PT90484B - Processo para a oxidacao bioquimica de esteroides e para a preparacao por engenharia genetica de celulas para esse fim - Google Patents

Description

Descrição

A presente invenção refere-se a um processo para a ^: oxidação bioquímica para a preparação de esteróides farmaceuti1' u |! camente úteis.

ENQUADRAMENTO GERAL DA INVENÇÃO

A 11£, 17<c, 21-tri-hidroxi-4-pregneno-3,20-diona (didrocortisona) é um esteróide farmaceuticamente importante, usado i pelas suas propriedades farmacológicas como corticosteróide e | como composto de partida para a preparação de numerosos esteróii des úteis, particularmente outros corticosteróides.

A hidrocortisona é produzida no córtex adrenal de vertebrados e foi originalmente obtida, apenas em pequenas quantidades, por um laborioso processo de extracção a partir do tecido do córtex adrenal. Só depois de se ter procedido à elucidação da sua estrutura se desenvolveram novas vias de produção, caracterizadas por uma combinação de operações de síntese química e de transformações microbiológicas. Só por causa dos compostos de partida que são empregados, tais como esteróides, áci1 dos biliares e sapogeninas serem abundantes e baratos, os presentes processos originam um produto menos dispendioso mas, mesmo assim, são ainda relativamente complicados. Previram-se diversas possibilidades para melhorar os presentes processos e também foram experimentadas tentativas bioquímicas.

Uma tentativa consistiu em conseguir efectuar a transformação dum esteróide de partida apropriado transformado num sistema bioquímico in vitro usando as proteínas do córtex adrenal isoladas que se sabe serem responsáveis pela transformação enzimática in vivo de esteroides com obtenção de hidrocortisona. No entanto, o isolamento difícil das proteínas e o elevado preço dos cofactores necessários parecem ser proibitivos para se conseguir um processo em grande escala economicamente atraente.

Outra tentativa consistiu em conservar as proteínas catalisantes no seu ambiente natural e ter as células do córtex adrenal a produzir a hidrocortisona pretendida numa cultura de células. No entanto, devido à pequena produtividade das células na prática, pareceu ser impossível tornar um tal processo bioquímico economicamente interessante.

processo in vivo no córtex adrenal de mamíferos e de outros vertebrados constitui um caminho bioquímico que parte do colesterol e, passando através de vários compostos intermediários, eventualmente proporciona hidrocortisona (veja-se a Figura 1). Oito proteínas estão directamente envolvidas neste método, cinco das quais são enzimas, de entre as quais quatro são enzimas do citocrómio P^q ^{e as} outras três são proteínas de transferência de electrões.

A primeira fase é a transformação do colesterol em 3j3~ -hidroxi-5-pregnene-20-ona (pregnenolona). Nesta transformação, que consiste em uma reacção de mono-oxigenase, estão envolvidas três proteínas: a enzima de clivagem da cadeia lateral (P^^^SCC, uma proteína contendo heme-Fe), adrenodoxina (ADX, uma proteína que contém e adrenodoxina-redutase (ADR, uma proteína que contém FAD). Além do colesterol como substrato, a reacção ainda necessita de oxigénio molecular e de NADPH.

Subsequentemente, a pregnenolona é transformada por

desidrogenação/isomerização em 4-pregneno-3,20-diona (progesterona). Esta reacção, catalisada pela proteína 3^-hidroxi-esteróide-desidrogenase/isomerase (3β -HSD), necessita de pregnenolona e de NAD⁺.

Para se obter hidrocortisona, a progesterona é subsequentemente hidroxilada em três posições, transformações essas que são catalisadas por mono-oxigenase. Na transformação de progesterona em 17oC-hidroxi-progesterona, estão envolvidas duas proteínas: esteróide 17flC-hidroxilase (Ρ^^θ17β^, uma proteína que contém heme-Fe) e NADPH citocrómio P^q redutase (RED, uma proteína que contém FAD e FMN). A reacção consoma progesterona, oxigénio molecular e NADPH.

Para a transformação de 17et-hidroxi-progesterona em 17«C, 21-di-hidroxi-4-pregneno-3,20-diona ( cortexolona ) , também são necessárias duas proteínas: esteróide-21-hidroxilase (P45QC21, uma proteína que contém heme-Fe) e a proteína RED acima mencionada. A reacção consome 17«Ç-hidroxi-progesterona, oxigénio molecular e NADPH.

Na transformação de cortexolona em hidrocortisona, estão envolvidas três proteínas : esteróide lip -hidroxilase (Ρ 11β) , uma proteína que contém heme-Fe e as proteínas acima mencionadas ADX e ADR.

Como se descreveu acima, as proteínas de citocrómio P45Q são enzimas que são essenciais para a transformação bioquímica do colesterol em hidrocortisona. Estas enzimas pertencem a um grupo mais largo de proteínas de citocrómio Ρ^^θ (ou, resumidamente, proteínas Ρ^^θ).

Estas proteínas foram encontradas em procariotes (várias bactérias) e em eucariotas (fermentos, bolores, plantas e animais). Nos mamíferos, encontram-se elevados níveis de proteí nas P₄₅₀ no córtex adrenal, nos ovários, testículos e fígado. Muitas dessas proteínas foram purificadas e estão agora bem caracterizadas. A sua actividade específica foi determinada. Recentemente, publicou-se um certo número de revisões sobre este assunto, tais como K. Ruckpaul e H. Rein (Edi.), Cytochrome P450 ^{e P}’ ^{R Ort}^^z de Montellano (Edi.), Cytochrome P45Q, x }

structure, mechanism and biochemistry.

As proteínas de citocrómio P^q caracterizara-se pelo seu máximo de absorvância específica a 450 nm depois da redução com monóxido de carbono. Nos organismos procarióticos, as proteínas P_45Q estão ou ligadas à membrana ou são citoplasmáticas. No que diz respeito às proteínas P45Q de bactérias, elas foram estudadas pormenorizadamente (por exemplo, P^^gmeg e P^^gCam) e verificou-se que estão envolvidas uma ferredoxina e uma ferre doxinreductase na actividade de hidroxilação. Para os organismos eucarióticos, descreveram-se dois tipos de proteínas P45Q,

I e II. As suas duas diferenças residem em:

1. a localização subcelular das proteínas do tipo I estar localizada na fracção microssómica e a das do tipõ II estar localizada na membrana interior dos mitocôndrios;

2. a maneira como os electrões são transferidos para a proteí na P45Q· θ tipo I é reduzido por NADPH por meio de Ρ^,redutase, enquanto o tipo II é reduzido por NADPH por meio de ferredoxina-redutase (por exemplo, adrenodoxina-redutase) e uma ferredoxina (por exemplo, adrenodoxina).

De acordo com a Patente de Invenção Europeia EP-A-0281245, podem preparar-se enzimas citocrome P45Q ^a partir da espécie Streptomyces e são usadas para a hidroxilação de compos tos químicos.

As enzimas são utilizadas sob uma forma isolada, o qu exige uma maneira de proceder bastante tediosa e dispendiosa.

A Patente de Invenção Japonesa JP-A-52236485 (Derwent

87-331234) refere que é possível introduzir em Saccharomyces cerevisiae os genes de enzimas de P45Q citocrómio do fígado e exprimi-los proporcionando enzimas que podem ser usadas devido à sua actividade de oxidação.

No entanto, nas referências acima mencionadas, não há qualquer indicação de utilização de enzimas de citocrómio P45Q para a preparação de compostos esteróides.

SUMÁRIO da invenção

A presente invenção proporciona uma multiplicidade de

cassetes de expressão para a produção de proteínas necessária para a construção de um sistema multigénico para a transformação por meio de um método em uma única operação de materiais de partida esteróides baratos, de maneira a obterem-se produtos finais mais raros e caros, caracterizada pelo facto de essa transformação se realizar em sistemas naturais, através de uma multiplicidade de transformações catalisadas por enzimas e mediadas por cofactores, tais como a produção de hidrocortisona a partir de colesterol. As cassetes de expressão de acordo com a presente invenção são úteis na produção final de sistemas multigénicos para realizar estas transformações em fases múltiplas.

Por consequência, de acordo com um dos seus aspectos, a presente invenção refere-se a uma cassete de expressão efectiva numa célula hospedeira recombinante em exprimir uma sequência de ADN codificante heteróloga, caracterizada pelo facto de a referida sequência de codificação codificar uma enzima que é capaz, sozinha ou em cooperação com uma proteína adicional, de catalisar uma fase de oxidação no processo geral biológico para a transformação de colesterol em hidrocortisona.

As cassetes de expressão de acordo com a presente invenção incluem, portanto, as sequências capazes de produzirem, num hospedeiro recombinante, as seguintes proteínas : enzima de clivagem da cadeia lateral (P^^qSCC); adrenodoxina (ADX); adrenodoxina-redutase (ADR); 3^-hidroxi-esteróide-desidrogenase/ isomerase (3JJ-HSD); esteróide 17<-hidroxilase (Ρ^θΙϊΛ); NADPH citocrómio Ρ₄₅θ redutase (RED); esteróide 21-hidroxilase (P45QC21); e esteróide IIP -hidroxilase (P45Q lip).

De acordo com outros aspectos, a presente invenção refere-se a células de hospedeiros recombinantes transformadas com as cassetes de expressão de acordo com a presente invenção, aos métodos para produzir as enzimas acima referidas e para usar essas enzimas para a oxidação; aos processos para usar as mencionadas células hospedeiras para oxidações específicas num caldo de cultura e às composições farmacêuticas que contêm os compostos preparados pelos citados processos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Em todas as Figuras, empregaram-se as seguintes abreviaturas : R^, EcoRI; H, HindIII; Sc Seal; P, PstI; K Kpnl; St, StuI; Sp Sphl; X, Xbal; N, Ndel; S; Smal; Ss, SstI; R EcoRV;

S Saci; B, BamHI; ^sIIf SacII; Sal, Sall; Xh, Xhol; Pv, PvuII; Bg, BglII e M, MluI.

A Figura 1 representa uma vista global esquemática das proteínas envolvidas nas operações que se sucedem na transformação de colesterol em hidrocortisona tal como ocorre no córtex adrenal de mamíferos.

A Figura 2 representa a construção do plasmídio pGBSCC-1. As sequências P_45QSCC são indicadas numa zona tracejada (IMWI).

A Figura 3 mostra a inserção de um fragmento PstI/Hind III sinteticamente derivado contendo as sequências 5'-P^ggSCC no plasmídio pTZl8R para se obter o plasmídio pTZ synlead.

pleto te (| obter

P

450

A Figura 4 mostra a construção de um comprimento comSCCcDNA de sequências P^^^SCC derivadas sinteticamen) e por clonação de cDNA ( 1/////////1 ) em pTZl8R para se do pl pGBSCC-2.

A Figura 5 mostra a sequência completa de nucleótidos asmídio pBHA-1.

A Figura 6 é uma representação esquemática da construção de pGBSCC-3. As sequências de P^^^SCCcDNA do plasmídio pGBSCC-2 foram introduzidas no plasmídio pBHA-1 lançadeira de Bacillus/E. coli. Dentro das caixas estão as indicações da legenda da Figura 4.

A Figura 7 mostra a introdução de um sítio de restrição Ndel em combinação com um codão de iniciação ATG antes do sítio de maturação P^^qSCC em pGBSCC-3, para se obter pGBSCC-4.

A Figura 8 representa um mapa típico de pGBSCC-5 que é obtido por remoção das sequências de E. coli do plasmídio pGBSCC-4.

A Figura 9 representa uma mancha de Western ensaiada

com anticorpos contra p^qSCC, demonstrando a expressão de P^ç-qSCC do plasmídio pGBSCC-5 introduzido em B. subtilis (pista

c) e em B. licheniformis (pista f). Extractos de controlo de B. Subtilis e de B. licheniformis são representados nas pistas a e d, respectivamente. Para comparação, também se adicionou córtex adrenal purificado P^^SCC (30 ng) a estes extractos de controlo (pista b e £, respectivamente).

A Figura 10 é uma representação esquemática da construção de pGBSCC-17. As sequências de codificação P SCC-DNA do plasmídio pGBSCC-4 foram introduzidas no vector de expressão pTZl8RN de E. coli. As sequências de P₄₅qSCC estão indicadas dentro de um rectângulo tracejado ( \il)lllíll\ ) .

A Figura 11 mostra a expressão de P^^^SCC de pGBSCC-17 em E. coli JM101.

(a) Manchamento de SDS/PAGE e com azul brilhante de Coomassie das fracções de proteína de células (20 p.1) preparadas a partir da mancha de controlo de E. coli (pista 3) e de transformantes SCC-301 e 302 de E. coli (pistas 1 e 2, respectivamente). Para comparação, representa-se o resultado obtido com 400 ng de P^^^SCC bovino purificado (pista ) .

(b) Análise da mancha de Western obtida com anticorpos contra ^Ρ450$£Ε óe fracções de proteína celulares (5 microlitros) preparadas a partir da estirpe de controlo E. coli JM101 (pista 2) e de transformantes SCC-301 de E. coli (pista 3) e SCC-302 (pista 4) de E. coli. Para comparação, representa-se o resultado obtido com 100 ng de P^qSCC bovino purificado (pista 1).

A Figura 12 representa a construção do plasmídio pUCG418 .

A Figura 13 representa a construção do vector de expressão de levedura pGB950 por inserção do promotor e do terminador com sítios de clonação múltiplos ( ) de lactase em pUCG418. Para derivar pGBSCC-6, insere-se um fragmento sintético Sall/Xhol contendo um codão de iniciação ATG e os codões para os primeiros oito aminoácidos de p qSCC em pGB950.

A Figura 14 é uma representação esquemática que mostra a construção da cassete de pGBSCC-7 de expressão de P^^^SCC de levedura.

A Figura 15 representa o resultado da análise de manchamento de Western ensaiado com anticorpos específicos para a proteína P^^^SCC.

As manchas A referem-se a extractos derivados de Saccharomyces cerevisiae 273-10B transformados com pGBSCC-10 (pista 1); de S. cerevisiae 273-10B como controlo (pista 2); de Kluyveromyces lactis CBS 2360 transformado com pGBSCC-7 (pista

3) e de K. lactis CBS 2360 como controlo (pista 4),

O conjunto de manchas B refere-se a extractos derivados de K. lactis CBS 2360 como controlo (pista 1) e K.lactis CBS 2360 transformado com pGBSCC-15 (pista 2), com pGBSCC-12 (pista 3) ou com pGBSCC-7 (pista 4).

O conjunto de manchas C refere-se a extractos derivados de S. cerevisiae 273-10B como controlo (pista 1), transformados com pGBSCC-16 (pista 2) ou com pGBSCC-13 (pista 3).

A Figura 16 é uma representação esquemática da construção do vector de expressão de levedura pGBSCC-9 contendo o promotor de isocitocrómio Cl (cyc-1) de S. cerevisiae.

A Figura 17 representa um diagrama da construção de P^5qSCCcDNA contendo vector de expressão pGBSCC-10 para S. cerevisiae.

A Figura 18 representa a construção do vector de expressão pGBSCC-12 de P^^^SCC, em que o fragmento de ADN derivado sinteticamente codifica a sequência de pre-P^^^SCC ( I/////////I ) é inserido em 5' para a sequência de codificação de P^^^SCC maturo .

A Figura 19 mostra a construção de pGBSCC-13. Esta cassete de expressão de P^^SCC para S. cerevisiae contém a sequência de pré-P^ggSCCcADN posicionada em 3' do promotor cyc-1 de S. cerevisiae.

A Figura 20 é uma representação ção dos plasmídios pGBSCC-14 e pGBSCC-15.

esquemática da constru Este último contém a

- 8 SCC na estrutura com a pré-sequênsequência de codificação Ρ^θ cia de citocrómio oxidase VI ( I/////////I ) .

A Figura 21 representa a construção do plasmídio pGBSCC-16. Neste plasmídio, a pré-sequência de citocrómio-oxidase VI ( \lllllllli\ ) de S. cerevisiae fundida com a sequência de codificação P^^gSCC é posicionada em 3' do promotor cyc-1.

A Figura 22 representa os mapas físicos dos plasmídios pGB17«-l (A) e pGB17ot-2 (B) que contêm o fragmento 3' de 1,4 kb e o fragmento 5' de 345 bp (/////////1 de P_45Q17eCcADN, respectivamente. Em pGBl7«t-3 (C), contendo a sequência de comprimento total ^P45Ql7eCcADN, a posição do codão de iniciação ATG é indicada.

A Figura 23 representa a mutação de pGB17ot-3 por mutagénese in vitro. 0 plasmídio pGBl7<-4 assim obtido contém um sítio de restrição Sall seguido por sinais de translação de leveduras óptimos precisamente a montante do codão de iniciação ATG.

A Figura 24 é uma vista esquemática da construção da cassete de expressão da levedura Ρ^^θ17<, pGBl7«-5.

A Figura 25 representa a mutação de pGB17et-3 por mutagénese in vitro. 0 plasmídio pGBl7oC-6 assim obtido contém um sítio de restrição Ndel no codão de iniciação ATG.

A Figura 26 é uma representação esquemática da construção de pGBl7ct-7. As sequências Ρ^θ17«ϊοΑϋΝ do plasmídio pGBl7eí-6 foram produzidas no plasmídio pBHA-1 de ida-e-volta de Bacillus/E. coli.

A Figura 27 representa um mapa físico de pGB17oe-8 que se obtém por remoção das sequências de E. coli do plasmídio pGBl7«-7.

A Figura 28 mostra mapas físicos de oGBC21-l e 2 contendo um fragmento de 1,53 kb 3'-P₄₅₀C21cADN e de 540 bp 5'P₄5qC21cADN EcoRI, respectivamente, no sítio de EcoRI do vector de clonação pTZ18R.

A Figura 29 representa a mutagénese in vitro por reacção de cadeia de polimerase (PCR) de pGBC21-2 para introduzir os sítios de restrição EcoRV e Ndel a montante do codão de inicia9 ção ATG PgθC21 seguida por clonação molecular para o vector de clonação pSP73 para derivar pGBC21-3.

A Figura 30 é uma vista esquemática da construção de pGBC21-4 contendo a sequência Ρ^θΟΣΙοΑϋΝ de comprimento completo .

A Figura 31 é uma representação esquemática da construção de pGBC21-5. A sequência P^gQC21cADN do plasmídio pGBC21-4 foi introduzida no plasmídio pBHA-1 de vai-vem de Bacillus/E. coli.

A Figura 32 representa um mapa físico de pGBC21-6 que I se obtém por remoção das sequências de E. coli do plasmídio pGBC21-5.

A Figura 33 representa a mutação de pGBC21-2 por mutagénese in vitro. O plasmídio pGBC21-7 assim obtido contém um sítio de restrição Sall seguido por sinais óptimos de translação de levedura precisamente a montante do codão de iniciação ATG.

A Figura 34 representa a construção de pGBC21-8, con; tendo um P^gQC21cADN de comprimento completo com sítios de res: trição de flanqueamento modificados apropriado para clonaçao no vactor de expressão de levedura.

A Figura 35 é uma representação esquemática que mostra a construção da cassete de expressão Ρ^θΟΣΙ em levedura pGBC21-9.

A Figura 36 representa a mutagénese in vitro provocada í por reacção de cadeia de polimerase pGBlip-1 para introduzir j sítios de restrição de flanqueamento apropriados e um codão de iniciação ATG para a sequência Ρ^θ iipc ADN de comprimento comple4 ; to, seguido por clonação molecular no vactor pBHA-1 de vai-vem de Bacillus/E. coli para derivar o plasmídio pGBll£-2.

A Figura 37 representa a mutagénese in vitro por reacção em cadeia de polimerase de pGBll/5-1 para introduzir sítios de restrição de flanqueamento apropriados e um codão de iniciação ATG para a sequência P^g^ll^cDNA de comprimento completo seguida por clonação molecular no vector de expressão de levedura . pGB950 para derivar o plasmídio pGBll^J-4.

Ά Figura 38 é uma vista esquemática da clonação molecular da sequência ADXcADN de uma mistura de córtex adrenal bovino poli-A⁺RNA/cDNA pelo método da reacção da cadeia de polimerase. A sequência cDNA que codifica a proteína ADX madura foi inserida nos sítios apropriados do vector de expressão de levedura pGB950 para se obter o plasmídio pGBADX-1.

A Figura 39 representa uma mancha de Western obtida com anticorpos contra ADX, demonstrando a expressão de ADX do plasmídio pGBADX-1 em transformantes ADX-101 e 102 de K. lactis CBS 2360 (pistas 4 e 5, respectivamente). Na pista 3, representa-se a mancha obtida com a estirpe de controlo K. lactis CBS 2360. Para comparação, também se proporciona, na pista 1, a mancha para ADX de córtex adrenal purificado (100 ng).

A Figura 40 representa a mutagénese in vitro provocada por reacção da cadeia de polimerase de pGBADR-1 para introduzir os sítios de restrição de flanqueamento apropriados e um codão de iniciação ATG na sequência ADRcDNA de comprimento total, seguida por clonação molecular no vector de expressão de levedura pGB950 para derivar pGBADR-2.

PORMENORES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere^se à preparação e à cultura de células que são empregadas em reactores de produção bioquímicos em larga escala e ao uso destas células para a oxidação de compostos e, particularmente, para a produção de esteróides, como se mostra na Figura 1.

Além disso, cada uma das reacçoes representadas pode ser realizada separadamente. Na invenção, também se inclui a alteração relativa da ordem de realização das operações num processo reaccional em operações múltiplas.

Como hospedeiros, preferem-se microrganismos mas também podem usar-se outras células, tais como células de plantas ou de animais, opcionalmente aplicadas em culturas de células ou de tecido de plantas ou animais transgénicos vivos. As células de acordo com a presente invenção são obtidas pela transformação genética de células receptoras apropriadas, preferivelmen11

te células de microrganismos apropriados, com vectores que con; têm sequências de ADN que codificam as proteínas envolvidas na i transformação de colesterol em hidrocortisona, compreendendo a enzima de clivagem da cadeia lateral (P_45QSCC), adrenodoxina (ADX), adrenodoxina-reductase (ADR ), 3p- hidroxi-esteróide-desidrogenase/isomerase (3£-HSD), esteróide-17«C-hidroxilase (P45Q17«) , NADPH citocrómio P^,.θ-redutase (RED), esteróide-21-hidroxilase (P₄₅qC21) e esteróide- lip -hidroxilase (P45Q 11£).

Algumas células hospedeiras podem já produzir por si próprias uma ou mais das proteínas necessárias, a nível suficiente, e, portanto, têm de ser transformadas com apenas ADN suplementar. Essas proteínas possivelmente próprias são ferredoxina, ferredoxina-redutase, P^g^-redutase e -hidroxi-esteróide-desidrogenase/isomerase.

Para verificar a presença das sequências que codificam proteínas que estão envolvidas na transformação de colesterol em hidrocortisona, escolheram-se fontes de ADN apropriadas. Uma fonte apropriada para a recuperação de ADN que codifica todas as proteínas envolvidas na conversão de colesterol em hidrocortisona é o tecido de córtex adrenal de vertebrados, por exemI ¹ pio, tecido de córtex adrenal bovino.

j 0 ADN que interessa pode também ser recuperado de váΪ rios microrganismos, por exemplo, = partir de Pseudomonas tesíj tosteroni, Streptomyces griseocarneus ou Brevibacterium sterolicum para obtenção de ADN que codifica a 3^-hidroxi-esteróide-desidrogenase/isomerase, e de Curvularia lunata ou de Cunning( hamella blakesleeana para a obtenção de ADN que codifica proteíií nas envolvidas na HJB-h idroxilação de cortexolona. As sequên1 cias de ADN que codificam as proteínas bovinas P₄g_QSCC, Ρ₄₅θ11β de origem bovina ou de origem microbiana, adrenodoxina bovina, adrenodoxina-redutase bovina, 3JB -hidroxi-esteróide-desidrogena( se/isomerase de origem bovina ou microbiana, P₄ggl7eí bovina,

P._c._r.C21 bovina e NADPH citocrome P._rn redutase bovina foram iso450 450 ladas de acordo com as seguintes maneiras de proceder :

1. Sequências Eucarióticas (cADN)

a. Preparou-se ARN total a partir de tecido apropriado.

Transcreveu-se ARN contendo poliA⁺ para cDNA de dupla cadeia e ligou-se a vectores bacteriofagos.

c. Escolheu-se a biblioteca de cDNA assim obtida com oligó32 meros marcados com P específicos para o cDNA pretendido ou por escolha de uma biblioteca de cDNA de lambda-gtll induzida por isopropil-p-D-tiogalacto-piranósido (IPTG)

125 usando o anticorpo específico marcado com I.

d. Inseriram-se insertos de cDNA de unidades de formação de placa positivos (pfu) em vectores apropriados para verificar :

- o comprimento total de cDNA por sequenciamento de nucleótidos;

- a sua expressão em várias células hospedeiras.

2. Genes Procarióticos

a. Preparou-se ADN genómico a partir de um microrganismo apropriado.

b. Para se obter uma biblioteca de ADN, clonaram-se fragmentos de ADN em vectores apropriados e transformaram-se no hospedeiro E. coli apropriado.

c. A biblioteca de ADN foi escolhida com oligómeros marcados com P específicos para o gene que interessa ou mediante escolha de uma biblioteca de ADN lambda-gtll induzida por 125

IPGT usando um anticorpo específico (marcado com I).

d. Isolaram-se colónias positivas de plasmídios e inseriram-se fragmentos de ADN subclonados em vectores apropriados para verificar :

- o comprimento total do gene;

- a expressão em várias células hospedeiras.

NOTA: De acordo com um método aperfeiçoado, o cADN (sequências eucarióticas) ou o gene (sequências procarióticas) foram amplificados usando dois oligómeros específicos pelo método conhecido como reacção na cadeia de polimerase (PCR) (Saiki e col., Science, 239, 487 - 491, 1988). Subsequen13 temente, o cADN ou o ADN amplificados foram inseridos nos vectores apropriados.

De acordo com um aspecto da presente invenção, proporcionam-se cassetes da expressão apropriadas, em que o ADN heterólogo, isolado de acordo com a maneira de proceder previamente descrita, é colocado entre sequências de controlo apropriadas para transcrição e translação, que permite que o ADN seja expresso no ambiente celular do hospedeiro, fornecendo a proteína ou as proteínas pretendidas. Opcionalmente, as sequências de controlo de iniciação são seguidas de uma sequência de sinal de segregação .

Sequências de controlo apropriadas têm de ser introduzidas conjuntamente com o ADN estrutural por intermédio das mencionadas cassetes de expressão. A expressão é tornada possível por transformação de uma célula hospedeira apropriada com um vector que contém sequências de controlo que são compatíveis com o hospedeiro relevante e estão em ligação operável com as sequências que codificam e de que se pretende a expressão.

Em alternativa, empregam-se sequências de controlo apropriadas presentes no genoma do hospedeiro. A expressão é possibilitada por transformação de umas células hospedeiras apropriadas com um vector que contém sequências que codificam a proteína pretendida flanqueadas por sequências hospedeiras que permitem a recombinação homóloga com o genoma hospedeiro de tal maneira que as sequências de controlo hospedeiras controlam apropriamente a expressão do ADN introduzido.

Como é geralmente compreendido, a expressão sequências de controlo compreende todos os segmentos de ADN que são necessários para a regulação apropriada da expressão da sequência de codificação à qual eles estão operavelmente ligados, tais como operadores, reforçadores e, particularmente, promotores e sequências que controlam a translação.

promotor pode ou não ser controlável regulando o seu ambiente. Os promotores apropriados para procariotes incluem, por exemplo, o promotor trp (induzível por eliminação de triptofano), o promotor lac (induzível com o análogo da galactose IPTG) o promotor de ^-lactamase e o promotor Pl derivado do fago (induzível por variação de temperatura).

Adicionalmente, especialmente para a expressão em Bacillus, os promotores úteis incluem as sequências promotoras de alfa-amilase, protease, Spo2, spac e 0105 e sintéticas. Um promotor preferido é o representado na Figura 5 e designado como Hpall. Os promotores apropriados para expressão em levedura incluem os promotores de 3-fosfo-glicerato-quinase e os de outras enzimas glicolíticas, assim como as regiões de promotores para álcool-desidrogenase e fosfatase de levedura. São também apropriados o factor de alongamento da transcrição (TEF) e os promotores de lactase.

Os sistemas de expressão em mamíferos empregam geralmente promotores derivados de vírus tais como os promotores de adenovírus e o promotor SV40, mas eles incluem também promotores reguláveis, tais como o promotor de metalotioneína, que é controlado pela concentração de metais pesados ou de glucocorticóide. Presentemente, são também apropriados sistemas de expressão de células de insectos com base em vírus, assim como sistemas de expressão baseados em promotores de células vegetais, tais como os promotores de nopalina-sintetase.

As sequências de controlo da translação incluem um sí tio de ligação de ribossoma (RBS) em sistemas procarióticos, en quanto em outros sistemas procarióticos, a translação pode ser controlada por uma sequência de nucleótidos que contêm um codão de iniciação tal como AUG.

Em adição ao promotor e às sequências de controlo de translação que são necessários para a transcrição do gene de ARN-polimerase, pode usar-se uma grande variedade de outras sequências de controlo, incluindo as que regulam a terminação (por exemplo, resultando em sequências de poli-adenilação em sistemas eucarióticos) no controlo da expressão. Alguns sistemas contêm elementos reforçadores que são desejáveis, mas não obrigatórios para efectuar a expressão.

A invenção também se refere a cassetes de expressão que contêm ainda outra sequência de codificação heteróloga que

codifica uma enzima que catalisa, sozinha ou em cooperação com uma ou mais proteínas adicionais, outra fase do conjunto de reacções da Figura 1.

Um grupo de vectores designados por pGBSCC-n, em que n é um número inteiro desde 1 a 17, é especialmente desenvolvido para o ADN que codifica a enzima P^qSCC.

Um outro grupo de vectores designado por pGB17ot-n, em que n é qualquer número inteiro de 1 a 5, é especialmente desenvolvido para o ADN que codifica a enzima Ρ^^θ17βΟ

Um outro grupo de vectores designado por pGBC21-n, em que n é qualquer número inteiro de 1 a 9, é especialmente desenvolvido para ADN que codifica a enzima Ρ^^θ021.

Ainda outro grupo de vectores designado por pGBlip-n, em que n é qualquer número inteiro de 1 a 4, é especialmente desenvolvido para ADN que codifica a enzima Ρ^,-θϋβ.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, podem proporcionar-se vectores que contêm pelo menos duas das cassetes de expressão de acordo com a presente invenção.

De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, escolheram-se células hospedeiras apropriadas que aceitam os vectores e que permitem que o ADN introduzido seja expressado. Quando se cultivam as células hospedeiras transformadas, as proteínas envolvidas na transformação de colesterol em hidrocortisona aparecem nos conteúdos das células. A presença do ADN pretendido pode ser demonstrada por processos de hibridização de ADN, a sua transcrição por hibridação de ARN, a sua expressão por ensaios imunolóqicos e a sua actividade determinando a presença de produtos oxidados depois da incubação com o composto de partida in vitro ou in vivo.

Os hospedeiros preferidos são microrganismos transformados, particularmente bactérias (mais preferivelmente, Escherichia coli e Bacillus e espécies Streptomyces) e leveduras (tais como Saccharomyces e Kluyveromyces). Outros organismos hospedeiros apropriados encontram-se entre as plantas e os animais, compreendendo insectos, cujas células isoladas são usadas

numa cultura de células, tais como células COS, células 0^7, células CHO e células de Spodoptera frugiperda (Sfg). Como variante, utiliza-se uma planta ou um animal transgénicos.

Um tipo particular de células hospedeiras recombinantes é aquele em que ou duas ou mais cassetes de expressão de acordo com a presente invenção foram introduzidas ou que foram transformadas por uma cassete de expressão que codifica pelo menos duas proteínas heterólogas, permitindo que a célula produza pelo menos duas proteínas envolvidas no processo reaccional representado na Figura 1.

Uma caracteristica importante da presente invenção reside no facto de as novas células preparadas serem não só capazes de produzir as proteínas envolvidas na transformação oxidante de esteróides, tendo eventualmente como resultado a obtenção de hidrocortisona, mas também de utilizar essas proteínas no vaso de reacção na transformação oxidante pretendida do correspondente esteróide de substrato adicionado ao líquido de cultura.

Dependendo da presença na célula hospedeira de uma multiplicidade de ADN heterólogo que codifica uma ou mais proteínas envolvidas no processo reaccional da Figura 1, conseguem-se fazer várias transformações bioquímicas, compreendendo a clivagem da cadeia lateral de um esterol e/ou modificações oxi} dativas em Cll, C17, C3 e C21. Portanto, as cassetes de expressão de acordo com a presente invenção são uteis na construção de um sistema multigénico que pode efectuar transformações intra( celulares sucessivas das múltiplas fases da sequência que é representada na Figura 1. Pode ser necessário introduzir no hospedeiro pretendido as cassetes de expressão que codificam na sua

I totalidade a proteína pretendida. Em alguns casos, uma ou mais das proteínas envolvidas no processo reaccional global podem já estar presentes no hospedeiro sob a forma de proteína natural

J que exerce a mesma actividade. Por exemplo, ferredoxina, ferredoxina-redutase e P^^^-redutase podem já estar presentes no hospedeiro. Nestas circunstâncias, só as restantes enzimas têm de ser proporcionadas pela transformação recombinante.

Como alternativa em relação às transformações bioquímicas in vivo, as proteínas envolvidas na transformação do colesterol com obtenção de hidrocortisona são colectadas, purificadas na medida do necessário e utilizadas para a transformação in vitro de esteróides num sistema isento de células, por exemplo, imobilizados numa coluna. Alternativamente, a mistura mais ou menos purificada contendo uma ou mais das enzimas indicadas no processo reaccional é utilizada como tal para a transformação do esteróide. CJm hospedeiro exemplifiçado contém ADN que codifica duas proteínas heterólogas, por exemplo, a enzima ^P450^{SCC e a} P^{roteína ft}DX necessárias para a produção de pregnenolona. Em comparação com o hospedeiro com apenas ADN de Ρ^^θSCC, o rendimento de pregnenolona no extracto isento de células depois de adição de ADN, NADPH e colesterol é consideravelmente melhorado.

A presente invenção proporciona cassetes de expressão necessárias para a construção de um processo de produção de uma única operação de diversos esteróides úteis. Partindo de compostos de partida baratos e abundantemente disponíveis é especial mente apropriada para a produção de hidrocortisona e de compostos intermediários.

A invenção torna obsoleto o processo baseado em reacções químicas dispendioso tradicional. Os compostos intermediários não precisam de ser isolados. À parte as novas células hospedeiras, os próprios processos utilizados para a cultura dessas células com o fim de provocar as transformações dos esteróides são análogas às maneiras de proceder biotecnológicas bem conhecidas na técnica.

A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes Exemplos que, no entanto, não devem ser considerados como constituindo uma limitação da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Clonação Molecular de um cDNA de Comprimento Completo que Codifica a Enzima de Clivagem da Cadeia Lateral do Citocrómio P^q

Utilizaram-se as técnicas gerais de clonação, assim como as análises de ADN e de ARN que se descrevem no manual de T. Maniatis e col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. A não ser que se indique outra coisa, todas a enzimas que modificam o ADN, os veículos de clonação molecular e as estirpes de E. coli foram obtidos de fornecedores comerciais e utilizados de acordo com as instruções do fabricante. Usaram-se os materiais e a aparelhagem para a separação e purificação do ADN e do ARN, de acordo com as instruções dos fornecedores .

Preparou-se tecido do córtex adrenal bovino a partir de rins de gado bovino recentemente obtidos, congelou-se rapidamente em azoto líquido e armazenou-se a -80° C.

A partir do córtex adrenal bovino congelado, prepararam-se ARN celulares totais, como é descrito por Auffrey e Rougeon (Eur. J. Biochem., 107, 303 - 314, 1980). O poliA⁺ARN adrenal foi obtido aquecendo a amostra total de ARN a 65° C antes da selecção de poliA por oligo(dT)cromatografia.

Os ADN complementares de poliA⁺ARN de córtex adrenal bovino foram sintetizados procedendo de acordo com a seguinte maneira :

Neutralizaram-se com beta-mercapto-etanol 10 microgramas de poliA⁺ARN, tratado com hidróxido metil-mercúrico. Ajustou-se esta mistura com solução 50 mM de Tris/HCl (pH 8,3 a 42° C), 40 mM de KC1, 6 mM de MgCÍ^, 10 mM de DTT, 3000 unidades de RNasin/ml, 4 mM de Na^P₂Oy, 50 microgramas de actinomicina D/ml, 0,1 mg de oligo (dT.„ _lo)/ml, 0,5mM de dGTP, 0,5 mM de dATP, 0,5 mM de dTTP, 0,25 mM de dCTP e 400 Ci de alfa- ^ZP-dCTP/ ml, tudo num volume final de 100 microlitros.

Colocou-se então a mistura em gelo durante 10 minutos, aqueceu-se a 42° C durante dois minutos e iniciou-se a síntese por adição de 150 unidades de AMV transcriptase inversa (Anglian Biotechnology Ltd.); a incubação realizou-se durante uma hora a 42° C.

Realizou-se a síntese da segunda cadeia lateral adij cionando ADN polimerase e RNase H de acordo com Gubler e Hoffman (Gene, 25 , 263-266, 1983). Depois de tratamento do ds ADN com T4 ADN polimerase (BRL) para se obterem extremidades abruptas, ligaram-se ligadores EcoRI decaméricos (Biolabs Inc.) aos fragmentos de ds ADN. Depois da digestão com EcoRI (Boehringer), separaram-se fragmentos de cADN de cadeia dupla a partir dos abundantes ligadores EcoRI por intermédio de cromatografia em Biogel A15 m (Bio-Rad). Ligaram-se aproximadamente 200 ng de ligador EcoRI contendo cADN de cadeia dupla com 10 microgramas de vector ADN (Promega) digerido com EcoRI e fosfatase de intestino de vitelo (Boehringer) tratada com lambda-gtll por T4-ADN ligase (Boehringer), como é descrito por Huynh e col. em DNA cloning techniques : A practical approach, páginas 49 - 78, Oxford IRL-Press, 1985). Fagos, obtidos depois do empacotamento in vitro da mistura de ligação, foram utilizados para infectar o hospedeiro E. coli Y1090 (Promega).

Desta biblioteca de cADN, escolheram-se aproximadamente 10θ unidades que formam placas (pfu) com um oligómero sin, 32 tetico marcado na extremidade com P, SCC-1 (5'-GGC TGA CGA AGT CCT GAG ACA CTG GAT TCA GCA CTGG-3'), específico para sequências de P^^qSCC ADN bovino, como é descrito por Morohashi e ! col. (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, RI, 4647 - 4651, 1984).

Obtiveram-se seis pfu que hibridizam e purificaram-se mais por realização de dois conjuntos adicionais de operações de infecção, placagem e hibridização. Os insertos de P^^^SCCcADN EcoRI foram subclonados no sítio de EcoRI de pTZl8R (pharmacia). O clone pGBSCC-1 (Figura 2) contendo o maior inserto EcoRI (1,4 Kb), derivado do clone lambda-gtll SCC-54, foi posteriormente analisado por mapeamento e sequenciamento com enzimas de restrição.

Os dados da sequência revelaram que o inserto pGBSCC-1 EcoRI era idêntico à sequência de nucleótidos de SCCcADN eni tre as posições 251 e 1824 no mapa de P^^qSCCcADN, como é descrito por Morohashi e col.

Os restantes nucleótidos 5'-P450SCCCADN foram sinteticamente derivados cionando um fragmento com 177 bp Pst/HindITT nos sítios apropriados de pTZ18R, obtendo-se como resultado pTZ/ synlead, como se representa na Figura 3, contendo além disso os nucleótidos que codificam a proteína P^^^SCC madura a partir da posição 118 a 273, como publicado por Morohashi e col., sítios restritivos adicionais para Seal, Avrll e StuI, sem afectar a sequência prevista de aminoácidos da proteína p^ggSCC.

^{0 P}450^SCCcADN de comprimento completo foi construído por clonação molecular em E. coli JM101 (ATCC 33876) de uma mistura de ligação que contém o fragmento 1372 bp HindIII/Kpnl pGBSCC-1, o fragmento 177 bp Pst/HindIII pTZ/synlead e pTZl9R ADN digeridos com PstI e Kpnl.

O plasmídio resultante, pGBSCC-2, contendo todas as sequências de nucleótidos que codificam a proteína de clivagem da cadeia lateral P45Q bovina madura está representada na Figura 4 .

Exemplo 2

Construção, Transformação e Expressão de P^g^SCC no Hospedeiro Bacteriano Bacillus subtilis

Para derivar a expressão de citocrómio P^^^SCC num hospedeiro Bacillus, transferiram-se sequências de P^g^SCCcAON para um vector vai-vem de E. coli/Bacillus pBHA-1.

A Figura 5 mostra a sequência de nucleótidos do plasmídio vai-vem pBHA-1. 0 plasmídio consiste nas posições 11-105 e 121 - 215 : terminador bacteriófago FD (duplo); posições 221 - 307 : uma parte do plasmídio pBR322 (nomeadamente, posições 2069 - 2153); posições 313 - 768 : bacteriófago Fl, origem da replicação (ou seja, posições 5482 - 5943); posições 772 - 2571; parte do plasmídio pBR322, ou seja, a origem da replicação e gene de beta-lactamase; posições 2572 - 2685 : transposão TN903, genoma completo; posições 2719 - 2772 : terminador de triptofano (duplo); posições 2773 - 3729 : transposão Tn9, um gene de clorofenicol-acetil-transferase.

Os nucleótidos na posição 3005 (A), 3038 (C), 3302 (A) e 3409 (A) diferem da sequência de codificação cat do tipo natural. Estas mutações foram introduzidas de modo a eliminar

os sítios Ncol, Bali, EcoRI e PvuII : posições 3730 - 3804; sítio de clonação múltipla; posições 3807 - 7264 : parte do plasmídio pUBllO contendo o promotor de Bacillus Hpall, a função de replicação e o gene de resistência à canamicina (fragmento EcoRI-PvuII) (McKenzie e col., Plasmid 15 , 93 - 103, 1986 e McKenzie e col., Plasmid 17, 83 - 85 , 1987); posições 7267 - 7331: sítio de clonação múltipla.

Os fragmentos foram reunidos por técnicas de clonação conhecidas, por exemplo, preenchendo as extremidades viscosas com Klenow, adaptador de clonação, etc. Todos os dados foram (R) derivados de Genbank , National Nucleic Acid Sequence Data Bank, NIH, Estados Unidos da América.

pGBSCC-3 foi derivado por clonação molecular em E. coli JM101 do inserto Kpnl/Sphl P^^qSCCcADN de pGBSCC-2 (descrito no Exemplo 1), nos sítios apropriados em pBHA-1 como é indicado na Figura 6.

Por clonação molecular em E. coli JM101, o codão de j iniciação de metionina foi introduzido trocando o fragmento ; StuI/Sphl em pGBSCC-3 por um fragmento Sphl/StuI derivado sinI teticamente :

SPH 1 STU 1

CATATGATCAGTACTAAGACCCCTAGG j GTACGTATACTAGTCATGATTCTGGGGATCC

NDE 1 ί contendo um sítio Ndel no codão de iniciação ATG. O plasmídio | pGBSCC-4 assim obtido está representado na Figura 7.

O promotor Hpall Bacillus foi introduzido a jusante das sequências P^^qSCCcADN por digestão de pGBSCC-4 com ί a enzima de restrição Ndel, separação da parte de E. coli do ' plasmídio de vai-vem por electroforese em gel de agarose e sub! sequente religação e transformação em células competentes de

Bacillus subtilis 1A40 (BGSC 1A40) . Analisaram-se as colónias resistentes a neomicina e obteve-se o plasmídio pGBSCC-5 (Figura 8) .

A expressão de P^^^SCC bovina foi estudada preparando uma fracção de proteína das células de uma cultura realizada durante a noite a 37° C em meio de TSB (Gobco), contendo 10 microgramas/ml de neomicina. Colheram-se as células de cultura de 100 microlitros, contendo aproximadamente 5.10⁶ células por centrifugação e ressuspenderam-se em solução 10 mM de Tris/HCl de pH 7,5. Realizou-se a lise adicionando lisózima (1 mg/ml) e incubando durante quinze minutos a 37° C. Depois de tratamen to com 0,2 mg de DNase/ml durante cinco minutos a 37° C, ajustou-se a mistura a 1 χ tampão SB, como descrito por Laemmli, Nature 227, 680 - 685, 1970, de modo a obter-se um volume final de 200 microlitros. Depois de se aquecer durante cinco minutos a 100° C, submeteram-se 15 microlitros da mistura a electroforese num gel de 7,5% de SDS/poliacrilamida. Como se mostra na Figura 9 (pista c), pode detectar-se uma banda de 53 kDa depois de se proceder ao manchamento de imunidade do gel ensaiado com anticorpos específicos de P^^qSCC.

Os anticorpos P^^^SCC bovinos específicos foram obtidos por imunização de coelhos com proteína P^^^SCC purificada e isolada de tecido do córtex adrenal bovino.

Exemplo 3

Expressão de P^^SCC no Hospedeiro Bacteriano Bacillus licheniformis

Realizou-se a expressão de P^^^SCC bovino em B. liche niformis por transformação do plasmídio pGBSCC-5 na estirpe hos pedeira apropriada B, licheniformis T5 (CBS 470.83). Analisou-se uma fracção da proteína celular preparada como se descreveu no Exemplo 2, a partir de uma cultura realizada durante a noite a 37° C em meio (Oxoide) de Caldo de Triptona Soja (TSB), contendo 10 microgramas/ml de neomicina, por ensaio de SDS/PAGE e manchamento de Western. Como se mostra na Figura 9 (pista f), visualizou-se uma banda de proteína com o tamanho de 53 kDa depois da incubação do filtro de nitrocelulose com anticorpos específicos para P_45QSCC bovina.

Analisou-se ainda um transformante, SCC-201, relativa mente à actividade in vivo de P^^^SCC (ver Exemplo 11).

Exemplo 4

Expressão de P _5QSCC no Hospedeiro Bacteriano Escherichia coli

a) Construção da Cassete de Expressão

Para derivar um vector de expressão apropriado no hospedeiro E. coli para P^qSCC bovina, realizou-se a mutação de pTZl8R por mutagénese dirigida à parte lateral, como foi descrito por Zoller e Smith (Methods in Enzymology 100, 468 - 500, 1983); Zoller e Smith (Methods in Enzymology 154, 329 - 350,

1987) e Kramer e Fritz (methods in Enzymology 154, 350 - 367, 1987). Os plasmídios e as estirpes para as experiências de mutagénese in vitro foram obtidos na firma Pharmacia Inc.

Utilizou-se um oligómero sintético derivado com a sequência

5'-CAG GAA ACA CAT ATG ACC ATG ATT-3'

I_I

Ndel para criar um sítio de restrição Ndel no codão de iniciação ATG do gene lac Z em pTZl8R.

O plasmídio resultante, pTZl8RN, foi digerido com Ndel e Kpnl e o fragmento Ndel/Kpnl ADN de pGBSCC-4, contendo o SCCcADN de comprimento completo foi inserido por clonação molecular como se indica na Figura 10.

A transcrição de sequências P^^^SCCcADN no plasmídio derivado pGBSCC-17 é provocada pelo promotor E, coli lac.

b) Expressão de P ^SCC no Hospedeiro E. coli JM101

Introduziu-se pGBSCC-17 em células competentes de E. coli JM101 escolhendo colónias resistentes a ampicilina.

Estudou-se a expressão do citocrómio P^^SCC preparando uma fracção de proteína celular (descrita no Exemplo 2) de transformantes SCC-301 e 302 de uma cultura realizada durante a noite a 37° C em meio 2 x TY (contendo por litro de água desionizada 16 gramas de bacto triptona (Difco) extracto de levedura (Difco), 10 gramas e NaCl, 5 gramas) contendo 50 microgramas/ml de ampicilina.

Analisaram-se as fracções de proteína por ensaio com SDS/PAGE e manchamento com azul brilhante de Coomassie (Figura 11A) ou por manchamento de Western e ensaiaram-se com anticorpos específicos para P^^^SCC bovina (Figura 11B) . Ambas as análises mostram que se trata de uma proteína com o comprimento esperado (Figura 11A, pistas 1 e 2 e na Figura 11B, pistas 3 e 4) para os transformantes SCC-301 e SCC-302, respectivamente, que está ausente na estirpe de controlo E. coli JM101 (Figura 11A, pista 3 e Figura 11B, pista 2).

Exemplo 5

Construção, Transformação e Expressão de P^^^SCC na Levedura Kluyveromyces lactis

a) Introdução do Marcador de Resistência à Geneticina em pUC19 í

Inseriu-se no sítio Smal de pUCl9 (Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103-119, 1985) um fragmento de ADN compreendendo o gene Tn5 (Reiss e col., EMBO J. , _3, 3317 - 3322, 1984) que confere resistência à geneticina sob a direcção de álcool-desidrogenase I (ADHI) promotor de S. cerevisiae, semelhante ao desi crito por Bennetzen e Hall (J. Biol. Chem. 257, 3018 - 3025, 1982). O plasmídio pUCG418 assim obtido está representado na ( Figura 12.

E, coli contendo pUCG418 foi depositado no Centraal Bureau voor Schimmelcultures sob o número CBS 872.87.

i b) Construção da Cassete de Expressão

Construiu-se um vector compreendendo pUCG418 (para a sua descrição veja-se o Exemplo 5 (a)) cortado com Xbal e HindIIl contendo o fragmento Xbal-Sall de pGB901 o promotor da lactase ¹ (veja-se J. A. van den Berg e col., continuação parcial do Pedii do de Patente de Invenção Norte-Americana com o Número de Série !

i 572 414 : Kluyveromyces como estirpe hospedeira) e ADN sintético compreendendo parte da região não codificante 3' do gene da lactase de K. lactis. Este plasmídio, pGB950, é representado na Figura 13.

O plasmídio pGB950 foi cortado com Sall e Xhol e nele foi inserido ADN sintético

SAL 1 STU 1 XHO 1

TCGACAAAAATGATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC

GTTTTTACTAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT obtendo-se como resultado o plasmídio pGBSCC-6, como se representa na Figura 13.

Isolou-se o fragmento de StuI-EcoRI de pGBSCC-2 (veja-se o Exemplo 1) contendo a região de codificação de P^^^SCC e preencheu-se a extremidade viscosa usando ADN polimerase de Klenow. Inseriu-se este fragmento em pGBSCC-6 cortado com StuI. Oplasmídio contendo o fragmento na orientação correcta foi designado pGBSCC-7 (veja-se a Figura 14).

c) Transformação de K. lactis

Desenvolveu-se a estirpe CBS 2360 de K. lactis em 100 ml de meio de YEPD (1% de extracto de levedura, 2% de peptona,

2% de glucose mono-hidratada) contendo 2,5 ml de uma solução de uma base azotada de levedura a 6,7% (peso/peso) (Difco Laboratories) até se obter uma DO,_in igual a cerca de 7.

610

Colectaram-se as células a partir de 10 ml da cultura por centrifugação, lavaram-se com tampão TE (solução 10 mM de Tris-HCl, de pH igual a 7,5; 0,1 mM de EDTA) e ressuspendeu-se em 1 ml de tampão de TE. Adicionou-se um volume igual de solução 0,2 molar de acetato de lítio e incubou-se a mistura durante uma hora a 30° C num banho-maria com agitação provocada por sacudidelas. Cortou-se 15 microgramas de pGBSCC-7 no sítio único de SacII no promotor de lactase, precipitou-se com etanol e ressuspendeu-se em 15 microlitros de tampão de TE.

Adicionou-se essa preparação de ADN a 100 microlitros das células pré-incubadas e prolongou-se a incubação por trinta minutos. Em seguida, adicionou-se um volume igual de PEG4000 a 70% e incubou-se a mistura durante uma hora, à mesma temperatura, seguida por um choque térmico de cinco minutos a 42° C. Em seguida, adicionou-se 1 ml de meio YEPD e incubaram-se as células durante 1,5 horas em banho-maria com agitação por meio de sacudidelas, à temperatura de 30o c. Finalmente, colectaram-se

as células por centrifugação, ressuspendeu-se em 300 microlitros de YEPD e espalharam-se em placas de agar contendo 15 ml de agar YEPD com 300 microgramas/ml de geneticina e uma hora antes da utilização, recobriram-se com uma camada constituída por 15 ml de YEPD-agar sem G418. Desenvolveram-se as colónias durante três dias a 30° C.

d) Análise dos Transformantes

Desenvolveram-se os transformantes e a estirpe de controlo CBS 2360 em meio de YEPD durante cerca de sessenta e quatro horas a 30° C. Colectaram-se as células por centrifugação, ressuspendeu-se a pelete numa solução de cloreto de sódio fisiológica a uma OD^^ igual a 300 e romperam-se as células por sacudimento com esferas de vidro durante três minutos num agitador Vortex, à velocidade máxima. Os resíduos das células foram separados por centrifugação durante dez minutos a quatro mil e quinhentas rotações por minuto, numa minicentrifuga GL Hearaeus Christ. Amostras de 40 microlitros dos sobrenadantes foram retiradas para análise de imuno-manchamento (veja-se Figura 15A, pista 3 e Figura 15B, pista 4).

Os resultados mostram que uma proteína com o comprimento esperado é expressa em células de K. lactis transformadas com pGBSCC-7. O transformante foi designado como K. lactis SCC-101.

Exemplo 6

Construção, Transformação e Expressão de P^^^SCC na Levedura Saccharomyces cerevisiae

a) Construção da Cassete de Expressão

A fim de eliminar o promotor da lactase, cortou-se pGB950 (veja-se Exemplo 4 b)) com Xbai e SalI, preencheram-se as extremidades viscosas usando ADN polimerase de Klenow e, subsequentemente, fez-se a ligação. No plasmídio resultante, pGBSCC-8, o sítio de Xbai é destruído mas o sítio de Sall é mantido .

O fragmento Sall de pGB!61 (veja-se J. A. van den

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e col., Pedido de Patente de Invenção Europeia EP-96430) contendo o isocitocrómio Cl (cyc 1) promotor de 5. cerevisiae foi isolado e parcialmente digerido com Xhol. Isolou-se o fragmento Xhol-Sall com 670 bp e clonou-se no sítio de Sall de pGBSCC-8.

No plasmídio escolhido, pGBSCC-9, o sítio de Sall entre o promotor cyc 1 e a região de não codificação 3¹ do gene da lactase é mantido (Figura 16) (HindIII parcialmente digerida).

O fragmento SalI-HindIII de pGBSCC-7 contendo a região de codificação de P_45QSCC foi inserido em pGBSCC-9 cortado com Sall e HindIII. No plasmídio resultante, pGBSCC-10, a região de codificação de P^^SCC fica a jusante do promotor cyc 1 (Figura 17) .

b) Transformação de S. cerevisiae

Desenvolveu-se a estirpe D273-10B (ATCC 24657) de S. cerevisiae em 100 ml de meio de YEPD durante a noite, a 30° C e, subsequentemente, diluíu-se (1 : 10000) com meio fresco e desenvolveu-se até uma DO,.„ igual a 6. Colectaram-se as células b 1U a partir de 10 ml de cultura, por centrifugação, e suspenderam-se em 5 ml de tampão TE. Colectaram-se novamente as células por centrifugação, suspenderam-se em 1 ml de tampão TE e adicionou-se 1 ml de solução 0,2 molar de acetato de lítio.

Incubaram-se as células durante uma hora num banho-maria com agitação por meio de sacudidelas a 30° C. Cortaram-se 15 microgramas de pGBSCC-10 no sítio único de MluI no promotor cyc 1, precipitou-se com etanol e ressuspendeu-se em 15 microlitros de TE. Adicionou-se esta preparação de ADN a 100 microlitros das células de levedura pré-incubadas e incubou-se (com agitação provocada por sacudimento) durante trinta minutos i a 30° C. Depois da adição de 115 microlitros de uma solução a i

I 70% de PEG4000, prolongou-se a incubação durante sessenta minutos, sem agitar. Subsequentemente, proporcionou-se um choque j térmico de cinco minutos a 42° C às células, adicionou-se 1 ml ί de meio de YEPD, seguido por incubação durante uma hora e trinta minutos a 30° C em banho-maria com agitação provocada por sacudimento. Finalmente, as células foram colectadas por centrifugação, ressuspendidas em 300 microlitros de YEPD e espalhadas sobre placas de agar-YEPD contendo geneticina (300 microgramas/ml) .

As colónias foram desenvolvidas durante três dias a

30° C.

c) Análise dos Transformantes

Desenvolveram-se transformantes e a estirpe de controlo em meio de YEPL (1% de extracto de levedura, 2% de bactopeptona, 3,48% de K₂HPC>₄ e 2,2% de solução a 90% de ácido L-( + )-láctico; antes de se proceder à esterilização, ajustou-se o pH a 6,0 usando uma solução de amónia a 25% durante sessenta e quatro horas a 30° C. Prosseguiu-se a análise procedendo como se descreve no Exemplo 5 (d).

A análise de imuno-manchamento demonstra a expressão de P₄₅₀SCC em S. cerevisiae (Figura 15A, pista 1).

Exemplo 7

Construção, Transformação e Expressão de ADN que codifica Pré-P^SqSCC na Levedura Kluyveromyces lactis

a) Construção da Cassete de Expressão

Cortou-se plasmídio pGB950 (veja-se Exemplo 5 (b)) com Sall e Xhol e inseriu-se ADN sintético

SAL I

TCGACAAAAATGTTGGCTCGAGGTTTGCCATTGAGATCCGCTTTGGTTAAGGCTTGTCC _{GTTTTTACAACCGAGCTCCAAACGGTAACTCTAGGCGAAACCAAT}rp_CCGAACAGG

ACCAATCTTGTCCACTGTTGGTGAAGGTTGGGGTCACCACAGAGTTGGTACTGGTGAAGG TGGTTAGAACAGGTGACAACCACTTCCAACCCCAGTGGTGTCTCAACCATGACCACTTCC

STU 1 XHO 1

TGCTGGTATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTriTCGATTC

ACGACCATAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT tendo-se obtido como resultado o plasmídio pGBSCC-11 (Figura 18/ Analogamente ao que se descreveu no Exemplo 5 (b), a região de codificação ^p45q^scc do plasmídio pGBSCC-2 foi inserida em pGBSCC -11 cortado com StuI. O plasmídio contendo o fragmento com a orientação correcta foi designado pGBSCC-12 (Figura 18).

b) Transformação de K. lactis e Análise dos Transformantes

Realizou-se a transformação de K. lactis com pGBSCC-12 como se descreveu no Exemplo 5 (c). Os transformantes foram analisados como se descreveu no Exemplo 5 (d). A análise demonstrou a produção de P_45QSCC por K. lactis (Figura 15 B, pista 3).

Exemplo 8

Construção, Transformação e Expressão de ADN que Codifica Pré-P._45QSCC na Levedura Saccharomyces cerevisiae

a) Construção da Cassete de Expressão fragmento de SalI-HindIII (HindIII parcialmente digerido) de pGBSCC-12, contendo a região de codificação de pré-P450SCC, foi inserido em pGBSCC-9 cortado com Sall e HindIII.

plasmídio resultante foi designado pGBSCC-13 (Figura 19).

b) Transformação de S. cerevisiae e Análise dos Transformantes

Transformou-se a estirpe D273-10B de S. cerevisiae com pGBSCC-13, como se descreveu no Exemplo 6 (b). Analisaram-se os transformantes como se descreveu no Exemplo 5 (c). 0 resultado obtido, representado na Figura 15C (pista 3), demonstra a expressão de P^qSCC por S. cerevisiae. Um transformante, SCC-105, foi ainda analisado relativamente à sua actividade in vitro de P^^SCC (veja-se Exemplo 12).

Exemplo 9

Construção, Transformação e Expressão em Kluyveromyces lactis de Sequências de P^^^SCC Fundidas na Pré-Região de Citocrómio Oxidase VI de Saccharomyces cerevisiae

a) Construção da Cassete de Expressão

Cortou-se plasmídio pGB950 (veja-se Exemplo 6 (b)) com Sall e Xhol e inseriu-se ADN sintético

SAL I

TCGACAAAAATGTTGTCTCGAGCTATCTTCAGAAACCCAGTTATCAACAGAACTTTGTT gtttttacaacagagctcgatagaagtctttgggtcaatagttgtcttgaaacaa

GAGAGCTAGACCAGGTGCTTACCACGCTACTAGATTGACTAAGAACACTTTCATCCAATC CTCTCGATCTCGTCCACGAATGGTGCGATGATCTAACTGATTCTTGTGAAAGTAGGTTAG

STU 1 XHO 1

CAGAAAGTACATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC

GTCTTTCATGTAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT tendo-se obtido como resultado o plasmídio pGBSCC-14.

A pré-sequência da sequência de aminoácidos da citocrómio oxidase VI (COX VI) foi tirada do artigo de Wright e col. (J. Biol, Chem., 259, 15401 - 15407, 1984). O ADN sintético foi concebido de maneira a usar os codões preferidos da levedura. Inseriu-se a região de codificação P^^^SCC do pGBSCC -2 em pGBSCC-14 cortado com StuI, procedendo de maneira semelhante à que se descreveu no Exemplo 5 (b). O plasmídio conten do a sequência de codificação de P^qSCC na estrutura com a pré -sequência COX VI foi designado pGBSCC-15 (Figura 20).

b) Transformação de K. lactis e Análise dos Transformantes

A transformação de K. lactis com pGBSCC-15 realizou-se como se descreveu no Exemplo 5 (c). Os transformantes foram analisados como se descreveu no Exemplo 5 (d). O resultado (Figura 15B, pista 2) mostra que P^^SCC foi expressada.

Exemplo 10

Construção, Transformação e Expressão de Sequências de P^ç-qSCC em Saccharomyces cerevisiae Fundidas com a Pré-Região de Citocrómio-Oxidase VI de Saccharomyces cerevisiae

a) Construção da Cassete de Expressão

Inseriu-se o fragmento de SalI-HindIII (HindIII parcialmente digerido) de pGBSCC-15, contendo a região de codifica ção de P_45QSCC fundida com a pré-sequência de COX VI em pGBSCC-9 cortado com Sall e HindIII. O plasmídio resultante foi designado pGBSCC-16 (Figura 21).

b) Transformação de S. cerevisiae e Análise dos Transformantes

D273-10B com Analisaram-se (c). Os resu demonstram a exTransformou-se S. cerevisiae estirpe pGBSCC-16, como se descreveu no Exemplo 6 (b).

os transformantes como se descreveu no Exemplo tados, representados na Figura 15C (pista 2), pressão de P._rnSCC em S. cerevisiae.

450 Exemplo 11

Actividade In Vivo de P._r„SCC em Bacillus licheniformis SCC-201 -450Obteve-se B. licheniformis SCC-201 como se descreveu no Exemplo 3. O microrganismo foi inoculado em 100 ml de meio

A. O meio A consiste em

Cloreto de cálcio hexa-hidratado 1 g

Sulfato de amónio 5 g

Cloreto de magnésio hexa-hidratado 2,25 g

Sulfato de manganês tetra-hidratado 20 mg

Cloreto de cobalto hexa-hidratado 1 mg

Ácido cítrico mono-hidratado 1,65 g

Água destilada 600 ml

Solução de armazenagem de elementos vestigiais 1 ml

Agente anti-espumante (SAG 5693) 0,5 mg

A solução de armazenagem contendo elementos vestigiais continha por litro de água destilada :

CuSO,.5H~O 4 2	0,75	g
h3bo3	0,60	g
Kl	0,30	g
FeSO4(NH4)2SO4.2H2O	27	g
ZnSO4·7H2O	5	g
Ácido cítrico.H2O	15	g
MnSO . .H„O 4 2	0,45	g
Na2Mo04.H20	0,60	g
H2SO4 (96%)	3	ml.
Depois de esterilização e	arrefecimento até 30°	c,

fim de completar o meio, adicionam-se 60 gramas de maltose mono-hidratada, dissolvida em 200 ml de água destilada (esterilizada

durante vinte minutos a 120° C) , 200 ml de solução de tampão de fosfato de potássio 1 molar (pH 6,8; esterilizada durante vinte minutos a 120° C), 1,7 gramas de base azotada de levedura (Difco), dissolvida em 100 ml de água destilada (esterilizada por filtração através de membrana).

Desenvolveu-se a cultura durante sessenta e quatro horas a 37° C e adicionaram-se subsequentemente 2 ml desta cultura, como inoculo, a 100 ml de meio A contendo 10 mg de colesterol. O colesterol foi adicionado sob a forma de uma solução (S) contendo 10 mg de colesterol; Tergitol y^etanol (1 : 1, volume/volume), 0,75 ml e Tween 8C^, 20 microlitros. Desenvolveu-se a cultura durante quarenta e oito horas a 37° C, depois do que se extraiu com 100 ml de diclorometano. Separou-se a mistura por centrifugação e colectou-se a fase constituída pelo dissolvente orgânico. Repetiu-se a maneira de proceder de extracção por duas vezes e reuniram-se as fracções de 3 x 100 ml de diclorometano. Evaporou-se o diclorometano por destilação em vácuo e analisou-se o extracto seco (aproximadamente 450 mg) relativamente ao seu teor em pregnenolona usando uma combinação de cromatografia em fase gasosa e espectrometria de massas.

Análise GC-MS

Do extracto seco, retirou-se uma quantidade definida e sililou-se adicionando uma mistura de piridina-bis-(trimetil-silil)-trif lúor-acetam.Lda e trimetil-cloro-silano . Analisou-se a amostra sililada por uma combinação de GL-MS-DS (Cario Erba MEGA 5160-Finnigan MAT 311A-Kratos DS 90) escolhido para trabalhar no modo de ião.

A cromatografia em fase gasosa realizou-se nas seguintes condições : agulha móvel de injecção a 300° C; coluna M. cpsi!29 0.25 de diâmetro interno df 0,2 jan, operada isotermicamente a 300^DC; introdução directa na fonte de MS.

Analisaram-se as amostras observando iõss m/z 298 de pregnenolona com uma resolução de 800. A partir dos resultados das determinações, é evidente que, no caso da estirpe hospedeira

B. licheniformis T5, não se detectou qualquer pregnenolona (limite de detecção 1 picograma), enquanto que, no caso de B. li33

cheniformis SCC-201, a produção de pregnenolona pode ser facilmente detectada.

Exemplo 12

Actividade In Vitro de P^^SCC Obtida a Partir de Saccharomyces cerevisiae SCC-105

Inoculou-se S. cerevisiae SCC-105, obtida como se descreveu no Exemplo 8, em 100 ml de meio B. O meio B continha por litro de água destilada:

Extracto de levedura 10 g Bacto-Peptona (Oxoid) 20 g Ácido láctico (a 90%) 20 g Fosfato de dipotássio 35 g pH = 5,5 (ajustado com amónia a 25% em peso/peso).

Deixou-se desenvolver esta cultura durante quarenta e oito horas a 30° C e, subsequentemente, utilizou-se como inoculo para um fermentador contendo meio C. O meio C consistia em :

Extracto de levedura	100	g
Bacto-peptona (Oxóide)	200	g
Ácido láctico (a 90%)	220	ml
Hidrogenofosfato de dipotássio	35	g
Água destilada	7800	ml

Ajustou-se o pH a um valor de pH = 6,0 com amónia (a 25%) e esterilizou-se o fermentador incluindo o meio (uma hora, 120° C).

Depois de se arrefecer, esterilizou-se por filtração através de membrana uma solução de 2,4 gramas de geneticina dissolvida em 25 ml de água destilada e adicionou-se ao meio. Deixou-se desenvolver a mistura inoculada no reactor agitado (oitocentas rotações por minuto) a 30° C, enquanto se fazia passar ar esterilizado através do caldo com um caudal de 300 litros/hora e o pH foi automaticamente mantido igual a 6,0 com 4 N e NH^OH a 5% (5% de NH^OH em água destilada; esterilizada por filtração através de membrana). Depois de quarenta e oito horas

iniciou-se uma alimentação de ácido láctico (solução a 90%, esterilizada por filtração através de membrana) com um caudal de 20 gramas/hora. Continuou-se a fermentação durante quarenta horas, depois dc que as células foram colectadas por centrifugação (4000 x g, quinze minutos).

Lavou-se o pelete com solução 0,9% (em peso/peso) de NaCl, seguida de centrifugação (4000 x g, quinze minutos); lavou-se a pelete com tampão de fosfato (50 mM, pH = 7,0) e colectaram-se as células por centrifugação (4000 x g, quinze minutos) Retomou-se a pelete em tampão de fosfato (50 mM, pH = 7,0) obten do-se como resultado uma suspensão que contém 0,5 grama de matéria seca/ml. Tratou-se esta suspensão num moinho Dyno (Willy

A. Bachofen Maschinenfabrik, Basileia, Suiça). Separaram-se as células não rompidas por centrifugação (4000 x g, quinze minutos). Guardou-se o extracto isento de células (2250 ml, 15 - 20 mg de Proteína/ml) a -20° C.

A P^ggSCC foi grosseiramente purificada por meio do seguinte procedimento. De 50 ml de extracto isento de células congelado, peletizou-se uma fracção bruta de membranas por ultracentrifugação (125000 x g, trinta minutos) e ressuspendeu-se em 50 ml de uma solução de fosfato de potássio 75 mM (pH = 7,0), contendo 1% de colato de sódio. Agitou-se lentamente a dispersão durante uma hora a 0° C e seguidamente centrifugou-se (12500C x g, sessenta minutos). Ao sobrenadante assim obtido, contendo proteínas de membrana solubilizadas, adicionou-se (NH^^SO^ (a 30% em peso/volume), enquanto se manteve o pH igual a 7,0 adicionando pequenas quantidades de uma solução de NH^OH (6 normal). Agitou-se a suspensão durante vinte minutos a 0°C, depois do que se colectou a fracção de proteínas precipitadas mediante centrifugação (15000 x g, dez minutos). Suspendeu-se de novo a pelete até perfazer 2,5 ml com solução de tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 7,0), contendo 0,1 mM de ditio-treitol e 0,1 mM de EDTA. Esta suspensão foi eluída numa coluna de filtração de gel (PD10, pharmacia), originando 3,5 ml de uma fracção de proteínas isentas de sais (6 mg/ml), que foi ensaiada relativamente à sua actividade de P._rr>SCC.

450

A actividade de P^^^SCC foi determinada por meio de ensaio que se baseia essencialmente num método de Doering (Metho ds Enzymology, 15, 591 - 596, 1969). A mistura de ensaio consis tia nas seguintes soluções:

Solução A (sistema doador de electrões que contém P^^^SCC natural ) :

uma solução 10 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0), contendo 3 mM de EDTA, 3 mM de fluarato de fenil-metil-sulfonilo (PMSF), 20 /í.m de adrenodoxina e 1 /Am de adrenodoxina-redutase (portadores de electrões; ambos purificados a partir de córtex adrenal bovino), mM de NADPH (doador de electrões) e mM de glucose-6-fosfato e unidades/ml de glucose-6-fosfato-desidrogenase (sistema de regeneração de NADPH).

Solução B (substrato) : solução micelar de 37,5 μ/τι de colesterol (duplamente radiomarcado com [26,2 7~¹⁴c[[ -colesterol (40 Ci/mole) e [7-alfa- hJ-colesterol (400 Ci/mole) em 10% (volume/volume) de Tergitol NP40/etanol (1 : 1, volume/volume).

Iniciou-se o ensaio misturando 75 microlitros de solução A com 50 microlitros de solução B e 125 microlitros de fracção de P^ç-qSCC grosseiramente purificada (ou tampão como referência). Agitou-se a mistura suavemente a 30° C. Extrairam-se amostras (50 microlitros), depois de decorridos zero, trinta e cento e oitenta minutos e diluiram-se com 100 microlitros de água. À amostra diluída adicionou-se metanol (100 microlitros) e clorofórmio (150 microlitros). Depois de se extrair e se centrifugar (5000 x g, dois minutos), colectou-se a fase, clorofórmica e secou-se. Dissolveu-se o resídio, depois de seco, em 50 microlitros de acetona contendo 0,5 mg de uma mistura de esteróides (colesterol, pregnenolona e progesterona - 1 : 1 : 1, em peso/peso/peso) e adicionaram-se 110 microlitros de ácido fórmico concentrado. Aqueceu-se a suspensão a 120° C durante quinze minutos.

3

Em seguida, determinou-se a proporção C/ H por contagem de cintilações em líquido de marcação dupla. Esta proporção constitui uma medida directa para a reacção de clivagem da cadeia lateral porque a cadeia lateral marcada com C se evapora da mistura sob a forma de ácido isocaprílico durante o proces so de aquecimento.

Empregando este ensaio, verificou-se que a fracção contendo P ₅₀SCC, grosseiramente purificada a partir de S. cerevisiae SCC-105 possuía actividade de clivagem da cadeia lateral. Durante três horas de incubação, 45% do colesterol tinha sido transformado. Por meio de cromatografia em camada fina, identificou-se o produto da reacção como sendo pregnenolona.

Exemplo 13

Clonação Molecular de cADN de Cadeia Completa que Codifica Citocrómio Bovino P._r. Esteróide 17eC-hidroxilase (P._cn17oC)

-4 5 (j-4 UAproximadamente uma toma com 10 pfu da biblioteca de cDNA de córtex adrenal bovino, descrita no Exemplo 1, foi escolhida para as sequências de P _17<jCcDNA, escolhendo-a com os dois oligómeros sintéticos marcados com P terminal específicos para P_45Q170t cDNA. O oligómero 17«C-1 (5'-AGT GGC CAC TTT GGG ACG CCC AGA GAA TTC-3 ' ) e o oligómero 17eC-2 (5 '-GAG GCT CCT GGG GTA CTT GGC ACC AGA GTG CTT GGT-3') são complementares da sequência bovina P^^^l7e<cDNA, como é descrito por Zuber e col.

(J. Biol. Chem., 261, 2475 - 2482, 1986) das posições 349 a 320 e das posições 139 a 104, respectivamente.

A selecção com o oligómero 170C-1 revelou ± 1500 pfu de hibridização. Escolheram-se diversos pfu de hibridização, purificaram-se e multiplicaram-se para o isolamento preparativo do fago ADN.

Os insertos EcoRI dos ADN recombinantes lambda-gtll foram subclonados no sítio EcoRI de pTZl8R. Um clone, pGBl7oc-l, foi ainda caracterizado por mapeamento de endonuclease de restrição e sequenciamento de ADN. O plasmídio pGB17«-l contém um inserto EcoRI com 1,4 Kb complementar da parte 3' de Pa partir do sítio de EcoRI na posição 320 até ao sítio de poliadenilação na posição 1721, como é descrito por Zuber e col. Um mapa de pGB17eC-l é representado na Figura 22A.

Obtiveram-se oito pfu hibridizantes seleccionando a biblioteca cDNA com o oligómero 17Or-2. Depois da purificação, a reprodução dos fagos recombinantes e o isolamento de rec lambda-gtll ADN, os insertos de EcoRI foram subclonados no sítio EcoRI de pTZl8R. Os insertos de EcoRI variavam de comprimento desde 270 bp a 1,5 kbp. Só um clone, pGBl7«t-2, contendo um fragmento de EcoRI com 345 bp foi posteriormente investigado por sequenciamento de nucleótidos e comparado com os dados da sequência de Ρ^₃θ17« cDNA publicados por Zuber e col.

Como se mostra na Figura 22B, a sequência P^^q17oCcDNA em pGBl7«C-2 começa 72 bp a montante do codão de iniciação AUG previsto na posição 47 e apresenta completa analogia com a porção 5' de ^P45q17*C cDNA até ao sítio EcoRI na posição 320, como foi descrito por Zuber e col.

Construiu-se um Ρ^^θ17« cDNA bovino de comprimento completo por clonação molecular em E. coli JM101 de uma mistura de ligação contendo um digesto parcial com EcoRI de pGB17oc-l e o fragmento de EcoRI com 345 bp de pGBl7oc-2. O clone assim obtido, pGBl70C-3, contém Ρ^^θ17« cDNA bovino de comprimento completo e é representado na Figura 22C.

Exemplo 14

Construção e Transformação de um Clone de P^q17cÇ cDNA de Comprimento Completo na Levedura Kluyveromyces lactis

a) Construção do Vector de Expressão

Para derivar um vector de expressão apropriado em hospedeiros de levedura para Ρ^θΠΛ bovino, procedeu-se à mutação de pGB17ot-3 por mutagénese dirigida no sítio, como é descrito por Zoller e Smith (Methods in Enzymol., 100, 468 - 500, 1983); Zoller e Smith (Methods in Enzymol. 154, 329 - 350, 1987) e Kramer e Fritz (Methods in Enzymol., 154, 350 - 367, 1987).

Os plasmídios e as estirpes para as experiências de mutagénese in vitro foram obtidos a partir de Pharmacia Inc..

Como se indica na Figura 23, 9 bp precisamente a montante, os codões de iniciação ATG foram alterados para se obter um sítio de restrição Sall e óptimos sinais de translação para levedura usando um oligómero sintético 17o£-3:

SAL 1

5¹-TCTTTGTCCTGACTGCTGCCAGTCGACAAAAATGTGGCTGCTC-3'

Digeriu-se o plasmídio pGB170C-4 resultante com Sall; o fragmento de ADN contendo ο Ρ₄^θ17α cADN de comprimento completo foi separado por electroforese em gel, isolado e transferido por clonação molecular em E. coli JM101 para o vector pGB950 (veja-se Exemplo 5), que foi primeiramente digerido com Xhol, as extremidades pegajosas preenchidas com ADN-polimerase de Klenow e, subsequentemente, digeriu-se com Sall, obtendo-se como resultado o plasmídio pGBl70t-5, tal como é representado na Figura 24.

b) Transformação de K. lactis

Utilizaram-se 15 microgramas de pGBl7ct-5 cortado no sítio único de SacII no lactase-promotor, para transformar a estirpe de K. lactis CBS 2360, como se indicou no Exemplo 5. Analisaram-se os transformantes relativamente à presença de sequências de pGB170C-5 integradas no genoma do hospedeiro por aná lise de Southern. Um transf ormante, 17OC-101, contendo pelo menos três cópias de pGBl7cc-5 no ADN hospedeiro genómico, foi pos teriormente analisado relativamente à sua actividade in vivo de

P . _r„17«. (veja-se Exemplo 16).

450 ^J

Exemplo 15

Construção e Transformação de Pθ!7«ηο3 Hospedeiros Bacterianos Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis

a) Construção do Vector de Expressão

Para derivar um vector de expressão apropriado em hos pedeiros de Bacillus para Ρ^^θΐ7θζbovino, efectuou-se a mutação de pGB17<K-3 por mutagénese dirigida para a cadeia lateral, tal como se descreveu no Exemplo 14.

Como se indica na Figura 25, introduziu-se um sítio de restrição Ndel no codão de iniciação ATG usando o oligómero 17oG-4 sintético

I 5'-GCT GCC ACC CAG AC^C ΑΤΑ Τψ GGC TGC TCC T-3' ; Ndel plasmídeo pGB17<£-6 resultante foi parcialmente digerido com EcoRI; o fragmento de ADN que contém ο Ρ^^θΙϊβοϋΝΑ de comprimento completo foi separado por electroforese em gel, isolado e ligado a EcoRI digerido com pBHA-1 DNA, como se representa na Figura 26. 0 ligado foi clonado molecularmente transferindo a mistura de ligação para dentro de E. coli, de maneira a obter-se pGB17OC-7.

b) Transformação de B.subtilis e B. licheniformis

Introduziu-se o promotor Hpall Bacillus a montante das sequências de P^₃q17<CcDNA por digestão do pGBl7«G-6 com a enzima de restrição Ndel, separação da parte de E. coli do plasmídeo vai-vem por electroforese em gel de agarose e subsequente religação e transformação de células competentes de B. subtills 1A40 (BGSC 1A40). As colónias resistentes a neomicina foram analisadas e obteve-se o plasmídio pGBl7®c-8 (Figura 27).

Realizou-se também a transformação do hospedeiro EA. í lichenif ormis T5 (CBS 470.83) com pGBl7<t-8. O plasmídio mantém-se estável nos hospedeiros Bacillus apropriados, como é revelado por análise de restrição do pGB17oc-8, mesmo depois de muitas gerações.

|j Exemplo 16

Actividade In Vivo de P^θ!7« em Kluyveromyces lactis 17qç-101 i

Obteve-se K. lactis 17«c-101 procedendo como se descreveu no Exemplo 14. Os organismos foram inoculados em 100 ml de meio D. O meio D continha por litro de água destilada os seguintes constituintes:

Extracto de levedura (Difco) 10 gramas

Bacto-peptona (Oxóide) 20 gramas

Dextrose 20 gramas. j

Depois de se esterilizar e arrefecer até 30° C, adicionaram-se ao meio 2,68 gramas de base azotada de levedura

(Difco) dissolvida em 40 ml de água destilada (esterilizada por filtração através de membrana) e 50 mg de neomicina dissolvida em 1 ml de água destilada (esterilizada por filtração através de membrana). Subsequentemente, adicionaram-se 50 mg de progesterona dissolvidos em 1,5 ml de dimetil-formamida a 100 ml de meio.

Desenvolveu-se a cultura durante cento e vinte horas a 30° C e, subsequentemente, extrairam-se 50 ml de caldo de cultura com 50 ml de diclorometano. Centrifugou-se a mistura e separou-se a fase constituída pelo dissolvente orgânico. Evaporou-se o diclorometano por destilação em vácuo e retomou-se oextracto seco (cerca de 200 mg) em 0,5 ml de clorofórmio. Este extracto continha 17cC-hidroxi-progesterona, como é demonstrado por cromatografia em camada fina.

A estrutura do composto foi confirmada por ressonância

I magnética nuclear protónica e por ressonância magnética nuclear de carbono 13. A análise por ressonância magnética nuclear também mostrou que a proporção de 17oC-hidroxi-progesterona/progesterona no extracto era aproximadamente igual a 0,3.

Exemplo 17 í; Clonação Molecular de cDNA de Comprimento Completo que Codifica j

j Citocrómio Bovino P,_rn Esteróide-21-Hidroxilase (P._rr.C21) , -4 (j-4 (j— —

Aproximadamente 10 pfu da biblioteca de cADN de cór' tex adrenal bovino, preparado como se descreveu no Exemplo 1, foram hibridados com oligo C21-1 marcado na extremidade com P. Este oligo, contendo a sequência 5'- GAT GAT GCT GCA GGT AAG CAG

AGA GAA TTC-3', é uma amostra específica para o gene P^^qC21 bo' vino situado a jusante do sítio EcoRI na sequência P._^C21, como ^; é descrito por Yoshioka e col. (J. Biol. Chem., 261, 4106 - 4109,

1986).

A partir da operação de selecção, obteve-se um pfu hii bridizante. O inserto de EcoRI deste ADN recombinante lambda-gtll foi subclonado no sítio de EcoRI de pTZl8R, tendo como resultado a obtenção do construto chamado pGBC21-l. Como se representa na Figura 28, este plasmídio contém um inserto de EcoRI com 1,52 kb, complementar das sequências P^^qC21cDNA do sítio de EcoRI, na posição 489 até ao sítio de poliadenilação, como é descrito por Yoshioka e col, como é revelado pelo sequenciamento dos nucleótidos.

Para se isolar a parte 5' restante (490 bp) de P45Q C21cDNA, preparou-se uma biblioteca de cDNA de córtex adrenal de bovino, de acordo com a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo 1, apenas com uma modificação única. Adicionou-se como primário para a primeira cadeia de cDNA de síntese o oligómero adicional C21-2. O oligómero C21-2 com a seguinte sequência de nucleótidos 5'- AAG CAG AGA GAA TTC-3¹ é posicio nado a jusante do sítio EcoRI de P_45QC21cDNA desde a posição 504 a 490.

A selecção desta biblioteca de cDNA com um oligómero 32

C21-3 marcado com P na extremidade, contendo a sequência específica de P_45QC21 5¹-CTT CCA CCG GCC CGA TAG CAG GTG AGC GCC ACT GAG-3¹ (posições 72 a 37), revelou aproximadamente 100 pfu que hibridizam. O inserto EcoRI de apenas um ADN recombinante lambda-gtll foi clonado no sítio EcoRI de pTZ18R, obtendo-se como resultado um construto designado pGBC21-2.

Este plasmídio (Figura 28) contém um inserto de 540 bp complementar das sequências P₄^qC21cDNA desde a posição -50 até ao sítio EcoRI na posição 489, como é revelado pelo sequenciamento de nucleótidos.

Exemplo 18

Construção de um Vector de Expressão P_45QC21cDNA Bacillus e Transformação nos Hospedeiros Bacterianos Bacillus subtilis e

Bacillus lichemiformis

a) Construção do Vector de Expressão

Para construir um P₄^qC21cDNA de comprimento total com sequências de flanqueamento específicas para o vector de expressão de Bacillus pBHA-1, a parte 5' do gene P₄^qC21 foi primeiramente modificado pelo método da reacção de cadeia de polimerase (PCR) com pGBC21-2 como modelo e dois oligómeros

P₄5qC21 como primários. O oligómero C21-4 (5'-CTG ACT GAT ATC CAT ATG GTC CTC GCA GGG CTG CTG-3') contém vinte e um nucleótidos complementares das sequências C21 das posições 1 a 21 e dezoito bases adicionais para criar um sítio de restrição EcoRV e um sítio de restrição Ndel no codão de iniciação ATG.

oligómero C21-5 (5'-AGC TCA GAA TTC CTT CTG GAT GGT CAC-3') é de vinte uma bases complementar da cadeia menos a montante do sítio EcoRI na posição 489.

A PCR realizou-se como foi descrito por Saiki e col. (Science 239, 487 - 491, 1988), com modificações mínimas. A PCR realizou-se num volume de 100 microlitros contendo : 50 mM de KC1, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM de MgClg, 0,01% (peso/volume) de gelatina, 200 ^M de cada dNTP, 1 jkM de cada primário C21 e 10 ng de pGBC21-2 como modelo.

Depois da desnaturação (sete minutos a 100°C) e da | adição de 2 unidades de Taq-polimerase (Cetus), a mistura reaci cional foi submetida a 25 ciclos de amplificação (cada um com _; dois minutos a 55° C, três minutos a 72° C e um minuto a 94°C) | num aparelho amplificador de ADN (Perkin-Elmer).

I No último ciclo, omitiu-se a fase de desnaturação.

Uma vista esquemática desta amplificação com P₄ggC21cDNA está representada na Figura 29.

!

O fragmento amplificado foi digerido com EcoRV e EcoRI e inserido por clonação molecular nos sítios apropriados de pSP73 (Promega). O plasmídio assim obtido é chamado pGBC21-3.

i

Como se mostra na Figura 30, o fragmento 3' Ρ₄^θ021-EcoRI de pGBC21-3 foi inserido na orientação da direita no sítio de EcoRI de pGBC21-3. Digeriu-se o vector pGBC21-4 assim i

ί obtido com EcoRV e Kpnl (Kpnl está situado no sítio de clonação múltipla de pSP73) e isolou-se o fragmento que contém P₄gQC21( cDNA de comprimento completo por electroforese em gel e inseriu-se nos sítios apropriados de pBHA-1 por clonação molecular.

O plasmídio assim derivado, pGBC21-5, está representado na Figura 31.

b) Transformação de Bacillus

Introduziu-se o promotor Hpall Bacillus a montante do gene P^^qC21cDNA por digestão de pGBC21-5 com a enzima de restrição Ndel, separação da parte de E. coli do plasmídio de vai-vem por electroforese em gel de agarose e subsequente religação e transformação de células competentes de B. subtilis 1A40 (BGSC 1A40). Analisaram-se as colónias resistentes a neomicina para se obter pGBC21-6 (Figura 32).

Também se realizou a transformação do hospedeiro B. licheniformis T5 (CBS 470.83) com pGBC21-6. O plasmídio mantém -se estável em ambos os hospedeiros Bacillus, como é revelado por análise de restrição.

Exemplo 19

Construção de um Vector de Expressão de Levedura P^çqC21cDNA e sua Transformação para o Hospedeiro de Levedura Kluyveromyces lactis

a) Construção do Vector de Expressão

Para derivar um vector de expressão apropriado em hos pedeiros de levedura para P^^qC21 bovina, procedeu-se à mutação de pGBC21-2 por mutagénese dirigida pelo sítio, como se descreveu no Exemplo 14. Para realizar a mutação, utilizou-se o oligómero C21-6 (5¹-CCT CTG CCT GGG TCG ACA AAA ATG GTC CTC GCA GGG-3') para criar o sítio de restrição Sall e óptimos sinais de translação de levedura a montante do codão de iniciação ATG, como se indica na Figura 33.

O fragmento SalI/EcoRI do plasmídio pGBC21-7 derivado foi ligado ao fragmento 3' P^çqC21-EcoRI de pGBC21-l e inserido por clonação molecular nos sítios apropriados de pSP73, como se indica na Figura 34. O pGBC21-8 derivado foi cortado com Sall e EcoRV (o sítio de EcoRV fica situado no sítio de clonação múltipla de pSP73) e o fragmento de ADN contendo P_45QC21cDNA de comprimento completo foi inserido no vector de expressão de levedura pGB950. 0 plasmídio pGBC21-9 derivado está representado na Figura 35.

b) Transformação de K. lactis

Digeriram-se 15 microgramas de pGBC21-9 com SacII e realizou-se a transformação de K. lactis CBS 2360 como se descreveu no Exemplo 5 (c).

Exemplo 20

Clonação Molecular de um cADN de Comprimento Completo que Codifica o Citocrómio Bovino P/cq Esteróide- 11£ -Hidroxilase (P^qlip)

Preparou-se uma biblioteca de cADN de córtex adrenal bovino como se descreveu no Exemplo 1, com uma modificação. Adicionou-se um outro primário específico Ρ^^θ adicional (oligómero 11£-1) com a sequência de nucleótidos 5'-GGC AGT GTG CTG ACA CGA-3¹ à mistura reaccional da síntese de cADN de primeira cadeia.

O oligómero llp-1 fica posicionado precisamente a jusante do codão de interrupção da translação da posição 1530 a 1513. As sequências de nucleótidos e as posições no mapa dos oligómeros P^q lip mencionados são todos derivados dos dados de sequência P^^lípcDNA, descritos por Morohashi e col. (J.

Biochem., 102 (3), 559 - 568, 1987). A biblioteca de cDNA foi , 32 seleccionada com o oligomero np- 2 marcado com P (5'-CCG CAC CCT GGC CTT TGC CCA CAG TGC CAT-3') e fica situada na extremidade 5' de P^^^lípcDNA a partir da posição 36 até à posição 1.

A selecção com oligómero lip-2 revelou 6 pfu que hibridizam. Estes foram mais purificados e analisados com o oligómero lip-3 (5'-CAG CTC AAA GAG AGT CAT CAG CAA GGG GAA GGC TGT-3', posições 990 até 955). Duas de entre estas seis pfu apresentarem um sinal de hibridização positivo com o „ 32 oligomero np- 3 marcado com P.

Os insertos de EcoRI de ambos os recombinantes np-lambda-gtll foram subclonados no sítio de EcoRI de pTZl8R.

Um clone com um inserto de EcoRI de 2,2 kb (pGBlip-1) foi seguidamente analisado com enzima de restrição de mapeamento e está representado na Figura 36. pGBllp-1 contém todas as sequências de P lípcDNA codificadas, determinadas como foi referido por *t J v

Morohashi e col.

Exemplo 21

Construção de um Vector de Expressão de P^^_QC21cADN Bacillus e Transformação nos Hospedeiros Bacterianos Bacillus subtilis e

Bacillus licheniformis

a) Construção do Vector de Expressão

Um P^^glipcDNA de comprimento completo com sequências de flanqueamento modificadas para o vector de expressão em Bacillus , pBHA-1, foi obtido pelo método de PCR (descrito no Exemplo 18) com pGBll^-1 como modelo e dois oligómeros P ,-θΙΐρ específicos como primários.

O oligómero 11JB-4 (5'-TTT GAT ATC GAA TTC CAT ATG GGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC-3') contém vinte e uma j bases complementares da sequência P^^^ll^cDNA madura desde a po; sição 72 até à posição 93 e vinte e uma bases para criar sítios ί de restrição EcoRV, EcoRI e Ndel e codão de iniciação ATG.

’ί O oligómero llp-5 (5'-TAA CGA TAT CCT CGA GGG

TAC CTA CTG GAT GGC CCG GAA GGT-3) contém vinte e uma bases complementares da cadeia menos P_45QlipcDNA a montante do codão de interrupção de translação na posição 1511 e vinte e uma i

' bases para criar sítios de restrição para EcoRV, Xhol e Kpnl.

i

Depois da amplificação por PCR com o modelo acima ii mencionado e primários Ρ^θΐΐβ, o fragmento amplificado (1,45 '! kb) foi digerido com EcoRI e Kpnl e inserido por clonação molecular no vector de expressão em Bacillus, pBHA-1, cortado com ! EcoRI e Kpnl para se obter o vector pGBllp-2 (veja-se Figura 36).

b) Transformação de Bacillus

Introduziu-se o promotor Hpall Bacillus a montante das sequências de P_45QlipcDNA por digestão de pGBllp-2 com Ndel, separação da parte de E. coli do plasmídio de vai-vem por elec- ί troforese em gel de agarose e subsequente religação (como se des46

creveu no Exemplo 18) e transformação de células competentes de B. subtilis 1A40 (BGSC 1A40). Analisaram-se as colónias resistentes a neomicina e obteve-se o plasmídio pGBlip-3. 0 plasmídio derivado pGBlip-3 foi também transmitido à estirpe do hospedeiro B. licheniformis, T5 (CBS 470.83).

Exemplo 22

Construção de um Vector de Expressão de Levedura P^g^llftcDNA e Transformação para o Hospedeiro de Levedura Kluyveromyces lactis

a) Construção da Cassete de Expressão

Obteve-se um Ρ^θΙΙβοΟΝΑ de comprimento completo com sequências de flanqueamento modificadas para o vector de expressão de levedura pGB950 pelo método PCR (descrito no Exemplo 18) com pGBlip-1 como modelo e dois oligómeros P^^^lip específicos como primários.

J O oligómero ll£-6 (5'-CTT CAG TCG ACA AAA ATG ) GGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC^3 ¹ ) contém vinte e uma bases ' complementares da sequência madura de Ρ^θΙίροϋΝΑ desde a posição 72 até 93 e dezoito bases adicionais para criar um sítio de restrição Sall, um sinal óptimo de translação da levedura e um

I codão de iniciação ATG.

: O oligómero lip-5 é descrito no Exemplo 21 (a).

Depois da amplificação por PCR com o modelo acima mencionado e primários Ρ^θ np, o fragmento amplificado (1,45 kb) | í foi digerido com Sall e Xhol e inserido por clonação molecular

I no vector de expressão da levedura pGB950 cortado com Sall, pa- [ ! !

;í ra se obter o vector pGBllp-4 (Figura 37).

j b) Transformação de K. lactis i !

Cortaram-se 15 microgramas de pGBll^-4 no sítio único SacII no promotor de lactase e realizou-se a transformação de

K. lactis CBS 2360 como se descreveu no Exemplo 5 (c).

Exemplo 23 ί

Clonação Molecular e Construção de um cDNA de Comprimento Total que Codifica a Adrenodoxina (ADX) Bovina e a Subsequente Transformação e Expressão de ADXcDNA na Levedura Kluyveromyces lactis

a) Clonação Molecular de ADX

Obteve-se directamente um ADXcDNA de comprimento completo com sequências de flanqueamento 5' e 3' modificado para o vector de expressão de levedura pGB950 a partir de uma piscina de mRNA/cDNA de córtex adrenal bovino (para a descrição pormenorizada, veja-se o Exemplo 1) por amplificação, usando o método de PCR (veja-se o Exemplo 18).

Para a amplificação de ADXcDNA, sintetizaram-se dois primários oligoméricos sintéticos.

oligómero ADX-1 (5¹-CTT CAG TCG ACA AAA ATG AGC AGC TCA GAA GAT AAA ATA-3') contendo vinte e uma bases complementares da sequência ADXcDNA madura na extremidade 5' como descrito por Okamura e col. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 5705 - 5709, 1985) a partir das posições 173 a 194. O oligómero ADX-1 contém a extremidade 5¹ de dezoito nucleótidos adicionais para criar um sítio de restrição Sall, um sinal óptimo de translação em levedura e um codão de iniciação ATG.

O oligómero ADX-2 (5¹-TGT AAG GTA CCC GGG ATC CTT ATT CTA TCT TTG AGG AGT T-3') é complementar da extremidade 3' da cadeia menos ADXcDNA a partir da posição 561 até 540 e contém nucleótidos adicionais para criar sítios de restrição para BamHI, Smal e Kpnl.

O método de PCR realizou-se como se descreveu no Exemplo 18, com 1 /Λ.Μ de cada um dos primários ADX e 10 microlitros de mistura mRNA/cDNA (como se descreveu no Exemplo 1) como modelo .

Na Figura 38, está representada uma vista esquemática desta amplificação de ADXcDNA.

fragmento amplificado contém uma sequência de ADXcDNA de comprimento completo com flancos modificados, que se caracterizou por análise dos sítios de restrição e sequenciamento dos nucleótidos.

b) Construção do Vector de Expressão

Digeriu-se o fragmento ADXcDNA amplificado foi digerido com Sall e Smal e inseriu-se por clonação molecular no vector de expressão pGB950 de levedura cortado com Sall e EcoRV. O plasmídio derivado, pGBADX-1, está representado na Figura 38.

c) Transformação de K. lactis

Submeteram-se a corte 15 microgramas de pGBADX-1 no sitio único de SacII no promotor de lactase e realizou-se a transformação de K. lactis como se descreveu no Exemplo 5 (c).

d) Análise dos Transformantes

Seleccionaram-se dois transformantes, ADX-101 e ADX-102, e a estirpe de controlo CBS 2360, para análise posterior. As estirpes foram desenvolvidas em meio de YEPD durante cerca de sessenta e quatro horas a 30° C. Isolou-se a proteína celular total como se descreveu no Exemplo 5 (d). Dos sobrenadantes, retiraram-se amostras de 8 microlitros para análise de imuno-manchamento (veja-se Figura 39, pistas 3, 4 e 5).

Os resultados obtidos mostram que uma proteína do comprimento esperado (14 KDa) é expressa em células de K. lactis transformadas com pGBADX-1.

A actividade de ADX determinada in vitro do transformante ADX-102 é descrita no Exemplo 24.

Exemplo 24

Actividade In Vitro de Adrenodoxina Obtida a Partir de Kluyveromyces lactis ADX-102

K. lactis ADX-102, obtido como se descreveu no Exemplo 23 e a estirpe de controlo K. lactis CBS 2360 foram desenvolvidas em 100 ml de meio de YEPD (1% de extracto de levedura, 2% de peptona e 2% de glucose mono-hidratada) contendo 2,5 ml de uma solução a 6,7% (peso/peso) de base azotada de levedura (Difco Laboratories) e 100 mg por litro de geneticina (sulfato de G418; Gibco Ltd.), durante cinquenta e seis horas a 30°C.

As células foram colectadas por centrifugação (4000 x x g, quinze minutos), estas foram suspensas de novo numa solução fisiológica de cloreto de sódio e lavadas com tampão de fosfato (pH 7,0; 50 mM). Depois de centrifugação (4000 x g, quinze minutos), a pelete foi suspensa de novo em tampão de fosfato (pH 7,0; 50 mM), obtendo-se como resultado uma suspensão que contém 0,5 grama de peso de células húmicas/ml. As células foram rompidas usando um homogeneizador Braun MSK ras de vidro com 0,45 a 0,50 milímetros), se romperam foram removidas por centrifugação (4000 x g, quinze minutos). Os extractos isentos de células (40 mg de proteína/ ml) foram armazenados a -20° C.

x 15 segundos, esfeAs células que não

A actividade de ADX, isto é, a capacidade de transferência de electrões de adrenodoxina-redutase para citocrómio P450SCC nos extractos isentos de células foi determinada por um j ensaio da actividade de P._rnSCC. A mistura de ensaio consistia 4 _> u nas seguintes soluções:

Solução A (sistema doador de electrões de P^^SCC natural com excepção de ADX) :

í j uma solução de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0) conj tendo 3 mM de EDTA, 2 jaM de adrenodoxina-redutase (purificada a partir de córtex adrenal bovino), 1 mM de NADPH (doador de elec trões), 15 mM de glucose-6-fosfato e 16 unidades por mililitro j de glucose-6-fosfato-desidrogenase (sistema de regeneração de

NADPH).

Solução B (substrato e enzima) :

uma solução micelar 75 μΜ de colesterol (duplamente radiomarcado com £26,2 7-^4(^2 -colesterol (40 Ci/mole) e £70^2 -colesterol (400 Ci/mole)) e 1,5 ^uM de P SCC (purificado a partir de córtex adrenal bovino) em 10% (volume/volume) de Tergitol® NP 40/ etanol (1 : 1, volume/volume).

O ensaio iniciou-se misturando 75 microlitros de Solução A com 50 microlitros de solução B e 125 microlitros de extracto isento de células ou 125 microlitros de um tampão de fosfato de potássio (50 mM, pH 7,0) contendo 10 μΜ de ADX (purificado a partir de córtex adrenal bovino).

Agitou-se a mistura suavemente a 30° C. amostras ao fim de quinze minutos de incubação e diluiram-se com 100 microlitros de água. De um substrato da amostra e de produto ou produtos realizou-se a extràcção com 100 microlitros de metanol e 150 microlitros de clorofórmio. Depois de centrifugação (5000 x g, dois minutos), colectou-se a fase clorofórmi ca e secou-se. Dissolveu-se o resíduo seco em 50 microlitros de acetona contendo 0,5 mg de uma mistura de esteróides (colesterol, pregnenolona e progesterona -1:1:1, peso/peso/peso) e, subsequentemente, adicionaram-se 110 microlitros de ácido fórmico concentrado,. Aqueceu-se a suspensão a 120° C durante 14 3 quinze minutos. Em seguida, determinou-se a proporção C/ H por contagem de cintilações do líquido de marcação dupla. A proporção constitui uma medição directa para a reacção de cliva 14 gem da cadeia lateral porque a cadeia lateral marcada com C é vaporizada da mistura sob a forma de ácido isocaprílico duran te o processo de aquecimento.

Usando este método de ensaio, pode ser facilmente demonstrada a actividade de transporte de electrões ADX no extrac to isento de células de K. lactis ADX-102. Nos ensaios com extracto isento de células de ADX-102 ou com ADX purificado, a cadeia lateral do colesterol estava clivada ao fim de quinze mi nutos com um rendimento de 50%, enquanto que no ensaio com extracto isento de células da estirpe de controlo K. lactis CBS 2360 não se conseguiu detectar qualquer clivagem da cadeia late ral.

Exemplo 25

Clonação Molecular e Construção de um cDNA de Comprimento Completo que Codifica a Adrenodoxina-Óxido-Redutase (ADR) Bovina e Subsequente Transformação de ADRcDNA na Levedura Kluyveromyces lactis

a) Clonação Molecular de Adrenodoxina-Óxido-Redutase

Preparou-se uma biblioteca de cDNA de córtex adrenal bovino, como se descreveu no Exemplo 1, com uma modificação. Adicionou-se um primário específico ADR adicional (oligómero

Retiraram-se

¹ ADR-1) com a sequência de nucleótidos 5'-GGC TGG GAT CTA GGC-3' à mistura reaccional da síntese de cDNA de primeira cadeia. 0 oligómero ADR-1 está situado precisamente a jusante do codão de interrupção de translação da posição 1494 até 1480.

As sequências de nucleótidos e as posições no mapa dos oligómeros ADR mencionados são todas derivadas dos dados da sequência de ADRcDNA descrito por Nonaka e col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 145 (3), 1239 - 1247, 1987.

A biblioteca de cDNA assim obtida foi escolhida com um oligómero ADR-2 marcado com (5^{* 1}_CAC CAC ACA GAT CTG

GGG GGT CTG CTC CTG TGG GGA-3').

Identificaram-se quatro pfu hibridizantes e purificaram-se subsequentemente. No entanto, apenas uma pfu apresentou também um sinal positivo com o oligómero ADR-3 (5'-TTC CAT CAG CCG CTT CCT CGG GCG AGC GGC CTC CCT-3¹), que fica situado no meio da ADRcDNA (posição 840 e 805). O inserto ADRcDNA (com aproximadamente 2 kb) foi clonado molecularmente no sítio de EcoRI de pTZl8R.

í O plasmídio pGBADR-1 assim obtido contém o inserto j ADRcDNA de comprimento completo, como é revelado por mapeamento das enzimas de restrição e pelo sequenciamento de nucleótidos. ί, O maoa físico de pGBADR-1 está representado na Figura 40.

ií

b) Construção da Cassete de Expressão !i Obteve-se um inserto ADRcDNA de comprimento completo com sequências de flanqueamento modificadas para o vector de expressão de levedura pGB950 pelo método de PCR (veja-se Exem| pio 18) com pGBADR-1 como modelo e dois oligómeros ADR específicos como primários.

Si ! O oligómero ADR-4 (5 '-CGA GTG TCG ACA AAA ATG l· TCC ACA CAG GAG CAG ACC-3¹) contém dezoito bases complemen1 tares das sequências de ADRcDNA maduras da posição 96 a 114 e ! dezoito bases para introduzir um sítio de restrição Sall, um sinal de translação para levedura óptimo e um codão de iniciação ATG.

oligómero ADR-5 (5'-CGT GCT CGA GGT ACC TCA GTG CCC CAG CAG CCG CAG-3¹) contém dezoito bases complementares para a cadeia menos de ADRcDNA a montante do codão de interrupção de translação na posição 1479 e quinze bases para criar sítios de restrição Kpnl e Xhol para clonação molecular em vários vectores de expressão.

Depois da amplificação de acordo com o modelo acima mencionado e com os primários ADR, o fragmento amplificado (1,4 kb) foi digerido com Sall e Xhol e inserido por clonação molecular no vector de expressão de levedura pGB950, cortado com Sall e Xhol.

plasmídio derivado pGBADR-2 é representado na Figura 40.

c) Transformação de K. lactis

Cortaram-se 15 microgramas de pGBADR-2 no sítio único SacII no promotor de lactase e realizou-se a transformação de K. lactis CBS 2360 como se descreveu no Exemplo 5 (c).

; Exemplo 26

Clonação Molecular de cDNA de Comprimento Completo que Codifica

NADPH-Citocrómio P^çq Redutase (RED) Bovina

A biblioteca cDNA de córtex adrenal bovino descrita no Exemplo 1 foi seleccionada com um oligómero sintético marca32 do com P de fórmula 5¹-TGC CAG TTC GTA GAG CAC ATT GGT GCG TGG CGG GTT AGT GAT GTC CAG GT-3', específico para uma região de aminoácidos conservada dentro de RED de rato, de porco e de coelho, como é descrito por Katagari e col. (J. Biochem., 100, 945 - 954, 1986) e Murakami e col. (DNA, 5., 1 - 10, 1986) .

Obtiveram-se cinco pfu que hibridizam e ainda foram caracterizados por mapeamento com enzima de restrição e sequenciamento de nucleótidos. Inseriu-se REDcDNA de comprimento completo em vectores de expressão e transformaram-se em hospedeiros j apropriados, como se mencionou nos Exemplos 2, 3 e 6.

Exemplo 27

Construção, Transformação e Expressão de uma Cassete de Expressão que Codifica as Proteínas qSCC e ADX na Levedura Kluyveromyces lactis

a) Construção da Cassete de Expressão

A cassete de expressão pGBADX-1 (veja-se Exemplo 23) foi digerida com SacII e HindIII (parcialmente) e as extremidades pegajosas foram preenchidas usando ADN-polimerase de Klenow. 0 fragmento de ADN compreendendo uma parte do promotor de lactase (mas ainda funcional), a sequência de codificação ADX e o terminador de lactase foi separado e isolado por electroforese em gel de agarose e, subsequentemente, inserido em pGBSCC-7, que foi primeiramente linearizado por digestão com Xbal (veja-se Exemplo 5 (b)) e as extremidades pegajosas foram preenchidas usando ADN-polimerase de Klenow. A construção foi estabelecida de tal maneira que se obtém um único sítio de restrição (SacII) que é necessário para transferir o plasmídio para K. lactis.

Este sítio de restrição único SacII fica situado na sequência do promotor de lactase que flanqueia a sequência SCC quando o sítio de restrição SacII no promotor de lactase que flanqueia a sequência ADX é destruído pela reacção de preenchimento .

A cassete de expressão assim obtida, pGBSCC/ADX-1, contém a sequência de codificação para SCC, assim como para ADX, cada uma accionada pelo promotor de lactase.

b) Transformação de K. lactis

A transformação de K. lactis CBS 2360 realizou-se coI mo se descreveu no Exemplo 5 (c) com 15 microgramas de pGBSCC/I ^! ADX-1, linearizado no único sítio de restrição SacII. Seleccioj nou-se um transformante (SCC/ADX-101) para estudo da expressão de SCC e de ADX.

c) Análise do Transformante K. lactis SCC/ADX-101

Prepararam-se fracções de proteína celular a partir de culturas de SCC/ADX-101 e da estirpe de controlo CBS 2360, como se descreveu no Exemplo 5 (d) e analisaram-se por SDS/PAGE e manchamento de Western. A mancha foi ensaiada com anticorpos específicos para SCC e ADX, respectivamente.

Quando é comparada com a estirpe de controlo, a fracção da proteína celular do transformante SCC/ADX-101 apresenta duas bandas adicionais de comprimento esperado (53 e 14 KDa, respectivamente), mostrando a expressão de ambas as proteínas SCC e ADX. Os níveis de expressão das duas proteínas no transformante SCC/ADX-101 são comparáveis com os níveis observados nos transformantes que expressam apenas uma proteína (para SCC, veja-se Figura 15A, pista 3, e para ADX, Figura 39, pista 5).

A actividade de SCC e de ADX in vitro de transformante SCC/ADX-101 é descrita no Exemplo 28.

Exemplo 28

Actividade In Vitro de P._r_SCC e de Adrenodoxina Obtidas a Par-450tir de Kluyveromyces lactis SCC/ADX-101

Desenvolveram-se K, lactis SCC/ADX-101 obtida como se descreveu no Exemplo 27 e a estirpe de controlo K. lactis SCC-101 como se descreveu no Exemplo 5 (d) em 1 litro de meio de YEPD (1% de extracto de levedura, 2% de peptona, 2% de glucose mono-hidratada), contendo 100 mg por litro de geneticina (sulfato de G418; Gibco Ltd.), durante setenta e duas horas a 30° C.

Colectaram-se as células por centrifugação (4000 x g, quinze minutos), suspenderam-se novamente em solução fisiológica de cloreto de sódio e lavaram-se com tampão de fosfato (pH

7,5, 75 mM) . Depois da centrifugação (4000 x g, quinze minutos) a pelete foi novamente suspensa em tampão de fosfato (pH 7,5, mM) obtendo-se como resultado uma suspensão que contém 0,5 gramas de peso húmido de células/ml. As células foram rompidas usando um homogeneizador Braun MSK (6 x 15 segundos, esferas de vidro com 0,45 - 0,50 milímetros). As células não rompidas foram separadas por centrifugação (4000 x g, quinze minutos).

Nos extractos isentos de células, a actividade do com55 plexo de proteína P^^qSCC/ADX foi ensaiada determinando a reacção de clivagem da cadeia lateral de colesterol na presença de NADPH e ADR. A mistura de ensaio consistia nas seguintes soluções :

Solução A (sistema doador de electrões de P_45QSCC natural, com excepção de ADX) :

uma solução 50 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0), contendo 3 mM de EDTA, 2 pM de adrenodoxina-redutase (purificada a partir de córtex adrenal bovino), 1 mM de NADPH (doador de electrões), 15 mM de glucose-6-fosfato e 16 unidades/ml de glucose-6-fosfato-desidrogenase (sistema de regeneração de NADPH Solução B (substrato) :

uma solução micelar de 37,5 >rM de colesterol (duplamente radiomarcado com ^26,27-^^c3-colesterol (40 Ci/mole) e C^{7 * * * * * *}*-³ h3 -colesterol (400 Ci/mole)) em 10% (volume/volume) de Tergitol®^jP 40/etanol (1 : 1, volume/volume).

O ensaio foi iniciado misturando 75 Pl de solução A com 50 microlitros de solução B e 125 microlitros de extracto isento de células. Agitou-se a mistura suavemente a 30° C. Retiraram-se amostras depois de sessenta minutos de incubação e diluiram-se com 100 microlitros de água. A partir de uma amostra de substrato e de produtos, extrairam-se estes com 100 microlitros de metanol e 150 microlitros de clorofórmio.

Depois da centrifugação (5000 x g, dois minutos), a camada clorofórmica foi colectada e seca. O resíduo seco foi dissolvido em 50 microlitros de acetona contendo 0,5 mg de uma mistura de esteróides (colesterol, pregnenolona e progesterona - 1 : 1 : 1, em peso/peso/peso) e, subsequentemente, adicionaram-se 110 microlitros de ácido fórmico concentrado.

Aqueceu-se a suspensão a 120° C durante quinze minutos Em seguida, determinou-se a proporção ¹⁴c/³H por contagem de cintilações do líquido de marcação dupla. A proporção é uma medida directa da reacção de clivagem da cadeia lateral porque a cadeia lateral marcada com é vaporizada da mistura sob a for ma de ácido isocaprílico durante o processo de aquecimento.

Usando este ensaio, demonstrou-se a actividade de clivagem da cadeia lateral de colesterol no caso do extracto isento de células de K. lactis SCC/ADX-101, enquanto, no extracto isento de células de K. lactis SCC-101, não foi detectável qualquer actividade.

Por meio de análise de HPLC, o produto da reacção obtido por extracto isento de células de K. lactis SCC/ADX-101 foi identificado como sendo pregnenolona.

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES

   - lâ Processo para a preparação de uma cassete de expressão, caracterizado por se construir, segundo a direcção de transcripção, uma região regulatória de iniciação transcripcional e translaccional, eventualmente uma sequência de sinal de secreção, uma sequência de codões sem terminação (código de |leitura aberto) compreendendo uma sequência codificante de DNA i heterólogo codificando uma proteína, que seja funcional, isoladamente ou em co-operação com uma ou mais proteínas adicionais, para catalisar um passo de oxidação no mecanismo biológico de conversão do colesterol em hidrocortizona, sendo esse passo de oxidação seleccionado de entre o grupo constituído por: conversão de colesterol em pregnenolona;

   conversão de pregnenolona em progesterona; conversão de progesterona em 17«x-hidroxiproges terona ; conversão de 17cc-hidroxiprogesterona em cortexolona e conversão de cortexolona em hidrocortixona, e e se construir ainda uma região regulatória de terminação translaccional e transcripcional, sendo as referidas regiões regulatórias funcionais numa célula hospedeira recombinante.

   -
2. 2â 57

   Processo para a preparação de uma cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência codificante de DNA heterólogo codificar pelo menos duas proteínas que sejam funcionais para catalisar, isoladamente ou em cooperação com uma ou mais proteínas adicionais, pelo menos dois passos de oxidação do grupo indicado na reivindicação 1.

   - 3â Processo para a preparação de uma cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cassete de expressão conter pelo menos um DNA heterólogo adicional, com as suas próprias sequências de controlo efectivas, que codifica uma proteína que seja funcional para catalisar, isoladamente ou em cooperação com uma ou mais proteínas adicionais, um passo de oxidação do grupo indicado na reivindicação

   1.

   I

   - 4ã II

   Processo para a preparação de uma cassete de | expressão, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, h caracterizado por a proteína se selecionar de entre as do grupo seguinte:

   | enzima de olivagem (cisão) de cadeia lateral (P^qSCC);

   | adrenodoxina (ADX);

   í adrenodoxina redutase (ADR);
3. 3p-hidroxiesteróide desidrogenase/isomerase (3p-HSD); es teróide-17ot-hidroxilase ( P . _cn17et) ;

   NADPH citrocroma Ρ₄₅θ redutase (RED);

   ! esteróide-21-hidroxilase (P₄^qC21) e | esteróide-lip-hidroxilase (Ρ^^θΐΐ^).

   - 5ã I

   Processo para a preparação de uma cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por

   - 58 as sequências codificantes de DNA heterólogo serem originárias da espécie bovina.

   _ 6â Processo para a preparação de uma cassete de expressão, de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizado por o DNA heterólogo codificar pelo menos uma proteína adicional do grupo indicado na reivindicação 4.

   - 7â Processo para a preparação de uma cassete de expressão, de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizado por a cassete de expressão conter pelo menos um DNA heterólogo adicional, com as suas próprias sequências de controlo efectivas que codificam uma proteína do grupo da reivindicação 3.

   i - 83 lí . Processo para a preparação de uma cassete de ^! expressão, de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracterizaí do por o DNA heterólogo codificar P^^SCC bovina e ADX bovina.

   i

   - 9ã Processo para a preparação de uma cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por oDNA heterólogo codificar a enzima P^^qSCC e a cassete de expres são ser escolhida do grupo designado por pGBSCC-n, em que n é í um número inteiro qualquer de 1 a 17.

   i

   - 10ã Processo para a preparação de uma cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o DNA heterólogo codificar a enzima Ρ^^θ17θί. e a cassete de expressão ser escolhida do grupo designado por pGB17«c-n, em que n é um número inteiro qualquer de 1 a 5.

   - llã Processo para a preparação de uma cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o DNA heterólogo codificar a enzima P._cnC21 e a cassete de ex450 pressão ser escolhida do grupo designado por pGBC21-n, em que n é um número inteiro qualquer de 1 a 9.

   - 12a _

   Processo para a preparação expressão, de acordo com a reivindicação 5, o DNA heterólogo codificar a enzima P pressão ser escolhida do grupo designado por n é qualquer número inteiro de 1 a 4.

   de uma cassete de caracterizado por e a cassete de expGBllp-n, em que

   450¹ *

   Processo para a preparação de células hospede ras recombinantes e da sua descendência, compreendendo células de microorganismos, plantas ou animais e contendo uma cassete de expressão com DNA heterólogo, caracterizado por a cassete de expressão ser uma das definidas em qualquer das reivindicações 1 a 12.

   1- 14â de células hospedeiacordo com a reivinser um microorganisProcesso para a preparação ras recombinantes e da sua descendência, de dicação 13, caracterizado por o hospedeiro mo .

   - 15â Processo para a preparação de células hospedeiras recombinantes e da sua descendência, de acordo com a reivin60 dicação 14, caracterizado por o hospedeiro ser uma espécie de Saccharomyces, Kluyveromyces ou Bacillus ou ser Escherichia coli.

   - 16â Processo para a preparação de células hospedeiras recombinantes e das sua descendência de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 15, compreendendo células de microorganismos, plantas ou animais, caracterizado por a célula conter pelo menos duas cassetes de expressão como se definiu em qualquer das reivindicações 1 a 12.

   - 17â Processo para a preparação de enzimas exógenas por meio de uma célula recombinante, caracterizado por se cultivar a célula hospedeira recombinante num meio nutriente em condições que permitem a formação e a acumulação das enzimas no líquido de cultura, e por a célula recombinante ser uma célula hospedeira recombinante como se definiu em qualquer das reivindicações 13 a 15.

   - 18â Processo para a preparação de uma mistura de enzimas endógenas, caracterizado por se cultivar uma célula recombinante num meio nutriente em condições que permitem a formação e a acumulação das enzimas no líquido de cultura, e por a célula recombinante ser uma célula hospedeira recombinante como se definiu na reivindicação 16.

   - 19^a Processo para a oxidação bioquímica selectiva in vitro, caracterizado por compreender incubar-se o composto a oxidar na presença de uma ou mais enzimas em condições que permitem a referida oxidação e a acumulação do composto oxidado no líquido de cultura, ração do composto oxidado, e por a enzima ou as enzimas utilizadas se com o processo referido nas reivindicações seguido pela recupeprepararem de acordo 17 ou 18.

   - 20â Processo para a oxidação de um composto seleccionado, caracterizado por compreender cultivarem-se células recombinantes na presença do composto em causa em condições em que ocorra a oxidação pretendida e que per mitam a acumulação do composto oxidado no líquido de cultura, seguido pela recuperação do composto oxidado, e por as células recombinantes utilizadas serem células hospedeiras de acordo com as definidas em qualquer das reivindicações 13 a 16.

   - 21â Processo de oxidação, de acordo com as reivindicações 19 ou 20, caracterizado por a reacção de oxidação ser uma das do grupo seguinte:

   clivagem da cadeia lateral de um composto de esterol com obtenção de pregnenolona;

   conversão de pregnenolona e progesterona;

   conversão de progesterona a 17oC-hidroxiprogesterona;

   conversão de 17cc-hidroxiprogesterona a cortexolona e conversão de cortexolona a hidrocortisona.

   - 22a _

   Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a oxidação consistir na clivagem da cadeia lateral de um composto de esterol obtendo-se a pregnenolona.

   - 23ã Processo de acordo com a reivindicação 21, ca62