JPH0253480A - リゾープスの形質転換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はりゾープスの形質転換法に関する。

〔従来の技術〕

インターフェロン、インターロイキンといった有用タン
パク質をバクテリアを形質転換することにより製造する
方法は確立されつつある。それと同時にバクテリアを用
いた場合の問題点も明らかになってきている。例えばバ
クテリアは目的とする有核生物のタンパク質（例えばホ
ルモン、酵素）の生産量が少なく、かつ該タンパク質が
菌体外へ分泌されにくい。さらに、インターフェロン及
びインターロイキンを大腸菌を用いて作った場合、これ
ら人工のタンパク質と天然のタンパク質との間では１次
構造は同じであるが、２次構造が異なり、その結果人工
のタンパク質は人体内で異物（抗原）として認識されて
しまう。そこで使用に際しては人工のタンパク質をリネ
ーチャーする必要がある。

ところで「くものすカビ」、「けかび」のような藻菌類
は、発酵工業において広く使用され、リゾープスはその
一種である。リゾーブス等のカビは、体外への酵素分泌
力が高く　（例えばアミラーゼの分泌量は液体培養：　
１５　ｇ／ｋｇ、固体培養：３０ｇ／ｋｇである）、か
つ細胞外へ分泌するために得られる蛋白質は１次構造の
みならず２次構造も天然の蛋白質と同じである。そこで
カビを形質転換して蛋白質の製造に用いることが期待さ
れる。

しかし、従来カビの形質転換法は確豆されているものは
少く、リゾープスについては全くない。

〔発明が解決しようとする課題〕

そξで本発明の目的は、カビの一種であるリゾープスの
形質転換法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

そこで本発明は、リゾープスの胞子を培養して発芽管を
得、該発芽管及び／又は胞子もしくは菌糸を細胞膜溶解
酵素（例えばノボザイム２３４）、キチナーゼ及びキト
サナーゼで処理してプロトプラスト化細胞とし、該細胞
をＤＮＡの存在下でポリエチレングリコールで処理して
ＤＮＡを含む融合細胞とし、得られた融合細胞を再生す
ることを含むリゾープスの形質転換法に関する。

以下本発明の形質転換法についてリゾープスニベウス（
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎ１ｖｅｕｓ）を例に説明する。

リゾーブスの胞子は溶菌酵素に対して耐性であり胞子か
ら直接プロトプラストを得ることは困難である。そこで
、まず胞子を液体培地で激しく振盪培養することにより
発芽管を形成させる。発芽管の形成は公知の方法をその
まま用いることができる。

次いで得られた胞子、発芽管菌糸混合液に対し溶菌酵素
を作用させ、例えば３０℃で２時間積やかに振盪しプロ
トプラスト化をおこなう。得られたプロトプラストはグ
ラスフィルターで濾過した後、種々のバッファーで洗浄
し形質転換の資料とする。

本発明において溶菌酵素としてノボザイム２３４、キチ
ナーゼ及びキトサナーゼの３種を用いる。いずれか一つ
の酵素を欠いてもプロトプラスト化は生じない。このよ
うにして得られたりゾープス　ニベウスの発芽管とプロ
トプラストを第１図及び第２図示す。プロトプラストの
大きさは直径約２０〜３０μｍ、形はほぼ球形をしてお
り、はとんど完全なプロトプラストが得られる。

得られたプロトプラストは次いで形質転換に供される。

まずプロトプラストはＤＮＡの存在下ポリエチレングリ
コール（以下ＰＥＧと略記する）で処理して、ＤＮＡを
含む融合細胞を得る。咳ＰＥＧ処理は、従来法により行
えばよい。例えばプロトプラストをＤＮＡを混合し、次
いで混合液にＰＥＧ溶液を加えて水中で放置することに
より行うことができる。

ここでＤＮＡとは、目的とするタンパク質をコードする
ＤＮＡ断片又はそれを含むプラスミドを意味する。目的
とするタンパク質及びベクタープラスミドには特に限定
はない。目的とするタンパク質の例としては、インター
フェロン、インターロイキン、アミラーゼ等を挙げるこ
とができる。

又、ベクタープラスミドとしては、リゾーブス内で発現
し、選択マーカー（例えば薬剤耐性、栄養要求性〉を有
するものであればいずれのものも用いることができる。

例えばプラスミドＹＲｐＧｌ（第３図）、ｐＧＧＲｌ（
第４図）を用いることができる。

ＤＮＡを含む融合細胞を培養し、形質転換株を選択する
ことによりリゾープスの形質転換体を得ることができる
。上記プラスミドＹＲｐＧ１及びｐＧＧＲｌはＧ４１８
耐性遺伝子を有することから、完全液体培地中で予めイ
ンキュベートした融合細胞を０４１８を含有する最少培
地で数日（２〜３日）間培養することにより形質転換体
のコロニーを選択することができる。形質転換体である
ことは、例えばｐＢＲ３２２をプローブとするハイブリ
ッド形成テストにより確認できる。

本発明の方法は、リゾープス　ニベウス以外のりゾーブ
スについても適用ができ、本発明の方法により得られた
りゾープス形質転換体を用いて種々の有用なタンパク質
を製造することが可能となる。

以下本発明を実施例によりさらに説明する。

実施例 （１）プロトプラストの形成 リゾープス　ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎ１ｖｅｕ
ｓ）の胞子を常法により採取して、２〜３Ｘ１０７胞子
となるようにＣＭ溶液〔１％グルコース、２％イースト
エクストラクト、２％ポリペプトン、０．１Ｍプロリン
〕に接種した。該溶液を３０℃で５時間往復振とうした
後、Ｇ−１フイルターで濾過し、Ａ液（５０ｍＭ　Ｋ　
Ｈ２Ｐ　０４．０．３Ｍマンニトール、ｐＨ５，５］で
２回洗浄した。得られた生成物をＡ液（７ｍｊ’）に懸
濁し、得られたｕＢ液にキチナーゼ５　ｍｇ　／　ｍｌ
、、キトサナーゼ１、５　ｍｇ　／　ｍｅ及びノボザイ
ム２３４を１．５ｍｇ／蔵を含有するΔ液５ｍｔ’を添
加し、３０℃で６０ｖ、　ｐ、　ｍ、で撹拌しつつ２時
間保持した。得られた生成物（プロトプラスト）をＧ−
２ガラスフイルターで濾取し、５０×ｇで３分間遠心分
離した後、５ｍｆｆＢ液Ｎ０ｍＭ　　ＭＯＰＳ　（３（
Ｎｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）　ｐｒｏｐａｎｐｌ　５ｕｌ
ｐｈａｎｉｃ　ａｃｉｄ）　（ｐＨ６，３）、０．３５
Ｍマンニトール〕で２回洗浄し、２００μｆのＣ液［１
０ｍＭ　　ＭＯＰＳ　（ｐ）Ｉ６．３）　、５０ｍＭＣ
ａＣｊ！２．０．３　ＭＶ　ン−）　−／ｌ、］に懸濁
した。

得られたプロトプラスト及び胞子の写真を第２図及び第
１図にそれぞれ示す。

（２）プラスミドＤＮＡの構築 〔プラスミドＹＲｐＧ１］ プラスミドＹＲｐＧ１は大腸菌よりプラスミドを通常の
方法により調製した。ＹＲｐＧｌの制限酵素地図を第３
図に示す。ＹＲｐＧｌは、ＹＲｐ７のｐｖｕ　ｆ１部位
に６４１８耐性遺伝子を含む約１，７ｋｂ　　ＰＶＵ　
ＩＩ断片が挿入されたものである。このＧ４１８耐性遺
伝子はＴｎ　９０３由来ではあるが、真核生物であるサ
ツ力ロミセスセレヴシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アクレモニウム　クリソ
ゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎ　ｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕ
ｍ）、さらにリゾープスと同じ接合菌類のフィコミセス
（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）において発現・機能したとい
う報告がある（Ｐｒｏｃ、Ｎ、Ａ、Ｓ、。

Ｕ、Ｓ、　Ａ、、狼、　　１９８６．７３４４〜７３４
７）。

〔プラスミドｐＧＧＲＩＥ プラスミドｐＧＧＲ，１は第４図のフローシートに従い
、遺伝子工学共立出版微生物学講座第８巻に記載の方法
に従って構築した。まず、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むｌ
、　７　ｋｂ　Ｐｖｕ　ＩＩ断片よりＡｌｕｍ、旧ｎｄ
ＩＩＩ断片を切りだし、Ｍ１３ｍｌｌ　９のＨｉｎｃ［
、旧ｎｄｌＩＩ部位にサブクローニングした。

次に、部位突然変異によりＧ４１８耐性遺伝子のＡＴＧ
直上流にＥＣＯＲ■部位を導入し、このｔｌｉｎｄ［［
、ＥｃｏＲＩ断片とＹＲｐＧ２の旧ｎｄｌＩＩ、Ｅｃｏ
ＲＩ断片をそれぞれ切りだし、リゲーションし、ｐＧＲ
ｌを構築した。このｐＧＲｌのＢｃｏＲ■部位にＲ，オ
リザエ（Ｒ，ｏｒｙｚａｅ）のグルコアミラーゼ遺伝子
のプロモーター領域を含むＢＣＯＲＩ断片を挿入し、ｐ
ＧＧＲｌを構築した。

（３）形質転換 ＣＤＮＡとして、プラスミドＹＲｐＧ１を使用〕（１）
で得たプロトプラスト１００μｌとプラスミドＹＲｐＧ
１約２５μｇを含む溶液１０μβを混ぜ水中に５分、１
０μβのＰＥＧ溶液を加えさらに水中に２０分、１．２
５ｍｆｆのＰＥＧ溶液を加え室温で２０分放置した。遠
心（８００Ｘｇ。

５分）によりプロトプラストを集菌し、０．３　Ｍマン
ニトールを含む完全液体培地１ｍｆ！を加え、３０℃、
３０分インキュベートした後、このうちの１００μｌを
軟寒天（再生寒天）と混ぜ、２５７、９μｇ／−の０４
１８を含む最少培地（ＭＭ培地）に重層した。この際、
軟寒天及び最少培地のプレートはリゾープス（Ｒｈｉｚ
ｏｐｕｓ）がコロニーを形成するようｐｌ（を２．５に
まで下げである。重層後、３０℃で２日から３日インキ
ュベートした結果、ＤＮＡを加えずに同様の操作を行な
ったコントロールと比較して明らかに生育の速いコロニ
ーが１１個得られた。また、同じ実験を再度行なったと
ころ生育の速いコロニーが１６個得られ、実験の再現性
が示された。

次ニ、これら１１個及び１６個のコロニーよりトータル
ＤＮＡを調製し、ｐＢＲ３２２をプローブとしてドツト
プロットアナリシスを行なった。

第５図及び第６図にドツトプロットの結果を示す。Ｐは
ポジティブコントロール、Ｗは野性株より調製したトー
タルＤＮＡをプロットしたものである。

第５図から明らかなように、１１個のコロニーの方では
少なくとも４個、第６図から明らかなように１６個のコ
ロニーの方では少なくとも６個がｐＢＲ３２２とハイブ
リダイズしており、リゾープス　ニベウス（Ｒｈｉｚｏ
ｐｕｓ　ｎ１ｖｅｕｓ）　ヘのプラスミドＹＲｐＧｌの
導入されていることが示された。

（ＤＮＡとしてプラスミドｐＧＧＲ１を使用〕ＹＲｐＧ
１の代わりにｐＧＧＲｌを用い、Ｒｏｎｉｖｅｕｓの形
質転換を行った。方法は再生の培地に、１．５％スター
チが入っていることと、Ｇ４１８の濃度が３８６．８μ
ｇ／ｒｄ！であることを除けば、前述の方法と同様であ
る。

３０℃で２日間インキュベートした結果、コントロール
と比較して、生育の良いコロニーを４個得られた。これ
ら４株をＧ４１８を含む培地にレプリカしたところ野性
株に比べ２倍から５倍の速さで生育し、Ｇ４１８に対し
耐性化していることが示された。

そこで、これら４株よりトータルＤＮＡを調製し、サザ
ン・ハイブリダイゼイションを行なった。

トータルＤＮＡは制限酵素では消化せずに、そのまま電
気泳動してプロッティングを行なった。プローブにはｐ
ＢＲ３２２を用いた。結果を第７図に示す。４個とも全
て２３ｋｂ以上の所にシグナルが見られ、導入したＤＮ
Ａがクロモソームにインチブレイトしたことが示唆され
た。

尚、形質転換実験に用いられた溶液等の詳細は以下の通
りである。

プラスミドＤＮＡ：０．５ｍｇヘパリンを含有するＣ液
で氷上で２０分間予備処理し た。（約２５μｇ含有） ＰＥＧ溶液：４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００．１０ｍ
ＭＭ０ＰＳ　（ｐＨ６，３）、 ５０　ｍ　Ｍ　ＣａＣｊ２２ 再生寒天　二０．２％アスパラギン、２％グルコース、
０．０５％ＫＨ２Ｐ○４． ０、０２５％Ｍｇ５Ｏ＜・７）１，０．０．３　Ｍマン
ニトール、０．６％寒天、ｐＨ ２，５ ＭＭ寒天培地二０．２％アスパラギン、２％グルコース
、０．０５％ＫＨ，Ｐ０４． ０、０２５％ＭｇＳ［］＜・７８２（］　、０．３　Ｍ
マンニトール、０．６％寒天、ｐＨ ２，５

【図面の簡単な説明】

第１図はリゾープスの胞子（生物の形態）を示す写真で
あり、第２図はりゾープスのプロトプラスト（生物の形
Ｂ）を示す写真でり、第３図はプラスミドＹＲｐＧ１の
制限酵素地図であり、第４図はプラスミドｐＧＧＲ１の
作成フローシートであり、第５図及び第６図にドツトプ
ロットアナリシスの結果を示し、第７図にサザンハイブ
リダイゼーションの結果を示す。 第５図 第６図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. リゾープスの胞子を培養して発芽管を得、該発芽管又は
   胞子もしくは菌糸をノボザイム２３４、キチナーゼ及び
   キトサナーゼで処理してプロトプラスト化細胞とし、該
   細胞をＤＮＡの存在下でポリエチレングリコールで処理
   してＤＮＡを含む融合細胞とし、得られた融合細胞を再
   生することを含むリゾープスの形質転換法。