FI114481B - Valintamerkkigeenittömät rihmasienikannat, menetelmä niiden valmistamiseksi, ja näiden kantojen käyttö - Google Patents

Description

114481

Valintamerkkigeenittömät rihmasienikannat, menetelmä niiden valmistamiseksi ja näiden kantojen käyttö - Selek-tionsmarkörgenfria trädformiga svampstammar, förfarande för deras framställning och användning av dessa stammar 5 Tämä keksintö koskee valintamerkkigeenistä vapaita rihma-sienikantoja, menetelmää näiden kantojen aikaansaamiseksi ja näiden kantojen käyttöä. Tämän keksinnön mukaista 10 menetelmää käytetään myös rihmasienikantojen paranteluun.

Yhdistelmä-DNA-tekniikan käyttöä koskeva yhteiskunnallinen kiinnostus on kasvamassa. Yksi lupaavista yhdistel-15 mä-DNA-tekniikan käyttösovellutuksista koskee kantojen parantelua. Fermentatiivisten tuotantoprosessien varhaisajoista lähtien tuotantoon käytettävien kantojen tuottavuuden parantamiseen on ollut tarvetta.

i 20 Klassiset kantojen parannusohjelmat teollisuuden käytössä olevien mikro-organismien osalta ovat perustuneet pääasiallisesti sattumanvaraisiin mutatointeihin, joita on seurannut valikointi. Mutatointimenetelmiä on kuvailtu : ' laajasti; niitä ovat UV-valon, NTG:n tai EMS:n käyttö 25 mutageeneina. Näitä menetelmiä on kuvailtu laajasti esi-merkiksi julkaisussa: "Biotechnology: a comprehensive treatise in 8 voi." Volyymi I, Microbial fundamentals, • ; Luku 5b, Verlag Chemie Gmbh, Weinheim, Saksa.

*> 3 0 Valintamenetelmät on kehitetty yleensä sopivan määrityk sen ympärille ja niiden tärkein merkitys koskee villityy-pin kantojen ja mutanttikantojen välistä erottamista.

On käynyt ilmi, että näiden perinteisten menetelmien 35 käyttömahdollisuudet ovat rajoitetut kantojen parantamis-ta varten. Kantojen parantelun perättäiset jaksot vähen-,,‘* tävät haluttujen tuotteiden saantoja. Tämä johtuu ainakin : ·.: osaksi käytettyjen mutatointimenetelmien sattumanvarai sesta luonteesta. Paitsi haluttuja mutaatioita, nämä me- 2 1 1 4481 netelxnät synnyttävät myös mutaatioita, jotka ovat epäedullisia, ja jotka voivat vaikuttaa negatiivisesti kantojen muihin ominaisuuksiin.

5 Näiden haittojen valossa voidaan ymmärtää, että yhdistel-mä-DNA-menetelmien käyttämistä tervehdittiin huomattavana parannuksena. Kantojenparannusohjelmissa käytetyt yhdiste lmä-DNA-menetelmät tähtäävät yleensä haluttujen geeni-tuotteiden lisääntyneeseen ilmentymiseen.

10

Geenituotteet voivat olla proteiineja, jotka itsessään ovat kiinnostuksen kohteina, mutta toisaalta on myös mahdollista, että kooditetut geenituotteet toimivat säätely-proteiineina muiden tuotteiden synteesissä.

15

Kantoja voidaan parantaa toimittamalla moninkertainen määrä kopioita haluttua proteiinia koodittavista geeneistä määrättyihin isäntäorganismeihin. On kuitenkin myös mahdollista lisätä ilmentymistasoja toimittamalla sääte-20 lygeenejä.

. Geenit viedään soluun käyttäen vektoreita, jotka toimivat :;V kuljettimina geenien toimittamiseksi. Sellaisia vektorei- ta voivat olla plasmidit, kosmidit tai faagit. Vektorin 25 avulla voi olla mahdollista ilmentää geenejä, jossa ta-* ’.· pauksessa vektori on yleensä itsenäisesti replikoituva.

Vektori voi kuitenkin myös ainoastaan kyetä integraati-oon. Toinen vektorille tunnuomainen ominaisuus on se, että kun ekspressiotuotetta ei voida valikoida helposti, *. .*. 30 perustuen muuttuneisiin fenotyyppisiin ominaisuuksiin, vektori on varustettu markkerilla, joka voidaan helposti » · ♦ seuloa.

Vektoreita ei ole eristetty kaikista tunnetuista mikro-. ,·. 35 organismeista joko siksi, että organismissa ei ole voitu I > * havaita yhtään vektoria, tai koska muista organismeista 3 114481 saatavia vektoreita on voitu käyttää muutoksitta tai vähäisin muutoksin. Sama pätee valintamerkkigeeneihin.

Erityisten merkkigeenien laajalle levinnyt käyttö ja myö-5 hempi leviäminen on viime aikoina muodostunut kiistanalaiseksi. Tämä johtuu erityisesti siitä havainnosta, että antibioottien ja antibioottivalintamarkkereiden käyttö saa aikaan antibiooteille vastustuskykyisiksi tulleiden kantojen ei-toivotun leviämisen. Tämän takia on 10 välttämätöntä kehittää jatkuvasti uusia yhä tehokkaampia antibioottej a.

Ei sen vuoksi ole yllättävää, että suurimittaisessa tuotannossa pyritään yleisesti käyttämään yhdistelmämikro-15 organismeja, jotka eivät sisällä antibioottiresistenssi-geenejä, ja vielä yleisemmin sisältävät niin vähän kuin mahdollista vierasta DNA:ta.

Transformoitu mikro-organismi sisältäisi edullisesti vain 20 halutun geenin (geenit), sen fragmentin (fragmentteja) tai modifikaatioita geenissä ja niin vähän kuin mahdol-, lista tai ei lainkaan jäänteitä kloonaukseen käytetystä :. DNArSta.

···: 25 Tässä keksinnössä tuodaan esille valintamerkkigeeni, joka : voidaan edelleen helposti poistaa yhdistelmärihma- sienestä. Mainitun merkkigeenin deleetio perustuu val-: : litsevaan valikointiin.

·’:· 30 Markkeria käytetään niinkin vaihtelevissa ryhmissä kuin bakteereissa, rihmasienissä ja hiivoissa.

: Tässä yhteydessä käytettyjen vaiintamarkkereiden edulli nen aktiivisuus perustuu seuraavaan kaksivaiheeseen toi-35 mintamalliin: 4 114481 a) geeni integroidaan isäntäorganismin genomiin ja yhdis-telmäsolut valikoidaan, b) transformoituja soluja kasvatetaan substraatilla, jon-5 ka merkkigeenin koodittama aktiivisuus muuttaa tuotteeksi, joka on solulle letaali.

I Valikoidut solut ovat yhdistelmäsoluja ja niistä puuttuu I valintamerkkigeeni.

10

Yleisesti ottaen tässä keksinnössä tuodaan esiin rihmasienisoluja, joiden genomissa on modifikaatio, jolle on tunnusomaista se, että muutos toimitetaan käyttäen amdS-geeniä tai siitä saatua cDNArta.

15

Esimerkki valintamerkkigeenistä, jota voidaan käyttää tällä tavalla, on asetamidaasigeeni. Tämä geeni on edullisesti saatavissa rihmasienistä, edullisemmin Aspergil-luksista, edullisimmin Aspergillus nidulansista.

20

Keksinnössä esitetään lisäksi haluttujen heterologisten , tai homologisten geenien tai DNA-osien toimittaminen, ; poistaminen tai modifiointi valituissa rihmasieni- isännissä käyttäen asetamidaasi(amdS)geeniä markkerina.

25 amdS-geeni poistetaan myöhemmin. amdS-geeni ja halutut • · · • ’/ geenit toimitetaan edullisesti paikkaspesifisesti.

• « · ·

Keksinnön mukaisesti esitetään vektori, joka sisältää: 30 a) halutun DNA-fragmentin, joka on määrä toimittaa ,>*·, rihmasienen genomiin, » ; : b) valinnaisesti DNA-sekvenssin, joka mahdollistaa vekto- ,,/ rin integroitumisen (paikkaspesifisesti) isäntäkannan 35 genomiin, 5 114481 c) asetamidaasia koodittavan geenin (esim. amdS-geenin A. nidulansista) DNA-toistojaksojen välissä.

Keksinnössä esitetään lisäksi mainitulla vektorilla 5 transformoituja rihmasieniä.

Keksinnössä esitetään lisäksi valintamerkkigeenivapaita yhdistelmärihmasieniä.

10 Keksinnössä esitetään erityisesti rihmasieniä, jotka sisältävät paikkaspesifisesti toimitettuja geenejä, joissa ei enää ole läsnä vierasta lisä-DNA:ta. Menetelmä sopii sen vuoksi myös isäntägenomin toistuville modifikaatiolle, esim. moninkertaisten geenikopioiden perättäiseen 15 toimittamiseen ennalta määrättyihin lokuksiin.

Keksintö koskee menetelmää valintamerkkigeenivapaiden rihmasienikantojen aikaansaamiseksi, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 20 a) halutun DNA-fragmentin ja valintamarkkerin integrointi kannan genomiin, b) rekombinanttien valikointi, ,,Τ 25 | T c) valintamarkkerin poistaminen käyttäen edullisesti si- ·;· säistä rekombinaatiota valintamarkkeria vierustavien • · « · ·/·’; toistojaksojen välillä, 30 d) vasta-valinta, joka perustuu valintamarkkerin puuttu-'T mi seen.

T · Vaikka tämä on edullinen menetelmä valintamerkkigeeniva- paan rihmasienikannan aikaansaamiseksi, keksintö koskee 35 myös tämän menetelmän modifikaatioita, esimerkiksi: Ha-Τ'. luttu DNA-fragmentti ja valintamarkkeri voivat olla läsnä ‘ ‘ kahdessa eri DNA-molekyylissä, jotka yhteistransformoi- 6 114481 daan. Valintamarkkeri ei välttämättä integroidu kannan genomiin vaan se voi olla läsnä episomaalisessa DNA-mole-kyylissä, joka voidaan parantaa (poistaa).

5 Tämän keksinnön mukaisesti kuvaillaan edelleen, että tämä merkkigeeni voidaan poistaa transformoitujen rihmasienien genomista jättämättä jäänteitä, so. kloonaukseen käytettyä DNA:ta.

10 Tässä keksinnössä tuodaan esille Aspergilluksen amdS-gee-nin käyttäminen merkkigeeninä.

Keksinnössä esitetään myös amdS-geenin käyttö halutun geenin poistamiseksi rihmasienen kromosomista.

15 Erityissuoritusmuodoissa käytetään seuraavien ryhmien kantoja: Aspergillus, Trichoderma ja Penicillium.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä koskee rihmasienikan-toja, jotka sisältävät genomisia modifikaatioita, jotka 20 on saatu aikaan toistamalla menettely samalla vektorilla tai muilla vektoreilla.

Kuvioissa käytetyt lyhenteet: '’· Restriktioentsyymit ja restriktiokohdat: 25 A = Apal; Ba = BamHI; B = Bglll; Bs = BssHII; E = EcoRI ;

: V H = Hindin; K = Kpnl; Nd = Ndel; N = NotI; Ps = PstI; P

111· = PvuII; Sa = Sali; Sc = Seal; S = Smal; Sn = SnaBI; Spe = Spel; Sp = Sphl; Ss = Sstll; Xb = Xbal; X = XhoI.

30 Muita: T. = LAC4-terminaattorisekvenssi ( I * :·’· ‘ Kuvio 1: esittää plasmidin pamdS-1 restriktiokarttaa.

‘.,.1 Tämä plasmidi sisältää A. nidulansin amdS-geenin cDNA-.n.

35 7 114481

Kuvio 2: esittää kaavamaisesti glaA-lokuksen merkki-geenivapaan deleetion A. nigeristä käytettäessä geenin vaihtovektoria pGBDEL4L. Olennainen osa geenin vaihtovek-torista pGBDEL4L sisältää amdS-geenin gpdA-promoottorin 5 ohjauksessa, kloonattuna toistojaksojen väliin (glaA-gee-nin 3'-ei-koodittava alue).

Kuviot 3-9: esittävät kaavamaisesti pGBDEL4L:n konstru-ointireittiä, jota esitellään edelleen esimerkissä 1.

10

Kuvio 10: A. Kpnl-pilkontatuotteet pGBDEL4L-transformanteista #41 (kaista 1), #24 (kaista 2), #23 (kaista 3) ja #19 (kaista 4) ja isäntäkannasta A. niger CBS 513.88 (kaista 5), ja 15 BamHI-pilkontatuotteet pGBDEL4L-transformanteista #41 (kaista 6), #24 (kaista 7), #23 (kaista 8), #19 (kaista 9) ja isäntäkannasta A. niger CBS 513.88 (kaista 10), tutkittuina 32P-leimatun glaA-promoottorifragmentin ja ksylanaasikoettimen kanssa.

20 B. Kpnl-pilkontatuotteet GBA-102:sta (kaista l) ja GBA- 102-kannoista fluoriasetamidivalikoinnin jälkeen: GBA-107 (kaista 2) ja GBA-108 (kaista 3), ja BamHI-pilkontatuot-: : : teet GBA-102:sta (kaista 4) ja GBA-102-kannoista fluo- riasetamidivalikoinnin jälkeen: GBA-107 (kaista 5) ja » * *j. 25 GBA-108 (kaista 6) , tutkittuina 32P-leimatun glaA-promoot- ;·.·. torifragmentin ja ksylanaasikoettimen kanssa.

Kuvio 11: I t · • · · A. Kaavamainen esitys villityypin glaA-lokuksen BamHI- ja 30 Kpnl-fragmenttien pituuksista Aspergillus nigerissä CBS •;j : 513.88.

’.* * B. Kaavamainen esitys typistetyn glaA-lokuksen BamHI- ja *,··*· Kpnl-fragmenttien pituuksista transformantissa #19 (= . ·*. GBA-102) .

·. 35 C. Kaaviomainen esitys typistetyn glaA-lokuksen BamHI- ja

Kpnl-fragmenttien pituuksista GBA-102-transformanteissa • » M f ‘ * amdS-geenin poistamisen jälkeen (=GBA-107 ja GBA-108).

s 114481

Kuvio 12: A. esittää kaavamaisesti qlaA-geenin integroitumisen A. niaer GBA-107:n typistetyn glaA-lokuksen 3'-ei-kooditta-vaan alueeseen.

5 B. esittää sisäisen rekombinaation tuloksen 3'alaA-tois-tojaksojen välillä, jotka ovat amdS-geenin vieressä.

Kuviot 13-24: esittävät kaavamaisesti integraatiovektorin pGBGLA30 konstruointireittiä, jota esitellään edelleen 10 esimerkissä 2.

Kuvio 25: Bglll-pilkontatuotteet pGBGLA30-transforman-teista #107-9 (kaista 1), #107-7 (kaista 2) ja #107-5 (kaista 3), isäntäkannasta A. niger GBA-107 (kaista 4) ja 15 parentaalikannasta A. niger CBS 513.88 (kaista 5), ja

Kpnl-pilkontatuotteet pGBGLA30-transformanteista #107-9 (kaista 6), #107-7 (kaista 7) ja #107-5 (kaista 8), isäntäkannasta A. niger GBA-107 (kaista 9) ja parentaalikannasta A. niger CBS 513.88 (kaista 10), tutkittuina 32P-20 leimatun glaA-fragmentin kanssa.

Kuvio 26: ft- | A: Kaavamainen esitys Aspergillus niger CBS 513.88:n vil- : lityypin glaA-lokuksen Kpnl- ja Bglll-fragmenttien pi- •j· 25 tuuksista.

B. Kaavamainen esitys Aspergillus niger GBA-107:n typis-tetyn glaA-lokuksen Kpnl- ja Bqlll-fraqmenttien pi-tuuksista.

i t i C: Kaavamainen esitys typistetyn glaA-lokuksen Kpnl- ja , , 30 Bglll-fragmenttien pituuksista, yhden pGBGLA30-kopion oi- : lessa integroitunut glaA:n 3 '-ei-koodittavaan alueeseen '·’ ’ kuten transformanteissa #107-5 (= GBA-119) ja #107-9 (= GBA-122) .

D: Kaavamainen esitys typistetyn glaA-lokuksen Kpnl- ja • 35 BglII-fragmenttien pituuksista GBA-119-transformantissa * » ♦ ’·!·' ja GBA-122-transformantissa amdS-geenin poistamisen jäl- : ‘ keen (= GBA-120, GBA-121, GBA-123 ja GBA-124).

9 114481

Kuvio 27: A: ΒσΙΙΙ-pilkontatuotteet A. niaer CBS 513.88 -kannasta (kaista 10), GBA-107-kannasta (kaista 9), GBA-119-kannas-ta (kaista 8) ja GBA-119-kannoista fluoriasetamidivali-5 koinnin jälkeen: #AG5-7 (= GBA-120) (kaista 5), #AG5-5 ( = GBA-121) (kaista 6) ja #AG5-6 (kaista 7); GBA-122-kannas-ta (kaista 4) ja GBA-122-kannasta fluoriasetamidivali-koinnin jälkeen: #AG-9-l (= GBA-123) (kaista 3), #AG-9-2) (kaista 2) ja #AG9-4 (= GBA-124) (kaista 1)., tutkittuina 10 32P-leimatun ei-koodittavan 3'1 glaA-fragmentin kanssa.

B: KpnI-pilkontatuotteet A. niaer CBS 513.88 -kannasta (kaista 10), GBA-107-kannasta (kaista 9), GBA-119-kannas-ta (kaista 8) ja GBA-119-kannasta fluoriasetamidivali-koinnin jälkeen: #AG5-7 (= GBA-120) (kaista 5), #AG5-5 (= 15 GBA-121) (kaista 6) ja #AG5-6 (kaista 7); GBA-122-kannas ta (kaista 4) ja GBA-122-kannasta fluoriasetamidivali-koinnin jälkeen: #AG9-1 (= GBA-123) (kaista 3), #AG9-2 (kaista 2) ja #AG9-4 (= GBA-124) (kaista 1), tutkittuina 32P-leimatun ei-koodittavan 3'1 glaA-fragment in kanssa.

20

Kuvio 28: esittää kaavamaisesti pGBGLA50:n konstruointi-reitin.

;Y: Kuviot 29-33: esittävät kaavamaisesti pGBGLA53:n konstru- 25 ointireitin.

t · ,·, Kuvio 34: esittää kaavamaisesti pGBamdSl:n konstruoinnin.

* Kuvio 35: esittää kaavamaisesti pGBamdS2:n konstruoinnin.

30 · Kuvio 36: esittää kaavamaisesti pGBamdS3:n konstruoinnin.

* # · ;··) Kuvio 37: esittää kaavamaisesti pGBamdS5:n konstruoinnin.

35 Kuvio 38: esittää kaavamaisesti pGBamdS6:n konstruoinnin.

10 114481

Kuvio 39: esittää kaavamaisesti pPTLAC4:n konstruoinnin, jota käytettiin pGBamdS6:n konstruoinnissa.

Kuvio 40: esittää kaavamaisesti pGBamdS7:n konstruoinnin.

5

Kuvio 41: Hindlll-pilkontatuotteet K. lactis CBS 683:sta (kaista 1), K. lactis CBS 2360:stä (kaista 2), K. lactis CBS 683/pGBamdSl -transformantista KAM-1 (kaista 3), K. lactis CBS 2360/pGBamdSl -transformantista KAM-2 (kaista 10 4) ja KAM-l-kannoista fluoriasetamidivalikoinnin jälkeen (kaista 5,6), tutkittuina 32P-leimatun LAC4-promoottori-fragmentin kanssa.

Kuvio 42: A: BamHI-pilkontatuotteet K. lactis CBS 15 683/pGBamdS3 -transformanteista (kaistat 1-3), tutkittuina 32P-leimatun LAC4-terminaattorifragmentin kanssa.

B: BamHI-pilkontatuotteet K. lactis CBS 683/pGBamdS5 -transformanteista (kaistat 1-5) ja isäntäkannasta K. lactis CBS 683 (kaista 6) , tutkittuina 32P-leimatun LAC4-ter-20 minaattorifragmentin kanssa.

Kuvio 43: BamHI-pilkontatuotteet S. cerevisiae D273-l : 10B:stä (kaista 1) ja S. cerevisiae D273-10B/pGBamdS5 - V: transformanteista (kaistat 2-8) , tutkittuina 32P-leimatun • j. 25 amdS-fragmentin kanssa.

• · • · • ·

Kuvio 44: Hindlll-pilkontatuotteet K. lactis CBS 2360:stä ,!! (kaista 1), K. lactis CBS 2360/pGBamdS6 -transformanteis- » f ' ta (kaista 6) ja K. lactis CBS 2360/pGBamdS6 -transfor- 30 mäntin kannoista fluoriasetamidivalikoinnin jälkeen (kaistat 2-5), tutkittuina 32P-leimatun LAC4-terminaatto- > 4 · v * rifragmentin kanssa.

*

:· · « i I

,*··. Kuvio 45: Bacillus-plasmidin pBHAl restriktiokartta.

Kuvio 46: Bacillus-plasmidin pLNF restriktiokartta.

35 11 114481

Kuvio 47: esittää kaavamaisesti pGBamdS21:n konstruoinnin .

Kuvio 48: esittää kaavamaisesti pGBamdS22:n konstruoin-5 nin.

Kuvio 49: esittää kaavamaisesti pGBamdS23:n konstruoinnin.

10 Kuvio 50: esittää kaavamaisesti pGBamdS25:n konstruoinnin.

Kuvio 51: esittää kaavamaisesti pGBamdS41:n konstruoinnin.

15 Tässä keksinnössä esitellään markkerin käyttö transformoitujen rihmasienikantojen valikoinnissa. Valintamerkki-geeniä voidaan käyttää episomaalisen DNA-vektorin yhteydessä. Tämän keksinnön mukaisesti merkkigeeni on kui-20 tenkin edullisesti integroitunut rihmasienikannan genomiin. Hyöty tämän keksinnön mukaisesta valintamark-kerista on siinä, että se on ei-antibioottinen dominoiva valintamarkkeri. Toinen hyöty tämän keksinnön mukaisesta '*' valintamarkkeri st a on siinä, että se voidaan helposti 25 poistaa transformoidusta rihmasienestä. Markkerin i * · • *.· deleetio perustuu dominoivaan valikointiin. Sellaisenaan tt||* tämän keksinnön mukainen valintamarkkeri on dominoiva ja kaksisuuntainen valintamarkkeri. Tietämän mukaan se on ainoa saatavissa oleva valintamarkkeri, joka on 30 kaksisuuntainen ja dominoiva molempiin suuntiin.

·’ Tässä kuvauksessa käytetään ilmausta 1valintamerkkigee- : ni 1 . Tällä ilmauksella tarkoitetaan merkkiproteiinia koo- dittavaa DNA:ta toiminnallisessa muodossa katsomatta si- 35 tä, onko se varsinainen geeni vai siitä saatu cDNA. Gee- ; niä tai cDNA:ta käytetään isäntäorganismista ja odote- > » » tuista silmukointiongelmista riippuen.

12 114481 Tämän keksinnön mukaisesti käytetään ilmausta 'vektori1. Tällä tarkoitetaan mitä tahansa DNA-molekyyliä, joka voidaan toimittaa valittuun rihmasieni-isäntään riippumatta 5 siitä, integroituuko vektori isäntäsolun genomiin vai pysyykö se episomaalisena. Vektori sisältää valikoitavan merkkigeenin, joka on toiminnallinen valitussa isännässä, tai se voidaan yhteistransformoida toisen DNA-molekyylin kanssa, joka sisältää sellaisen valintamerkkigeenin.

10 Tämän keksinnön mukaisesti käytetään ilmausta 'halutut heterologiset tai homologiset geenit tai DNA-fragmentit'. Tällä tarkoitetaan DNA-fragmenttia, joka voidaan saada isäntäkannasta tai toisesta lajista tai kannasta. Haluttu 15 DNA-fragmentti voi sisältää minkä tahansa geneettisen tekijän, sen osia tai yhdistelmiä, kuten geenin (koodi-tusosan tai kokonaisen lokuksen), cDNA:n, promoottorin, terminaattorin, intronin, signaalisekvenssin, minkä tahansa säätelevän DNA-sekvenssin tai DNA:ta sitovien pro-20 teiinien tunnistussekvenssin. Fragmentti voi myös käsittää DNA-sekvenssin, jota on modifioitu, so. se sisältää yhden tai useamman nukleotidimuutoksen (esim. insertioi- - ‘ ta, deleetioita, substituutioita).

* » 25 Tässä kuvauksessa käytetään edelleen ilmausta 'toimitta- *» » : ’ minen' (geeniä koskeva toimenpide), koskien haluttua gee- :* niä tai DNA-fragmenttia. Tällä tarkoitetaan haluttujen DNA-sekvenssien insertiota, deleetiota tai substituutiota valitussa isäntäsolussa.

30 Tämän keksinnön mukaisesti käytetty ilmaus 'geneettinen T modifikaatio' tarkoittaa mitä tahansa DNA-sekvenssimodi- :,· · fikaatiota valitussa rihmasienisolussa, joka on seuraus • i · !tiii siitä, että toimitetaan jokin edellä mainituista 35 halutuista DNA-fragmenteista isäntäsoluun, edullisesti ’!''. transformaation tai yhteistransformaation avulla.

» ·. t

» I

13 1 1 4481

Kaikki nämä geneettiset modifikaatiot voidaan yleisesti suorittaa käyttäen tämän keksinnön mukaista menetelmää, johon liittyy valintamerkkigeenin poistaminen myöhemmin.

Sen seikan ansiosta, että rihmasienikanta, joka sisältää 5 sellaisen geneettisen modifikaation, ei sisällä valinta-merkkigeeniä, tämän keksinnön mukainen menettely voidaan toistaa niin, että edellä esitetyt modifikaatiot voidaan yhdistää rihmasienikannassa. Lopuksi, tämän keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää toistuvasti siihen 10 pisteeseen saakka kunnes saavutetaan rihmasienikanta, josta kaikki ei-toivotut aktiivisuudet on poistettu vastaavien geneettisten tekijöiden deleetion tai inaktivaa-tion kautta, ja joka sisältää halutut aktiivisuudet halutuissa tasoissa, vastaavien haluttujen DNA-fragmenttien 15 perättäisen toimittamisen kautta haluttuina kopiomäärinä ja edullisesti halutuissa ja määrätyissä lokuksissa.

A. nidulansin asetamidaasigeeni (amdS) mahdollistaa A. nidulansin kasvun asetamidi ainoana N-lähteenä. Mikro-20 organismeilla, joilta puuttuu mahdollisuus, tai joilla on vain hyvin rajallinen kyky käyttää asetamidia ainoana N-lähteenä, asetamidaasigeeniä voidaan käyttää periaattees-: sa valintamarkkerina edellyttäen, että solut ottavat ase tamidia vastaan. amdS-geeniä on onnistuneesti käytetty 25 merkkigeeninä Aspergilluksissa (Kelly ja Hynes (1985) EMBO J. 4_, 475-479; Christensen et ai., (1988) Bio/Tech- ··· nology 6, 1419-1422) , Penici 11 jumeissa (Beri ja Turner * « * (1987) Curr. Genet. 11, 639-641) ja Trichodermissa (Penttilä et ai., (1987) Gene 61, 155-164).

30 Γ. Tässä tuodaan ensimmäistä kertaa esille A. nidulansin ;· amdS-geenin käyttö valintamarkkerina muissa organismeissa ; | kuin rihmasienissä. Tämän valintamarkkerin käyttö esitetään bakteereissa ja hiivoissa. Käyttö osoitetaan 35 erityisesti S. cerevisiaessa, K. lactiksessa, B.

subtiliksessa, B. licheniformiksessa ja E. colissa. Otta-' ' maila huomioon valintamarkkerin esiintuotu käyttökelpoi- 14 114481 suus lajeissa, jotka ovat niinkin erilaisia kuin sienet, hiivat ja bakteerit, on odotettavissa, että markkeri voi olla käyttökelpoinen myös muissa näihin ryhmiin kuuluvissa lajeissa. Tämän markkerin käyttö ei sen vuoksi ole 5 rajoittunut esille tuotuihin lajeihin.

A. nidulansin amdS-geeni pystyy muuttamaan asetamidin ammoniakiksi ja etikkahapoksi. Tämä ominaisuus mahdollistaa A. nidulansin kasvun alustalla, joka sisältää asetamidia 10 ainoana N-lähteenä tai C-lähteenä.

Toinen amdS-geenin ominaisuus on se, että se kykenee myös muuttamaan fluoriasetamidin ammoniakiksi ja fluorietikka-hapoksi. Fluorietikkahappo on kuitenkin myrkyllinen so-15 luille. Tämä ominaisuus muodostaa perustan tämän keksinnön mukaiselle näkökohdalle, so. merkkigeenivapaiden rihmasienikantojen muodostamiselle. Fluoriasetamidin muuntava ominaisuus mahdollistaa transformoitujen solujen vastavalikoimisen. amdS-geeni toimitetaan isäntäkantaan 20 ja integroidaan genomiin homologisen rekombinaation avulla. Transformoidut kannat valikoidaan alustalla, joka sisältää asetamidia ainoana N-lähteenä. Valikoituja i : kantoja kasvatetaan sen jälkeen alustalla, joka sisältää .V fluoriasetamidia ja ureaa (tai muita, edullisesti määrät- 25 tyjä N-lähteitä) ainoina N-lähteinä. Eloonjääneet kannat :'·‘; sisältävät amdS-geeni-deleetion.

.'1'. Tämän keksinnön mukaisesti käytetään A. nidulansin amdS- geeniä asetamidaasimerkkigeeninä. Asiaankuuluvat ominai-30 suudet, jotka A. nidulansin amdS-geenin koodittama aseta-midaasi saa aikaan, so. kyky hydrolysoida asetamidi am-’;· moniakiksi ja asetaatiksi samoin kuin kyky vapauttaa ‘ fluorietikkahappoa fluoriasetamidista, voidaan saada ai- Γ kaan myös muiden lähteiden asetamidaasien avulla. Aseta- 3 5 midaasimerkkigeenin käyttö ei sen vuoksi ole rajoittunut A. nidulansin amdS-geeniin vaan käsittää minkä tahansa f ! t 15 114481 DNA-sekvenssin, joka koodittaa toiminnallista asetamidaa-sia.

Markkerideleetion esiintymistiheys lisääntyy huomattavas-5 ti, kun lisätään geenin kapasiteettia kromosominsisäiseen homologiseen rekombinaatioon. Tämän saavuttamiseksi amdS-geeni sijoitetaan edullisesti DNA-toistojaksojen väliin.

Nämä toistojaksot eivät välttämättä ole kumpikin läsnä vektorissa vaan ne voidaan myös saada aikaan yksinkertai-10 sen tekijäinvaihduntaintegraation avulla. Vaihtoehtoisesti voidaan jättää pois vierustavat toistojaksot ja nojautua muihin mekanismeihin merkkigeenin poistamiseksi tai inaktivoimiseksi. Siinä tapauksessa tulokset voivat kuitenkin olla vähemmän ennustettavissa eivätkä ehkä johda 15 merkkigeenin poistumiseen vaan pelkästään sen inaktivoi-tumiseen.

Vektori voidaan konstruoida sillä tavalla, että merkki-geenin poistamisen jälkeen isäntäkannan kromosomiin ei 20 jää ylimääräistä vierasta DNA:ta (kiinnostuksen kohteena olevaa DNA:ta lukuunottamatta). Keksinnön mukaisesti tuodaan esille vektori, joka sisältää: » » *.· i a) halutun DNA-fragmentin toimitettavaksi rihmasienen I 4 V,· genomiin, :· 25 r » i * b) valinnaisesti DNA-sekvenssin, joka mahdollistaa vekto- • · >·· rin integroitumisen (paikkaspesifisesti) rihmasienikannan lii* genomiin, 30 c) geenin, joka koodittaa asetamidaasia (esim. A. nidu-lansin amdS-geenin), DNA-toistojaksojen välissä.

! Samanlaisia tuloksia voidaan saavuttaa, kun isäntä- : genomiin toimitettavaksi tarkoitettu DNA-fragmentti ja 35 valikoitava merkkigeeni (esim. asetamidaasigeeni) ovat ; läsnä kahdessa eri DNA-molekyylissä, jotka yhteistrans- formoidaan, jossa tapauksessa valikoitavan markkerin si- 16 114481 sältävä DNA-molekyyli ei välttämättä integroidu isäntä-genomiin vaan se voi olla läsnä episomaalisessa DNA-mole-kyylissä, joka voidaan parantaa (poistaa).

5 Sekvenssejä, joita käytetään kohdassa b) mainittuun integraatioon, käytetään, jos halutaan paikkaspesifinen (tai paremminkin lokusspesifinen) integroituminen. Jos sellaista sekvenssiä ei ole läsnä, vektori voi siitä huolimatta integroitua genomiin. Tämä ei vaikuta kykyyn 10 poistaa valintamerkkigeeni.

Edellä kuvailtua dominoivaa vastavalikointia voidaan käyttää kehitettäessä teollisia tuotantokantoja eri tavoin. Dominoivan valintamarkkerin käyttö on erityisen 15 edullista kehitettäessä parannettuja tuotantokantoja, johtuen siitä, että nämä kannat ovat usein diploidisia tai polyploidisia.

amdS-geenin integrointiin käytetty vektori sisältää edul-20 lisesti toisen kiinnostavan geenin. Keksinnön mukaisesti on edelleen mahdollista toimittaa haluttuja vieraita tai : homologisia geenejä tai DNA-paloja valittuihin rihma- * t · V/ sieniin käyttäen amdS-geeniä markkerina. amdS-geeni * ; poistetaan myöhemmin. amdS-geeni ja halutut geenit tai 25 DNA-palat toimitetaan edullisesti paikkaspesifisesti, • ♦ · : ** minkä jälkeen amdS-geeni poistetaan.

• « · ♦ * » · * » » V ’ Keksinnön mukaisesti esitetään erityisesti rihmasieniä, jotka sisältävät paikkaspesifisesti toimitettuja geenejä ·; 30 ilman, että läsnä on lisäksi vierasta DNA:ta. Keksintöä sovelletaan halutun geenin tai DNA-palan moninkertaisten , *, kopioiden integrointiin ennaltamäärättyihin genomisiin ;; · lokuksiin.

·;· 35 Keksintö koskee menetelmää merkkigeenivapaiden rihma- sienikantojen valikoimiseksi, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 17 114481 - halutun geenin tai DNA-palan ja valintamarkkerin integroinnin homologisen rekombinaation avulla ekspres-siokasettiin liitettyjen sekvenssien ja isäntäkromosomis- 5 sa olevien sekvenssien välillä, - valikoinnin, käyttäen dominoivaa valinta merkkigeeniä, - valintamerkkigeenin poistamisen käyttäen valintamerkki-geenin viereisiä alueita, - valikoinnin, joka perustuu valintamerkkigeenin puuttu-10 miseen (vastavalikointi).

Tämän keksinnön mukaisesti osoitetaan lisäksi, että tämä merkkigeeni voidaan poistaa transformoitujen rihmasienien kromosomeista jäännöksiä jättämättä, so. kloonaukseen 15 käytettyä DNA:ta. Keksinnön mukaisesti osoitetaan lisäksi, että samankaltaisia ellei identtisiä tuloksia voidaan saada aikaan, kun haluttu geeni tai geenipala ja valinta-markkeri sijaitsevat kahdessa eri DNA-molekyylissä, jotka yhteistransformoidaan.

20

Keksinnön mukaisesti esitetään lisäksi amdS-geenin käyttö halutun geenin poistamiseksi rihmasienen kromosomista.

> I · i Edellä olevan valossa tämän keksinnön mukainen menetelmä I » · •j 25 sopii ihanteellisesti mutta ei rajoitu geenien kloonauk- • t • ·* seen ja ilmentämiseen, jotka koodittavat proteiineja, joita käytetään elintarvikesovellutuksissa, rehusovellu-v ’ tuksissa ja farmaseuttisten aineiden alalla, tai geenien, joita käytetään antibioottien ja muiden bioaktiivisten _;· 30 aineiden biosynteesissä, so. yhdistelmäproteiineja ja/tai isäntäorganismeja, joihin sovelletaan tiukkoja rekiste-. röintivaatimuksia.

’*·' Alalla tunnetaan hyvin esimerkkejä sellaisista proteii- ;· 35 neista ja niitä ovat kymosiini, fytaasi, ksylanaasit, ; : amylaasit, sellulaasit ja hemisellulaasit, sytokiinit ja muut farmaseuttiset proteiinit jne.

18 114481

Samaa menetelmää käytetään geenien poistamiseksi, jotka koodittavat proteiineja, jotka vaikuttavat haluttujen proteiinien tuotantotasoihin, jälleen jättämättä merkki-geeniä genomiin. Sellaisia proteiineja ovat proteaasit, 5 jotka hydrolysoivat aktiivisesti haluttuja tuotteita, jotka ilmentyvät runsaasti isäntäkannassa, ja joilla sen vuoksi on alentunut kyky tuottaa ja/tai erittää haluttuja proteiineja. Edullisessa menetelmässä tietyn geenin poistamiseksi käytettäisiin DNA-rakennetta, joka sisältää 10 seuraavat osat 5'-suunnasta 31-suuntaan mukaisessa järjestyksessä: sekvenssit poistettavan geenin 5'-puolella, liitettyinä suoraan sekvensseihin poistettavan geenin 31 -puolella, joiden alapuolella on toiminnallinen valinta-merkkigeeni (edullisesti asetamidaasigeeni), jonka ala-15 puolella on jälleen poistettavan geenin 3'-puoleisia sekvenssejä. Tässä tapauksessa molemmat poistettavan geenin 3'-puoleiset sekvenssit valitaan siten, että ne muodostavat toistojaksoja, jotka vierustavat valintamerkkigeeniä. Tämän DNA-rakenteen transformointi, ja sen jälkeen pois-20 tettavan geenin kromosomikopion vaihtaminen DNA-rakentee-seen, jossa on tekijäinvaihtokohdat poistettavan geenin 5'- ja 31-puoleisissa sekvensseissä, johtaa kyseisen gee-V nin deleetioon. Sen jälkeen kromosominsisäinen rekom- ‘ ; binaatio toistojaksojen välillä, jotka vierustavat valin- 25 tamerkkigeeniä, ja näiden rekombinanttien vastavalikoin-ti, johtavat lopulta valintamerkkigeenivapaaseen kantaan, josta tietty geeni puuttuu. Tällaiseen deleetioon käytet-V : ty DNA-rakenne voidaan konstruoida siten, että yhtään vierasta DNA:ta tai muita jäänteitä geneettisestä modifi-··· 30 kaatiosta ei ole jäljellä deleetion sisältävässä kannas- sa.

;; · Keksinnön mukaisesti tuodaan esille valintamerkkigeeniva- paita yhdistelmärihmasieniä. Sellaiset rihmasienet voivat 35 olla organismeja, jotka esille tuodun tekniikan • · käyttämisen jälkeen sisältävät ylimääräisen kopion halutusta geenistä (joko homologisen tai heterolo- 19 114481 gisen). Sellaiset rihmasienet voidaan transformoida yhä uudelleen käyttäen perättäisesti samaa tekniikkaa, jolla lisätään tai poistetaan lisäkopioita samasta tai muusta kiinnostavasta geenistä.

5

Rihmasienelle voi olla tunnusomaista myös se, että ne sisältävät (a) ennaltamäärätyn geenin poistettuna tai muutettuna jollain tavalla.

10 Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä on mahdollista hienosäätää haluttujen proteiinien tuotantoa. Tämä mahdollisuus perustuu helppouteen, jolla liittämis- ja poisto jakso ja voidaan toistuvasti suorittaa. Menetelmän avulla on mahdollista halutun geenikopiomäärän liittäminen 15 tai poistaminen. Proteiineja tuotetaan siten haluttuja määriä ja halutuissa suhteissa. Tämä on erityisen käyttökelpoista tuotettaessa proteiini- tai entsyymiseoksia.

Koska on tunnettua, että asetamidaasigeeni kykenee aseta- 20 midin konversioon ainoana N-lähteenä Aspergilluksessa, tässä osoitetaan, että asetamidaasigeeni on helposti poistettavissa transformoitujen Aspergillusten genomista.

Tämän aikaansaamiseksi amdS-geeni kloonataan identtisten (tai läheisesti toisiaan muistuttavien) toistojaksojen 25 väliin. Periaatteessa voidaan käyttää mitä tahansa ident- V tistä toistojaksoa, joka mahdollistaa sisäisen rekom- * binaation. Keksinnön mukaisissa esimerkeissä tämä osoite-: taan kloonaamalla amdS-geeni amyloglukosidaasin (glaA) ei-koodittavien 31-sekvenssien väliin.

• ;. 3 0

On osoitettu, että amdS-geeni voidaan integroida ja poistaa maljaamalla alustalle, joka sisältää fluoriasetamidia ·> · ja ureaa N-lähteinä.

i* 35 On lisäksi osoitettu, että amyloglukosidaasigeeni voidaan poistaa Aspergi1luksen genomista. Vaihtovektori konstruoidaan, joka sisältää osan glaA-promoottorista, synteet- 114481 20 tisen DNA-sekvenssin, joka sisältää lopetuskodonit jokaisessa kolmessa lukukehyksessä, amdS-geenin A. nidulansis-ta A. nidulansin glyseraldehydi-3-fosfaattidehydro-genaasipromoottorin ohjauksessa, ja jossa amdS-geenin 5 vieressä on alaA:n ei-koodittavia 31-sekvenssejä. A. nicer in transformoinnin jälkeen vektori integroidaan kaksinkertaisen tekijäinvaihdon avulla, korvaten siten tehokkaasti amyloglukosidaasigeeni. amdS-aktiivisuuden suhteen valikoinnin jälkeen transformoidut kannat maljataan 10 fluoriasetamidia ja ureaa sisältävälle maljalle. Vali kointi johti kantoihin, joista puuttui amdS-geeni.

Tämä esimerkki kuvaa mahdollisuutta käyttää amdS-qeeniä halutun geenin poistamiseksi Aspergillus-kannan genomis-15 ta. Muita geenejä voidaan eliminoida tai modifioida vastaavalla tavalla.

Lisäesimerkissä on osoitettu, että geeni voidaan liittää ilman markkeria ennalta määrättyyn kohtaan genomissa.

20 Integrointivektori konstruoidaan, joka sisältää A. nige- rin qlaA-lokuksen ja amdS-geenin, jonka vieressä on kaksi qlaA:n ei koodittavaa 3'-toistojaksoa.

• · « « » ♦

Rakenteen on osoitettu integroituvan amyloglukosidaasilo-*·* 25 kukseen. Fluoriasetamidivalikoinnin jälkeen amdS-geeni : *poistetaan. Tällä tavalla geenikopio integroidaan spesi- ··· fiseen lokukseen jättämättä markkeri-DNA:ta jäljelle.

* * · , · * »

Edellä olevasta käy ilmi, että tässä yhteydessä kuvaillut ; 30 menetelmät mahdollistavat alaa tuntevien integroida tai poistaa haluttuja geenejä ennalta määrättyjen lokusten > « * kohdalla jättämättä jäljelle valintamarkkeri-DNA:ta.

lit** Tätä menetelmää voidaan käyttää geenin monistamiseen ja 35 korvaamiseen.

( I · » · 21 114481

Erityisen tärkeä käyttösovellutus olisi haluttujen geenien integroiminen. Perinteisen kantojen parantamisen jälkeen, geenit, joihin voidaan haitallisesti vaikuttaa perinteisten kantojen parannusmenetelmien avulla, korvataan 5 kiinnostavan geenin tuoreilla luonnollisilla kopioilla menettämättä ilmentymistasoa.

Systeemin, jota on kuvailtu Aspergi1luksen kohdalla edellä, odotetaan antavan samoja tuloksia, jos käytetään 10 muita sienikantoja, joiden tiedetään olevan kykenemättömiä kasvamaan asetamidi ainoana N-lähteenä. amdS-geenin käyttöä valintamarkkerina on kuvailtu muiden muassa Peni-cilliumin ja Trichoderman osalta. amdS-geeniä voidaan sen lisäksi käyttää myös rihmasienissä, jotka kykenevät käyt-15 tämään asetamidia ainoana N-lähteenä joskin heikosti.

Tässä tapauksessa heikosti kasvavien transformoimattomien solujen edellytykset voidaan repressoida lisäämällä CsCl:a valikointialustoihin (Tilburn, J. et al^. (1983)

Gene, 26, 205-221). Tästä johtuen systeemin odotetaan 20 olevan yleisesti käyttökelpoinen rihmasienille.

Yhdessä tämän patenttihakemuksen esimerkissä osoitetaan odottamatta, että A. nidulansin amdS-geeniä voidaan ♦ · — " —11 — — - ; käyttää valintamarkkerina K. lactiksessa. Tässä • * · *; 25 esimerkissä on osoitettu, että kaksi eri K. lactis - • · kantaa ei pysty kasvamaan asetamidi ainoana N-lähteenä.

Kyseiset kaksi K. lactis -kantaa maljataan YCB-alustaan, v · joka on a) täydellinen mutta ilman N-lähdettä, b) kuten kohdassa a) mutta asetamidin kanssa, c) kuten kohdassa a) ·*· 3 0 mutta ammoniumsulfaatin kanssa.

i · , \ Osoitetaan, että kannat eivät kasva b)-kohdan mukaisessa i » · ';· · alustassa mutta kasvavat c)-kohdan mukaisessa alustassa.

'*·>* Näin ollen, edellyttäen, että hiivasolut käyttävät aseta- 35 midia, ja että amdS-geeni voidaan ilmentää K. lactikses-: sa, systeemi on käyttökelpoinen hiivoilla myös ainakin

* I

valintamarkkerina. Ottamalla huomioon vastavalikointi 22 114481 fluoriasetamidia käyttäen, joitakin lisäedellytyksiä on huomioitava. Fluoriasetamidi on toksinen asetyyli-CoA-syntetaasientsyymin aktivoimana. Edellytykset fluo-riasetamidivastavalikoinnin toiminnalle myös amdS+-hii-5 voissa ovat sen vuoksi 1) fluoriasetamidin ei tulisi olla toksinen amdS'-hiivoille, 2) hiivan soluseinän ja solumembraanin tulisi olla fluoriasetamidia läpäiseviä ja 10 3) asetyyli-CoA-syntetaasientsyymin tulisi olla aktiivi nen.

Tämän testaamiseksi amdS-geeni kloonattiin K. lactikseen.

15 A. nidulansin amdS-geenin mahdollisten silmukointiongel-mien välttämiseksi K. lactiksessa, amdS cDNA A. nidulan-sista kloonattiin kuten kokeellisessa jaksossa on esitetty.

20 Sen jälkeen amdS kloonattiin hiivapromoottorin (LAC4, ADH1, K1EF) alapuolelle vektoriin, joka sisälsi toisen markkerin (fosfotransferaasi-G418). Tätä kloonausta kuvaillaan esimerkissä 8. Sekä G418-markkerin että amdS-geenin sisältävät vektorit seulottiin käyttäen G418-mark-; 25 keriä ja käytettiin sen jälkeen valikointiolosuhteiden ' optimoimiseksi amdS+-fenotyypin suhteen.

v · K. lactiksen suora valikointi on myös esitetty ja S.

cerevisiaen osalta suora valikointi on esitetty 30 esimerkissä 11.

, \ Myöhemmin osoitetaan, että vastavalikointia voidaan käyt- : * tää transformoituihin hiivakantoihin amdS-geenin poista-

k I

miseksi.

• 35 23 1 1 4481 amdS-geenisysteemiä käytetään geenin sekä merkkigeeniva-paaseen insertioon että merkkigeenivapaaseen deleetioon hiivassa.

5 Lisäsuoritusmuodossa laktaasigeeni poistetaan K. lactik-sesta, kun taas esimerkissä 14 kymosiinigeenin kopio liitetään K. lactiksen genomiin.

j Tässä insertioon ja deleetioon käytettyjä geenejä käyte- 10 tään vain esimerkkeinä. Samaa tekniikkaa voidaan soveltaa käyttäen muita geenejä tai DNA-paloja. Edellä mainitun mukaisesti insertioon tai deleetioon käytetyt DNA-frag-mentit voivat olla mutatoituja geenejä, promoottorisekvenssejä, säätelysekvenssejä tms. Kaikissa tapauksissa on 15 mahdollista liittää tai poistaa näitä sekvenssejä haluttuihin genomisiin kohtiin ja haluttuina määrinä, jättämättä jäljelle merkkigeeniä.

Tämän systeemin käytön soveltuvuus muissa hiivakannoissa 20 on ilmeinen.

. Tämän systeemin käytön ensimmäisenä vaiheena bakteereissa osoitetaan esimerkissä 15, että Bacillus subtilis ja E. coli eivät pysty kasvamaan asetamidi ainoana N-lähteenä.

25 : ’,· Esimerkissä 16 kuvaillaan vektoreita, jotka on konstruoi- tu käytettäväksi Bacilluksessa ja E. colissa.

Esimerkeissä 17 ja 18 osoitetaan, että amdS-geeniä voi-30 daan käyttää tehokkaasti Bacilluksessa ja E. colissa va-lintamarkkerina, kun taas esimerkissä 19 osoitetaan bak- t teeristen amdS*-transformanttien fluoriasetamidivastavali-

P

kointi.

35 Tämän systeemin edut ovat moninaiset. Merkittävimmät edut ; esitetään jäljempänä: 114481 24 - On osoitettu, että amdS-systeemi on yleisesti käyttökelpoinen (kasvisoluihin, eläinsoluihin, hiivoihin, bakteereihin ja rihmasieniin jne.)» edellyttäen ainoastaan, että kysymyksessä oleva isäntä ei pysty kasvamaan tai 5 kasvaa vain heikosti asetamidi ainoana C-lähteenä tai N-lähteenä, mutta voi käyttää hyväksi joko asetaattia tai ammoniakkia ainoana C- tai vastaavasti N-lähteenä.

- amdS-svsteemi on ainoa kaksisuuntainen ja dominoiva valikointisysteemi. Tämä ominaisuus on äärimmäisen käyt- 10 tökelpoinen käytettäväksi poly- tai aneuploidisissa kannoissa kuten usein on laita, kun kysymyksessä ovat luonnolliset isolaatit ja/tai teolliset kannat.

- Perinteisen kantojen parantamisen jälkeen halutun geenin mutatoituja kopioita voidaan helposti vaihtaa muta- 15 toimattomiin kopioihin geeninvaihdon avulla, johtuen siitä, että halutut geenit on integroitu hyvin määriteltyihin lokuksiin. Geenit vaihdetaan siten mutatoimattomiin geeneihin vaikuttamatta ilmentymistasoon.

- Johtuen mahdollisuudesta toimittaa multippeleita integ-20 raatioita hyvin määriteltyihin ja sen vuoksi ei-sattuman- varaisiin lokuksiin, voidaan olla varmoja, että ei-toi-vottuja ominaisuuksia ei synny kantaan geenimonistamisen . yhteydessä.

- Kasvava huoli, koskien erilaisten valintamarkkereiden * · · ’ ^ 25 vapautumista ympäristöön voitetaan esillä olevan systee- min avulla. Yhdenkään valintamerkkigeenin tai muun tar-* ; peettoman tai ei-toivotun DNA-sekvenssin ei tarvitse olla läsnä tuotantokannoissa haluttujen geenien tai geneettis-v · ten modifikaatioiden toimittamisen jälkeen.

30 : : : Yleiset molekulaariset kloonaustekniikat lit t "r - — — — n - - Tässä yhteydessä kuvailluissa esimerkeissä tavanomaiset molekulariset kloonaustekniikat, kuten nukleiinihappojen 35 eristäminen ja puhdistaminen, nukleiinihappojen elektro-: /: foresointi, entsymaattinen modifiointi, nukleiinihappojen ·:·· pilkkominen ja/tai monistaminen, E. colin transformointi 114481 25 jne, suoritettiin kuten kirjallisuudessa on kuvailtu (Sambrook et ai., (1989) "Molecular Cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New York; Innis et al., (edit.) (1990) "PCR pro-5 tocols, a guide to methods and applications" Academic Press, San Diego). Oligodeoksinukleotidien synteesi ja DNA-sekvenssianalyysi suoritettiin Applied Biosystemsin 380B DNA-synteesilaitteessa ja vastaavasti 373A DNA-sek-vensointilaitteessa, valmistajan toimittamien käyttömanu-10 aalien mukaisesti.

A. nigerin transformointi A. nioerin transformointi suoritettiin menetelmän mukai-15 sesti, jota ovat kuvailleet Tilburn, J. et ai., (1983)

Gene 26, 205-221 ja Kelly, J. & Hynes, M. (1985) EMBO J., 4, 475-479, seuraavin muutoksin: - itiöitä kasvatettiin 16 tuntia 30°C:ssa pyöriväliikkei-sessä ravistelijassa nopeudessa 300 kierrosta minuutissa 20 (rpm) Asperqilluksen minimaalialustassa. Asperqilluksen minimaalialusta sisältää seuraavat aineosat: litraa kohti: 6 g NaN03:a; 0,52 g KCl:a; 1,52 g KH2P04:a; 1,12 ml 4 ; M KOH:a; 0,52 g MgS04.7H20:a; 10 g glukoosia; 1 g kase- * * * · iiniaminohappoja; 22 mg ZnS04.7H20:a; 11 mg H3B03:a; 5 mg ,:. 25 FeS04.7HzO: a ; 1,7 mg CoCl2.6H20: a ; 1,6 mg CuS04.5H20: a; 5 mg MnCl2.4H20:a; 1,5 mg Na^oQ,. 2H20: a; 50 mg EDTA:a; 2 mg • « riboflaviinia; 2 mg tiamiini.HCl:a; 2 mg nikotiiniamidia; *;;* 1 mg pyridoksiini.HCl:a; 0,2 mg pantoteenihappoa; 4 μg » · · ’·* ’ biotiinia; 10 ml penisilliini (5000 IU/ml)/streptomysiini 30 (5000 UG/ml) -liuosta (Gibco).

• ♦ : - protoplastien muodostamiseen käytettiin vain Novozym V : 234:ää (Novo Industri) eikä yhtään helikaasia; - protoplastien muodostamisen jälkeen (60-90 minuuttia) ·.·, KC-puskuria (0,8 M KCl:a, 9,5 mM sitruunahappoa, pH 6,2)

» I

35 lisättiin 45 ml:n tilavuuteen ja protoplastisuspensiota :.i.; sentrifugoitiin nopeudessa 2500 g 4°C:ssa 10 minuuttia » keinukuppiroottorissa. Protoplastit suspendoitiin uudel- 114481 26 leen 20 ml:aan KC-puskuria. Sen jälkeen lisättiin 25 ml STC-puskuria (1,2 M sorbitolia, 10 mM Tris-HCl:a pH 7,5, 50 mM CaCl2:a), ja sen jälkeen protoplastisuspensiota sentrifugoitiin 2500 g 4°C:ssa 10 minuuttia keinukuppi-5 roottorissa, pestiin STC-puskurissa ja suspendoitiin uudelleen STC-puskuriin pitoisuudessa 108 protoplastia/ml; - 200 Miraan protoplastisuspensiota lisättiin DNA-frag-mentti 10 μ1:η tilavuudessa TE-puskuria (10 mM Tris-HCl:a pH 7,5, 0,1 mM EDTAra) ja sen jälkeen 100 μΐ PEG-liuosta 10 (20 % PEG 4000 (Merck), 0,8 M sorbitolia, 10 mM Tris- HCl:a pH 7,5, 50 mM CaCl2:a);

- DNA-protoplastisuspension inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa 10 minuutin ajan lisättiin hitaasti 1,5 ml PEG-liuosta (60 % PEG 4000 (Merck), 10 mM Tris-HCl:a pH

15 7,5, 50 mM CaCl2:a) sekoittaen putkia toistuvasti. 20 mi nuutin inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa suspensiot laimennettiin 5 ml:11a STC-puskuria, sekoitettiin kääntämällä ja sentrifugoitiin 2000 g huoneen lämpötilassa 10 minuutin ajan. Protoplastit suspendoitiin uudelleen 20 varovasti 1 ml:aan 1,2 M sorbitolia ja maljättiin valikoivalle regeneraatioalustalle, joka sisälsi Aspergi1luk-sen minimaalialustaa ilman riboflaviinia, tiamiini.HClra, ; nikotiiniamidia, pyridoksiini.HC1:a, pantoteenihappoa, .·.·. biotiinia, kaseiiniaminohappoja ja glukoosia, mutta li- 25 sänä 10 mM asetamidia ainoana typenlähteenä, 1 M sakka- roosia, jähmetettynä 2 %:isella bakteriologisella agaril-’ * la #1 (Oxoid, Englanti). 6-10 päivän kasvatuksen jälkeen *;·· 30°C:ssa maljat toistomaljättiin valikoiville asetamidi- '·" ' maljoille, jotka sisälsivät Aspergilluksen valikoivaa re- 30 generointialustaa 2 %:nen glukoosi sakkaroosin asemesta ·,· · ja 1,5 % agaroosia agarin asemesta. Yksittäisiä transfor- : : : mänttejä eristettiin 5-10 päivän kasvatuksen jälkeen 30°C:ssa.

114481 27 A. orvzaen transformointi A. orvzaen transformointi suoritettiin menetelmän mukaisesti, jota on kuvaillut Christensen, T. et ai. EP-hake-5 muksessa 0 238 023 A2.

T. reesein transformointi T. reesein transformointi suoritettiin menetelmän mukai-10 sesti, jota ovat kuvailleet Penttilä, M., Knowles, J.

(1987) Gene 61 155-164.

P, chrvsogenumin transformointi 15 Ca-PEG-välitteistä protoplastien transformointimenetelmää käytetään. Protoplastien valmistaminen ja L. chrvso-qenumin transformointi suoritettiin menetelmän mukaisesti, jota on kuvaillut Gouka et ai., Journal of Biotechnology 20 (1991), 189-200 seuraavin muunnoksin: 20 - Transformoinnin jälkeen protoplastit maljattiin valikoiville regenerointialustamaljoille, jotka sisälsivät . Aspergi 1 luksen minimaalialustaa, osmoottisesti stabiloi- tuna 1,2 M sakkaroosilla, joka alusta sisälsi 0,1 % ase-' 25 tamidia ainoana typenlähteenä, ja joka oli jähmetetty 1,5 %:isella bakteriologisella agarilla #1 (Oxoid, Englanti).

; - Inkuboinnin kestettyä 5-8 päivää 25°C:ssa transforman- tit tulivat näkyviin.

* · * 30 K. lactiksen transformointi :Y: L lactis -hiiva transformoitiin käyttäen litiumasetaat- ' . timenetelmää, jota on kuvaillut Ito, H. et ai., (1983) J.

Bacteriol. 153, 163-168 seuraavin muunnoksin: 35 : : : - Transformaatiota varten K. lactis -viljelmä kerättiin :*·· tiheyden ollessa OD610 0,5-1,0.

28 114481 - Transformoitujen solususpensioiden 5 minuutin lämpösho-kin jälkeen lisättiin 1 ml YEPD/YNB:tä (1 % hiivauutetta, 2 % Bacto-peptonia, 2 % glukoosia ja 0,17 % hiivan typpi-perusalustaa (Yeast Nitrogen Base) ilman aminohappoja 5 (YNB; Difco) ja solususpensioita inkuboitiin 30°C:ssa inkubointiravistelijassa 150-180 minuuttia.

- Edellä mainitun inkuboinnin jälkeen (30°C:ssa 150-180 minuuttia) solususpensiot sentrifugoitiin 2000 g huoneen lämpötilassa 5 minuutin kuluessa ja maljattiin YEPD/G418- 10 kaksikerrosalustalle, joka oli jähmetetty 2 %:isella Bac-to-agarilla (Difco). YEPD/G418-kaksikerrosmaljät valmistettiin seuraavasti: 10 minuuttia ennen solususpensioiden siirrostamista 15 ml YEPD-agaria (1 % hiivauutetta, 2 % Bacto-peptonia, 2 % glukoosia, jähmetettynä 2 %:isella 15 Bacto-agarilla (Difco)) ilman G418:aa valettiin 15 ml:n päälle YEPD-agaria, joka sisälsi 50 μg G418/ml. Tästä muodostuu YEPD/G418-kaksikerrosmaljoja, jotka sisältävät 25 μg G418/ml, antibiootin diffundoitumisen jälkeen. YEPD/G418-kaksikerrosmaljät sisälsivät 25 μg G418/ml K.

20 lactis CBS 683:n tapauksessa tai 100 μg G418/ml vastaavasti K. lactis CBS 2360:n tapauksessa.

: DNA:n eristäminen Asoercrilluksesta. Trichodermasta. Peni- • * · · cilliumista ia hiivasta k · · 1,1 -r 25 ;.[it DNA:n eristäminen Aspergilluksesta ja Trichodermasta suo- • · ritettiin menetelmän mukaisesti, jota on kuvaillut Yel- f · · *·” ton, et ai. (1984), Proc. Natl. Acad. Sei. 81, 1470-1474.

• t · t * » • 30 DNA:n eristäminen Penici11lumista suoritettiin menetelmän • · · mukaisesti, jota on kuvaillut Kolar et ai., Gene 62 (1988), 127-134.

... DNA:n eristäminen K. lactiksesta tai S. cerevisiaesta * · "* 35 suoritettiin menetelmien mukaisesti, joita ovat kuvail- leet Fujimura ja Sakuma (1993), Biotechniques 14, 538.

i » · » · 114481 29

Bacilluksen transformointi ia DNA;n eristäminen

Eri Bacillus-lajien transformointi sekä plasmidi-DNA:n tai kromosomaalisen DNA:n eristäminen näistä lajeista 5 suoritettiin kuten Bron (1990) on kuvaillut, ••Plasmids": Molecular Biological Methods for Bacillus, Harwood, CR ja Cutting, SM, edit., sarjassa Modern Microbiological Methods, John Wiley & Sons, Chichester, UK).

10 B^_ subtilis BS-154:n (CBS 363.94) transformaatiota varten käytettiin kompetentteja soluja ja B. licheniformis T5:n (CBS 470.83) transformaatiota varten käytettiin proto-plastitransformaatiota. Neomysiinivalikoinnissa käytettiin pitoisuutta 20 μg/ml. B^_ subtiliksen transformant-15 tien asetamidivalikoinnissa käytettiin minimaa1ialusta-agaria, jossa kaseiiniaminohapot ja hiivauute korvattiin 20 mM asetamidilla. B. licheniformiksen transformanttien asetamidivalikoinnissa käytettiin protoplastien re-generointialustaa, jossa ammoniumsulfaatti korvattiin 20 20 mM asetamidilla.

amdS-valintamarkkerin poistaminen • · · * · · * * * ·

Asneraillusta. Trichodermaa ja Penicilliumia koskevissa 25 useimmissa esimerkeissä amdS-merkkigeeni kloonataan identtisten toistojaksojen väliin, jotka koostuvat osasta » · ' ! amyloglukosidaasigeenin ei-koodittavaa 3'-aluetta. amdS- •;;j valintamarkkerin poistaminen saadaan aikaan joko sisäisen i · · '·' ‘ rekombinaation avulla qlaA:n 3'-pään ei-koodittavien 30 toistojaksojen välillä, jotka vierustavat amdS-valinta- • * ·,; ; markkeria, tai homologisen rekombinaation avulla toisto- * » · '·/ : jaksojen välillä, jotka muodostuvat integraation avulla yksinkertaisen tekijäinvaihtotapahtuman kautta. Solujen

• I

... seulonta, jotka ovat menettäneet amdS-valintamarkkerin, 35 saadaan aikaan kasvattamalla maljoilla, jotka sisältävät fluoriasetamidia. Solut, jotka sisältävät amdS-geenin, *;·: metaboloivat fluoriasetamidin ammoniakiksi ja fluo- 30 114481 riasetaatiksi, joka on solulle myrkyllinen. Siten vain solut, jotka ovat menettäneet amdS-geenin, pystyvät kasvamaan fluoriasetamidia sisältävillä maljoilla.

5 Poistettaessa amdS-markkeri Asperoillus-transformanteis-ta, näiden transformanttien itiöitä siirrostettiin valikoivalle regenerointialustalle (kuvailtu edellä), joka sisälsi 32 mM fluoriasetamidia ja 5 mM ureaa 10 mM aseta-midin sijasta, 1,1 % glukoosia 1 M sakkaroosin sijasta ja 10 1,1 % vaan ei 2 % bakteriologista agaria #1 (Oxoid, Eng lanti) . 7-10 kasvatuspäivän jälkeen 35°C:ssa yksittäisiä pesäkkeitä otettiin talteen ja siirrostettiin 0,4 % lisille perunadekstroosiagarmaljoille (Oxoid, Englanti). Poistettaessa amdS-markkeri Trichoderma-transformanteista.

15 näiden transformanttien itiöitä siirrostettiin ei-vali-koiville minimaalialustamaljoille (litraa kohti: 20 g glukoosia, 5 g (NH4)2S04:a, 15 g KH2P04:a, 0,6 g MgS04:a, 0,6 g CaCl2:a, 0,005 g FeS04.7H20:a, 0,016 g MnS04.H20:a, 0,0014 g ZnS04.7H20:a, 0,002 g CoCl2:a; pH 5,5), joihin oli 20 lisätty 10 mM fluoriasetamidia. 5-10 päivän kuluttua 30°C:ssa pesäkkeet kerättiin talteen ja maljättiin 0,4 %:iselle perunadekstroosiagarille (Oxoid, Englanti).

• · « • · · » 1 · ·

Poistettaessa amdS-markkeri Penicillium-transformanteis- • · ,j. 25 ta, näiden transformanttien itiöitä maljattiin väli- • 1 koivalle alustalle, joka sisälsi Asperaillus-minimaa- ,·. lialustaa, jossa oli 10 mM f luoriasetamidia ja 5 % glu- • ‘II,' koosia ja jähmetetty 1,5 %:isella bakteriologisella aga- li· ’ rilla #1 (Oxoid, Englanti). 5-10 kasvatuspäivän kuluttua 30 25°C:ssa resistentit pesäkkeet tulivat näkyviin.

» · · r t < > · · f 1 t v · Glukoamvlaasituotannon määrittäminen A. nigerin transfor- t mänteillä * » 1 " i · * · · * 1 » · 35 A. niaerin yhdistelmä- ja kontrollikantojen itiöitä ke- rättiin talteen siirrostamalla itiöitä tai rihmastoa PDA-· maljoille (Potato Dextrose Agar, Oxoid) , jotka oli vai- 114481 31 luistettu valmistajan ohjeiden mukaisesti. 3-7 kasvatus-päivän jälkeen 30°C:ssa itiöt kerättiin talteen sen jälkeen kun maljoille oli lisätty 0,01 % Triton X-100:aa. Steriilillä vedellä pesun jälkeen suunnilleen 107 itiötä 5 valikoiduista transformanteista ja kontrollikannoista siirrostettiin ravistelupulloihin, jotka sisälsivät 20 ml nestemäistä esiviljelyalustaa, joka sisälsi litraa kohti: 30 g maltoosi.H20:a; 5 g hiivauutetta; 10 g hydrolysoitua kaseiinia; 1 g KH2P04:a; 0,5 g MgS04.7H20:a; 3 g Tween 10 80:tä; 10 ml penisilliiniä (5000 IU/ml)/streptomysiiniä (5000 UG/ml); pH 5,5. Näitä viljelmiä kasvatettiin 34°C:ssa 20-24 tuntia. 5-10 ml tätä viljelmää siirrostettiin 100 ml:aan fermentointialustaa, joka sisälsi litraa kohti: 70 g maltodekstriinejä; 25 g hydrolysoitua kaseii-15 nia; 12,5 g hiivauutetta; 1 g KH2P04:a; 2 g K2S04:a; 0,5 g MgS04.7H20:a; 0,03 g ZnCl2:a; 0,02 g CaCl2:a; 0,01 g MnS04.4H20:a; 0,3 g FeS04.7H20:a; 10 ml penisilliiniä (5000 IU/ml)/streptomysiiniä (5000 UG/ml); säädettynä pH-arvoon 5,6 4 N H2S04:llä. Näitä viljelmiä kasvatettiin 34°C:ssa 20 5-10 päivää. Näytteitä otettiin glukoamylaasituotanto- analyysiä varten eri ajankohtina fermentoinnin aikana. Fermentaatiolieminäytteet sentrifugoitiin (10 minuuttia; :j‘: lOOOOxg) ja supernatantit otettiin talteen.

* · l · · I I I • 25 Glukoamylaasiaktiivisuus määritettiin inkuboimalla 10 μΐ i · kuusi kertaa laimennettua viljelmän supernatanttinäytettä * a 0,032 M NaAc/HAc:ssä pH 4,05, mukana 115 μΐ 0,2 %:ista (paino/tilavuus) p-nitrofenyyli-a-D-glukopyranosidia } · r (Sigma) 0,032 M NaAc/HAc:ssä pH 4,05. 30 minuutin inku-30 boinnin jälkeen huoneenlämpötilassa 50 μΐ 0,3 M Na2C03:a : lisättiin ja absorptio aallonpituudessa 405 nm mitattiin.

i · s v · A405nm on AG-tuotannon mitta.

r M m i · ,···. amdS cDNA:n kloonaaminen i » • « · • 35 A. nidulansin amdS-geeni sisältää kolme pientä intronia '*”· (Corrick et ai., (1987) Gene 53, 63-71). Ongelmien vält- 114481 32 tämiseksi, jotka näiden introneiden väärä silmukoituminen aiheuttaa hiivoissa tai silmukoitumisen puuttuminen bakteereissa, amdS cDNA:ta on käytetty ilmentämiseen hiivoissa ja bakteereissa. Corrick et ai., ((1987), Gene 53., 5 63-71) ovat kuvailleet A. nidulansin polyA+ RNA -valmis teen amdS cDNA:n kloonausta. Tässä esimerkissä on käytetty A. niqer NRRL 3135 -transformanttia #4, joka on transformoitu A. nidulansin amdS-geenin sisältämän plas-midin pAF2-2S moninkertaisilla kopioilla (van Hartings-10 veld et ai., (1993), Gene 127. 87-94). Kokonais-RNA eristettiin suoralla LiCl-saostuksella menetelmän mukaisesti, joka on modifioitu Auffrayn et ai. menetelmästä, ((1980)

Eur. J. Biochem. 107. 303-314). A. niqer -itiöiden annettiin itää ja niitä kasvatettiin yli yön 37°C:ssa minimaa-15 lialustassa (Cove (1966) Biochim. Biophys. Acta 113. 51-56) täydennettynä glukoosilla hiilenlähteenä ja asetamidi ainoana typenlähteenä. Rihmasto otettiin talteen ja kuivattiin suodattamalla ja jäädytettiin sen jälkeen neste-typellä, jauhamista varten. Jauhe dispergoitiin 3 M LiCl, 20 6 M ureaan 0°C:ssa ja säilytettiin yli yön 4°C:ssa. Solun kokonais-RNA saatiin sentrifugoinnin jälkeen 16000 g 30 minuutin ajan ja kahdella peräkkäisellä uutolla feno- ; j'; li/kloroformi/isoamyylialkoholia (50:48:2). RNA saostet- .i* * V. tiin etanolilla ja liuotettiin 1 ml:aan 10 mM Tris-HCl:a t · · 25 (pH 7,4), 0,5 % SDS:a. polyA+-valikointia varten koko- nais-RNA-näytettä kuumennettiin 5 minuutin ajan 65°C:ssa t · ) ja sijoitettiin sen jälkeen oligo(dT)-selluloosakolon- * · * ·;;; niin. Useiden pesujen jälkeen liuoksella, joka sisälsi 10 V mM Tris-HCl:a pH 7,4, 0,5 % SDS:a ja 0,5 M NaCl:a, polyA+ 30 RNA otettiin talteen eluoimalla 10 mM Tris-HCl:llä pH 7,4 !,· · ja 0,5 %:isella SDS:llä ja saostettiin etanolilla. Suunnil-

t i I

V : leen 5 μg polyA+ mRNA:ta käytettiin templaattina kään- teiskopioinnissa käyttäen alukkeina oligo (dT) -alukkeita. Re- i · ...t aktioseosta (50 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM DTT, 6 mM MgCl2, t · 35 80 mM KC1, 0,2 mM kutakin dNTP:tä ja 0,1 mg BSA/ml) inku- M,· boitiin 30 minuutin ajan 37°C:ssa mukana 500 yksikköä i

Murine MLV -käänteistranskriptaasia (BRL) ja 75 yksikköä 114481 33 RNaasin inhibiittoria (Promega) 100 μ1:η tilavuudessa. Käänteistranskriptaasia lisättiin vielä 200 yksikköä ja reaktiota jatkettiin 30 minuuttia. Seos uutettiin kloroformilla ja saostettiin etanolilla 0,25 M ammoniumasetaa-5 tin läsnäollessa. Tätä ensimmäisen juosteen cDNA-seosta käytettiin templaattina seuraavassa polymeraasiketjureaktiossa (PCR) amdS cDNA:n monistamiseksi. Genomista amdS-sekvenssiä käytettiin kahden synteettisen oligonukleoti-din konstruoimiseksi, joita käytettiin alukkeina tässä 10 PCR:ssä: AB3100 (SEKVENSSI ID NO: 1): 5'-CTAATCTAGAATGCCTCAATCCTGAA-31 (amdS-spesifinen sek venssi nukleotidistä -3 nukleotidiin +16, jota edeltää 15 Xbal-kohta ja 4 lisänukleotidiä).

AB3101 (SEKVENSSI ID NO: 2): 5·-GACAGTCGACAGCTATGGAGTCACCACA-3' (amdS-spesifinen sekvenssi, sijoittuen amdS-lopetuskodonin alapuolelle nukle-20 otidivälillä 1911-1884, jota vierustaa Sall-lisäkohta).

PCR-reaktio suoritettiin käyttäen 10 % cDNA-seoksesta : templaattina ja 0,1 μg kumpaakin oligoista AB3100 (SEK- VENSSI ID NO:l) ja AB3101 (SEKVENSSI ID NO: 2) alukkeina.

• · 25 Denaturoinnin (7 minuuttia 100°C:ssa) jälkeen, ja kun oli ; lisätty 1,3 yksikköä Taq-polymeraasia, reaktioseokselle suoritettiin 25 monistus jaksoa (kukin jakso: 2 minuuttia 94°C:ssa, 2 minuuttia 55°C:ssa ja 3 minuuttia 72°C:ssa).

’’ Viimeisessä jaksossa ketjunpidennysvaihe kesti kauemmin 30 (7 min.) täyspitkien fragmenttien synteesin mahdollista- : miseksi. Saatu DNA-fragmentti pilkottiin Xbal: llä ja Sa- · 11: llä ja subkloonattiin plasmidin pUC18 Xbal/Sall-koh- ____: tiin. tuloksena olevaa plasmidia merkittiin tunnuksella .···. pamdS-1 (kuvio 1) . Plasmidin pamdS-1 restriktioanalyysi 35 varmisti intronien puuttumisen ja eksonien oikean fuusion ’·.*,· amdS cDNA:ssa.

I I m · 114481 34

Esimerkki 1 A. niqer -geenin merkkiaeenivapaa deleetio käyttäen amdS-geeniä 5 Tässä esimerkissä genominen kohdegeeni A. nigerissä vaihdetaan transformoimalla A. niger vaihtovektorilla, joka integroituu A. nigerin genomiin kaksoistekijäinvaihtoisen homologisen rekombinaation kautta. Vaihtovektori sisältää DNA-alueen, joka on homologinen kohdelokuksen suhteen, 10 jonka alueen DNA-toistojaksojen vierustama valikoitava merkkigeeni keskeyttää.

Tässä esimerkissä käytetään pGBDEL4L-plasmidia glaA-koo-ditusalueen ja glaA-promoottorialueen (Proksimaalisen) 15 osan poistamiseksi. Tämä vektori sisältää osan A. nigerin genomisesta glaA-lokuksesta. jossa glaA-kooditussekvens-sit sekä osa glaA-promoottorisekvensseistä on korvattu A. nidulansin amdS-geenillä, joka on A. nidulansin gpdA-pro-moottorin ohjauksessa valintamarkkerina, jota vierustavat 20 3'-pään ei-luetut glaA-sekvenssit suorina toistojaksoina.

A. nigerin transformointi tällä vektorilla ohjaa glaA-geenin vaihtamista amdS-merkkigeeniin. Suorittamalla : fluoriasetamidivastavalikointi näillä transformanteilla, kuten kokeellisessa menetelmä jaksossa on kuvailtu, amdS-25 merkkigeeni tulee poistetuksi oikein sisäisen rekombinaa-;v. tiotapahtuman avulla 3' glaA -DNA-toistojaksojen välillä, I mikä johtaa merkkigeenivapaaseen AglaA-yhdistelmäkantaan, *"* joka ei lopulta sisällä yhtään vierasta DNA-sekvenssiä '** * (kaaviokuvana lähemmin kuviossa 2) .

30

i,i : Lvhvt kuvaus glaA geeninvaihtovektorista PGBDEL4L

Geeninvaihtovektori pGBDEL4L sisältää 5'-osan A. nigerin .·*·. amyloglukosidaasin (glaA) promoottorialueesta, synteetti- ’·' 35 sen 16 bp DNA-sekvenssin, joka toimittaa lopetuskodonit kaikissa kolmessa lukukehyksessä, A. nidulansin asetami- daasi (amdS) -geenin A. nidulansin glyseraldehydi-3-fos- 114481 35 faattidehydrogenaasin (gpdA) promoottorin ohjauksessa, jota vierustavat molemmilla puolilla 3'ei-koodittavat qlaA-sekvenssit.

5 PGBDEL4L:n konstruointireitti

Lopullisen deleetiovektorin pGBDEL4L saamiseksi, useita glaA-lokuksen subklooneja tehtiin ensin. Kaaviokuva on esitetty kuviossa 3. A. nigerin glaA-lokus on molekulaa-10 risesti kloonattu ja aikaisemmin kuvailtu (EP 0 463 706 AI). Plasmidi pAB6-l sisältää kokonaisen glaA-lokuksen A. niaeristä 15,5 kb Hindlll-fragmentissa, kloonattuna plas-midin pUC19 HindiII-kohtaan (Yanisch-Perron et ai., Gene 33 (1985) 103-119, ja se on saatavissa esim. Boehringer 15 Mannheim·lta, Saksa). pAB6-l pilkottiin EcoRI:llä ja 1,8 kb EcoRI DNA-fragmentti, juuri glaA-geenin yläpuolella, eristettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla ja liitettiin EcoRI:llä pilkottuun plasraidiin pUC19 ja siirrettiin sitten E. coliin ja kloonattiin molekulaarisesti.

20 Tuloksena saatua plasmidia merkittiin tunnuksella pAB6-3 (kuvio 3A). Plasmidin pAB6-4 konstruoimiseksi, joka on pAB6-l:n toinen subklooni, pAB6-l pilkottiin Hindin:11a : ja Bqlll: 11a. 4,6 kb kokoinen DNA-fragmentti, joka sisäl- si qlaA-promoottorin ja osan glaA kooditussekvenssistä, • · 25 eristettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla ja lii- tettiin plasmidiin pUC19, joka pilkottiin ennalta Hindll- t · 1:11a ja BamHI: llä (kuvio 3B) . Sen seurauksena BamHI- ’l'.! sekä Bglll-kohdat pAB6-4:ssä tuhoutuivat sopivasti tämän • · · • kloonausmenetelmän avulla.

30 : Seuraavaksi, sen jälkeen kun plasmidi pAB6-4 oli pilkottu · Hindlll: 11a ja EcoRI: llä ja tarttuvat 5'-päät täytetty käyttäen E. colin DNA-polymeraasia, 1,8 kb glaA:n pro-.···. moottori-DNA-fragmentti eristettiin agaroosigeelielektro- ·’ 35 foreesin avulla, liitettiin pAB6-3:een, joka oli osittain pilkottu EcoRI:llä ja käsitelty E. colin DNA-polymeraa-: * silla tasapäiden muodostamiseksi, ligaatioseos siirret- 36 714481 tiin E. coliin molekulaarista kloonausta varten. Saatu plasmidi (tunnuksella pAB6-31) sisältää qlaA:n 3,6 kb promoottorifragmentin, jonka keskeltä on tuhottu EcoRI-kohta, mutta joka yhä sisältää EcoRI-kohdan (tämän jäl-5 keen ainoan tässä DNA-fragmentissa) juuri qlaA:n ATG-aloituskohdan yläpuolella (kuvio 4).

Tässä käytetty A. nidulansin amdS-geeni sijaitsee suunnilleen 4 kb kokoisessa EcoRI-Kpnl-fragmentissa plasmi-10 dissa pGW325 (Wernars et ai., tutkielma (1986) Agricultural University, Wageningen, Hollanti). Tämä EcoRI-Kpnl DNA-fragmentti, joka sisältää amdS-geenin, jota vierusta-vat sen omat säätelysekvenssit, kloonattiin molekulaari-sesti pUC19:n sopiviin kohtiin kuten Verdoes et ai. ovat 15 kuvailleet (Transgenic Res. 2 ss. 84-92, 1993), josta oli tuloksena pAN4-l. pAN4-l pilkottiin EcoRI:llä ja Koni:-llä, amdS-geenin sisältävä 4 kb kokoinen DNA-fragmentti eristettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla, liitettiin EcoRI:llä ja Kpnl:llä pilkottuun pAB6-31:een ja li-20 gaatioseos siirrettiin E. coliin molekulaarista kloonausta varten. Saatu plasmidi sai tunnuksen pAB6S (kuvio 5) ja sisältää qlaA:n 3,8 kb promoottori-DNA-fragmentin ja 4 : kb amdS-fragmentin.

I · « · · t t » • · 25 Plasmidi pAB6S pilkottiin ensin osittain Sali: llä ja lii-;·'*·. tettiin synteettisesti saatuun oligonukleotidiin TN0001 I · (SEKVENSSI ID NO: 3), jolla on seuraava sekvenssi: » t I * » · · I I · *·* * TN0001 (SEKVENSSI ID NO: 3): 5'TCGATTAACTAGTTAA 3' 30 • # i.i ί ja pilkottiin seuraavaksi EcoRI: llä. pUC19:n sisältävä v · DNA-fragmentti, glaA-promoottori ja amdS-geenisekvenssit puhdistettiin ja eristettiin agaroosigeelielektroforeesin I · avulla. Sali:llä pilkotusta plasmidista pAB6-l eristet-35 tiin 2,2 kb 3'-pään viereinen glaA-DNA-fragmentti samaten » agaroosigeelielektroforeesin avulla ja liitettiin edellä mainittuun syntettiseen oligonukleotidiin, käsiteltiin 114481 37 T4-polynukleotidikinaasilla, pilkottiin sitten EcoRI;llä ja liitettiin edellä mainittuun pAB6S:stä eristettyyn DNA-fragmenttiin. DNA-ligaatioseos siirrettiin E. coliin ja kloonattiin molekulaarisesti. Saatu plasmidi sai tun-5 nuksen pGBDELl ja se esitetään kuviossa 6. Tämän menetelmän avulla yhtäaikaisesti Sall-restriktiokohta tuhottiin, ja lopetuskodonit kaikissa lukukehyksissä toimitettiin.

Suunnilleen 1 kb suuren DNA-fragmentin saamiseksi, joka 10 sisältää alaA:n 3'-pään ei-koodittavia DNA-sekvenssejä, jotka sijaitsevat juuri qlaA-qeenin lopetuskodonin alapuolella, ja jota vierustavat sopivat restriktiokohdat, suoritettiin PCR-monistaminen. Tässä PCR-monistuksessa plasmidia pAB6-l käytettiin templaattina, ja alukkeina 15 kahta syntettisesti tehtyä oligonukleotidiä:

Oligo AB2154 (SEKVENSSI ID NO: 4): 5' AACCATAGGGTCGACTAGACAATCAATCCATTTCG 3' fqlaArn 3'-pään ei-koodittava sekvenssi juuri lopetuskodonin alapuo-20 lella) ja

Oligo AB2155 (SEKVENSSI ID NO: 5): 5' GCTATTCGAAAGCTTATTCATCCGGAGATCCTGAT 3' ( qlaA:n 3‘- . pään ei-koodittava sekvenssi EcoRI-kohdan ympärillä suun- i · a · nilleen 1 kb lopetuskodonin alapuolella) .

♦ · · * · 25 PCR suoritettiin kuten Saiki et ai. ovat kuvailleet I 4 t ’ * (Science 239. 487-491, 1988), ja TAQ-polymeraasin toimit- tajan (Cetus) mukaisesti. Kaksikymmentäviisi monistusjak-*·* soa (jokainen 2 minuuttia 55°C:ssa; 3 minuuttia 72°C:ssa 30 ja 2 minuuttia 94°C:ssa) suoritettiin DNA-monistuslait- • :,· I teessä (Perkin-Elmer/Cetus) . Monistettu 1 kb DNA-frag- :/· '· mentti pilkottiin Hindlll: 11a ja Sali: llä. puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla, saostettiin etano- • t lilla ja kloonattiin sen jälkeen pGBDELl:n Hindlll- ja * » **.* 35 Sall-restriktiokohtiin. Siten saatu plasmidi sai tunnvik- M,· sen PGBDEL2 (kuvio 7A,B).

114481 38

Lopullisen qlaA-geeninvaihtovektorin pGBDEL4L aikaansaamiseksi amdS-promoottorialue pGBDEL2:ssa vaihdettiin voimakkaampaan A. nidulansin gpdA-promoottoriin. gpdA-pro-moottorisekvenssin liittäminen amdS-geenin kooditusse-5 kvenssiin suoritettiin polymeraasiketjureaktiomenetelmän (PCR) avulla. Tätä PCR-liitäntää varten käytettiin kahta eri templaattia: plasmidia pAN7-l (Punt et ai., Gene 56, 117-124, 1987), joka sisältää E. colin hph-geenin A. nidulansin gpdA-promoottorin ja A. nidulansin trpC-ter-10 minaattorin ohjauksessa, ja plasmidia pAN4-l, joka sisältää A. nidulansin amdS-geenin sen omien säätelysekvenssi-en ohjauksessa. Alukkeina käytettiin neljää synteettistä oligonukleotidiä, joilla oli seuraavat sekvenssit: 15 Oligo AB 2977 (SEKVENSSI ID NO:6): 5' TATCAGGAATTCGAGCTCTGTACAGTGACC 3' fqpdA:n 5'-pään promoottorispesifinen oligonukleotidi, joka sijaitsee suunnilleen 880 bp E. colin hph-geenin ATG-aloituskodonin yläpuolella) 20

Oligo AB2992 (SEKVENSSI ID NO:7): 5' GCTTGAGCAGACATCACCATGCCTCAATCCTGGGAA 3' « i · I I · .V. Oligo AB2993 (SEKVENSSI ID N0:8): M. 25 5' TTCCCAGGATTGAGGCATGGTGATGTCTGCTCAAGC 3' ./! (kumpikin sekvenssi on komplementaarinen toistensa suh- ' ’ teen ja sisältävät 18 bp gpdA-promoottorin 3'-päästä ja ·;;· 18 bp amdS-kooditusalueen 5'-osasta) $ · · 30 Oligo AB2994 (SEKVENSSI ID NO:9): : 5' CTGATAGAATTCAGATCTGCAGCGGAGGCCTCTGTG 3' (arodS-spesifinen sekvenssi Bqlll-kohdan ympärillä suun-nilleen 175 bp ATG-aloituskodonin alapuolella) **.* 35 880 bp gpdA-promoottorialueen yhdistämiseksi amdS-koodi- tussekvenssiin, kaksi erillistä PCR:ää suoritettiin: en-*:*: simmäinen monistaminen pAN7-l templaattina ja oligonukle- 114481 39

otidit AB 2977 (SEKVENSSI ID NO:6) ja AB2993 (SEKVENSSI ID NO:8) alukkeina, 880 bp DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisältää qpdA-promoottorin. jonka vieressä on 3’-rajalla 18 nukleotidiä, jotka ovat komplementaariset 5 amdS-geenin 5'-pään suhteen, ja toinen PCR-reaktio pAN4-l templaattina ja oligonukleotidit AB2992 (SEKVENSSI ID NO:7) ja AB2994 (SEKVENSSI ID NO:9) alukkeina, 200 bp kokoisen DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisältää amdS-geenin 5'-osan, jonka vieressä on 5'-rajalla 18 nukleoti-10 diä, jotka ovat komplementaariset crpdA-promoo11orin 3'-pään suhteen. Kaaviokuva näistä monistamisista esitetään kuviossa 8A. Muodostetut kaksi fragmenttia puhdistettiin sen jälkeen agaroosigeelielektroforeesin avulla, saostet-tiin etanolilla ja käytettiin templaatteina kolmannessa 15 PCR-reaktiossa oligonukleotidit AB 2977 (SEKVENSSI ID

NO:6) ja AB2994 (SEKVENSSI ID NO:9) alukkeina. Tuloksena saatu DNA-fragmentti pilkottiin EcoRI:llä. puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesin ja etanolisaostuksen avulla ja kloonattiin pTZ18R:n (United States Biochemicals) Eco-20 RI-kohtaan. Tuloksena saatu plasmidi sai tunnuksen pGBGLA24 (kuvio 8B).

. amdS-promoottorisekvenssin pGBDEL2:ssa vaihtamiseksi qpdA-promoottorisekvenssiin. suunnilleen 1 kb kokoinen ' 25 pGBGLA24:n EcoRI/BqlII-fraqmentti eristettiin aga- ,.1! roosigeelielektroforeesin avulla pilkkomisen jälkeen so- % · a 1 pivilla restriktioentsyymeillä ja liitettiin pGBDEL2:n * 1 · >··· EcoRI- ja BglII-kohtiin. Tuloksena saatua qlaA geenin- » · » * vaihtovektoria nimitettiin tunnuksella pGBDEL4L (kuvio 30 9) .

« « · * · · * 1 · 1 qlaA:n promoottori- ia kooditussekvenssien deleetio A. niqerissä • · • · · "· 35 Ennen A. niqerin transformointia pGBDEL4L:llä E. coli - :/;/· sekvenssit poistettiin Hindlll- ja Xhol-pilkonnalla ja

* :1: agaroosigeelielektroforesoimalla. A. niqer -kanta CBS

114481 40 513.88 (talletettu 10. lokakuuta, 1988) transformoitiin joko 2,5, 5 tai 10 ^g:n DNA-fragmentilla kokeelliset menetelmät -jaksossa kuvailluilla menetelmillä, käyttäen asetamidia ainoana N-lähteenä valikoivilla maljoilla.

5 Yksittäisiä A. niaer -transformantteja puhdistettiin useita kertoja valikoiville, asetamidia sisältäville mi-nimaalimaljoille. Yksittäisten transformanttien itiöitä kerättiin talteen kasvattamalla noin 5 päivää 30°C:ssa 0,4 %:isillä peruna-dekstroosiagarmaljoilla (Oxoid, Eng-10 lanti). Southern-analyysit suoritettiin typistetyn qlaA-lokuksen läsnäolon varmistamiseksi. Useiden transformanttien suurimolekyylipainoinen DNA eristettiin, pilkottiin BamHI:llä ja Kpnl:llä ja fraktioitiin sen jälkeen elekt-roforesoimalla 0,7 %:isella agaroosigeelillä. Nitrosellu-15 loosakalvoille siirtämisen jälkeen hybridisaatio suoritettiin vakiomenetelmien mukaisesti käyttäen kahta 32P-leimattua koetinta: Xhol/Sall qlaA -promoottorifragment-tia, eristettynä plasmidista pAB6-4 (kuvailtu edellä, kuvio 3A) ja koetinta, joka tunnistaa endogeeniset ksy-20 lanaasisekvenssit (EP-patenttihakemus 0 463 706 A). Tulokset ainoastaan neljästä transformantista (#19, #23, #24, #41) ja kontrollikannasta A. niqer CBS 531.88 on ; ;*; esitetty esimerkkeinä kuviossa 10A. Tämän autoradiogram- min paremmin ymmärtämiseksi, kuviossa 11 esitetään hybri- • * 25 disoituvien fragmenttien koko käsittelemättömissä ja ty- .Y# pistetyissä qlaA-lokuksissa.

« ·

* I

»

Tunnusomaista käsittelemättömälle qlaA-lokukselle on 3,5 » · · *·' * kb hybridisoituva fragmentti BamHI-hydrolysaatissa ja 4,5 30 kb hybridisoituva fragmentti Kpnl-hydrolysaatissa (kuvio :,· : 11A) . Typistetystä glaA-lokuksesta 3,5 kb BamHI hybri- '·/· ’· disoituva fragmentti ja 4,5 kb Kpnl hybridisoituva frag- mentti puuttuvat, ja ne on korvattu 5,5 kb BamHI hybri- • » disoituvalla fragmentilla ja 6,3 kb Kpnl hybridisoituval- i »

35 la fragmentilla. Tässä esimerkissä, kuten kuvasta 10A

Y,·’ voidaan havaita, transformantilla #19 esiintyy odotettu * » > * I ·

1 I

1 1 4481 41 kuvio typistetystä qlaA-lokuksesta (kuvio 11B). Tälle transformantille annettiin tunnus GBA-102.

Muissa transformanteissa ei ollut tapahtunut qlaA-qeenin 5 korvautumista. Heikosti hybridisoituvat vyöhykkeet: 4, 8 ja 15 kb Konl-hydrolysaatissa. ja 7 ja 12 kb BamHI-hydro-lysaatissa viittaavat ksylanaasisekvensseihin sisäisinä kontrolleina.

10 amds-geenin poistaminen A. niger GBA-102:sta vastavali-koinnin avulla fluoriasetamidia sisältävillä maljoilla amdS-geeni transformantissa A. niger GBA-102 poistettiin jälleen kuten kokeellisessa on kuvailtu, amds-valinta-15 merkkigeenin poistuminen vain kahdesta elinkykyisestä yhdistelmäkannasta varmistettiin kromosomaalisen DNA:n Southern-analyysin avulla. Suurimolekyylipainoinen DNA eristettiin, pilkottiin BamHI:11a ja Kpnl:llä ja erotettiin sen jälkeen elektroforesoinnin avulla 0,7 %:isella 20 agaroosigeelillä. Nitroselluloosalle siirtämisen jälkeen suoritettiin hybridisaatio vakiomenetelmien mukaisesti, käyttäen aikaisemmassa jaksossa kuvailtuja koettimia.

, Kaaviomainen esitys hybridisoituvista fragmenteista on t t · · ·,·. esitetty kuviossa 11C. Southern-analyysien tulokset esi- 25 tetään kuviossa 10B. Hybridisoituvan 5,2 kb BamHI-frag- i mentin ja 3,4 kb hybridisoituvan Kpnl-fragmentin läsnä- i · · • ·’ olo, ja siihen liittyvä hybridisoituvan 5,5 kb BamHI- * * * *"* fragmentin ja hybridisoituvan 6,3 kb Kpnl-fragmentin me- V ‘ netys on ominaista amdS-valintamarkkerin puuttumiselle.

30 Heikommat hybridisoituvat 7 ja 12 kb fragmentit BamHI-i *. · hydrolysaatissa, ja 4, 8 ja 15 kb Kpnl-fragmentit viit- iT: taavat jälleen endogeeniseen ksylanaasilokukseen. Kummal- 1 . lakin kannalla esiintyy odotettu kuvio. Näissä yhdistel- I · ,,, mäkannoissa, joiden tunnukset olivat GBA-107 ja GBA-108, » » *···* 35 edulliset qlaA-sekvenssit poistetaan oikein eikä sillä » : : : lopulta ole valintamerkkigeeniä lainkaan. Molempia kanto- ;·*; ja voidaan käyttää uudelleen muiden geenien tai DNA-osien 114481 42 poistamiseksi tai liittämiseksi käyttäen samantyyppistä vektoria.

Esimerkki 2 5 glaA-qeenin merkkioeenivapaa toimittaminen kohdistettuna typistetyn glaA-lokuksen qlaA:n 3'-pään ei-koodittavaan alueeseen A. niqer GBA-107:ssä Tässä esimerkissä kuvaillaan geenin toimittamista A. ni-10 qerin genomiin käyttäen suunnilleen samaa lähestymistapaa ja menetelmiä kuin edellisessä esimerkissä on kuvailtu. Halutun geenin tai DNA-palan lisäksi vektori sisältää isäntägeenille homologisia DNA-sekvenssejä vektorin kohdentamiseksi isännän ennaltamäärättyyn genomiseen lokuk-15 seen yksinkertaisen tekijäinvaihdon avulla. Tämäntyyppinen vektori sisältää valintamerkkigeenin, jonka vieressä on lisäksi DNA-toistojaksoja. Valintamerkkigeeni tällä vektorilla saaduissa transformanteissa voidaan poistaa jälleen sopivasti käyttäen vastavalikointimenetelmää.

20 Esimerkki glaA-geenikopion toimittamisesta kuvataan, joka integroituu typistettyyn qlaA-lokukseen AglaA A. niqer GBA-107 yhdistelmäkantaan, joka saatiin esimerkissä I , ,·, (kaaviokuva kuviossa 12).

I « · il1 · I 1 I « · I 1 1 ' t 25 glaA-integrointivektorin kuvaus: pGBGLA30 « · · * * 1 t · 1 | t t ' ·’ Integrointivektori pGBGLA30 sisältää A. nigerin amyloglu- * kosidaasigeenin (glaA) natiivin promoottorin ohjauksessa, V · ja A. nidulansin amdS-geenin A. nidulansin qpdA-promoot- 30 torin ohjauksessa, jota vierustavat glaA:n 3'-pään ei-1 koodittavat sekvenssit, integroitumisen ohjaamiseksi f » 1 · t";'; glaA:n 3'-pään ei-koodittavaan alueeseen ja amdS-valinta- ’ , merkkigeenin poistamiseksi vastavalikoinnin kautta.

t 1 » » 1 > » * r i % i * I lit i t I « · 1 I « S I 1 1 1 ft ft 114481 43

Inteqrointivektorin konstruointi 1,8 kb XhoI/EcoRI alaA -promoottorifragmentti pAB6-l:stä (kuvio 13) subkloonattiin Smal- ja EcoRI-kohtiin 5 pTZ19R:ssä (United States Biochemicals). glaA-promootto-rifragmentin XhoI-kohdan esiintyöntyvä 5'-pää täytettiin käyttäen E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmenttia ennen kloonaamista pTZ19R:ään. Smal-kohta tuhoutuu ja XhoI-kohta säilyy tässä kloonausmenetelmässä. Siten saatu 10 plasmidi merkittiin tunnuksella pGBGLAS (kuvio 13).

Sopivien restriktiokohtien (Aatu, SnaBI. Asnl ja NotI) toimittamiseksi ja XhoI-kohdan tuhoamiseksi glaA-promoot-torissa, synteettinen fragmentti, joka sisälsi kaksi oli-15 gonukleotidiä AB3657:n (SEKVENSSI ID NO:10) ja AB3658:n (SEKVENSSI ID N0:11): 5' AGCTTGACGTCTACGTATTAATGCGGCCGCT 3' AB3657 IIIIIIMIIIIIIIIIMIimill 20 3' ACTGCAGATGCATAATTACGCCGGCGAAGCT 5' AB3658 liitettiin pGBGLA5:n Hindin- ja XhoI-kohti in. Siten saatu plasmidi sai tunnuksen pGBGLA26 (kuvio 14).

• 1 « » « · 25 Seuraavaksi 3,4 kb EcoRI-fragmentti pAB6-l:stä, joka si-sälsi jäljelle jääneen 3'-osan glaA-promoottorista. glaA- • · kooditussekvenssin ja osan glaA:n 3'-pään ei-koodittavas-'·' ta sekvenssistä, kloonattiin pGBGLA26:n EcoRI-kohtaan.

Tämän uuden plasmidin tunnukseksi tuli pGBGLA27 (kuvio t · · ·’ 30 15). Tämä plasmidi pilkottiin osittain EcoRI:llä ja syn

teettinen fragmentti, joka sisälsi oligonukleotidit :.: i AB3779 (SEKVENSSI ID NO: 12) ja AB3780 (SEKVENSSI ID

V: NO:13): .···. 35 5' AATTGGGGCCCATTAACTCGAGC 3' AB3779

Il MIMMIN II III II

. ... 3' CCCCGGGTAATTGAGCTCGTTAA 5' AB3780 • · · 1 1 » · • · 114481 44 liitettiin EcoRI-kohtaan glaA-geenin 3' glaA ei-kooditta-van sekvenssin päähän. Tässä kloonausvaiheessa EcoRI-kohta tuhoutui ja Apal- ja Xhol-restriktiokohdat toimitettiin. Tuloksena oleva plasmidi sai tunnuksen pGBGLA42 5 (kuvio 16).

2,2 kb glaA:n 3'-pään ei-koodittavien sekvenssien monistaminen ja yhtäaikainen sopivien restriktiokohtien säätö suoritettiin polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla.

10 Näissä PCR-reaktioissa plasmidia pAB6-l, joka sisälsi koko glaA-lokuksen. käytettiin templaattina ja alukkeiksi konstruoitiin neljä synteettistä oligonukleotidiä, joilla oli seuraavat sekvenssit: 15

Oligo AB3448 (SEKVENSSI ID N0:14): 5' GTGCGAGGTACCACAATCAATCCATTTCGC 3' (glaA:n 3'-pään ei-koodittava spesifinen sekvenssi juuri glaA-geenin lopetuskodonin alapuolella) 20 Oligo AB3449 (SEKVENSSI ID NO:15): 5' ATGGTTCAAGAACTCGGTAGCCTTTTCCTTGATTCT 3' (glaA:n 3'-pään ei-koodittava spesifinen sekvensi Kpnl- , .·. kohdan ympärillä suunnilleen l kb lopetuskodonin alapuo- • · ;:v lella) *: 25 Oligo AB3450 (SEKVENSSI ID N0:16): ., * I 5'AGAATCAAGGAAAAGGCTACCGAGTTCTTGAACCAT 3' : ‘ (glaA:n 3'-pään ei-koodittava spesifinen sekvensi Kpnl- kohdan ympärillä suunnilleen 1 kb lopetuskodonin alapuo-V · lella) 30 Oligo AB3520 (SEKVENSSI ID NO:17): i 5' ATCAATCAGAAGCTTTCTCTCGAGACGGGCATCGGAGTCCCG 3' mi · (glaA:n 3'-pään ei-koodittava spesifinen sekvenssi suun- % ’ . nilleen 2,2 kb lopetuskodonin alapuolella) * » * * · • · · ·;·’ 35 Kpnl-kohdan tuhoamiseksi suunnilleen 1 kb glaA-geenin ; lopetuskodonin alapuolella ja Sali-kohdan muuttamiseksi ·;·· suunnilleen 2,2 kb glaA-geenin lopetuskodonin alapuolella 114481 45

Xhol-kohdaksi, kaksi erillistä polymeraasiketjureaktiota suoritettiin: ensimmäinen reaktio oligonukleotidit AB3448 (SEKVENSSI ID NO:14) ja AB3449 (SEKVENSSI ID NO: 15) alukkeina, suunnilleen 1 kb DNA-fragmentin monistamiseksi 5 juuri qlaA-aeenin lopetuskodonin alapuolella, ja toinen reaktio oligonukleotidit AB3450 (SEKVENSSI ID NO:16) ja AB3520 (SEKVENSSI ID NO:17) alukkeina, suunnilleen 1,2 kb DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sijaitsee juuri Kpnl-kohdan alapuolella qlaA:n 31-pään ei-koodittavalla alu-10 eella, kumpikin pAB6-l templaattina. Kaaviokuva näistä monistuksista on esitetty kuviossa 17A. PCR suoritettiin kuten esimerkissä 1 on kuvailtu. Kaksikymmentäviisi monistus jaksoa suoritettiin (kukin 1 minuutti 55°C:ssa; 1,5 minuuttia 72°C:ssa ja 1 minuutti 94°C:ssa).

15

Kaksi muodostettua PCR DNA -fragmenttia puhdistettiin agaroosigeelielektroforesoinnin ja etanolisaostuksen avulla ja käytettiin sen jälkeen templaatteina kolmannessa PCR:ssä, oligonukleotidit AB3448 (SEKVENSSI ID NO:14) 20 ja AB3520 (SEKVENSSI ID NO:17) alukkeina, fuusiofragmen-tin muodostamiseksi. Kaksikymmentäviisi monistusjaksoa suoritettiin (kukin 2 minuutti 55°C:ssa; 3 minuuttia 72°C:ssa ja 2 minuutti 94°C:ssa) DNA:n monistuslaitteessa * · · ",V (Perkin-Elmer/Cetus) . Monistettu DNA-fragmentti puhdis- t I * 25 tettiin agaroosigeelielektroforesoinnin ja etanolisaos-tuksen jälkeen ja subkloonattiin sen jälkeen pTZ18R:n t · * • Smal-kohtaan. Saatua plasmidia nimitettiin tunnuksella pGBGLA17 (kuvio 17B) .

» * i · · 30 Tämän glaA:n 3'-pään ei-koodittavan alueen yhdistämiseksi : amdS-geeniin, osa amdS-geenistä subkloonattiin pGBDEL4L:- stä pSP73:een (Pr omega) . Tätä konstruointia varten pGBDEL4L pilkottiin Bqlll:11a ja Hindlll:11a. 3,4 kb ‘ ’ amdS/glaA:n 3' ei-koodittava fragmentti eristettiin aga- 35 roosigeelielektroforeesin avulla ja subkloonattiin ; ;*: pSP73:n (Promega) sopiviin kohtiin. Tuloksena saatu plas-

t · I

midi sai tunnuksen pGBGLA21 (kuvio 18) .

114481 46

Suunnilleen 1 kb kokoinen glaA:n 3'-pään ei-koodittava alue tässä plasmidissa vaihdettiin pGBGLAl7:n 2,2 kb glaA:n 3'-pään ei-koodittavaan alueeseen. pGBGLA17 ja pGBGLA21 pilkottiin Kpnl:llä ja Hindlll:11a. pGBGLA17:n 5 glaA:n 2,2 kb 3'-pään ei-koodittavan alueen DNA-fragmentti pGBGLA17:sta ja 4,9 kb DNA-fragmentti pGBGLA21:stä eristettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla, liitettiin ja seuraavaksi kloonattiin molekulaarisesti siirtämällä ligaatioseos E. coliin. Siten saatu plasmidi sai 10 tunnuksen pGBGLA22 (kuvio 19).

amdS-geeni pidennetyllä 31glaA ei-koodittavalla alueella tehtiin valmiiksi qpdA-promoottorin kanssa ja yhdistettiin amdS-geenin jäljellä olevaan osaan. pGBGLA22 pilkot-15 tiin Bqlll:11a ja Hindlll:11a. 4,4 kb amdS/3'gla ei-koodittavan alueen DNA-fragmentti eristettiin agaroosigee-lielektroforesoinnin avulla, liitettiin sen jälkeen Bqlll:11a ja Hindlll:11a pilkottuun pGBGLA24:ään ja siirrettiin E. coliin. Siten saatua plasmidia merkittiin 20 pGBGLA25 (kuvio 20) .

pGBGLA25 pilkottiin osittain EcoRI:llä ja qpdA-promootto-rin EcoRI-kohtaan liitettiin synteettinen fragmentti, IV joka sisälsi kaksi oligonukleotidiä AB3781 (SEKVENSSI ID 25 NO:18) ja AB3782 (SEKVENSSI ID NO:19): ( · i • · · *·: 5' AATTGGGGCCCAGCGTCC 3' AB3781

111111111IIIII

::: 3· CCCCGGGTCGCAGGTTAA 5' AB3782 ♦ · · 30 Tämän uuden plasmidin nimeksi tuli pGBGLA43 (kuvio 21).

* · · ’· Tästä kloonausvaiheesta johtuen, EcoRI restriktiokohta V · juuri ennen qpdA-promoottoria tuhoutui toimittamalla

Apal-restriktiokohta.

.·«·. 35

Plasmidi pGBGLA43 pilkottiin Apal:llä ja XhoI:llä ja 5,3 :.i.: kb DNA-fragmentti, joka sisälsi qpdA-promoottorin/amds- geenin/3 ’qlaA:n ei-koodittavan alueen, eristettiin aga- 47 1 1 4481 roosigeelielektroforeesin avulla, ligoitiin sen jälkeen Anal:llä ja XhoI;llä pilkotun pGBGLA42:n kanssa ja siirrettiin E. coliin. Saadulle plasmidille tuli tunnus pGBGLA28 (kuvio 22).

5

Ennen kloonausta 3'glaA ei-koodittavan alueen DNA-frag-mentti (sijaiten suunnilleen 2,2 kb qlaA-geenin lopetus-kodonin alapuolella, tunnuksella 31'qlaA ei-koodittava alue) monistettiin ja varustettiin sopivilla restrik-10 tiokohdilla käyttäen PCR-menetelmää.

Tätä PCR-reaktiota varten plasmidia pAB6-l käytettiin templaattina ja alukkeiksi konstruoitiin kaksi synteettistä oligonukleotidiä, joilla oli seuraavat sekvenssit: 15

Oligo AB3746 (SEKVENSSI ID NO:20): 5' TGACCAATAAAGCTTCTCGAGTAGCAAGAAGACCCAGTCAATC 3' (osaksi 3'glaA ei-koodittava spesifinen sekvenssi Sali-kohdan ympärillä, sijaiten noin 2,2 kb qlaA-geenin lope-20 tuskodonin alapuolella)

Oligo AB3747 (SEKVENSSI ID N0:21): 5' CTACAAACGGCCACGCTGGAGATCCGCCGGCGTTCGAAATAACCAGT 3· (osaksi 3''qlaA ei-koodittava spesifinen sekvenssi XhoI-;*.* kohdan ympärillä, sijaiten noin 4,4 kb qlaA-geenin lope- ·*;’ 25 tuskodonin alapuolella) X * « ; V Kaksikymmentäviisi monistusjaksoa suoritettiin (kukin 1 t ,.*,·* minuutti 55°C:ssa; 1,5 minuuttia 72°C:ssa ja 1 minuutti ; i : 94°C:ssa) suoritettiin DNA:n monistuslaitteessa (Perkin- 30 Elmer/Cetus). Kaaviomainen esitys tästä monistamisesta on J esitetty kuviossa 23A. Siten saatu DNA-fragmentti pilkot- , tiin Hindlll: 11a. puhdistettiin agaroosigeelielektrofo- * * · reesin ja etanolisaostuksen avulla ja subkloonattiin mo- * lemmissa orientaatioissa pTZ19R:n HindiII-kohtaan. Tulok- • « · 35 sena saadut plasmidit saivat tunnukset pGBGLA29A ja . pGBGLA29B (kuvio 23) .

» * » » » 114481 48

Viimeinen vaihe käsittää 31'glaA ei-koodittavan sekvenssin pGBGLA29A:sta liittämisen plasmidiin pGBGLA28. Tämän aikaansaamiseksi pGBGLA29A pilkottiin Hindlll:11a ja Not-:llä. 2,2 kb kokoinen 3'glaA ei-koodittavan alueen frag-5 mentti eristettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla, liitettiin sen jälkeen Hindlll;11a ja NotI;llä pilkottuun pGBGLA28:aan ja siirrettiin E. coliin. Saatua integraa-tiovektoria nimitettiin pGBGLA30:ksi (kuvio 24).

10 A. niqer GBA-107:n transformointi integraatiovektori11a PGBGLA30

Ennen transformointia E. coli -sekvenssit poistettiin integraatiovektorista pGBGLA30 Xhol-pilkonnalla ja aga-15 roosigeelielektroforesoinnilla. A. niqer -kanta GBA-107 transformoitiin joko 5 tai 10 Mg:11a DNA-fragmenttia koemenetelmät- jaksossa kuvailluilla menetelmillä. Yksittäisiä A. niqer -transformantteja puhdistettiin useita kertoja valikoivilla, asetamidia sisältävillä maljoilla.

20 Yksittäisten transformanttien itiöitä kerättiin noin 5 päivän kasvatuksen jälkeen 30°C:ssa 0,4 %:isella pe-runadekstroosiagarmaljoilla (Oxoid, Englanti). Southern-analyysit suoritettiin sen varmistamiseksi, oliko integ-roituminen endogeenisen typistetyn glaA-lokuksen 31 glaA

! · · •25 ei-koodittavaan alueeseen tapahtunut. Useiden transfor- mänttien suurimolekyylipainoinen DNA eristettiin, pilkot- • · · : .* tiin joko Koni:llä taai Bqlll:11a ja fraktioitiin sen jälkeen elektroforesoimalla 0,7 %:isella agaroosigeelil-·· : ·* lä. Hybridisointi suoritettiin nitroselluloosakalvoille 30 siirtämisen jälkeen vakiomenetelmien mukaisesti. Koetti- • mena käytettiin 32P-leimattua, suunnilleen 0,7 kb Xhol/Sall glaA -promoottorifragmenttia, joka oli eristet- • , ty plasmidista pAB6-4 (kuvailtu esimerkissä 1). Tulokset vain kolmesta transformantista (#107-5, #107-9 ja #107,7) i · ·

I I

35 ja vertailukannasta A. niqer GBA107 ja sen kantamuodosta • ;*: A. niqer CBS 531.88 on esitetty esimerkkinä kuviossa 25.

* · »

Jotta autoradiogrammi tulisi paremmin ymmärretyksi, ku- 114481 49 viossa 26A,B,C on kaavioesitys, joka osoittaa hybridisoi-tuvien fragmenttien kokoja koskien käsittelemätöntä alaA-lokusta, typistettyä alaA-jokusta ja typistettyä qlaA-lo-kusta, jossa yksi pGBGLA30-kopio on integroitunut ennalta 5 määrättyyn 3'glaA ei-koodittavaan alueeseen.

Tunnusomaista käsittelemättömälle qlaA-lokukselle on 4,5 kb hybridisoituva fragmentti Kpnl-hydrolysaatissa ja 10 kb hybridisoituva fragmentti Bqlll-hydrolysaatissa. Tun-10 nusomaista A. niqer GBA-107:n typistetylle glaA-lokuksel-le on 3,4 kb hybridisoituva fragmentti Kpnl-hydrolysaa-tissa ja 13 kb hybridisoituva fragmentti Bglll-hvdro-lysaatissa. Kun kysymyksessä on pGBGLA30-vektorin integroituminen typistetyn qlaA-lokuksen 31-alueeseen, Kpnl-15 hydrolysaatissa on odotettavissa vielä 6,7 kb hybridisoituva fragmentti, 3,4 kb hybridisoituvan fragmentin lisäksi, ja Bqlll-hydrolysaatissa 13 kb hybridisoituva fragmentti puuttuu ja on korvattu 14,5 kb hybridisoituvalla fragmentilla. Kuten kuviosta 25 voidaan havaita, trans-20 formanteilla #107-5 ja #107-9 esiintyy odotettu hybri- disaatiokuvio yhden pGBGLA30-kopion ollessa integroitunut ennalta määrättyyn typistetyn qlaA-lokuksen 3' ei-koodit-. tavaan alueeseen. Transformantin #107-7 hybridisaatioku- i · · »at vio osoittaa pGBGLA3 0-kopion integroitumisen toisaalle A.

> » · '*’·* 25 niqer GBA-107:n genomiin. Transformantit, joilla • · · pGBGLA30-kopio oli integroitunut oikein, nimettiin tun-; *.· nuksilla GBA-119 ja GBA-122, ja niitä käytettiin amdS- '·* valintamerkkigeenin asianmukaiseen poistamiseen sen j älli’: keen.

30 /. amdS-valintamerkkiqeenin poistaminen A. niqer -kannoista ti· · , :* GBA-119 ia GBA-122 vastavalikoinnin avulla fluoriasetami- • · · dia sisältävillä maljoilla t I f 35 A. niqer -transformanttien GBA-119 ja GBA-122 amdS-valin-, tamerkkigeeni poistettiin jälleen kuten menetelmät-jak- »I * sossa on kuvailtu. amdS-valintamerkkigeenin poistuminen 114481 50 useista eloonjääneistä yhdistelmäkannoista varmistettiin kromosomaalisen DNA:n Southern-analyysin avulla. Suurimo-lekyylipainoinen DNA eristettiin, pilkottiin joko Koni:-llä tai BqlII:lla ja erotettiin sen jälkeen elektrofo-5 resoimalla 0,7 %:isella agaroosigeelillä. Nitrosellu-loosalle siirtämisen jälkeen hybridisaatio suoritettiin vakiomenetelmien mukaisesti. Koettimena käytettiin plas-midista pGBGLA29A (kuvailtu edellä, kuvio 24) eristettyä, 32P-leimattua 2,2 kb Hindlll/NotI 3 ' 'qlaA ei-koodi ttavaa 10 fragmenttia.

Kaaviomainen esitys hybridisoituvista fragmenteista esitetään kuviossa 26. Kuviossa 27A,B on esitetty tulokset vain kolmesta eloonjääneestä yhdistelmäkannasta A. niqe-15 ristä GBA-119 (#AG5-5, #AG5-6 ja #AG5-7), samoin kuin kolmesta eloonjääneestä yhdistelmäkannasta A. nigeristä GBA-122 (#AG9—1, #AG-9-2 ja #AG9-4) ja vertailukannoista A. niqer CBS 531.88 ja A. niger GBA-107.

20 Kannassa A. niqer CBS 531.88, 6,9 kb hybridisoituva fragmentti on läsnä Kpnl-hvdrolysaatissa ja 6,9 kb hybridisoituva fragmentti BgjLII-hydrolysaatissa. A. niqer -kannassa GBA-107, 6,9 kb hybridisoituva fragmentti on • * · läsnä Kpnl-hvdrolvsaatissa ja 13 kb hybridisoituva frag- T t · ' ; 25 mentti BgjLII-hydrolysaatissa. A. niqer -kannoissa GBA-119 •j ja GBA-122, joissa on yksi pGBGLA30-kopio integroituneena * ·’ 3'gjLaA ei-koodittavaan alueeseen, 8 kb ja 6,7 kb hybri- .disoituvat vyöhykkeet ovat läsnä Kpnl-hydrolysaatissa, ja V : 14,5 kb ja 7,6 kb hybrid iso i tuvat vyöhykkeet ovat läsnä 30 Bqlll-hydrolysaatissa.

» · * » » ti· ·

Ominaista amdS-valintamerkkigeenin oikealle poistamiselle • , on 6,7 kb ja 8,5 kb hybridisoituvien fragmenttien läsnä- * » »» » olo Kpnl-hydrolysaatissa ja yhtäaikainen 8 kb hybridisoi-35 tuvan fragmentin menetys. BgjLII-hydrolysaatissa 14,5 kb ; ja 6,9 kb hybridisoituvat fragmentit ja yhtäaikainen 7,6 • I 9 kb hybridisoituvan fragmentin menetys ovat ominaista 114481 51 amdS-valintamerkkigeenin puuttumiselle. Kuten kuviosta 27 voidaan havaita, kannoilla #AG5-7, #AG5-5, #AG9-1 ja AG9-4 esiintyy oikeanlainen hybridisaatiokuvio koskien oikein poistettua amdS-valintamerkkigeeniä. Näitä kantoja mer-5 kittiin tunnuksilla GBA-120, GBA-121, GBA-123 ja vastaavasti GBA-124. Kantojen #AG5-6 ja #AG9-2 hybridisaatioku-viot osoittavat koko pGBGLA30-kopion menetystä, mistä on seurauksena parentaali A. niaer GBA-107 -kanta, joka sisältää vain typistetyn glaA-lokuksen.

10

Kannoista A. niaer GBA-120, GBA-121, GBA-123 ja GBA-124 testattiin ravistelupullofermentaatioissa kyky tuottaa glukoamylaasia. Vertailukantoina testattiin A. niaer CBS 531.88, GBA-107, GBA-119 ja GBA-122. Ravistelupullofer-15 mentaatiot ja glukoamylaasimääritys suoritettiin kuten koemenetelmät-jaksossa on kuvailtu. Kannoilla GBA-119 -GBA-124 voitiin mitata tasot vaihteluvälillä 150-200 U/ml. Nämä glukoamylaasitasot olivat odotettavissa ja verrattavissa tasoihin, jotka saatiin parentaalilla, 20 transformoimattomalla kannalla A. niaer CBS 531.88.

Esimerkki 3 - Fytaasiaeenin markkerivapaa toimittaminen, kohdistaen i t c * V. typistetyn glaA-lokuksen 3*qlaA ei-koodittavaan alueeseen • t .^ 25 A. niaer GBA-107 -kannassa * * Tässä esimerkissä kuvaillaan geenin toimittamista A. ni- * * · '·· aerin genomiin käyttäen suunnilleen samaa lähestymistapaa * » V ' ja menetelmiä kuin edellisessä esimerkissä on kuvailtu.

30 Pääerona on se, että kiinnostava geeni ja valintamerkki- t · j : : geeni sijaitsevat kahdessa erillisessä vektorissa, ja :T: että nämä vektorit yhteistransformoidaan A. niaeriin.

• ‘. Kiinnostavan geenin ja merkkigeenin lisäksi vektorit si- sältävät isäntägenomin suhteen homologisia DNA-sekvensse- » * ’*;·* 35 jä vektorien kohdentamiseksi isännän ennalta määrättyyn ’ 1'· genomiseen lokukseen yksinkertaisen tekijäinvaihdon avul- ·:**: la. Suorittamalla fluoriasetamidivastavalikointi näillä 114481 52 (ko)-transformanteilla (kuten koemenetelmät-jaksossa on kuvailtu), amds-merkkigeeni poistuu asianmukaisesti sisäisen rekombinaation avulla DNA-toistojaksojen välillä, jotka muodostuvat integraation kautta yksinkertaisella 5 tekijäinvaihdolla.

Yhteistransformointiin käytettyjen vektoreiden kuvailu

Kiinnostavan geenin sisältävä vektori pGBGLA53 sisältää 10 A. ficuumin fytaasigeenin A. niqerin glukoamylaasin (glaA) -promoottorin ohjauksessa, jonka vieressä ovat 3' glaA ei-koodittavat sekvenssit, integroitumisen ohjaamiseksi 3'glaA ei-koodittavaan alueeseen. Valintamerkkigee-nin sisältävä vektori pGBGLASO sisältää A. nidulansin 15 amdS-geenin A. nidulansin gpdA-promoottorin ohjauksessa, jonka vieressä ovat 3'glaA ei-koodittavat sekvenssit integroitumisen ohjaamiseksi 3'glaA ei-koodittavaan alueeseen.

20 pGBGLA50:n konstruointireitti pGBGLASO:n konstruointi käsittää yhden kloonausvaiheen.

. Plasmidi pGBGLA29A pilkottiin Hindin; 11a ja tarttuvat

Hl I

päät täytettiin käyttäen E. colin DNA-polymeraasin Kle- fr » · '/·, 25 now-fragmenttia. Sen jälkeen 2,2 kb 3 ''glaA ei-kooditta- van alueen fragmentti eristettiin agaroosigeelielektrofo- * * reesin avulla, liitettiin sen jälkeen Apal:llä pilkottuun pGBGLA43:een ja käsiteltiin T4 DNA -polymeraasilla tasa- * » » V * päiden muodostamiseksi ja siirrettiin E. coliin. Saatua 30 plasmidia, joka sisälsi 3''glaA ei-koodittavan alueen > · ·,· { DNA-fragment in oikeassa orientaatiossa, merkittiin tun-

Tt:*ϊ nuksella pGBGLASO (kuvio 28).

k • » » i % \ i · ,,. PGBGLA53:n konstruointireitti 35 ίΐί Ensimmäinen vaihe pGBGLA53:n konstruointireitillä on kah- den fragmentin subkloonaus, jotka käsittävät glaA-pro- 53 1 1 4481 moottorin yhdistettynä A^. ficuumin fytaasigeenin melkein koko kooditussekvenssiin. Tämän saavuttamiseksi plasmidi pGBGLA42 pilkottiin Hindlll:11a ja EcoRI:llä. ja 1,8 kb Hindlll/EcoRI 5'glaA -promoottorifragmentti eristettiin 5 agaroosigeelielektroforeesin avulla. Plasmidi pFYT3 (EP-patenttihakemus 0 420 358 AI) pilkottiin EcoRI:llä ja Balll:11a. ja 1,6 kb EcoRI/BalII-fraamentti. joka sisälsi 3'-osan glaA-promoottorista yhdistettynä fytaasigeenin 5'-osaan, eristettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla 10 ja ligoitiin yhdessä 1,8 kb Hindlll/EcoRI 51glaA-promoot-torifragmentin kanssa, joka oli eristetty pGBGLA42:sta, pSp73:n (Promega) HindiII- ja BglII-kohtiin. Tuloksena olevaa plasmidia merkittiin tunnuksella pGBGLA49 (kuvio 29) .

15

Seuraava vaihe on 3'glaA ei-koodittavan alueen DNA-frag-mentin kloonaus pGBGLA49:ään. Ennen kloonausta tämä 3'glaA ei-koodittavan alueen DNA-fragmentti (joka sijaitsi suunnilleen 2,2 kb glaA-geenin lopetuskodonin alapuo-20 lella) monistettiin ja varustettiin sopivilla restrik-tiokohdilla käyttäen PCR-menetelmää.

M : Tätä PCR-reaktiota varten plasmidia pAB6-l käytettiin :.V templaattina ja alukkeiksi konstruoitiin kaksi synteet- .*· 25 tistä oligonukleotidiä, joilla oli seuraavat sekvenssit: « <

Oligo AB4234 (SEKVENSSI ID NO:22): 5 'GAAGACCCAGTCAAGCTTGCATGAGC 3' I I | (3' glaA ei-koodittava sekvenssi, joka sijaitsee suunnil-. 30 leen 2,2 kb glaA-geenin lopetuskodonin alapuolella)

Oligo AB4235 (SEKVENSSI ID NO:23): ‘ 5' TGACCAATTAAGCTTGCGGCCGCTCGAGGTCGCACCGGCAAAC 3' (3'glaA ei-koodittava sekvenssi, joka sijaitsee suunnil-leen 4,4 kb glaA-geenin lopetuskodonin alapuolella).

35 * i % • * ·

Kaksikymmentäviisi monistusjaksoa suoritettiin (kukin 1 minuutti 94°C:ssa; l minuutti 55°C:ssa ja 1,5 minuuttia 114481 54 72°C:ssa) DNA:n monistuslaitteessa (Perkin-Elmer). Kaavioesitys tästä monistuksesta on esitetty kuviossa 30A.

Siten saatu fragmentti pilkottiin Hindlll:11a. puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla ja subkloonat-5 tiin pTZ19R:n Hindlll-kohtaan. Tuloksena oleva plasmidi sai tunnuksen pGBGLA47 (kuvio 30).

Plasmidi pGBGLA47 pilkottiin Hindlll:11a ja Notlrllä, 2,2 kb 3''glaA ei-koodittava DNA-fragmentti eristettiin aga-10 roosigeelielektroforeesin avulla ja kloonattiin pGBGLA49:n Hindlll- ja NotI-kohtiin. Tuloksena oleva plasmidi sai tunnuksen pGBGLASl (kuvio 31).

Viimeinen vaihe pGBGLA53:n konstruointireitillä on DNA-15 fragmentin kloonaus, joka sisältää loppuosan fytaasia koodittavasta sekvenssistä yhdistettynä 3'glaA ei-koodit-tavaan DNA-fragmenttiin, joka sijaitsee juuri glaA-geenin lopetuskodonin alapuolella. Ennen kloonausta loppuosa fytaasigeenistä ja 3’glaA ei-koodittava DNA-fragmentti, 20 joka sijaitsee juuri glaA-geenin lopetuskodonin alapuolella, yhdistettiin ja varustettiin sopivilla restrik-tiokohdilla käyttäen PCR-menetelmää. PCR:ssä käytettiin ; · plasmidia pAB6-l templaattina ja alukkeina käytettiin * • '/> kahta synteettistä oligonukleotidiä, joilla oli seuraavat ·;· 25 sekvenssit: • ► * * * ·

Oligo AB4236 (SEKVENSSI ID NO:24): 5' TGACCAATAAAGCTTAGATCTGGGGGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCTTAGA- « > « CAATCAATCCATTTCGC 3' . . 30 (36 bp fytaasia koodittavasta sekvenssistä, alkaen Bglll- * kohdasta lopetuskodoniin saakka, yhdistettynä 3 1 glaA ei- 'koodittavaan alueeseen, alkaen juuri glaA-geenin lopetus-*;··· kodonin alapuolella)

Oligo AB4233 (SEKVENSSI ID NO:25): 35 5' TGACCAATAGATCTAAGCTTGACTGGGTCTTCTTGC 3' • » i '··’ (3glaA ei-koodittava alue, joka sijaitsee suunnilleen 2,2 kb glaA-geenin lopetuskodonin alapuolella) 114481 55

Kaksikymmentäviisi monistusjaksoa suoritettiin (kukin 1 minuutti 94°C:ssa; 1 minuutti 55°C:ssa ja 1,5 minuuttia 72°C:ssa) DNA:n monistuslaitteessa (Perkin-Elmer). Kaavioesitys tästä monistuksesta on esitetty kuviossa 32A.

5 Siten saatu fragmentti pilkottiin Hindlll:11a. puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla ja subkloonat-tiin pTZ19R:n Hindlll-kohtaan. Tuloksena olevat plasmidit saivat tunnukset pGBGLA48 ja pGBGLA52 (kuvio 32B).

10 Plasmidi pGBGLA52 pilkottiin Bcrlll: 11a ja osittain Bam- HI:llä, 2,2 kb fvtaasi/3'glaA ei-koodittava DNA-fragment-ti eristettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla ja kloonattiin pGBGLA51:n Bqlll-kohtaan. Saatua plasmidia, joka sisälsi 2,2 kb fvtaasi/3'glaA ei-koodittavan DNA-15 fragmentin oikeassa orientaatiossa, merkittiin tunnuksella pGBGLA53 (kuvio 33).

A. niqer GBA-107:n transformointi vektoreilla PGBGLA50 ia PGBGLA53 20

Ennen transformaatiota E. colin sekvenssit poistettiin pGBGLA50:stä ja pGBGLA53:sta Xhol-pilkonnalla ja vastaa- • i vasti Hindlll-pilkonnalla, jota seurasi agaroosigee- : : lielektroforesointi. A. niqer GBA-107 -kanta transformoi- ··* 25 tiin järjestyksessä: 1 /zg:lla pGBGLA50-fragmenttia plus l • Mg: 11a pGBGLA53-fragmenttia, lMg:lla pGBGLA50-fragmenttia plus 5 jttg: 11a pGBGLA53:a, tai 1 Mg:Ha pGBGLA50-fragment- * > ♦ « tia plus 10 Mg: Ha pGBGLA53-fragmenttia käyttäen koemenetelmät-jaksossa kuvailtua transformaatiomenetelmää.

. . 30 * t · ·;· : Yksittäisiä transformantteja eristettiin, puhdistettiin '·' * ja Southern-analysoitiin käyttämällä samoja hydrolysaat- ·;··· teja ja koettimia kuin esimerkissä 2 on kuvailtu, sekä pGBGLA50:n että pGBGLA53:n integraation varmistamiseksi.

·, 35 Noin 10-20 %:ssa analysoituja transformantteja sekä ’·'·' pGBGLA50 että pGBGLA53 oli integroitunut A. niqer GBA-107 ‘ * -isäntäkantaan. Transformanttia, jossa esiintyi oikea 114481 56 integraatiokuvio koskien yhtä pGBGLA50-kopiota ja yhtä pGBGLA53-kopiota, molemmat integroituneina typistetyn qlaA-lokuksen ennalta määrättyyn 3'glaA ei-koodittavaan alueeseen, käytettiin amdS-valintamerkkigeenin poistami-5 seen myöhemmin.

amdS-merkkiaeenin poistaminen vastavalikoinnin avulla fluoriasetamidia sisältävillä maljoilla 10 Suoritettaessa fluoriasetamidivastavalikointia (kuten koemenetelmät-jaksossa on kuvailtu), amdS-merkkigeeni poistettiin sisäisellä rekombinaatiolla DNA-toistojaksojen välillä, jotka muodostuivat integroinnin yhteydessä yksinkertaisen tekijäinvaihdon kautta (so. 3'glaA ei-koo-15 dittavat sekvensit). Ainoastaan amdS-merkkigeenin oikea poistuminen varmistettiin Southern-analyysin avulla käyttäen samoja hydrolysaatteja ja koettimia kuin esimerkissä 2.

20 Esimerkki 4 glaA-geenin ia fvtaasiqeenin merkkiqeenivapaa toimittaminen A. orvzaehin • · » · Tässä esimerkissä kuvaillaan glaA-geenin tai fytaasigee-;· 25 nin merkkigeenivapaata toimittamista A^ orvzaehin | NRRL3485. Aj. orvzae NRRL3485 transformoitiin kuten koeme- * t netelmät-jaksossa on kuvailtu käyttäen samoja vektoreita , ja lähestymistapaa kuin esimerkeissä 2 ja 3. Yksittäisiä • » ♦ transformantteja eristettiin, puhdistettiin ja Southern-, , 30 analyysi suoritettiin kromosomaalisella DNA:11a useille ·;; · transformanteille pGBGLA30-vektorin tai vastaavasti V ‘ pGBGLA50- ja pGBGLA53-vektoreiden integraatioiden varmis- ·;>'· tamiseksi. Southern-analyysissä käytettiin samoja hydro- lysaatteja ja koettimia kuin esimerkissä 2.

\ 35 * » · 114481 57 axndS-cfeenin poistaminen vastavalikoinnin avulla fluo-riasetamidia sisältävillä maljoilla pGBGLA30-vektorin ollessa kysymyksessä käytettiin trans-5 formanttia, jossa oli yksi ainoa pGBGLA30-kopio integroituneena isäntäkannan Aj_ orvzae NRRL3485 -genomiin, amdS-geenin poistamiseksi asianmukaisesti. Vastavalikointi fluoriasetamidia sisältävillä maljoilla suoritettiin kuten koemenetelmät-jaksossa on kuvailtu. amdS-geenin oikea 10 poistuminen varmistettiin useiden fluoriasetamidiresis-tenttien kantojen kromosomaalisen DNA:n Southern-analyy-sillä. Samoja hydrolysaatteja ja koettimia käytettiin kuin esimerkissä 2 on kuvailtu.

15 pGBGLA50- ja pGBGLA53-vektoreiden yhteistransformaation ollessa kysymyksessä, käytettiin transformanttia, joka sisälsi yhden kopion sekä pGBGLA50:a että pGBGLA53:a integroituneena isäntägenomiin, amdS-merkkigeenin poistamiseksi asianmukaisesti. Vastavalikointi fluoriasetamidia 20 sisältävillä maljoilla suoritettiin kuten koemenetelmät-jaksossa on kuvailtu. amdS-merkkigeenin (esim. pGBGLASO-vektori) oikea poistuminen varmistettiin useiden fluo-• · riasetamidiresistenttien kantojen kromosomaalisen DNA:n : Southern-analyysillä käyttäen samoja hydrolysaatteja ja ··· 25 koettimia kuin esimerkissä 2 on kuvailtu.

» * ·

Esimerkki 5 « * « · glaA-geenin ia fytaasiaeenin merkkigeenivapaa toimittaminen T. reeseihin . . 30 *;; * Tässä esimerkissä kuvaillaan glaA-geenin tai fytaasigee- V ' nin merkkigeenivapaata toimittamista Trichoderma reesei - ·;*·· kantaan QM9414 (ATCC 26921) . T. reesei QM9414 transfor- moitiin kuten koemenetelmät-jaksossa on kuvailtu käyttäen ·, 35 samoja vektoreita ja lähestymistapaa kuin esimerkeissä 2 I t * ‘ja 3. Yksittäisiä transformantteja eristettiin, puhdis-' ’ tettiin ja Southern-analyysi suoritettiin kromosomaali- 114481 58 sella DNA:11a useille transformanteille pGBGLA30-vektorin tai vastaavasti pGBGLASO- ja pGBGLAS3-vektoreiden integraatioiden varmistamiseksi. Southern-analyysissä käytettiin samoja hydrolysaatteja ja koettimia kuin esimerkissä 5 2.

amdS-aeenin poistaminen vastavalikoinnin avulla fluo-riasetamidia sisältävillä maljoilla 10 pGBGLA30-vektorin ollessa kysymyksessä käytettiin trans- formanttia, jossa oli yksi ainoa pGBGLA30-kopio integroituneena isäntäkannan Ί\_ reesei QM9414 -genomiin, amdS-geenin poistamiseksi asianmukaisesti. Vastavalikointi fluoriasetamidia sisältävillä maljoilla suoritettiin ku-15 ten koemenetelmät-jaksossa on kuvailtu. amdS-geenin oikea poistuminen varmistettiin useiden fluoriasetamidiresis-tenttien kantojen kromosomaalisen DNA:n Southern-analyy-sillä.

20 pGBGLA50- ja pGBGLAS3-vektoreiden yhteistransformaation ollessa kysymyksessä, käytettiin transformanttia, joka sisälsi yhden kopion sekä pGBGLA50:a että pGBGLA53: a ini',; · tegroituneena isäntägenomiin, amdS-merkkiaeenin poistami- ::: seksi asianmukaisesti. Vastavalikointi fluoriasetamidia ··· 25 sisältävillä maljoilla suoritettiin kuten koemenetelmät- jaksossa on kuvailtu. amdS-merkkigeenin (esim. pGBGLA50- » · vektori) oikea poistuminen varmistettiin useiden f luo-riasetamidiresistenttien kantojen kromosomaalisen DNA:n » » ·

Southern-analyysillä käyttäen samoja hydrolysaatteja ja . . 30 koettimia kuin esimerkissä 2 on kuvailtu.

• i · • i · ti* ·

I * I

• « * t • I t

I » I

t I | » > * •IMI i » 59 114481

Esimerkki 6 P. chrvsoqenumin geenin merkkigeenivapaa toimittaminen P. chrvsoaenumiin vhteistransformaation avulla käyttäen amdS-geeniä valintamarkkerina 5 Tässä esimerkisä kuvaillaan geenin merkkigeenivapaata toimittamista P_j_ chrvsoqenumin genomiin yhteistransformaati-on avulla.

10 Yhteistransformaatiomenettelyssä 2 eri DNA-palaa toimitetaan protoplasteille, toisen niistä ollessa amdS-valinta-markkeri, jonka läsnäollessa tapahtuu ensimmäinen trans-formanttiseulonta kuten koemenetelmät-jaksossa on kuvailtu, toisen ollessa toinen kiinnostava DNA-pala, esim.

15 tiettyä, kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä koodattava. Tietyssä transformanttimäärässä molemmat DNA-palat integroituvat kromosomeihin ja säilyvät ja ilmentyvät pysyvästi.

20 amdS-valintamerkkigeeni voidaan sen jälkeen poistaa valikoivasti puhdistetuista transformanteista käyttämällä vastavalikointimenetelmää, jota on kuvailtu koemenetel- :: mät-jaksossa, samalla kun toinen DNA-pala säilyy pysyväs- # ·/· ti integroituneena transformantin kromosomeihin. Menetel- ··· 25 män yleisen sovellettavuuden valaisuesimerkkinä, niaD- • ·*; geenin merkkigeenivapaa toimittaminen kuvaillaan, joka * · ,j. mahdollistaa niaD-isännän kasvun nitraatti ainoana typen- , lähteenä.

* » > . . 30 Isäntänä tälle yhteistransformaatiolle on P. chrvso- genumin niaD-kanta. jolta puuttuu nitrattireduktaasi, ja '·’ ’ joka sen vuoksi on kykenemätön kasvamaan maljoilla, jotka ;*: sisältävät nitraatin ainoana typenlähteenä. Näitä kantoja on helppo saada aikaan hyvin tunnetuilla menetelmillä 35 (Gouka et ai.., Journal of Biotechnology 20 (1991), 189-

> i I

200, ja siinä olevat viitejulkaisut).

* I

114481 60

Yhteistransformaation aikana (menetelmä kuvailtu koemenetelmät- jaksossa) kaksi DNA-palaa toimitetaan samanaikaisesti protoplasteille: 7,6 kb EcoRI-restriktiofragmentti pGBGLA28:sta, joka sisältää amdS-valintamerkkiaeenin. ja 5 6,5 kb EcoRI-restriktiofragmentti pPCl-l:stä, joka sisäl tää Pj. chrvsoaenumin niaD-aeenin. Ennen transformaatiota kumpikin fragmenteista on erotettu E. colin vektorisek-vensseistä agaroosigeelielektroforeesin avulla ja puhdistettu agaroosigeelistä elektroeluution avulla.

10

Transformanttien ensimmäinen valikointi tapahtui valikoivilla maljoilla, jotka sisälsivät asetamidin ainoana typenlähteenä kuten koemenetelmät-jaksossa on kuvailtu.

15 Transformanttien joukosta löydetään yhteistransformantit toistomaljaamalla puhdistettujen transformanttien itiöitä maljoille, jotka sisältävät nitraatin ainoana typenlähteenä. Tavallisesti noin 20-60 % toistomaljatuista trans-formanteista kykeni kasvamaan tällä alustalla, mikä 20 osoitti, että näissä transformanteissa ei ainoastaan amdS-valintamerkkigeeni vaan myös niaD-geeni oli integroitunut genomiin ja ilmentyi.

* > · v amdS-geenin poistaminen vastavalikoinnin avulla fluo- 25 riasetamidia sisältävillä maljoilla i * * · amdS-valintamerkkigeeni poistetaan sen jälkeen yhteis- i t l · .’:transformanteista vastavalikoinnin avulla fluoriasetami- f * · dilla. Itiöitä siirrostettiin tiheydessä 104 itiötä maljaa . . 30 kohti. 5-7 päivän inkuboinnin jälkeen 25°C:ssa fluo- t t t riasetamidiresistentit pesäkkeet voitiin identifioida * * * ·,* ’ tiiviinä pesäkkeinä, jotka erottuivat selvästi heikkoa taustakasvua vasten. Rekombinanttien niaD+-fenotyyppi osoitetaan niiden kasvulla fluoriasetamidialustalla, joka \ 35 sisältää nitraatin ainoana typenlähteenä. Rekombinanttien I i * amdS-fenotyyppi varmistettiin rekombinanttien kasvun

i i » M

puuttumisena maljoilla, jotka sisälsivät asetamidin aino- 114481 61 ana typenlähteenä. Tyypillisesti 0,1-2 % alunperin malja-tuista itiöistä omasi halutun fenotyypin.

Useiden fluoriasetamidiresistenttien kantojen kromosomaa-5 lisen DNA:n Southern-analyysi varmisti, että amdS-valin-tamerkkigeeni oli poistunut P_j_ chrvsoaenumin genomista.

Esimerkki 7

Kluvveromvces lactis -hiivan amdS-miinus-fenotvvpin tes-10 taus

Edellytys amdS-valintasysteemin käytölle K. lactikselle on se, että tämä hiiva ei sisällä yhtään asetamidaasiak-tiivisuutta. Tämän testaamiseksi K. lactis -kannat CBS 15 683 ja CBS 2360 on testattu seuraavilla kolmella eri kiinteällä alustalla: I Hiivan hiiliperusalusta (Yeast Carbon Base, YCB, Dif-co), joka sisältää kaikki olennaiset ravinteet ja vita- 20 miinit lukuunottamatta typpilähdettä.

II YCB täydennettynä 5 mM asetamidilla.

» · * · III YCB, joka sisältää 0,1 % (paino/tilavuus) NH4(S04)2.

» ♦ 25 ,*. Kaikki kolme alustaa sisälsivät 1,2 % (paino/tilavuus)

Oxoid-agaria (agar n:o 1) ja 30 mM natriumfosfaattipusku-ria pH:ssa 7,0. Difcon YCB:tä käytettiin pitoisuudessa # i · ‘ 1,17 % (paino/tilavuus).

30 * 1 · : Täysin kasvaneita K. lactis -pesäkkeitä havaittiin vain V ’ alustalla III, joka sisälsi ammoniakkia typenlähteenä.

Maljoilla, joista puuttui typenlähde tai asetamidi oli ,*·*, ainoa typenlähde, kasvua ei havaittu tai havaittiin sa- > » 35 tunnaisesti lievää taustakasvua, joka todennäköisesti I I * johtui agar ia kontaminoivasta vähäisestä typpimäärästä •’ · tai muista alustakomponenteista. Johtopäätöksenä on se, 114481 62 että kummastakin K. lactis -kannasta puuttuu riittävä asetamidaasiaktiivisuus pitämään yllä kasvua asetamidi ainoana typenlähteenä. Tämän tulisi mahdollistaa A. nidu-lansin amdS-geenin käytön valintamarkkerina K. lactis -5 hiivassa.

Esimerkki 8

Plasmidien konstruointi amdS-geenin käyttämieksi hiivoissa 10 pGBBamdSl:n konstruointi

Plasmidia pGBHSA20 on aikaisemmin käytetty ihmisen seerumin albumiinin (HSA) ilmentämiseksi K. lactiksessa (Swin-kels et ai., 1993, Antonie van Leeuwenhoek 64., 187-201).

15 pGBHSA20:ssä HSA cDNA:ta ohjaa K. lactiksen LAC4-promoot-tori (kuvio 34, plasmidin pGBHSA20 fyysinen kartta). HSA cDNA:n 3·-päätä vierustavat LAC4-terminaattorisekvenssit. Transformanttien valikoimiseksi pGBHSA20 sisältää Tn5-fosfotransferaasigeenin, joka antaa resistenssin antibi-20 ootille G418 (Geneticin, BRL) (Reiss et ai., (1984) EMBO

J. 3., 3317-3 322), jota ohjaa S. cerevisiaen ADHl-promoot-tori (Bennetzen ja Hall (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025) . LAC4-promoottorin tunnusomaisessa Sstll-kohdassa pGBHSA20 sisältää E. coli -vektorin pTZ19R, jota käyte- » 25 tään monistamiseen E. colissa. Ennen transformointia K.

i t , ,‘j lactikseen. pTZ19R-sekvenssit poistetaan pGBHSA20:stä

Sstll-pilkonnan ja agaroosigeelipuhdistuksen avulla.

t LAC4-promoottorin Sstll-kohdassa lineaariseksi tehdyn f i t 1 pGBHSA20:n transformointi K. lactikseen johtaa integroi- 30 tumiseen genomiseen LAC4-promoottoriin homologisen rekom-! binaation avulla. pGBamdSl saadaan pGBHSA20:stä korvaa- V * maila amdS cDNA pamdSl:stä HSA cDNA:lla. Sali-kohdat toi- »i | mitettiin PCR:ää käyttäen amdS cDNA:n 5'- ja 3'-päihin.

Tässä PCR:ssä pamdSl:tä käytettiin templaattina ja oligo-35 ja AB3514 (SEKVENSSI ID NO:26) ja AB3515 (SEKVENSSI ID

» * t ‘i·1 NO:27) käytettiin alukkeina.

» i > > « «

I I

114481 63

Oligo AB3514 (SEKVENSSI ID NO:26): 5'-CTGCGAATTCGTCGACATGCCTCAATCCTGGG-3' (5'-pään amdS-spesifinen sekvenssi, joka sisältää toimitetun Sali-kohdan) 5

Oligo AB3515 (SEKVENSSI ID NO:27): 5'-GGCAGTCTAGAGTCGACCTATGGAGTCACCACATTTC-3' (3'-pään amdS-spesifinen sekvenssi, joka sisältää toimitetun Sali-kohdan).

10

Siten saatu PCR-fragmentti pilkottiin Sali:llä ja kloonattiin pGBHSA20:n Sall/XhoI-kohtiin. Useita klooneja saatiin, jotka sisälsivät jommankumman kahdesta mahdollisesta amdS cDNA:n orientaatiosta restriktioanalyysistä 15 pääteltynä. Yksi klooneista, joka sisältää amdS cDNA:n oikeassa orientaatiossa, on pGBamdSl, jonka fyysinen kartta on esitetty kuviossa 34.

pGBamdS3:n konstruointi 20

Heterologisen hybridisaation avulla, käyttäen koetinta, joka on peräisin S. cerevisiaen pidennystekijän 1-a-gee-nistä (Fl-α; Nagata et ai., (1984) EMBO J. 3, 1825-1830), on eristetty genominen klooni, joka sisältää EFl-a-cteenin

t t I

25 K. lactis -homologin, jolla on tunnus K1EF1. Tässä esi-‘ ; merkissä on käytetty 813 bp fragmenttia, joka sisältää •j K1EF1-promoottorin, amdS-aeenin ilmentämiseksi K. lactik-

·* ·' sessa. Käyttämällä oligonukleotidejä AB3701 (SEKVENSSI ID

NO:28) ja AB3700 (SEKVENSSI ID NO:29), tämä fragmentti V > 30 monistettiin PCRrssä käyttäen templaattina genomista DNA:ta K. lactis -kannasta CBS 683. AB3700 (SEKVENSSI ID ; NO:29) konstruoidaan siten, että se sisältää 21 nukleoti- :';'= diä KlEF-promoottorista ja 38 nukleotidiä amdS-geenin • _ ATG-aloituskodonin yläpuolelta.

* * > < » !. 35 AB3701:n (SEKVENSSI ID NO:28) ja AB3700:n (SEKVENSSI ID : NO:29) on kuten on esitetty jäljempänä:

I I

64 114481

Oligo AB3701 (SEKVENSSI ID NO:28): 5'-CTGCGAATTCGTCGACACTAGTGGTACCATTATAGCCATAGGACAGCAAG 3· (5' KlEFl-spesifinen promoottorisekvenssi, joka sisältää lisärestriktiokohdat EcoRI. Sali. Spel, ja Koni promoot-5 torin 5'-päässä)

Oligo AB3700 (SEKVENSSI ID NO:29): 5·-GCTCTAGAGCGCGCTTATCAGCTTCCAGTTCTTCCCAGGATTGAGGCATTTT-TAATGTTACTTCTCTTGC-3' 10 (3' KlEFl-spesifinen promoottorisekvenssi yhdistettynä amdS cDNA:n 5'sekvensseihin restriktiokohdilla BssH2 ja lisäkohdalla Xbal).

PCR suoritettiin käyttäen vakio-olosuhteita ja saatu PCR-15 fragmentti pilkottiin EcoRI:llä ja Xbal:llä ja subkloo-nattiin EcoRI/Xbal:llä pilkottuun pTZ19R:ään. Tuloksena saadun plasmidin pTZKlEFl fyysinen kartta esitetään kuviossa 35. Loppuosa amdS cDNA:sta samoin kuin osa LAC4-terminaattorisekvensseistä saatiin pGBamdSlrstä pilkko-20 maila BssH2:11a ja Sohi:llä. Tämä BssH2-SphI-fraqmentti kloonattiin BssH2:11a ja Sphl:llä pilkottuun pTZKlEFlreen ja tuloksena saatua plasmidia merkittiin tunnuksella pGBamdS2 (kuvio 35). Viimeisenä vaiheena pGBamdS2:n konstruoinnissa, sekä pGBamdS2 että pTY75LAC4 (Das ja 'iV 25 Hollenberg (1982) Current Genetics 6, 123-128) pilkottiin ' ; Sphl:llä ja Hindlll:11a. 5,7 kb DNA-fragmentti ·; pGBamdS2:sta ja 1,2 kb DNA-fragmentti pTY75LAC4:stä, joka ·’ sisältää loput LAC4-terminaattorisekvenssit. puhdistet- tiin agaroosigeeleiltä fraktioinnin jälkeen ja ligoitiin V : 30 sen jälkeen ja käytettiin E. colin transformointiin. Tu loksena olevaa ekspressiovektoria, jossa amdS cDNArta : ohjaa K. lactiksen KlEFl-promoottori, merkittiin tunnuksi*; sella pGBamdS3 (kuvio 36) .

< » 65 1 1 4481 pGBamdS5:n konstruointi S. cerevisiaen alkohoiidehydrogenaasi I:n (ADHI1) promoottorin yhdistäminen amdS cDNA:han suoritettiin PCRrssä 5 käyttäen pGBHSA20:a templaattina. Toinen alukkeista (AB3703; SEKVENSSI ID NO:31) sisältää sekvenssejä, jotka ovat komplementaarisia ADHl-promoottorisekvenssin 3'-pään suhteen, jotka on yhdistetty amdS cDNA -sekvensseihin.

Toinen aluke (AB3702; SEKVENSSI ID NO:30) sisältää ADH1-10 promoottorin 5'-pään:

Oligo AB3702 (SEKVENSSI ID NO:30): 5'-CTGCGAATTCGTCGACACTAGTGGTACCATCCTTTTGTTGTTTCCGGGTG-3' (5' ADHl-spesifinen promoottorisekvenssi, joka sisältää 15 lisärestriktiokohdat EcoRI. Sali. Soel ja Kpnl promoottorin 5'-päässä).

Oligo AB3703 (SEKVENSSI ID NO:31): 5'-GCTCTAGAGCGCGCTTATCAGCGGCCAGTTCTTCCCAGGATTGAGGCATTGTA-2 0 TATGAGATAGTTGATTG-3' (3' ADHl-spesifinen promoottorisekvenssi yhdistettynä amdS-sekvenssin 5'-päähän, lisärestriktiokohdilla BssH2 ja Xbal).

25 PCR-reaktio suoritettiin käyttäen "touchdown"-toimintaoh-! jetta (Don et ai., (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4008).

Reaktioseokset saatettiin 30 monistus jaksoon, pudottaen • pariuttamislämpötilaa 1°C joka toisessa jaksossa, lähtien • t t * : 55°C:sta alarajalle ("touchdown") 40°C:ssa, jossa lämpö- *.· * 30 tilassa suoritettiin vielä 10 jaksoa (jaksot: 2' 94°C:ssa, 2' pariuttamista, 3' 72°C:ssa). Saatu PCR-frag-; : : mentti pilkottiin EcoRI:llä ja Xbal:llä ja subkloonattiin :*!*: pTZ19R:ään. Tuloksena saatu plasmidi pTZs.c.ADHl ja ' . pGBamdS3 pilkottiin Koni:llä ja BssH2:11a. 6,8 kb frag- ' ' 35 mentti pGBamdS3:sta ja 750 bp fragmentti pTZs.c.ADHl:stä s * puhdistettiin geelielektroforeesin avulla, ligoitiin ja ; käytettiin E. coli JM109:n transformointiin. Tuloksena « * 114481 66 saatua ekspressiovektoria merkittiin tunnuksella pGBamdS5 (kuvio 37) .

pGBamdS6:n konstruointi 5

Plasmidi pGBamdS3 sisältää amdS cDNA:n KlEFl-promoottorin ohjauksessa ja 1,5 kb LAC4-terminaattorisekvenssien ollessa sen 3'-pään vieressä (kuvio 36). pGBamdS6 konstruoidaan kloonaamalla fragmentti, joka sisältää fuusion, 10 joka käsittää LAC4-promoottorin ja terminaattorisekvens-sit amdS-ekspressiokasetin yläpuolella pGBamdS3:ssa (kuvio 38). LAC4-promoottorin ja terminaattorisekvenssien yhdistämiseksi on ensin konstruoitu pTLAC4 (kuvio 39).

PCR:ää käyttäen toimitetaan lisärestriktiokohtia 600 bp 15 LAC4-terminaattorifragmentin 5'- ja 3'-päihin. PCR:ssä K. lactiksen CBS 683 kromosomaalista DNA:ta käytettiin temp-laattina, ja oligonukleotidejä AB3704 (SEKVENSSI ID NO: 32) ja AB3705 (SEKVENSSI ID NO:33) käytettiin alukkeina: 20 Oligo AB3704 (SEKVENSSI ID NO:32): 5'-GCTCTAGAAGTCGACACTAGTCTGCTACGTACTCGAGAATTTATACTTAGA-TAAG-3' (LAC4-terminaattorispesifinen sekvenssi, joka alkaa LAC4-, lopetuskodonin kohdalta ja sisältää lisärestriktiokohdat ' 25 Xbal. Sali, Spel. SnaBI ja XhoI).

T Oligo AB3705 (SEKVENSSI ID NO:33): ; 5'-TGCTCTAGATCTCAAGCCACAATTC-3' /1' (LAC4-terminaattorispesifinen sekvenssi sisältäen lisä- Γ;’: 30 restriktiokohdan Xbal) .

: ,·. PCR suoritettiin käyttäen vakio-olosuhteita ja tuloksena » I · saatu DNA-fragmentti pilkottiin Xbal: llä ja subkloonat-tiin pTZ19R:n Xbal-kohtaan, jolloin saatiin pTLAC4 (kuvio ’ · 35 39). LAC4-promoottorisekvenssi saadaan pilkkomalla pKS105 (van den Berg et ai., (1990) Bio/Technology 8, 135-139) , Xbal: llä ja SnaBI: llä. Xbal-SnaBI LAC4 -promoottorifrag- > · 114481 67 mentti kloonattiin pTLAC4:n Spel/SnaBI-kohtiin ja merkittiin tunnuksella pPTLAC4 (kuvio 39). Viimeisessä vaiheessa pGBamdS6:n konstruoinnissa plasmidi pPTLAC4 pilkottiin Xbal:llä. 4,1 kb DNA-fragmentti pPTLAC4:stä puhdistettiin 5 geelielektroforeesin avulla ja kloonattiin pGBamdS3:n

Spel-kohtaan. Saatua geeninvaihtovektoria merkittiin tunnuksella pGBamdS6 (kuvio 38).

pGBamdSS:n konstruointi 10 pGBamdS7 konstruoitiin kloonaamalla fragmentti, joka sisältää osan LAC4-promoottorista sekä kymosiinin ekspres-siokasetin, LAC4-promoottorin ja terminaattorisekvenssien väliin, jotka sijaitsevat pGBamdS6:ssa (kuvio 40). Plas-15 midi pKS105 sisältää prokymosiinin cDNA:n yhdistyneenä S. cerevisiaen α-tekijän prepro-alueeseen LAC4-promoottorin ohjauksessa (van den Berg et ai., (1990) Bio/Technology 8, 135-139). PCR:ää käyttäen toimitettiin lisärestrik-tiokohtia LAC4-promoottorin ja kymosiinin ekspres-20 siokasetin välisen fuusion 5·- ja 3'-kohtiin. PCRrssä pKS105:n DNA :ta käytettiin templaattina ja oligonukle-otidejä AB3965 (SEKVENSSI ID NO:34) ja AB3966 (SEKVENSSI ID NO:35) käytettiin alukkeina: V 25 Oligo AB3965 (SEKVENSSI ID NO:34): ; ‘ 5'-CTGCTACGTAATGTTTTCATTGCTGTTTTAC-3' (LAC4-promoottorispesifinen sekvenssi, joka alkaa rest- « riktiokohdasta SnaBI) « ; i · 30 Oligo AB3966 (SEKVENSSI ID NO:35): 5'-CCGCCCAGTCTCGAGTCAGATGGCTTTGGCCAGCCCC-3' • (kymosiinispesifinen sekvenssi lisärestriktiokohdalla

XhoI) .

35 PCR suoritettiin käyttäen vakio-olosuhteita ja saatu PCR-*...· fragmentti pilkottiin SnaBI: llä ja XhoI: llä. Plasmidi ; pGBamdS6 pilkottiin osittain XhoI: llä ja pilkottiin sen 68 114481 jälkeen SnaBI:lläf ja 10,9 kb DNA-fragmentti eristettiin ja puhdistettiin geelielektroforeesin avulla. SnaBI-XhoI-fuusiofragmentti, LAC4-promoottori/kvmosiinin ekspres-siokasetti, kloonattiin pGBamdS6:n SnaBI/Xhol-kohtiin.

5 Tuloksena saatua plasmidia merkittiin tunnuksella pGBamdS7 (kuvio 40).

HindiII-kohdan tuhoamiseksi suunnilleen 66 bp ky-mosiinigeenin aloituskohdan yläpuolella, pGBamdS7 pilkot-10 tiin osittain Hindlll:11a ja sitä käsiteltiin E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla tasapäiden muodostamiseksi, ligoitiin sen jälkeen ja siirrettiin £. coliin molekulaarista kloonausta varten. Saatua plasmidia merkittiin tunnuksella pGBamdSS ja se sisälsi LAC4-pro-15 moottorifragmentin, jonka Hindlll-kohta oli tuhoutunut.

Esimerkki 9 amdS cDNA:n ilmentyminen LAC4-promoottorista K. lactis -hiivassa 20

Ekspressiovektori pGBamdSl sisältää paitsi amdS cDNA:n, toisen valintamarkkerin, joka antaa resistenssin antibiootille G418. Tämä mahdollistaa ensin transformanttien valikoinnin käyttäen G418-resistenssiä, joka on hyvin 25 vakiintunut menetelmä (Sreekrishna et ai., (1984) Gene » 28. 73-81). Tällä tavalla saatuja transformantteja voi-• daan käyttää myöhemmin amdS cDNA:n ilmentymisen varmista- I V · 1 ·’ miseksi ja olosuhteiden optimoimiseksi amdS*-fenotyypin seulomiseksi K. lactiksessa. Kun nämä olosuhteet on va-».* : 30 kiinnutettu, amdS*-transformanttien suora valikointi voi daan suorittaa esim. käyttämällä ekspressiokasetteja il- I man lisävalintamarkkereita.

* * * · • * · ' , pGBamdSl (kuvio 34) tehtiin lineaariseksi LAC4-promootto- IMI· ’3 5 rissa Sstl-pilkonnalla. pTZ19R-sekvenssit poistettiin • · ';·* fraktioimalla ja puhdistamalla agaroosigeeleiltä. 15 pq ; tätä DNA-fragmenttia käytettiin transformoitaessa K· lac- I » 69 1 1 4481 tis -kannat CBS 2360 ja CBS 683 kuten Ito, H. et ai. ovat kuvailleet, (1983) J. Bacteriol. 153. 163-168, niillä muunnoksilla, joita koemenetelmät-jaksossa on kuvailtu. Transformaatiomaljoja inkuboitiin 30°C:ssa 3 päivän ajan.

5 G4l8-resistenttejä kantoja saatiin molemmilla kannoilla. Useita yksittäisiä transformantteja kummastakin kannasta sekä villityypin kantoja levitettiin sen jälkeen maljoille, jotka sisälsivät erilaisia kiinteitä alustoja (taulukko 1). YEPD ja YEPD/G418 on kuvailtu koemenetelmät-10 jaksossa. YCB, YCB/NH4 ja YCB/asetamidi on kuvailtu esimerkissä 7 alustoina I, II ja vastaavasti III. YNB-lac/NH4 ja YNB-lac/asetamidi sisältävät 0,17 % (paino/tilavuus) Yeast Nitrogen Base'a (hiivan typpiperusalusta) ilman aminohappoja ja ammoniumsulfaattia (Difco), jotka sisäl-15 tävät lisäksi 1 % (paino/tilavuus) laktoosia, 30 mM nat-riumfosfaattipuskuria pH:ssa 7,0 ja joko 0,1 % (paino/tilavuus) NH4(S04)2:a tai vastaavasti 5 mM asetamidia.

amdS+fenotyyppi CBS 683/pGBamdSl -transformantilla oli 20 selvä YCB/asetamidilla (taulukko 1). CBS 2360 -transfor-manteilla, jotka sisälsivät saman ekspressiovektorin, ei kuitenkaan esiintynyt kasvua YCB/asetamidilla. Tästä pääteltiin, että tämä saattaisi johtua LAC4-promoottorin induktion puuttumisesta, joka ohjaa amdS cDNA:ta, kun » 1 25 läsnä ei ole laktoosia eikä galaktoosia, koska hiilenläh- r » ; teestä riippuvaisia eroavuuksia LAC4-promoottorin sääte- ·; lyssä eri K. lactis -kantojen välillä on kuvailtu (Breu- • ·’ nig (1989) Mol. Gen. Genet. 216. 422-427). Taulukko 1 ,.T esittää, että näin tosiaan on, alustalla, joka sisältää t · 1 V : 30 laktoosin ainoana hiilenlähteenä ja asetamidin ainoana typenlähteenä, CBS 2360 -transformantit kykenivät kasva-; maan. Sen vuoksi voidaan päätellä, että käytetystä hii- I | f · lenlähteestä riippuen, nämä transformantit ilmentävät , riittävästi A. nidulansin amdS cDNArta ylläpitääkseen MM» ‘ 1 35 hiivan K. lactis kasvua asetamidi ainoana typenlähteenä.

< 1 t 1 > t 5 1 » » » » 114481 70

Southern-analyysit suoritettiin sen varmistamiseksi, oliko integroituminen LAC4-promoottoriin tapahtunut. Suuri-molekyylipainoista DNA:ta useista CBS 2360 - ja CBS 683 -transformanteista eristettiin, pilkottiin Hindlll:11a ja 5 fraktioitiin sen jälkeen elektroforeesin avulla 0,7 %:isella agaroosigeelillä. Nitroselluloosalle siirtämisen jälkeen hybridisointi suoritettiin tavanomaisten menetelmien mukaisesti. Koettimena käytettiin 32P-leimattua, suunnilleen 1,5 kb SacII/Hindlll LAC4 -promoottorifrag-10 menttia, joka oli eristetty plasmidista pGBHSA20 (kuvio 34). CBS 683 - ja CBS 2360 -transformantteja identifioitiin, jotka sisälsivät yhden pGBamdSl-ekspressiokasetin integroituneena LAC4-lokukseen; yksi esimerkki kummastakin on esitettynä kuviossa 41 ja tunnuksella KAM-1 ja 15 vastaavasti KAM-2. pGBamdSlrn yksikopiointegraatio LAC4-promoottoriin tuottaa kaksi uutta HindIII-fragmenttia.

4,2 kb ja 8,6 kb, joista kumpikin on läsnä transforman-teissa KAM-1 ja KAM-2. Koska CBS 683 sisältää kaksi LAC4-lokusta ja pGBamdSl on integroinut vain toisen niistä 20 KAM-1:een, KAM-1:n hydrolysaatissa esiintyy myös 5,6 Hin-dlll-fragmentti, joka on peräisin toisesta koskemattomasta LAC4-lokuksesta.

♦ f | ' -I ' * i ‘ » i * » » » I f i « i % %

1 I

ί f 4 f S ! r » f ( tv· I « t I » * 1 * i t » J Ϊ t * »1*1* I t I · » i > t # Ϊ > * * I » 71 114481

Taulukko 1.

K. lactiksen CBS 683 ja CBS 2360 villityyppien ja pGBamdSl-transformanttien kasvu kiinteillä alustoilla, jotka sisältävät erilaisia typpi- ja/tai hiililähteitä.

5 kanta CBS683 CBS 2360 transformoiva ei pGB- ei pGBamdSl DNA amdSl YEPD + + + + YEPD-G418 - + - + 10 YCB - YCB/NH4 + + + + YCB/asetamidi + - YNB/NH4 + + + + YNB-lac/asetami- - + - + 15 di

Esimerkki 10 * ' > '> K. lactiksen CBS 683 - ja CBS 2360 -transformanttien suo- , * - - - —1" ------- ' ' — 11 ' - ^ — — ' — —' ~ ~ —1 20 ra valikointi käyttäen asetamidia ainoana tvpenlähteenä . Sstll: 11a linearisoitu pGBamdSl (15 μ%) transformoitiin K. lactis -kantoihin CBS 683 ja CBS 2360 käyttäen trans-·!.’ formaatiomenettelyä, jota Ito, H. et ai. ovat kuvailleet, * 25 ((1983) J. Bact. 153. 163-168) seuraavin muunnoksin: - K. lactis -kasvustot otettiin talteen transformaatiota • # — - : varten tiheydessä OD610 = 0,5 - 1,0.

V * - DNA-solususpension 5 minuutin lämpöshokin jälkeen suo- t ·:··· ritettiin fenotyypin ilmentäminen 150-180 minuutin ku- 30 luessa 30°C:ssa 1 ml:n tilavuuksissa. Erilaisia alustoja * * · ’ käytettiin kummallakin kannalla. CBS 683:lie käytettiin YEPD/YNB-1 iuosta (1*YNB (Hiivan typpiperusalusta, Yeast * · 114481 72

Nitrogen Base, Difco), 1 % Bacto-peptonia, 1 % hiivauu-tetta ja 2 % glukoosia) tai YNB-glu-liuosta (11YNB (Yeast Nitrogen Base ilman aminohappoja ja ammoniumsulfaattia,

Difco), joka sisälsi lisäksi 1 % (paino/tilavuus) glukoo-5 siä ja 30 mM natriumfosfaattipuskuria pH:ssa 7,0). Tämän inkuboinnin jälkeen solut sentrifugoitiin 2000 g huoneenlämpötilassa 5 minuutin ajan ja maljattiin sen jälkeen YCB/asetamidille (esimerkki 7). CBS 2360:lie käytettiin YNB-lac-alustaa (11YNB (Yeast Nitrogen Base ilman amino-10 happoja ja ammoniumsulfaattia, Difco), joka sisälsi lisäksi 1 % (paino/tilavuus) laktoosia ja 30 mM natriumfosfaattipuskuria pH:ssa 7,0). Tämän inkuboinnin jälkeen solut sentrifugoitiin 2000 g huoneenlämpötilassa 5 minuutin ajan ja maljattiin sen jälkeen YNB-lac/asetamidille (esi-15 merkki 9).

Kasvua jatkettiin 30°C:ssa 3 päivän ajan. amdS+-transfor-mantteja saatiin molemmilla kannoilla. Havaitut transfor-maatiofrekvenssit olivat verrattavissa niihin, jotka to-20 dettiin käytettäessä G418-valikointia. Transformanttien oikea identtisyys varmistettiin maljaamalla sen jälkeen YEPD-maljoille, jotka sisälsivät G418:a, ja Southern-ana-. lyysin avulla.

t · t 25 pGBamdS3 (kuvio 36), jossa amdS cDNA:ta ohjaa KlEFl-pro-moottori, tehtiin lineaariseksi LAC4-terminaattorissa ; '/ pilkkomalla XhoI: llä, ja 15 /ug geelistä eristettyä frag- ;i‘ menttia transformoitiin sen jälkeen K. lactis -kantaan · CBS 683 käyttämällä suoraa valikointia YCB/asetamidi-mal- 30 joilla kuten edellä on kuvailtu koskien pGBamdSlrn trans-: formointia CBS 683reen. Jotkut saaduista transformanteis- II» ta analysoitiin Southern-blottauksen avulla. Suurimole-kyylipainoinen DNA eristettiin, pilkottiin BamHI:llä ja erotettiin sen jälkeen elektroforeesin avulla 0,7 %:isel- * i · 35 la agaroosigeelillä. Nitroselluloosalle siirtämisen jäl-. keen hybridisaatio suoritettiin tavanomaisilla menetel- millä. Koettimena käytettiin 32P-leimattua, 1,2 kb 73 114481

Sphl/Hindlll LAC4 -terminaattorifragmenttia, joka oli eristetty plasxnidista pTY75LAC4 (kuvailtu esimerkissä 8) . Tulokset useista CBS 683 -transformanteista, jotka sisälsivät pGBamdS3-plasmidin, ja useista transformanteista, 5 jotka sisälsivät pGBamdS5-plasmidin, on esitetty kuvioissa 42A ja vastaavasti 42B. Vertailukanta CBS 683 on esitetty kuviossa 42B. CBS 683 -transformanteissa on läsnä ylimääräinen 6,8 kb hybridisoituva fragmentti käsittelemättömän LAC4-terminaattorin 3,7 kb hybridisoituvan frag-10 mentin lisäksi. Tämä osoittaa plasmidien oikean integroitumisen LAC4-terminaattorialueeseen.

Kaikissa näissä transformanteissa pGBamdS3 integroitui yhtenä tai useampana kopiona LAC4-terminaattoriin (6,8 kb 15 hybridisoituvan fragmentin intensiteetti on osoitus vektorin integroituneiden kopioiden määrästä). On päätelty, että myös konstitutiivinen K1EF1-promoottori voi ohjata amdS cDNA:ta valintamarkkerina käyttöä varten. Samanlaisia tuloksia saatiin pGBamdS5:llä (kuvio 37), jossa amdS 20 cDNArta ohjaa S. cerevisiaen ADHl-promoottori.

Esimerkki 11 S. cerevisiaen transformointi pGBamdS5:llä valikoiden : : suoraan asetamidilla 25 i' Tässä esimerkissä on testattu, voidaanko amdS cDNAtta ·’: käyttää myös valintamarkkerina muissa hiivoissa, esim. S.

·· cerevisiaessa. S. cerevisiae -kannan D237-10B amdS-feno- tyyppi on ensin varmistettu sekä sen kyky käyttää am-30 moniakkia ainoana typenlähteenä, käyttämällä samoja alus-. . toja ja typenlähteitä kuin K. lactiksella esimerkissä 7.

Kuten K. lactiksen tapauksessa on havaittu, täysin kasva-·, * neita S. cerevisiae -pesäkkeitä havaittiin ainoastaan maljoilla, jotka sisälsivät ammoniakin typenlähteenä.

35 Maljoilla, jotka eivät sisältäneet typenlähdettä tai si-sälsivät asetamidin ainoana typenlähteenä, kasvua ei havaittu tai havaittiin satunnaista heikkoa taustakasvua.

» % 114481 74

Plasmidi pGBamdS5 lirvearisoitiin ADHl-promoottorissa pilkkomalla osittain Sohi:llä. S. cerevisiae -kanta D273-10B (ATCC 25657) transformoitiin 15 ^grlla geelieristet-tyä, linearisoitua pGBamdSS-fragmenttia, käyttäen trans-5 formointimenetelmiä, joita on kuvailtu esimerkissä 10 pGBamdSl:n transformaatiossa K. lactis CBS 683:een.

Transformoinnin jälkeen solut maljattiin YCB/asetamidi-maljoille (esimerkki 9) ja niiden annettiin kasvaa 30°C:ssa 3 päivän ajan. Useita amdS+-transformantteja 10 saatiin tässä transformaatiossa. Joidenkin amdS-transfor-manttien Southern-analyysi varmisti, että amdS cDNA oli pysyvästi integroitunut S. cerevisiaen genomiin.

Suurimolekyylipainoista DNA:ta eristettiin ja pilkottiin 15 BamHI:lä. erotettiin sen jälkeen elektroforeesin avulla 0,7 %:isella agaroosigeelillä ja blotattiin nitrosellu-loosalle. Koettimena käytettiin 32P-leimattua 750 bp EcoRV amdS -fragmenttia, joka oli eristetty pGBamdSlistä. Tulokset useista D273-10B/pGBamdS5-transformanteista samoin 20 kuin vertailukannasta D273-10B (ATCC 25657) on esitetty kuviossa 43. Kaksi hybridisoituvaa fragmenttia on läsnä D273-10B-transformanteissa, toinen 6,6 kb fragmentti, joka edustaa monikopiofragmenttia, ja toinen hybridisoi-: tuva fragmentti, jonka koko on tuntematon ja joka on gee- 25 ninviereinen. Vertailukannalla D273-10B (ATCC 25657) ei *:· odotetusti esiinny hybridisoituvaa fragmenttia.

» · • ·

Esimerkki 12 amdS-markkerin poistaminen K. lactiksen ia S. cerevisiaen 30 amdS+-transformanteista käyttäen fluoriasetamidivastava- , . likointia > > · * » · *·’ * Edellä kuvailluissa esimerkeissä amdS:n sisältäviä eks- pressiokasetteja integroidaan yksinkertaiseen tekijäin-35 vaihtoon perustuvan homologisen rekombinaation avulla I(. lactis ja S. cerevisiae -genomeihin. Tämä tarkoittaa sitä, että amdS cDNArn vieressä on suoria toistojaksoja 75 1 1 4 4 81 näiden amdS-hiivatransformanttien genomissa. amdS cDNA poistuu siis pienestä transformanttipopulaatiofraktiosta intrakromosomaalisten mitoottisten rekombinaatioiden avulla, joiden esiintymistiheys on alhainen, cDNA:ta vie-5 rustavien suorien toistojaksojen välillä. Tulisi olla mahdollista valikoida näitä tapahtumia käyttäen fluo-riasetamidia sisältäviä alustoja, yhdistettä, joka on toksinen amdS+-soluille mutta ei amdS'soluille kuten on osoitettu A. nidulansin osalta, Hynes ja Pätemän ((1970) 10 Mol. Gen. Genet. 108. 107-116). amdS+-soluissa fluo- riasetamidi muuntuu ammoniakiksi ja fluoriasetaatiksi, jälkimmäisen ollessa toksinen tullessaan asetyyli-CoA-syntetaasin aktivoimaksi. Edellytykset fluoriasetamidi-vastavalikoinnin toimimiseksi myös amdS+-hiivoissa ovat 15 sen vuoksi 1) fluoriasetamidin ei tulisi olla toksinen amdS-hiivoille. 2) hiivan soluseinän ja solukalvon tulisi olla läpäiseviä fluoriasetamidille ja 3) entsyymin ase-tyyli-CoA-syntetaasi tulisi olla aktiivinen. Tämän testaamiseksi on käytetty K. lactis CBS 683 -transformant-20 tia, joka sisältää yhden pGBamdSl-kopion integroituneena LAC4-promoottoriin, tunnuksella KAM-1, ja S. cerevisiae D273-10B -transformanttia, joka sisältää yhden pGBamdSS-kopion integroituneena ADHl-promoottoriin, tunnuksella : SAM-l. Sekä KAM-1 että SAM-1 puhdistettiin vähintään kol- ·.·.· 25 messa kierroksessa valikoivalla alustalla (YCB/asetamidi) parentaalien amdS-kantojen aiheuttaman kontaminaation : poissulkemiseksi. KAM-1 ja SAM-1 maljattiin kumpikin ti- ·· heydessä suunnilleen 103 CFU/malja (pesäkkeen muodostavaa yksikköä) YCB/NH4:lle, joka sisälsi lisäksi 10 mM fluo-30 riasetamidia. Sekä KAM-l:n että SAM-l:n osalta, 5-20 ; ,·, fluoriasetamidiresistenttiä pesäkettä tuli näkyviin 3-6 päivän kuluttua 30°C:ssa. Useiden yksittäisten KAM-1 - ja I « f SAM-1 -peräisten amdS'-pesäkkeiden kromosomaalisen DNA:n Southern-analyysi varmisti, että amdS cDNA oli asianmu-: 35 kaisesti poistunut K. lactis - ja S. cerevisiae -geno- ’·_ meistä homologisen rekombinaation kautta vierustavien suorien toistojaksojen välillä (kuvio 41). Itse asiassa 114481 76 yhdessä KAM-1 amdS' -rekombinantissa rekombinaation tekijä invahtokohta sijaitsi polymorfisen HindiII-kohdan ja amdS cDNA:n välissä. Tämä polymorfinen Hindlll-kohta sijaitsee 92 bp LAC4-lukukehyksen yläpuolella pGBamdSl:n 5 LAC4-promoottorissa, kuitenkaan tämä kohta ei ole läsnä CBS 683:n LAC4-promoottorissa. Rekombinaatiotapahtuma on säilyttänyt Hindlll-kohdan tämän erityisen KAM-1 -rekom-binantin genomissa, jota muutoin ei voitaisi erottaa pa-rentäälikannasta CBS 683 (ylimääräinen 4,2 kb fragmentti 10 kuviossa 41, kaista 6). Tämä KAM-1-rekombinantti sulkee sen vuoksi pois mahdollisuuden, että olisi eristetty CBS 683 -kontaminantteja KAM-1 amdS' -rekombinanttien asemesta. Edellä olevasta voidaan päätellä, että amdS cDNA voidaan poistaa hiivagenomeista niiden ollessa suorien tois-15 tojaksojen vierustamia, käyttäen fluoriasetamidivastava-likointia. Tässä esimerkissä amdS' K. lactis - ja S. cere-visiae -rekombinantteja esiintyy tiheydessä noin 0,1 %.

On havaittu, että joillakin hiivakannoilla tehokasta vas-20 tavalikointia fluoriasetamidilla ei voida suorittaa YCB/NH4-alustalla, johtuen luultavasti asetyyli-CoA-synte-taasin voimakkaasta hiilikataboliittirepressiosta. Noissa tapauksissa on onnistuneesti käytetty YNB-galaktoosi/NH4-• · alustaa (tämä alusta on sama kuin esimerkissä 9 kuvailtu V 25 YNB-lac/NH4 mutta sisältää 1 % galaktoosia 1 % laktoosin asemesta) , joka sisältää lisäksi 10 mM fluoriasetamidia % * | vastavalikointia varten.

« · · » * t · :': *: Esimerkki 13 30 K. lactis -geenin merkkioeenivapaa deleetio käyttäen : , ·. amdS-markkeria t · « » · > * >

Usein käytetty tekniikka hiivageenien manipuloimiseksi on "yksivaiheinen geenin ositus", menetelmä, jonka avulla on 35 mahdollista jakaa geenit useaan osaan (modifioida) yhdes-,·, sä transformaatiovaiheessa (Rothstein et ai. (1983) Met- hods Enzymol. 101. 202-211). Tässä menetelmässä transfor- 114481 77 moiva plasmidi, joka sisältää kopion kohdegeenistä hiivan valikoitavan markkerin osiin jakamana, integroituu hiiva-genomiin kaksinkertaisen tekijäinvaihdon käsittävän homologisen rekombinaation kautta, mistä on seurauksena vil-5 lityypin kohdegeenin korvautuminen ositetulla kopiolla. amdS+-hiivatransformanttien "yksivaiheisen geeniosituk-sen" ja fluoriasetamidivastavalikoinnin yhdistelmän avulla, kuten esimerkissä 12 on kuvailtu, tulisi olla mahdollista poistaa geenejä hiivagenomeista jättämättä 10 jäljelle valikoitavia markkereita. Tässä esimerkissä on käytetty tätä yhdistelmää LAC4-geenin poistamiseksi K. lactis CBS 2360 -genomista. K. lactiksen LAC4 geenin yksivaiheista geeninvaihtoa varten konstruoitiin plasmidi pGBamdS6 (kuvio 38), joka sisältää amdS-ekspressiokasetin 15 LAC4-promoottorin ja terminaattorisekvenssien vieressä.

Ylimääräinen LAC4-terminaattorifragmentti on läsnä suoraan amdS-ekspressiokasetin yläpuolella siten, että amdS-ekspressiokasetin vieressä on suoria toistojaksoja, joiden avulla on mahdollista leikata amdS-sekvenssejä K.

20 lactis -genomista näiden suorien toistojaksojen välisen intrakromosomaalisen rekombinaation avulla. Plasmidi pGBamdS6 pilkottiin Spel;llä ja Hindlll:11a. ja 6,6 kb DNA-fragmentti eristettiin geelielektroforesoinnin jäl- · keen. Tätä Spel-Hindlll-fragmenttia, joka sisälsi geenin t 25 vaihtovektorin, käytettiin K. lactis CBS 2360:n transfor-!' mointiin käyttäen esimerkissä 10 kuvailtuja menetelmiä.

; amdS+-transformantteja siirrostettiin YEPD-maljoille, ·· jotka sisälsivät 0,008 % X-gal:a (5-bromi-4-kloori-3- indolyyli-/?-D-galaktopyranosidiä) , korvatun LAC4-geenin f 30 sisältävien transformanttien seulomiseksi.

I t I I * * f · amdS+-transformantit analysoitiin Southern-blottauksen • * · avulla. Suurimolekyylipainoista DNA:ta eristettiin, pil-kottiin Hindlll:11a, erotettiin sen jälkeen elektrofo- ; 35 resoimalla 0,7 %:isella agaroosigeelillä ja blotattiin nitroselluloosakalvolle. Koettimena käytettiin plasmidis-ta pPTLAC4 (kuvailtu esimerkissä 8) eristettyä 32P-leimat- 78 1 1 4481 tua 600 bp Xbal LAC4 -terminaattorifragmenttia. Tulokset, koskien amdS+ CBS 2360 -transformanttia, jonka LAC4-geeni oli poistettu, samoin kuin vertailukantaa CBS 2360, esitetään kuviossa 44. amdS+ CBS 2360 -transformantin olles-5 sa kysymyksessä, 7,4 kb hybridisoituva fragmentti on läsnä, mikä osoittaa asianmukaisesti poistetun LAC4-geenin. Vertailukunnassa CBS 2360 esiintyy 2,0 kb hybridisoituva fragmentti, joka edustaa käsittelemätöntä LAC4-lokusta.

10 Näiden amdS+-transformanttien seuraava fluoriasetamidi-vastavalikointi, jota esimerkissä 12 on kuvailtu, tuotti rekombinantteja, joilla oli amdS-fenotyyppi. amdS'-rekom-binanttien kromosomaalisesta DNArsta tehtiin Southern-15 analyysi. Suurimolekyylipainoista DNA:ta eristettiin, pilkottiin Hindlll:11a. erotettiin sen jälkeen 0,7 %:lla agaroosigeelillä ja blotattiin nitroselluloosalle. Samaa edellä kuvailtua 32P-leimattua koetinta käytettiin. Tulokset amdS' CBS 2360 -rekombinanteista on esitetty kuviossa 20 44. amdS-rekombinanttien ollessa kysymyksessä, 5,4 kb hybridisoituva fragmentti on läsnä, mikä varmisti sen, että LAC4-geeni puuttui, samoin kuin amdS-markkerin asianmukaisen poistumisen hiivagenomista. amdS-markkerin : ; · puuttuminen näistä K. lactis LAC4' -kannoista tarjoaa mah- ’*’·* 25 dollisuuden käyttää amdS-markkeria uudelleen geenien li- sädeleetioita ja/tai modifikaatioita varten.

• * t Esimerkki 14 ; Geenin merkkigeenivapaa liittäminen K- lactiksen qenomiin # 30 käyttäen amdS-markkeria • · * i * ·;·* Geenien merkkigeenivapaassa liittämisessä hiivagenomiin on käytetty kymosiinin cDNArta malligeeninä. Tässä esi- ’***· merkissä kymosiinin cDNA on liitetty K. lactiksen LAC4- » * » i,,/ 35 lokukseen, samalla kun LAC4-geeni on vaihdettu ja jättä- I*. mättä valintamarkkeria. Markkerivapaan geeni-insertion periaate on sama kuin geenien merkkivapaassa deleetiossa, 114481 79 jota esimerkissä 13 kuvailtiin, paitsi että tässä tapauksessa vaihtovektori pGBamdS8 sisältää kiinnostuksen kohteena olevan geenin, kymosiinin cDNA:n (kuvio 40). Plas-midi pGBamdS8 pilkottiin Spel:llä ja Hindlll:11a ja 8,0 5 kb DNA-fragmentti eristettiin geelillä. 10 μg tätä fragmenttia transformoitiin K. lactis CBS 2360:een kuten esimerkissä 10 on kuvailtu. amdS*-transforroantteia saatiin aikaan, joiden LAC4-qeeni oli poistunut ja kymosiiniak-tiivisuus saavutettu. Kymosiinin aktiivisuus määritettiin 10 kuten on kuvailtu (van den Berg et ai. (1990) Bio/Techno-logy 8, 135-139). Sen jälkeen näitä transformantteja vas-tavalikoitiin fluoriasetamidilla kuten esimerkissä 12 on kuvailtu, amdS-fenotyyppisiä rekombinantteja eristettiin, mutta jotka yhä tuottivat kymosiinia. amdS~. kymosiini+ 15 rekombinanttien kromosomaalisen DNA:n Southern-analyysi varmisti LAC4-geenin korvautumisen kymosiinin cDNA:lla samoin kuin amdS-markkerin asianmukaisen poistumisen K. lactiksen genomista. Näiden rekombinanttien amdS/kvmosii-ni+-fenotyyppi varmistettiin myös kasvun puuttumisella 20 YCB/asetamidimaljoilla ja kymosiiniaktiivisuuden avulla (tarkemmin edellä). Näiden rekombinanttien amdS~-fenotyyp-pi mahdollistaa näiden kantojen jatkomanipuloinnin käyttäen amdS-markkeria, esim. kymosiinin ekspressiokasetin 1 · : * lisäkopioiden integroinnin ja/tai K. lactis -geenien de- ♦ * 25 leetion kuten esimerkissä 13 on kuvailtu.

: '.·* Esimerkki 15 ·:· Bacillusten ja E. colin amdS'-fenotyypin testaus » I * 30 Edellytys amdS-valintasvsteemin käytölle Bacilluksissa on : ,·. se, että nämä gram-positiiviset bakteerit eivät sisällä * · asetamidaasiaktiivisuutta. Tämän testaamiseksi B^ subti- lis BS-154 -kanta (CBS 363.94) maljättiin Bacilluksen : minimaalialustalle, joka sisälsi kaikki välttämättömät

35 ravinteet ja vitamiinit paitsi typenlähdettä (28,7 mM

K2HP04:a, 22 mM KH2P04:a, 1,7 mM natriumsitraattia, 0,4 mM

'tj MgS04:a, 0,75 μΜ MnS04:a, 0,5 % (paino/tilavuus) glukoosia > > 114481 80 ja 1,5 % agaria. Tällä alustalla ei sellaisenaan havaittu mitään kasvua, tai kun siihen oli lisätty asetamidia ty-penlähteeksi. Kasvua havaittiin vain siinä tapauksessa, että minimaalialusta sisälsi lisäksi joko 20 mM (NH4)2S04:a 5 tai 20 mM KN03:a typenlähteeksi. Johtopäätöksenä on se, että Bacillus BS-l54:stä (CBS 363.94) puuttuu riittävä asetamidaasiaktiivisuus kasvun ylläpitämiseksi asetamidi ainoana typenlähteenä. Tämän ilmiön tulisi mahdollistaa A. nidulansin amdS-geenin käyttö valintamarkkerina gram-10 positiivisissa bakteereissa.

Vastaavalla tavalla on testattu asetamidaasiaktiivisuuden puuttuminen gram-negatiivisesta bakteerista, tässä tapauksessa E. colista. sen osoittamiseksi, voidaanko A.

15 nidulansin amdS-geeniä käyttää valintamarkkerina myös näissä mikro-organismeissa. Tässä tapauksessa käytettiin M9-minimaalialustaa (Sambrook et ai. (1989) "Molecular Cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New York), joka sisälsi 20 lisäksi 0,02 Mg (paino/tilavuus) tiamiinia. Täysin kasvaneita E. coli JM109:n pesäkkeitä todettiin siirrostetta-essa M9-maljoille. Mitään kasvua ei kuitenkaan havaittu tai vain heikkoa taustakasvua, kun NH4C1 jätettiin pois i M9-maljoilta tai korvattiin 20 mM asetamidilla. Johtopää- ! 25 töksenä on se, että E. coli JM109 -kannasta puuttuu riit-;· tävä asetamidaasiaktiivisuus ylläpitämään kasvua asetami- daasi ainoana typenlähtenä. Tämän tulisi mahdollistaa A. nidulansin amdS-geenin käyttö valintamarkkerina myös ;·, gram-negatiivisissa bakteereissa.

30 , , Esimerkki 16 t · amdS-ekspressiovektoreiden konstruointi bakteereissa ! * f ' * ’ ’ käyttöä varten !'*: pGBamdS22:n konstruointi 35 * * * A. nidulansin amdS-geenin ilmentämiseksi eri Bacillus- • * lajeissa amdS cDNA pamdS-l:stä on kloonattu Bacilluksen 81 1 1 4481 ekspression perusvektoriin pBHA-1 (EP-patenttihakemus 89201173.5; fyysinen kartta kuviossa 45). amdS cDNA -geenin ATG-aloituskodonin kohtaan toimitettiin Ndel-kohta pamdS-l:ssä käyttäen oligonukleotidejä AB3825 (SEKVENSSI 5 ID NO:36) ja AB3826 (SEKVENSSI ID NO:37), joilla on seu-raavat sekvenssit:

Oligo AB3825 (SEKVENSSI ID NO:36): 5'-CGCGCTTATCAGCGGCCAGTTCTTCCCAGGATTGAGGCATATGT-3' 10

Oligo AB3826 (SEKVENSSI ID NO:37): 5'-CTAGACATATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAG-31 Näiden oligonukleotidien pariuttaminen suoritettiin käyt-15 täen vakiomenetelmiä. Tuloksena saatu kaksijuosteinen DNA-fragmentti liitettiin BssHII/Xbal:llä pilkottuun pamdS-l:een ja siirrettiin E. coliin. Yhdestä transfor-mantista eristettiin pGBamdS21 ja karakterisoitiin rest-riktioentsyymianalyysin avulla (kuvio 47). pGBamdS21 pil-20 kottiin Kpnl:llä ja Hindlll:11a. ja amdS cDNA:n sisältävä fragmentti kloonattiin Kpnl:llä ja Hindlll:11a pilkottuun pBHA-1:een. Tuloksena saatu plasmidi sai tunnuksen pGBamdS22 (kuvio 48).

i * t 25 pGBamdS25:n konstruointi • * * ; Halutun DNA-sekvenssin paikkaspesifisen integroitumisen ·· osoittamiseksi B. licheniformiksen genomiin, käyttäen /. amdS-geeniä valintamarkkerina, amdS cDNA kloonattiin eks- 30 pressio/integrointivektoriin pLNF (kuvio 46). Tämä vektori, joka sisältää B. licheniformiksen amylaasigeenin 5' ja 3' ei-koodittavat sekvenssit, mahdollistaa paikkas-pesifisen integraation vastaavaan kromosomaaliseen amy-laasilokukseen. pGBamdS21 (kuvailtu edellä, kuvio 47) 35 pilkottiin Ndel:llä ja PvuII:11a ja amdS cDNA:n sisältävä fragmentti ligoitiin Ndel:llä ja Seal:llä pilkotun pLNF:n kanssa. Ligaatioseos transformoitiin B. subtilis BS- 114481 82 154:ään (CBS 363.94). Transformantit valikoitiin minimaa-lialustalla, joka sisälsi lisäksi 20 /xg/ml neomysiiniä. Yhdestä transformantista, tunnuksella BAA-101, eristettiin plasmidi pGBamdS25 (kuvio 50).

5 pGBamdS 41:n konstruo int i A. nidulansin amds cDNA:n ilmentämiseksi E. colissa käytettiin pTZ18R/N:a, pTZ18R:n johdannaista, jota kuvail-10 laan EP-patenttihakemuksessa 0 340 878 AI. pTZ18R/N eroaa pTZ18R:stä siten, että Ndel-kohta muodostettiin lacZ-lu-kukehyksen ATG-aloituskodonin kohdalle pTZ18R:ssä käyttäen in vitro paikkakohdennettua mutatointia. pGBamdS21 pilkottiin Ndel:llä jaHindlll:11a ja geelillä eristetty, 15 amdS cDNA:n sisältävä fragmentti liitettiin Ndel:llä ja Hindlll:11a pilkottuun pTZ18R/N:ään. Tätä ligaatioseosta käytettiin E. coli JM109:n transformointiin ja yhdestä transformantista eristettiin pGBamdS41 (kuvio 51).

20 Esimerkki 17

Bacillusten transformointi käyttäen amdS-aeeniä valinta-markkerina » * * E. coli -sekvenssien poistamiseksi pGBamdS22:sta ja 25 "hpa2,,-promoottorin sijoittamiseksi välittömästi amds ·'· cDNA:n yläpuolelle, pGBamdS22 pilkottiin Ndel: llä. teh- . * » ; V tiin uudelleen renkaanmuotoiseksi ligoimalla ja käytet- tiin B. subtilis BS-154:n (CBS 363.94) transformointiin.

; : Transformantteja valikoitiin asetamidiminimaalimaljoilla 30 ja neomysiiniresistenssi tarkistettiin. Yhdestä näistä ! transformanteista eristettiin ekspressiovektori pGBamdS23 * , (kuvio 49) ja karakterisoitiin restriktioentsyymianalyy- - sin avulla. Nämä tulokset osoittavat, että l) A. nidulan sin amdS cDNA ilmentyy hyvin Bacillus-promoottorisekvens-35 sin ohjauksessa ja 2) että amdS-qeeniä voidaan käyttää . valintamarkkerina Bacillusten transformaatiossa.

* t I " * I ( 1

k I

114481 83 B. licheniformis T5 (CBS 470.83) transformoitiin vektorilla pGBamdS25. Transformointi suoritettiin kuten koeme-netelmät-jaksossa on kuvailtu ja amdS+-transformantteia saatiin suoran valikoinnin avulla modifioiduilla proto-5 plastien regenerointimaljoilla, jotka sisälsivät lisäksi 20 mM asetamidia ainoana typenlähteenä (kuvailtu koemenetelmät- jaksossa) . pGBamdS25:n läsnäolo transformanteissa varmistettiin niiden neomysiiniresistenssifenotyypin avulla samoin kuin sillä tosiseikalla, että plasmidi voi-10 tiin eristää uudelleen transformanteista.

Yhtä näistä transformanteista, tunnuksella BAA-103, käytettiin plasmidin pGBamdS25 integraation aikaansaamiseksi B. licheniformiksen genomiin, kohdistettuna amylaasilo-15 kukseen. Plasmidin integrointi suoritettiin kasvattamalla transformantteja 50°C:ssa minimaalialusta-agarilla, joka sisälsi asetamidin ainoana typenlähteenä. Useita pesäkkeitä siirrettiin toistuvasti (2-3 kertaa) tuoreille maljoille ja sitten inkuboitiin 50°C:ssa. Eristetyistä pe-20 säkkeistä testattiin niiden kyky kasvaa asetamidi ainoana typenlähteenä ja neomysiiniresistenssi pitoisuudessa 1 μq/ml. Itsenäisesti replikoituvan plasmidi-DNA:n ρυθμοί.j : minen osoitettiin integranteista eristetyn DNA:n uudel- leentransformoinnin avulla. Neomysiiniresistenttejä pe-*:· 25 säkkeitä ei saatu.

1 t * Tämä tulos on selvä osoitus siitä, että amdS-geeni on sopiva markkeri Bacillus-lajien valikointiin, jotka si- v · · sältävät yhden amdS-geenikopion.

30 • · '*· * Esimerkki 18 I φ · - ' E. colin transformointi käyttäen amdS-aeeniä valintamark- ; · * i kerinä » < 35 E. coli JM109 transformoitiin vektorilla pGBamdS41 käyt-··*’ täen vakiomenetelmiä. Valikoinnit suoritettiin joko M9- maljoilla, jotka sisälsivät lisäksi 0,02 Mg/ml tiamiinia 114481 84 ja 50 μς/πιΐ ampisilliiniä, tai M9-maljoilla ilman ammoniakkia mutta lisäyksenä 20 mM asetamidia, 0,02 μg/ml tiamiinia ja 0,05 mM IPTG:tä. Useita amdS+/ampisil-liiniresistenttejä transformantteja saatiin, joista 5 pGBamdS41 voitiin eristää uudelleen. Transformaatiofre-kvenssit, käyttäen valikointia ampisilliinillä tai aseta-midilla, olivat vertailukelpoiset. Tämä osoittaa, että A. nidulansin amdS-geeni on toiminnallinen markkeri myös gram-negatiivisten bakteerien transformaatioon.

10

Esimerkki 19 amdS+-bakteeritransformanttien fluoriasetamidivastavali-kointi 15 Bakteeristen amdS+-transformanttien vastavalikointi käyttäen fluoriasetamidia edellyttää asetyyli CoA-synte-taasientsyymin aktiivisuutta fluoriasetaatin muuntamiseksi fluoriasetyyli-CoA:ksi. Asetyyli-CoA-syntetaasin kata-boliittirepression välttämiseksi, jota on havaittu E.

20 colissa (Brown et ai., 1977), bakteerisia amdS+-transformantteja tai yksikopioisia integrantteja kasvatettiin synteettisillä alustoilla, jotka sisältävät NH4Cl:n typen-: lähteenä ja asetaatin hiilen- ja energianlähteenä.

··· 25 Monelta organismilta, mukaan lukien B^. subtilis (Freese, E. ja Fortnagel, P. (1969) J. Bacteriol. 90, 745-756) , puuttuu toiminnallinen glyoksylaattisivureitti ja sen vuoksi ne metaboloivat asetaattia vain, kun alustaan on lisätty TCA-syklin välituotelähde, kuten esim. glutamaat-. . 30 tia tai sukkinaattia. Bacillus amdS+ -kantoja kasvatet- tiin TSS-alustalla, joka sisälsi 0,01 % glutamaattia ja ’·* * 50 mM asetaattia kuten Grundy et ai. (1993) ovat kuvail- :i leet, Molecular Microbiology 10, 259-271. Tähän agarilla jähmetettyyn alustaan lisättiin fluoriasetamidia pitoi- 35 suusalueella 1-50 mM. Bj. subtilis BAA-101 tai B. licheni-

i I I

formis BAA-103 (yksikopiointegrantti) siirrostettiin tiheydessä 102 solua maljaa kohti. Tietyssä fluoriasetami- 114481 85 dipitoisuudessa vain muutama pesäke tuli näkyviin. pGBamdS25:n puuttuminen näistä pesäkkeistä osoitettiin analysoimalla plasmidi-DNA ja kromosomaalinen DNA, neomy-siiniherkkyydellä ja kyvyttömyydellä kasvaa asetamidi 5 ainoana typenlähteenä. BAA-103:n vastavalikointi joissain tapauksissa johti amylaasigeenin menetykseen, mikä osoitettiin aktiivisuusmäärityksillä ja Southern-blottauksil-la. Tämä osoittaa, että fluoriasetamidivastavalikointia voidaan käyttää amdS-solujen seulontaan populaatiosta, 10 joka käsittää enimmäkseen amdS+ Bacillus -soluja, ja spesifisen kohdegeenin samanaikaiseen poistamiseen.

Vastaavalla tavalla on käytetty minimaalialustaa #132, jota ovat kuvailleet Vanderwinkel, E. ja De Vlieghere, 15 M., European J. Biochem., 5 (1968) 81-90, joka sisälsi lisäksi fluoriasetamidia pitoisuusalueella 1-50 mM ja 0,05 mM IPTG:tä amdS~ E. coli JM109 -solujen valikoimiseksi pGBamdS41-transformanttipopulaatiosta. Soluja siirros-tettiin tiheydessä 102 solua maljaa kohti. Tietyssä fluo-20 riasetamidipitoisuudessa vain muutama pesäke tuli näkyviin. pGBamdS41:n puuttuminen fluoriasetamidilla seulotuista pesäkkeistä varmistettiin DNA:n eristämisellä, : ampisilliiniherkkyydellä ja kyvyttömyydellä kasvaa aseta- • 4 :.V midi ainoana typenlähteenä. Tämä osoittaa, että fluo- 25 riasetamidivastavalikointia voidaan käyttää amdS-solujen : valikoimiseen populaatiosta, joka sisältää enimmäkseen ·· amdS+ E. coli -soluja.

j » * » * # 5 * · * · · * » * * * » · I · t > · » * « · • · » » * · « · 86 1 1 4481 SEKVENSSILISTAUS: (1) YLEISET TIEDOT: (1) HAKIJA: (A) NIMI: Gist-brocades N.V.

(B) KATU: Wateringseweg 1 (C) KAUPUNKI: Delft (E) MAA: Alankomaat

(F) POSTINUMERO (ZIP): 2611 XT

(ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Valintamerkkigeenittömät rihmasienikannat, menetelmä niiden valmistamiseksi, ja näiden kantojen käyttö (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 37 | (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin julkaisulupa #1, versio #1.25 (EPO) (2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo I (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) i (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: ·· (B) KLOONI: AB3100 0‘: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 1 CTAATCTAGA ATGCCTCAAT CCTGAA 26 (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: \. ·* (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 28 emäsparia > (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: kyllä 87 1 1 448 1 (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3101 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:2 GACAGTCGAC AGCTATGGAG TCACCACA 28 (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 16 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: TN0001 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:3 TGCATTAACT AGTTAA 16 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) ;;· (iii) HYPOTEETTINEN: ei i i t : (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB2154 « 1 1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:4 AACCATAGGG TCGACTAGAC AATCAATCCA TTTCG 35 I (2) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 emäsparia ;**: (B) TYYPPI: nukleiinihappo ... (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) :(iii) HYPOTEETTINEN: ei 114481 88 (iii) ANTI-SENSE: KYLLÄ (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB2155 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:5 GCTATTCGAA AGCTTATTCA TCCGGAGATC CTGAT 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:6 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB2977 (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:6 TATCAGGAAT TCGAGCTCTG TACAGTGACC 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:7 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 36 emäsparia , (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·,· j (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • s · ·· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) i · fV (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: KYLLÄ > » · *’ ’ (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB2992 1 ί (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:7

Tl GCTTGAGCAG ACATCACCAT GCCTCAATCC TGGGAA 36 (2) SEKVENSSIN ID NO: 8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: •( (A) PITUUS: 36 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste • ‘ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 89 114481 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB2993 (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:8 TTCCCAGGAT TGAGGCATGG TGATGTCTGC TCAAGC 36 (2) SEKVENSSIN ID NO:9 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 36 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: kyllä (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB2994 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:9 CTGATAGAAT TCAGATCTGC AGCGGAGGCC TCTGTG 36 (2) SEKVENSSIN ID NO:10 TIEDOT: 5 # · t · (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: •V (A) PITUUS: 31 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo t’j (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste ; ' : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen *..T (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) * » · ‘ (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei * · i': (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3657 » (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:10 AGCTTGACGT CTACGTATTA ATGCGGCCGC T 31 » (2) SEKVENSSIN ID NO:11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 114481 90 (A) PITUUS: 31 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: kyllä (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3658 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:11 TCGAAGCGGC CGCATTAATA CGTAGACGTC A 31 (2) SEKVENSSIN ID NO:12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 23 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3779 t · · f * i (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 12 :.V AATTGGGGCC CATTAACTCG AGC 23 a • · * /; (2) SEKVENSSIN ID NO:13 TIEDOT: • · ‘ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 23 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo *’ * (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen il (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) t » t ‘ (iii) HYPOTEETTINEN: ei ' s i i t (iii) ANTI-SENSE: kyllä * (vii) ALKUPERÄ: , (B) KLOONI: AB3780 ‘ * f 1 » 114481 91 (Xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:13 AATTGCTCGA GTTAATGGGC CCC 23 (2) SEKVENSSIN ID NO:14 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3448 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:14 GTGCGAGGTA CCACAATCAA TCCATTTCGC 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:15 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 36 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei ;V (iii) ANTI-SENSE: kyllä > · · *.·. (vii) ALKUPERÄ: ·: (B) KLOONI: AB3449 ' : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:15 ATGGTTCAAG AACTCGGTAG CCTTTTCCTT GATT CT 36 ‘ (2) SEKVENSSIN ID NO: 16 TIEDOT: . . (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: : (A) PITUUS: 36 emäsparia . (B) TYYPPI: nukleiinihappo '*[ (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen j 1 ’; (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) . (iii) HYPOTEETTINEN: ei 114481 92 (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3450 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:16 AGAATCAAGG AAAAGGCTAC CGAGTTCTTG AACCAT 36 (2) SEKVENSSIN ID NO:17 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 42 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: kyllä (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3520 (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:17 ATCAATCAGA AGCTTTCTCT CGAGACGGGC ATCGGAGTCC CG 42 (2) SEKVENSSIN ID NO:18 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ,V (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) * · · •| (iii) HYPOTEETTINEN: ei > · (iii) ANTI-SENSE: ei :·; (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3781 ; (ΧΪ) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 18 ί i AATTGGGGCC CAGCGTCC 18 ’ (2) SEKVENSSIN ID NO: 19 TIEDOT: ' / (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ; : (A) PITUUS: 18 emäsparia • ‘ (B) TYYPPI: nukleiinihappo ; (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste ", (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 93 114481 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: kyllä (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3782 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:19 AATTGGACGC TGGGCCCC 18 (2) SEKVENSSIN ID NO:20 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 43 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3746 (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:20 TGACCAATAA AGCTTCTCGA GTAGCAAGAA GACCCAGTCA ATC 43 (2) SEKVENSSIN ID NO:21 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 47 emäsparia v (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste j (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ! (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) ;·. (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: kyllä :· (vii) ALKUPERÄ: , (B) KLOONI: AB3747 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:21 ‘ ' CTACAAACGG CCACGCTGGA GATCCGCCGG CGTTCGAAAT AACCAGT 47 / (2) SEKVENSSIN ID NO:22 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 114481 94 (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB4234 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:22 GAAGACCCAG TCAAGCTTGC ATGAGC 26 (2) SEKVENSSIN ID NO:23 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 43 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: kyllä (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB4235 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 23 ;*.· TGACCAATTA AGCTTGCGGC CGCTCGAGGT CGCACCGGCA AAC 43 i · (2) SEKVENSSIN ID NO: 24 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 69 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo , (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste ’(D) TOPOLOGIA: lineaarinen . (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) > c · (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: :* (B) KLOONI: AB4236 95 114481 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:24 TGACCAATAA AGCTTAGATC TGGGGGTGAT TGGGCGGAGT GTTTTGCTTA GACAATCAAT CCATTTCGC 69 (2) SEKVENSSIN ID NO:25 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 36 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: kyllä (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB4233 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:25 TGACCAATAG ATCTAAGCTT GACTGGGTCT TCTTGC 36 (2) SEKVENSSIN ID NO:26 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 32 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) : (iii) HYPOTEETTINEN: ei i < t « :V: (iii) ANTI-SENSE: ei ii’ (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3514 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 26 ;·. CTGCGAATTC GTCGACATGC CTCAATCCTG GG 32 i · (2) SEKVENSSIN ID NO:27 TIEDOT: • : * (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: , (A) PITUUS: 37 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ,(C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen I · ' ;·’ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei t f 1 · · 114481 96 (iii) ANTI-SENSE: kyllä (Vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3515 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:27 GGCAGTCTAG AGTCGACCTA TGGAGTCACC ACATTTC 37 (2) SEKVENSSIN ID NO:28 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 50 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3701

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:28 CTGCGAATTC GTCGACACTA GTGGTACCAT TATAGCCATA GGACAGCAAG

50 (2) SEKVENSSIN ID NO:29 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 70 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen f * • · ,·. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) • · ! ·': (iii) HYPOTEETTINEN: ei , (iii) ANTI-SENSE: kyllä ; i · • · *' (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3700

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:29 :·. GCTCTAGAGC GCGCTTATCA GCTTCCAGTT CTTCCCAGGA TTGAGGCATT

] ’ TTTAATGTTA CTTCTCTTGC 70 ':(2) SEKVENSSIN ID NO: 30 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ; (A) PITUUS: 50 emäsparia ’··, (B) TYYPPI: nukleiinihappo 114481 97 (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3702

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:30 CTGCGAATTC GTCGACACTA GTGGTACCAT CCTTTTGTTG TTTCCGGGTG

50 (2) SEKVENSSIN ID NO:31 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 70 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: kyllä (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3703 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:31 GCTCTAGAGC GCGCTTATCA GCGGCCAGTT CTTCCCAGGA TTGAGGCATT GTATATGAGA TAGTTGATTG 70 i » 1 » · V: (2) SEKVENSSIN ID NO:32 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 55 emäsparia ‘ * (B) TYYPPI: nukleiinihappo _ (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * » · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei i : '* (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: . (B) KLOONI: AB3704 « r · * > » > * » · i » 114481 98 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:32 GCTCTAGAAG TCGACACTAG TCTGCTACGT ACTCGAGAAT TTATACTTAG ATAAG 55 (2) SEKVENSSIN ID NO:33 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 25 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: kyllä (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3705 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:33 TGCTCTAGAT CTCAAGCCAC AATTC 25 (2) SEKVENSSIN ID NO:34 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 31 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) ; ·; (iii) HYPOTEETTINEN: ei • · » # (iii) ANTI-SENSE: ei ':* (vii) alkuperä: (B) KLOONI: AB3965 i i , (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 34 CTGCTACGTA ATGTTTTCAT TGCTGTTTTA C 31 • · » (2) SEKVENSSIN ID NO:35 TIEDOT: ;,· · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ,i ;·. (A) PITUUS: 37 emäsparia ' \ ‘ (B) TYYPPI: nukleiinihappo ,(C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste * (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • a · t a (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) t ♦ r t (iii) HYPOTEETTINEN: ei i * i >

I I

99 1 1 4481 (iii) ANTI-SENSE: kyllä (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3966 (χί) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:35 CCGCCCAGTC TCGAGTCAGA TGGCTTTGGC CAGCCCC 37 (2) SEKVENSSIN ID NO:36 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 44 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3825

(ΧΪ) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:36 CGCGCTTATC AGCGGCCAGT TCTTCCCAGG ATTGAGGCAT ATGT

44 (2) SEKVENSSIN ID NO:37 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 44 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste ; : : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: KYLLÄ (vii) ALKUPERÄ: (B) KLOONI: AB3826 : .·. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 37

M CTAGACATAT GCCTCAATCC TGGGAAGAAC TGGCCGCTGA TAAG

:T: 44

Claims (25)

100 Λ Λ A Α Γ\ Λ 114481

1. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää dominoivan, kaksisuuntaisen ja vastavalikoituvan valintamerkkigeenin, 5 jota vierustavat DNA-toistojaksot, jotka mahdollistavat sisäisen rekombinaation rihmasienen genomissa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen vektori, tunnettu siitä, että DNA-toistojaksot valitaan genomista poistettavan DNA- 10 sekvenssin 5'- tai 3'-päästä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen vektori, tunnettu siitä, että valintamerkkigeeni on asetamidaasigeeni.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen vektori, tunnettu siitä, että asetamidaasigeeni on sieniperäinen.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen vektori, tunnettu siitä, että asetamidaasigeeni on Aspergillus-lajista. 20

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen vektori, tunnettu siitä, että vektori sisältää myös halutun DNA-fragmentin. I · V 25

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen vektori, tunnettu siitä, että haluttu DNA-fragmentti sisältää jonkin seuraavista geneettisistä tekijöistä tai niiden yhdistelmiä: geeni, cDNA, • ;1 promoottori, terminaattori, säätelytekijä, introni, ·· : tunnistussekvenssi DNÄ:ta sitovalle proteiinille, v : 30 translaation aloituskohta tai restriktiokohta. Ί'

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen vektori, tunnettu siitä, : että haluttu DNA-fragmentti sisältää sekvenssin, joka koodaa ; ' kymosiinia, fytaasia, ksylanaasia, lipaasia, amylaasia, ‘.Ί.· 35 proteaasia tai β-galaktosidaasia. / » 1 > 114481

9. Rekombinantti rihmasieni, joka on transformoitu jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukaisella vektorilla.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen rihmasieni, tunnettu siitä, 5 että se käsittää vähintään kaksi eri jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukaista vektoria.

11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen rihmasieni, tunnettu siitä, että vektori on integroitunut mainitun 10 rihmasienen genomiin paikkaspesifisen homologisen rekombinaation kautta.

12. Jonkin patenttivaatimuksista 9-11 mukainen rihmasieni tunnettu siitä, että rihmasieni on Aspergillus, Trichoderma 15 tai Penicillium.

13. Menetelmä valintamerkkigeenittömän rekombinantin rihmasienen aikaansaamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: 20 a) haluttu DNA-fragmentti ja dominoiva ja kaksisuuntainen valintamerkkigeeni integroidaan rihmasienen genomiin, b) transformantit valikoidaan c) valintamerkkigeeni poistetaan rekombinaatiolla valin-tamerkkigeenin viereisten toistojaksojen välillä 25 d) vastavalikoidaan, mikä perustuu valintamerkkigeenin puuttumiseen.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu < r » ;·; siitä, että valintamerkkigeenin 5'- tai 3'-puolelle kloo- 30 nataan sekvenssi, joka muodostaa toistojakson sekvenssin kanssa, joka on sen sekvenssin 3'- tai 5'-puolella, joka poistetaan genomista.

: ,·. 15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että haluttu DNA-fragmentti käsittää jonkin seuraavista geneettisistä tekijöistä, tai niiden yhdistelmiä: geeni, cDNA, promoottori, terminaattori, säätelytekijä, int- t s * roni, tunnistussekvenssi DNAita sitovalle proteiinille, 114481 translaation aloituskohta tai restriktiokohta.

16. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että kohdat a)-d) toistetaan saadulla rekombinantilla rihmasienellä käyttäen joko samaa tai eri haluttua DNA-fragmenttia.

17. Jonkin patenttivaatimuksista 13 - 16 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että valintamerkkigeeni on asetamidaasigeeni.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valintamerkkigeeni on sieniperäinen asetamidaasigeeni . 15

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valintamerkkigeeni on Aspergillus-lajin asetamidaasigeeni

20. Menetelmä bioaktiivisen tuotteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää jonkin patenttivaatimuksista 13 - 19 mukaisen menetelmän mukaisesti valmistetun rihmasienen kasvattamisen. * *

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bioaktiivinen yhdiste on proteiini. I * ·

22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu » siitä, että bioaktiivinen yhdiste on antibiootti. '* 30

23. Rihmasienen, joka on valmistettu jonkin patenttivaatimuksista 13 - 19 mukaisella menetelmällä, käyttö bioaktiivisen yhdisteen valmistamiseksi. ' » ,··, 35

24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen käyttö, tunnettu siitä, ’* että bioaktiivinen yhdiste on proteiini. 114481

25. Patenttivaatimuksen 23 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että bioaktiivinen yhdiste on antibiootti. 1 1 4481 Patenkrav