。対照株CBS 2360は2.0kbハイブリッドフラグメントを示し、これは自然型LAC4遺伝子座を表している。
【0116】
引き続き、これらのamdS+ 形質転換細胞のフルオロアセトアミド逆選択によりamdS- 表現型を有する組換え体を得た。amdS- 組換え体の染色体DNAでサザン分析を行った。高分子量DNAを単離し、HindIIIで消化し、次に0.7%アガロースゲルで分離し、ニトロセルロースにブロットした。上記と同じ32P標識プローブを用いた。amdS- CBS 2360組換え体の結果は、図60に示されている。amdS- 組換え体の場合には、5.4kbのハイブリッド形成フラグメントが存在し、LAC4遺伝子が存在しないこと及びamdSマーカーの酵母ゲノムからの除去が確認された。これらのK.ラクチスLAC4 - からamdSマーカーをなくすと、更に遺伝子の欠失及び/又は修飾にamdSマーカーを再使用する可能性を与える。
【0117】
【実施例14】
amdSマーカーを用いる K. ラクチスゲノムへの遺伝子のマーカー遺伝子を含まない挿入
遺伝子を酵母ゲノムにマーカー遺伝子含まずに挿入するために、モデル遺伝子としてキモシンcDNAを用いた。本実施例においては、LAC4遺伝子を置き換えかつ選択マーカーを残さずにK.ラクチスLAC4遺伝子座にキモシンcDNAを挿入した。マーカーのない遺伝子挿入の原理は、この場合には交換ベクターpGBamdS8が問題の遺伝子、キモシンcDNAを含んでいることを除いて実施例13に記載されている遺伝子のマーカーを含まない欠失と同様である(図55)。プラスミドpGBamdS8をSpeI及びHindIIIで消化し、8.0kbDNAフラグメントをゲル単離した。10μg のこのフラグメントを実施例10に記載されているようにK.ラクチス CBS 2360 に形質転換した。交換したLAC4遺伝子及びキモシン活性を有するamdS+ 形質転換細胞が得られた。
【0118】
キモシン活性を (van den Bergら (1990) Bio/technology 8, 135-139)に記載されているように測定した。これらの形質転換細胞の実施例12に記載されている次のフルオロアセトアミド逆選択により、なおキモシンを生産するamdS- 表現型と組換え体を単離した。amdS- の染色体DNAのサザン分析により、キモシン+ 組換え体からLAC4遺伝子がキモシンに置換されかつK.ラクチスゲノムからamdSマーカーが正しく除去されていることが確認された。これらの組換え体のamdS- /キモシン+ 表現型もYCB/アセトアミドプレート上で発育しないこと及びキモシン活性の存在(上記参照)によって確認された。これらの組換え体のamdS- 表現型は、更にこれらの菌株のamdSマーカーを用いる操作、例えばキモシン発現カセットの別のコピーの組込み及び/又は実施例13に記載されているK.ラクチス遺伝子の欠失が可能である。
【0119】
【実施例15】
バシラス及び E. コリのamdSマイナス表現型の試験
バシラスにおけるamdS選択系の使用の必要条件は、これらのグラム陽性菌がアセトアミダーゼ活性を有しないことである。これを試験するために、窒素源を除く必須栄養分及びビタミンすべてを含むバシラス最少培地にB.サチリス株 BS-154(CBS 363.94) を塗布した(28.7mMK2 HPO4 、22mMKH2 PO4 、1.7mMクエン酸ナトリウム、0.4mMMgSO4 、0.75μM MnSO4 、0.5%(w/v) グルコース及び1.5%寒天)。この培地のままあるいは窒素源として20mMアセトアミドで補足した場合増殖は全く見られなかった。最少培地を窒素源として20mM(NH4)2 SO4 あるいは20mMKNO3 で補足した場合にのみ増殖が見られた。バシラス BS-154(CBS 363.94) は、単独の窒素源としてアセトアミド上で発育を維持するのに十分なアセトアミダーゼ活性がないと結論される。この現象から、A.ニドゥランスamdS遺伝子はグラム陽性菌において選択マーカーとして使用しなければならない。
【0120】
同様に、グラム陰性菌、この場合E.コリにアセトアミダーゼ活性のないことを試験して、A.ニドゥランスamdS遺伝子がこれらの微生物にも選択マーカーとして用いることができるかを確立した。この場合には、0.02μg(w/v)チアミンで補足したM9最少培地 (Sambrookら (1989) “Molecular Cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New York)を用いた。M9プレートに塗布した場合にE.コリ JM109の十分発育されたコロニーが見られた。しかしながら、M9プレートからNH4 Clが除かれたり20mMアセトアミドに置き換えられた場合には、全く発育しないかあるいはわずかなバックグラウンド増殖のみ見られた。E.コリ JM109株は、単独の窒素源としてアセトアミド上で増殖を維持するだけの十分なアセトアミダーゼ活性がないと結論される。これにより、A.ニドゥランスamdS遺伝子はグラム陰性菌において選択マーカーとして使用しなければならない。
【0121】
【実施例16】
細菌に有用なamdS発現ベクターの構築
pGBamdS22の構築
種々のバシラス種においてA.ニドゥランスamdS遺伝子を発現させるために、pamdS−1のamdScDNAを基礎的なバシラス発現ベクターpBHA−1(欧州特許出願第 89201173.5 号; 物理的地図として図61)にクローン化した。amdScDNA遺伝子のATG開始コドンで、下記配列を有するオリゴヌクレオチド AB3825 (配列番号36)及び AB3826 (配列番号37)を用いてpamdS−1にNdeI部位を導入した:
オリゴ AB3825 (配列番号36):
5′CGCGCTTATCAGCGGCCAGTTCTTCCCAGGATTGAGGCATATGT 3′
オリゴ AB3826 (配列番号37):
5′CTAGACATATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAG 3′
【0122】
これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、標準法を用いて行った。得られた二本鎖DNAフラグメントをBssHII/XbaI消化pamdS−1に連結し、E.コリに移した。形質転換細胞の1つからpGBamdS21を単離し、制限酵素分析によって確認した(図63)。pGBamdS21をKpnI及びHindIIIで消化し、amdScDNA含有フラグメントをKpnI及びHindIIIで消化したpBHA−1にクローン化した。得られたプラスミドをpGBamdS22と称した(図64)。
pGBamdS25の構築
選択マーカーとしてamdSを用いて所望のDNA配列のB.リケニホルミスゲノムへの部位特異的組込みを証明するために、amdScDNAを発現/組込みベクターpLNFでクローン化した(図62)。B.リケニホルミスアミラーゼE.coliの5′及び3′非コーディング配列を含むこのベクターは、対応する染色体アミラーゼ遺伝子座において部位特異的組込みを可能にする。pGBamdS21(上記、図63)をNdeI及びPvuIIで消化し、amdScDNA含有フラグメントをNdeI及びScaIで消化したpLNFと連結した。連結混合物をB.サチリス BS-154 (CBS 363.94)に形質転換した。20μg/mlネオマイシンで補足した最少培地で選択した。形質転換細胞の1つからプラスミドpGBamdS25(図66)を単離し、BAA−101と称した。
【0123】
pGBamdS41の構築
A.ニドゥランスamdScDNAをE.コリで発現させるために、欧州特許第 0 340 878 A1 号に記載されているpTZ18Rの誘導体、pTZ18R/Nを用いた。pTZ18R/Nは、NdeI部位が試験管内部位特定突然変異誘発を用いてpTZ18RのlacZ読み枠のATG開始コドンで作られる点でpTZ18Rと異なるものである。pGBamdS21をNdeI及びHindIIIで消化し、amdScDNAを含むゲル単離フラグメントをNdeI及びHindIIIで消化したpTZ18R/Nに連結した。この連結混合物を用いて、E.コリ JM109を形質転換し、形質転換細胞の1つからpGBamdS41(図67)を単離した。
【0124】
【実施例17】
選択マーカーとしてamdS遺伝子を用いるバシラスの形質転換
E.コリ配列をpGBamdS22から欠失させかつamdScDNAのすぐ上流に“hpa2”プロモーターを配置するために、pGBamdS22をNdeIで消化し、連結により再び環状にし、B.サチリス BS-154 (CBS 363.94)を形質転換するために用いた。形質転換細胞をアセタミド最少プレートで選択し、ネオマイシン耐性をチェックした。これらの形質転換細胞の1つから発現ベクターpGBamdS23(図65)を単離し、制限酵素分析により確認した。これらの結果は、1)バシラスプロモーター配列の調節によってA.ニドゥランスamdScDNAが十分に発現される及び2)amdS遺伝子がバシラスの形質転換において選択マーカーとして用いることができることを示している。
【0125】
B.リケニホルミス T5 (CBS 470.83)をベクターpGBamdS25で形質転換した。実験の項で記載されているように形質転換を行い、単独の窒素源として20mMアセトアミドで補足した修飾プロトプラスト再生プレート上で直接選択することによりamdS+ 形質転換細胞が得られた(実験に記載されている)。形質転換細胞内のpGBamdS25の存在は、ネオマイシン耐性表現型及びプラスミドが形質転換細胞から再単離することができる事実により確認した。BAA−103と称するこれらの形質転換細胞の1つを用いて、pGBamdS25をアミラーゼ遺伝子座を標的にしたB.リケニホルミスゲルムに組込ませた。プラスミド組込みは、単独の窒素源としてアセトアミドを含む最少培地寒天上で形質転換細胞を発育させることにより行った。若干のコロニーを新しいプレートに繰り返し(2〜3回)移した後、50℃でインキュベートした。単離したコロニーを単独の窒素源としてアセトアミド上での増殖能及び1μg/mlのネオマイシンに対する耐性について試験した。自律複製プラスミドDNAが存在しないことは、組込み体から単離されたDNAを宿主株に再び形質転換することにより確立された。ネオマイシン耐性コロニーは得ることができなかった。
この結果から、amdS遺伝子単コピーを含むバシラス種を選択するのにamdS遺伝子が適切なマーカーであることは明らかである。
【0126】
【実施例18】
選択マーカーとしてamdS遺伝子を用いる E. コリの形質転換
標準手順を用いてE.コリ JM109をベクターpGBamdS41で形質転換した。0.02μg/mlチアミン及び50μg/mlアンピシリンで補足したM9プレートあるいは20mMアセトアミド、0.02μg/mlチアミン及び0.05mMIPTGで補足したアンモニウムを含まないM9プレートで選択した。amdS+ /アンピシリン耐性形質転換細胞を得、それからpGBamdS41を再単離した。アンピシリン又はアセトアミド上の選択を用いる形質転換頻度は匹敵しうるものであった。これは、A.ニドゥランスamdS遺伝子がグラム陰性菌の形質転換に選択マーカーとして同様に機能することを証明するものである。
【0127】
【実施例19】
amdS + 細菌形質転換細胞のフルオロアセトアミド逆選択
フルオロアセトアミドを用いる細菌amdS+ 形質転換細胞の逆選択には、フルオロアセテートをフルオロアセチル−CoAに変換する酵素アセチルCoAシンテターゼの活性が必要である。E.コリで見られた(Brownら 1977)アセチルCoAシンテターゼのカタボライト抑制を避けるために、細菌amdS+ 形質転換細胞又は単コピー組込み体を窒素源としてNH4 Cl並びに炭素及びエネルギー源として酢酸塩を含む特定培地上で発育させた。
【0128】
B.サチリス(Freese,E., Fortnagel,P. (1969) J. Bcteriol 90, 745-756)のような多くの生物はグリオキシル酸塩機能分路がなく、従って培地がグルタミン酸塩又はコハク酸塩のようなTCAサイクル中間体源で補足される場合にのみ酢酸塩を代謝する。バシラスamdS+ 株をGrundy, F.J.ら (1993) Molecular Microbiology 10, 259-271に記載されている0.01%グルタミン酸塩及び50mM酢酸塩を含むTSS培地で発育させた。寒天で固化したこの培地にフルオロアセトアミドを1〜50mMの濃度で加えた。B.サチリス BAA-101又はB.リケニホルミス BAA-103(単コピー組込み体)を1プレート当たり102 細胞濃度で塗布した。あるフルオロアセトアミド濃度ではわずかなコロニーしか出現しなかった。これらのコロニーにpGBamdS25が存在しないことは、プラスミド及び染色体DNA分析、ネオマイシンに対する感受性及び単独の窒素源としてアセトアミド上での増殖不能により証明された。BAA−103の逆選択の場合には、活性アッセイ及びサザンブロットによって示されるアミラーゼ遺伝子のロスをもたらした。これは、フルオロアセトアミド逆選択を用いて多数のamdS+ バシラス細胞及び特定標的遺伝子の同時欠失を含む集団からamdS- 細胞を選択することができることを示している。
【0129】
同様に、1〜50mMの濃度のフルオロアセトアミド及び0.05mMのIPTGで補足したVanderwinkel E., De Vlieghere M, European J. Biochem, 5 (1968) 81-90に記載されている最少培地 #132 を用いてpGBamdS41形質転換細胞の集団からamdS- E.コリ JM109細胞を選択した。細胞を1プレート当たり102 細胞の濃度で塗布した。あるフルオロアセトアミド濃度ではわずかなコロニーしか出現しなかった。フルオロアセトアミド選択コロニーからpGBamdS41が存在しないことは、DNA単離、アンピシリンに対する感受性及び単独の窒素源としてアセトアミド上での発育不能により確認された。これは、フルオロアセトアミド逆選択を用いて多数のamdS+ E.コリ細胞を含む集団からamdS- を選択することができることを証明するものである。
【0130】
【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:26塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
直接の起源
クローン名:AB3100
配列
【0131】
配列番号:2
配列の長さ:28塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:YES
直接の起源
クローン名:AB3101
配列
【0132】
配列番号:3
配列の長さ:16塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
直接の起源
クローン名:TN0001
配列
【0133】
配列番号:4
配列の長さ:35塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
直接の起源
クローン名:AB2154
配列
【0134】
配列番号:5
配列の長さ:35塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:YES
直接の起源
クローン名:AB2155
配列
【0135】
配列番号:6
配列の長さ:30塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
直接の起源
クローン名:AB2977
配列
【0136】
配列番号:7
配列の長さ:36塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:YES
直接の起源
クローン名:AB2992
配列
【0137】
配列番号:8
配列の長さ:36塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
直接の起源
クローン名:AB2993
配列
【0138】
配列番号:9
配列の長さ:36塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:YES
直接の起源
クローン名:AB2994
配列
【0139】
配列番号:10
配列の長さ:31塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
直接の起源
クローン名:AB3657
配列
【0140】
配列番号:11
配列の長さ:31塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB3658
配列
【0141】
配列番号:12
配列の長さ:23塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB3779
配列
【0142】
配列番号:13
配列の長さ:23塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB3780
配列
【0143】
配列番号:14
配列の長さ:30塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
直接の起源
クローン名:AB3448
配列
【0144】
配列番号:15
配列の長さ:36塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB3449
配列
【0145】
配列番号:16
配列の長さ:36塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB3450
配列
【0146】
配列番号:17
配列の長さ:42塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:YES
直接の起源
クローン名:AB3520
配列
【0147】
配列番号:18
配列の長さ:18塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB3781
配列
【0148】
配列番号:19
配列の長さ:18塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB3782
配列
【0149】
配列番号:20
配列の長さ:43塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB3746
配列
【0150】
配列番号:21
配列の長さ:47塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB3747
配列
【0151】
配列番号:22
配列の長さ:26塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB4234
配列
【0152】
配列番号:23
配列の長さ:43塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB4235
配列
【0153】
配列番号:24
配列の長さ:69塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB4236
配列
【0154】
配列番号:25
配列の長さ:36塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:YES
直接の起源
クローン名:AB4233
配列
【0155】
配列番号:26
配列の長さ:32塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
直接の起源
クローン名:AB3514
配列
【0156】
配列番号:27
配列の長さ:37塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
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直接の起源
クローン名:AB3515
配列
【0157】
配列番号:28
配列の長さ:50塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
直接の起源
クローン名:AB3701
配列
【0158】
配列番号:29
配列の長さ:70塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:YES
直接の起源
クローン名:AB3700
配列
【0159】
配列番号:30
配列の長さ:50塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
直接の起源
クローン名:AB3702
配列
【0160】
配列番号:31
配列の長さ:70塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:YES
直接の起源
クローン名:AB3703
配列
【0161】
配列番号:32
配列の長さ:55塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
直接の起源
クローン名:AB3704
配列
【0162】
配列番号:33
配列の長さ:25塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:YES
直接の起源
クローン名:AB3705
配列
【0163】
配列番号:34
配列の長さ:31塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
直接の起源
クローン名:AB3965
配列
【0164】
配列番号:35
配列の長さ:37塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:YES
直接の起源
クローン名:AB3966
配列
【0165】
配列番号:36
配列の長さ:44塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:NO
直接の起源
クローン名:AB3825
配列
【0166】
配列番号:37
配列の長さ:44塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:DNA (ゲノム)
ハイポセティカル配列:NO
アンチセンス:YES
直接の起源
クローン名:AB3826
配列
【図面の簡単な説明】
図面で用いられる略語:
制限酵素及び制限部位:
A=ApaI;Ba=BamHI;B=BglII;Bs=BssHII;E=EcoRI;H=HindIII;K=KpnI;N=NdeI;N=NotI;Ps=PstI;P=PvuII;Sa=SalI;Sc=ScaI;S=SmaI;Sn=SnaBI;Spe=SpeI;Sp=SphI;Ss=SstII;Xb=XbaI;X=XhoI。
その他:
T.=LAC4ターミネーター配列
【図1】プラスミドPamdS−1の制限地図である。本プラスミドは、A.ニデュランス (A.nidulans) 由来のamdSのcDNAを含んでいる。
【図2】遺伝子置換ベクターpGBDEL4Lを用いたA.ニガー由来のglaA遺伝子座のマーカー遺伝子を含まない欠失の模式図である。遺伝子置換ベクターpGBDEL4Lの実質部分は、反復(glaA遺伝子の3′非コーディング領域)間にクローン化gpdAプロモーターの調節によってamdS遺伝子を含んでいる。
【図3】実施例1に示されるpGBDEL4Lの構築経路の模式図である。
【図4】実施例1に示されるpGBDEL4Lの構築経路の模式図である。
【図5】実施例1に示されるpGBDEL4Lの構築経路の模式図である。
【図6】実施例1に示されるpGBDEL4Lの構築経路の模式図である。
【図7】実施例1に示されるpGBDEL4Lの構築経路の模式図である。
【図8】実施例1に示されるpGBDEL4Lの構築経路の模式図である。
【図9】実施例1に示されるpGBDEL4Lの構築経路の模式図である。
【図10】実施例1に示されるpGBDEL4Lの構築経路の模式図である。
【図11】実施例1に示されるpGBDEL4Lの構築経路の模式図である。
【図12】実施例1に示されるpGBDEL4Lの構築経路の模式図である。
【図13】 32P標識glaAプロモーターフラグメント及びキシラノーゼプローブでプローブされたpGBDEL4L形質転換細胞 #41(レーン1)、 #24(レーン2)、 #23(レーン3)及び #19(レーン4)及び宿主株 A. ニガー CBS 513.88 (レーン5)のKpnI消化物並びにpGBDEL4L形質転換細胞 #41(レーン6)、 #24(レーン7)、 #23(レーン8)及び #19(レーン9)及び宿主株 A. ニガー CBS 513.88 (レーン10)のBamHI消化物のオートラジオグラフである。
【図14】 GBA-102 (レーン1)及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-102株: GBA-107(レーン2)及び GBA-108(レーン3)のKpnI消化物並びに GBA-102(レーン4)及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-102株: GBA-107(レーン5)及び GBA-108(レーン6)のBamHI消化物のオートラジオグラフである。
【図15】アスペルギルスニガー CBS 513.88 における野生型glaA遺伝子座のBamHI及びKpnIフラグメント長の模式図である。
【図16】形質転換細胞 #19(= GBA-102) における切断型glaA遺伝子座のBamHI及びKpnIフラグメント長の模式図である。
【図17】 GBA-102 形質転換細胞におけるamdS遺伝子(= GBA-107及び GBA-108)除去後の切断型glaA遺伝子座のBamHI及びKpnIフラグメント長の模式図である。
【図18】 A.ニガーの切断型glaA遺伝子座の3′非コーディング領域にglaA遺伝子を組込む模式図である。
【図19】amdS遺伝子に隣接する3′glaA反復間の内部組換えの結果である。
【図20】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図21】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図22】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図23】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図24】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図25】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図26】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図27】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図28】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図29】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図30】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図31】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図32】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図33】実施例2に示される組込みベクターpGBGLA30の構築経路の模式図である。
【図34】 32P標識glaAプロモーターフラグメントでプローブされたpGBGLA30形質転換細胞 #107-9 (レーン1)、 #107-7 (レーン2)及び #107-5 (レーン3)、宿主株 A. ニガー GBA-107(レーン4)及び親株 A. ニガー CBS 513.88 (レーン5)のBglII消化物並びにpGBGLA30形質転換細胞 #107-9 (レーン6)、 #107-7 (レーン7)及び #107-5 (レーン8)、宿主株 A. ニガー GBA-107(レーン9)及び親株 A. ニガー CBS 513.88 (レーン10)のKpnI消化物のオートラジオグラフである。
【図35】アスペルギルスニガー CBS 513.88 における野生型glaA遺伝子座のKpnI及びBglIIフラグメント長の模式図である。
【図36】アスペルギルスニガー GBA-107における切断型glaA遺伝子座のKpnI及びBglIIフラグメント長の模式図である。
【図37】形質転換細胞 #107-5(= GBA-119)及び #107-9(= GBA-122)のようにglaA3′非コーディング領域に組込まれた単コピーを含む切断型glaA遺伝子座のKpnI及びBglIIフラグメント長の模式図である。
【図38】 GBA-119 及び GBA-122形質転換細胞におけるamdS遺伝子(= GBA-120、GBA-121 、GBA-123 及びGBA-124)除去後の切断型glaA遺伝子座のKpnI及びBglIIフラグメント長の模式図である。
【図39】 32P標識3″glaA非コーディングフラグメントでプローブされたA.ニガー CBS 513.88 (レーン10)、GBA-107 (レーン9)、GBA-119 (レーン8)及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-119株: #AG5-7 (= GBA-120)(レーン5)、 #AG5-5 (= GBA-121)(レーン6)及び #AG5-6 (レーン7);GBA-122 (レーン4)及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-122株: #AG9-1 (= GBA-123)(レーン3)、 #AG9-2 (レーン2)及び #AG9-4 (= GBA-124)(レーン1)のBglII消化物のオートラジオグラフである。
【図40】 32P標識3″glaA非コーディングフラグメントでプローブされたA.ニガー CBS 513.88 (レーン10)、GBA-107 (レーン9)、GBA-119 (レーン8)及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-119株: #AG5-7 (= GBA-120)(レーン5)、 #AG5-5 (= GBA-121)(レーン6)及び #AG5-6 (レーン6); GBA-122(レーン4)及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-122株: #AG9-1 (= GBA-123)(レーン3)、 #AG9-2 (レーン2)及び #AG9-4 (= GBA-124)(レーン1)のKpnI消化物のオートラジオグラフである。
【図41】pGBGLA50の構築経路の模式図である。
【図42】pGBGLA53の構築経路の模式図である。
【図43】pGBGLA53の構築経路の模式図である。
【図44】pGBGLA53の構築経路の模式図である。
【図45】pGBGLA53の構築経路の模式図である。
【図46】pGBGLA53の構築経路の模式図である。
【図47】pGBGLA53の構築経路の模式図である。
【図48】pGBGLA53の構築経路の模式図である。
【図49】pGBamdS1の構築経路の模式図である。
【図50】pGBamdS2の構築経路の模式図である。
【図51】pGBamdS3の構築経路の模式図である。
【図52】pGBamdS5の構築経路の模式図である。
【図53】pGBamdS6の構築経路の模式図である。
【図54】pGBamdS6構築で用いたpPTLAC4構築の模式図である。
【図55】pGBamdS7構築の模式図である。
【図56】 32P標識LAC4プロモーターフラグメントでプローブされたK.ラクチス(K.lactis) CBS 683(レーン1)、K.ラクチス CBS 2360 (レーン2)、K.ラクチス CBS 683/pGBamdS1形質転換細胞 KAM-1(レーン3)、K.ラクチス CBS 2360 /pGBamdS1形質転換細胞 KAM-2(レーン4)及びフルオロアセトアミド選択後の KAM-1株(レーン5、6)のHindIII消化物のオートラジオグラフである。
【図57】 32P標識LAC4ターミネーターフラグメントでプローブされたK.ラクチス CBS 683/pGBamdS3形質転換細胞(レーン1−3)のBamHI消化物のオートラジオグラフである。
【図58】 32P標識LAC4ターミネーターフラグメントでプローブされたK.ラクチス CBS 683/pGBamdS5形質転換細胞(レーン1−5)及び宿主株K.ラクチス CBS 683(レーン6)のBamHI消化物のオートラジオグラフである。
【図59】 32P標識amdSフラグメントでプローブされたS.セレビシエ(S.cerevisiae) D273-10B (レーン1)及びS.セレビシエ D273-10B /pGBamdS5形質転換細胞(レーン2−8)のBamHI消化物のオートラジオグラフである。
【図60】 32P標識LAC4ターミネーターフラグメントでプローブされたK.ラクチス CBS 2360 (レーン1)、K.ラクチス CBS 2360 /pGBamdS6形質転換細胞(レーン6)及びフルオロアセトアミド選択後のK.ラクチス CBS 2360 /pGBamdS6形質転換細胞由来株のBamHI消化物のオートラジオグラフである。
【図61】バシラス(Bacillus)プラスミドpBHA1の制限地図である。
【図62】バシラスプラスミドpLNFの制限地図である。
【図63】pGBamdS21構築の模式図である。
【図64】pGBamdS22構築の模式図である。
【図65】pGBamdS23構築の模式図である。
【図66】pGBamdS25構築の模式図である。
【図67】pGBamdS41構築の模式図である。
Claims (8)
- 選択マーカー遺伝子を含まない糸状菌の作製方法であって、下記段階を含む上記方法:a)菌株のゲノムに所望のDNAフラグメント並びに優性及び二方向選択マーカー遺伝子を組込む、b)形質転換細胞を選択する、c)選択マーカー遺伝子に隣接する反復配列間の組換えにより選択マーカー遺伝子を欠失する、d)選択マーカー遺伝子が存在しないことに基いて逆選択する。
- 選択マーカー遺伝子の両側で反復配列をクローン化することを特徴とする、請求項2記載の作製方法。
- 選択マーカー遺伝子配列の5’又は3’配列をクローン化して、ゲノムから欠失されるべき配列の3’又は5’配列により反復配列を形成することを特徴とする請求項1記載の方法。
- 所望のDNAフラグメントが次の遺伝要素:遺伝子、cDNA、プロモーター、ターミネーター、調節要素、イントロン、DNA結合タンパク質の認識配列、翻訳開始部位又は制限部位、その一部、修飾型又は組合わせのいずれか1種を含む請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1に記載の段階a)〜d)が、請求項4記載の同一か又は異なる所望のDNAフラグメントを用いて、得られた組換え体株上で反復される請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 選択マーカー遺伝子がアセトアミダーゼ遺伝子である請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 選択マーカー遺伝子が真菌由来のアセトアミダーゼ遺伝子である請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 選択マーカー遺伝子がアスペルギルス種由来のアセトアミダーゼ遺伝子である請求項7記載の方法。
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