JPH11308991A - ステロイドの生化学的酸化方法 - Google Patents

ステロイドの生化学的酸化方法

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JPH11308991A
JPH11308991A JP11078556A JP7855699A JPH11308991A JP H11308991 A JPH11308991 A JP H11308991A JP 11078556 A JP11078556 A JP 11078556A JP 7855699 A JP7855699 A JP 7855699A JP H11308991 A JPH11308991 A JP H11308991A
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Herman Slijkhuis
ヘルマン スレイクハイス
Gerardus Cornelis Maria Selten
ヘラルデュス コルネリス マリア セルテン
Eric Bastiaan Smaal
エリック バスチアーン スマール
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Aventis Pharmaceuticals Inc
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Hoechst Marion Roussel
Hoechst Marion Roussel Inc
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 医薬的に有用なステロイドの製造のための経
済的な生化学的酸化方法を提供する。 【解決手段】 コレステロールのヒドロコルチゾンへの
変換の生化学的経路中の酸化工程を、単独であるいは付
加的な１以上のタンパク質と共同で、触媒する機能を有
するタンパク質をコード化する異種ＤＮＡコード配列、
及び組換え宿主中で有効な対応するコントロール配列を
含有する該宿主中で作動し得る発現カセットを含有する
組換え宿主を、栄養培地中で外因性タンパク質が培養物
中に生成蓄積できる条件下に培養することによりなる組
換え細胞による外因性タンパク質の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は医薬的に有用なステ
ロイドの製造のための生化学的酸化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ
−４−プレグネン−３，２０−ジオン（ヒドロコルチゾ
ン）は、その薬理的性質からコルチコステロイドとして
及び多くの有用なステロイド、特に他のコルチコステロ
イドの製造のための出発化合物として重要な医薬ステロ
イドである。ヒドロコルチゾンは脊椎動物の副腎皮質に
おいて生産され、初めは副腎皮質組織からの骨の折れる
抽出によってほんの少量得られていた。構造解明後にな
ってはじめて、化学的合成工程と微生物学的変換の組合
せによって特徴づけられる新規な製造経過が開発され
た。用いられるステロール、胆汁酸、サポゲニン等の出
発化合物が豊富で安価であるというのみの理由で、これ
らの方法はそれほど高価でない生成物を与えるが、依然
としてかなり複雑である。これらの方法を改良するため
のいくつかの試みがなされ、また生化学的アプローチが
試みられた。
【０００３】１つの試みはステロイドのヒドロコルチゾ
ンへの生体内での酵素的変換に関与することが知られて
いる、単離された、副腎皮質タンパク質を用いて、生体
外生化学系で適当な出発ステロイドをヒドロコルチゾン
に変換したことであった。しかしながら、タンパク質の
単離が困難なことと必要なコファクターの高価さが経済
的に引き合う方法の大規模化を困難にするものと考えら
れた。別のアプローチは触媒するタンパク質をそれらの
自然の環境を保ち、副腎皮質細胞に細胞培養液中でヒド
ロコルチゾンを生成させることであった。しかしなが
ら、実験中の細胞の低生産性ゆえに、かかる生化学方法
を経済的に引き合うものとすることは不可能であると考
えられた。
【０００４】哺乳類及び他の脊椎動物の副腎皮質におけ
る生体内プロセスはコレステロールからはじまり、種々
の中間化合物を経て最終的にヒドロコルチゾンを与える
生化学経路を構成する（図１参照）。この経路には８つ
のタンパク質が直接関与し、それらのうち５つは酵素
（そのうち４つはチトクロームＰ450 酵素）であり、他
の３つは電子伝達タンパク質である。最初の工程は、コ
レステロールの３β−ヒドロキシ−５−プレグネン−２
０−オン（プレグネノロン）への変換である。この変換
すなわちモノオキシゲナーゼ反応においては３つのタン
パク質が関与する：側鎖切断酵素（Ｐ450 ＳＣＣ、ヘム
−Ｆ含有タンパク質）、アドレノドキシン（adrenodoxi
n)（ＡＤＸ、Fe2S2 含有タンパク質）及びアドレノドキ
シンリダクダーゼ（adrenodoxinreductase）（ＡＤＲ、
ＦＡＤ含有タンパク質）。基質としてのコレステロール
に加え、この反応はさらに分子状酸素及びＮＡＤＰＨを
必要とする。ついでプレグネノロンは脱水素／異性化に
よって４−プレグネン−３，２０−ジオン（プロゲステ
ロン）に変換される。タンパク質３β−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼ／イソメラーゼ（３β−ＨＳ
Ｄ）によって触媒されるこの反応は、プレグネノロン及
びＮＡＤ+ を必要とする。ヒドロコルチゾンを得るため
に、プロゲステロンはついで３位でヒドロキシル化され
るが、この変換はモノオキシゲナーゼによって触媒され
る。プロゲステロンの１７α−ヒドロキシプロゲステロ
ンへの変換には、２つのタンパク質が関与する：ステロ
イド１７α−ヒドロキシラーゼ（Ｐ450 １７α、ヘム−
Ｆ含有タンパク質）及びＮＡＤＰＨチトクロームＰ450
リダクターゼ（ＲＥＤ、ＦＡＤ及びＦＭＮ含有タンパク
質）。この反応はプロゲステロン、分子状酸素及びＮＡ
ＤＰＨを消費する。１７α−ヒドロキシプロゲステロン
の１７α、２１−ジヒドロキシ−４−プレグネン−３，
２０−ジオン（コルテキソロン）の変換にも２つのタン
パク質が必要とされる：ステロイド−２１−ヒドロキシ
ラーゼ（Ｐ450 Ｃ２１、ヘム−Ｆ含有タンパク質）及び
前述のタンパク質ＲＥＤ。この反応は１７α−ヒドロキ
シプロゲステロン、分子状酸素及びＮＡＤＰＨを必要と
する。コルテキソロンのヒドロコルチゾンへの変換には
３つのタンパク質が関与する：ステロイド１１β−ヒド
ロキシラーゼ（Ｐ450 １１β）、ヘム−Ｆ含有タンパク
質及び上記タンパク質ＡＤＸ及びＡＤＲである。
【０００５】上述したごとく、チトクロームＰ450 タン
パク質はコレステロールのヒドロコルチゾンへの生化学
的変換に必須の酵素である。これらの酵素はより大きな
グループであるチトクロームＰ450 タンパク質（または
単にＰ450 タンパク質）に属する。これらは原核生物
（種々の細菌）及び真核生物（酵母、カビ、植物及び動
物）中に存在する。哺乳類では、高レベルのＰ450 タン
パク質が副腎皮質、卵巣、精巣及び肝臓に見い出され
る。これらのタンパク質の多くは今日、精製され良く特
徴付けがされている。これらの特異的活性も決定されて
いる。この主題について最近Ｋ．ラックポール（Ruckpa
ul）及びＨ．レイン（Rein）編「チトクロームＰ450 」
（“Cytochrome Ｐ450 ”）及びＰ．Ｒ．オルティズ・
デ・モンテラノ（Ortiz de Montellano)編「チトクロー
ムＰ450 、構造、メカニズム及び生化学」（“Cytochro
me Ｐ450 、Structure, Mechanism and Diochemistry
”）等のいくつかの概説が発表された。チトクローム
Ｐ450 タンパク質は一酸化炭素による還元後の４５０nm
でのそれらの特異的吸収極大によって特徴づけられる。
原核生物においては、Ｐ450 タンパク質は膜結合性（me
mbrane bound）かまたは細胞血漿質性（cytoplasmatic)
である。細菌性Ｐ450 タンパク質（例えばＰ450meq 及
びＰ450 cam)を詳細に研究した限りでは、フェレドキシ
ン及びフェレドキシンリダクターゼがヒドロキシル化活
性に関与する。真核生物では、２つのタイプのＰ450 タ
ンパク質、Ｉ及びIIが記述されている。これら２つの違
いは、 1. 亜細胞局在性、タイプＩはミクロソーム画分に局在
し、タイプIIはミトコンドリアの内膜に局在する； 2. 電子がＰ450 タンパク質に伝達される方法、タイプ
ＩはＰ450 リダクターゼの作用でＮＡＤＰＨにより還元
され、タイプIIはフェロドキシンリダクターゼ（例えば
アドレノドキシンリダクターゼ）及びフェレドキシン
（例えばアドレノドキシン）の作用下ＮＡＤＰＨによっ
て還元される。
【０００６】ヨーロッパ特許公開（ＥＰ−Ａ）第０２８
１２４５号によるとチトクロームＰ450 酵素はストレプ
トマイセス種から調製され、化合物のヒドロキシル化に
用いることができる。この酵素は単離された形態で用い
られるが、この単離は長々とした、コストを要する操作
である。日本国特開昭第６２−２３６４８５号（ダーウ
ェント８７−３３１２３４）はサッカロマイセス・セレ
ビシェ中に肝臓チトクロームＰ450 酵素の遺伝子を導入
し、それらを発現させて酸化活性について利用すること
ができる酵素を生成させることが可能であることを教示
している。しかしながら、上記文献にはチトクロームＰ
450 酵素をステロイド化合物の製造に使用する記載はな
い。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、安価なステ
ロイド出発物質のより希少で高価な最終産物への一段階
変換であって、多重度の酵素触媒及びコファクター伝達
変換（a multiplicityof enzyme-catalyzed and cofact
or-mediated conversion) を通して自然の系（native s
ystems）で行われている変換、例えばコレステロールか
らヒドロコルチゾンの生産のための多重遺伝子の構築に
必要なタンパク質の生成のための多重度の発現カセット
（expression cassettes）を提供する。本発明の発現カ
セットは、これらの多工程変換を行うための多重遺伝子
系の最終生産に有用である。かくのごとく、その一面に
おいて、本発明は異種コードＤＮＡ配列であって、単独
または付加的タンパク質と共同でコレステロールのヒド
ロキシコルチゾンへの変換のための生物学経路での酸化
工程を触媒することができる酵素をコード化するコード
配列を組換え宿主細胞中で発現するのに有効な発現カセ
ットに関する。従って、本発明の発現カセットは組換え
宿主中で以下のタンパク質を生産することができる配列
を含む：側鎖切断酵素（Ｐ450 ＳＣＣ）、アドレノドキ
シン（ＡＤＸ）、アドレノドキシンリダクターゼ（ＡＤ
Ｒ）、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ／
イソメラーゼ（３β−ＨＳＤ）、ステロイド１７α−ヒ
ドロキシラーゼ（Ｐ450 １７α）、ＮＡＤＰＨチトクロ
ームＰ450 リダクターゼ（ＲＥＤ）、ステロイド−２１
−ヒドロキシラーゼ（Ｐ450 Ｃ２１）及びステロイド１
１β−ヒドロキシラーゼＰ450 １１β）。別の面で本発
明は、これらのベクターまたは本発明の発現カセットで
形質転換された組換え宿主細胞、上記酵素の生産方法及
びこれらの酵素の酸化のための使用、該宿主細胞を培養
液中での特異的酸化のために使用する方法、及び該方法
によって製造される化合物を含有する医薬組成物に関す
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は大規模な生化学
的生産反応器で用いるのに適した細胞の製造及び培養、
及びこれらの細胞の化合物の酸化特に図１に示すステロ
イド類の生産のための使用を包含する。示された反応は
それぞれ別個に行うことができる。本発明には多工程反
応における工程の交換も含まれる。
【０００９】
【発明の実施の形態】微生物が好ましい宿主であるが、
細胞培養や生存トランスゲニック（transgenic）植物ま
たは動物の組織において任意的に用いられる植物または
動物の細胞等の他の細胞も同様に用いることができる。
本発明の細胞は適当な受容体細胞、特に適当な微生物細
胞の、側鎖切断酵素（Ｐ450 ＳＣＣ）、アドレノドキシ
ン（ＡＤＸ）、アドレノドキシンリダクターゼ（ＡＤ
Ｒ）、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ／
イソメラーゼ （３β−ＨＳＤ）、ステロイド−１７α
−ヒドロキシラーゼ（Ｐ450 １７α）、ＮＡＤＰＨチト
クロームＰ450 リダクターゼ（ＲＥＤ）、ステロイド−
２１−ヒドロキシラーゼ（Ｐ450 Ｃ２１）及びステロイ
ド−１１β−ヒドロキシラーゼ （Ｐ450 １１β）を包
含するコレステロールのヒドロコルチゾンへの変換に関
与するタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含有する
ベクターによる遺伝子形質転換によって得られる。ある
種の宿主細胞は必要なタンパク質の１以上をそれら自身
で十分な量生産することができ、その場合には補給的Ｄ
ＮＡ配列のみで形質転換しなければならない。かかる可
能性のある自己タンパク質はフェレドキシン、フェレド
キシンリダクターゼ、Ｐ450 リダクターゼ及び３β−ヒ
ドロキシステロイドヒドロゲナーゼ／イソメラーゼであ
る。
【００１０】コレステロールのヒドロコルチゾンへの変
換に関与するタンパク質をコード化する配列の取得（re
trieval)のために、適当なＤＮＡ源が選択された。コレ
ステロールのヒドロコルチゾンへの変換に関与するすべ
てのタンパク質をコード化するＤＮＡの収得に適当な源
は脊椎動物の副腎皮質組織、例えばウシ副腎皮質組織で
ある。種々の微生物からも関与するＤＮＡを取得でき
る：例えばシュードモナス・テストステロニ（testoste
roni）、ストレプトマイセス・グリセオカルネウス（gr
iseocarneus)またはブレビバクテリウム・ステロリクム
（sterolicum) から３β−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼ／イソメラーゼをコード化するＤＮＡ、クル
ブラリア・ルナタ（Curvularia lunata)またはクニンガ
メラ・ブラケスリーアナ（Cunninghamella blakesleean
a)からコルテキソロンの１１β−ヒドロキシル化に関与
するタンパク質をコード化ＤＮＡ。タンパク質ウシＰ
450ＳＣＣ、ウシＰ450 １１βもしくは微生物等価タン
パク質、ウシアドレノドキシン、ウシアドレノドキシン
リダクターゼ、ウシもしくは微生物起源の３β−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼ／イソメラーゼ、ウシ
Ｐ450 １７α、ウシＰ450 Ｃ２１、及びウシもしくは微
生物起源のＮＡＤＰＨチトクロームＰ450 リダクターゼ
をコードするＤＮＡ配列（sequences)を以下の工程に従
って単離した。
【００１１】1. 真核生物配列（ｃＤＮＡ’ｓ） ａ 適当な組織から全ＲＮＡを調製した。 ｂ ポリＡ+ 含有ＲＮＡを２本鎖ｃＤＮＡに転写し、バ
クテリオファージベクター中に連結した。 ｃ 得られたｃＤＮＡライブラリーを、目的とするｃＤ
ＮＡに特異的な32Ｐラベルオリゴマーを用いて、または
特異的(125Ｉ−ラベル）抗体を用いるイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導λ（ラ
ムダ）−gt１１ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
によってスクリーニングした。 ｄ ヌクレオチド配列決定によってｃＤＮＡの全長を確
認するため、正の（positive）プラーク形成単位（pfu'
s)のｃＤＮＡ挿入物（inserts)な適当なベクターに挿入
した。
【００１２】2. 原核生物遺伝子 ａ 適当な微生物からゲノムＤＮＡを調製した。 ｂ ＤＮＡライブラリーを得るため、ＤＮＡ断片を適当
なベクター中にクローン化し、適当なＥ．コリ宿主に形
質転換した。 ｃ 対象とする遺伝子に特異的な32Ｐラベルオリゴマー
を用いて、または特異的（ 125Ｉラベル）抗体を用いる
ＩＰＴＧ誘導λ−gt１１ＤＮＡライブラリーのスクリー
ニングによって、該ＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グした。 ｄ 陽性の（positive）コロニーのプラスミドを単離
し、サブクローン化した（subcloned)ＤＮＡ断片を適当
なベクター中に挿入して全長遺伝子を確認した。 注：改良法によれば、特定のｃＤＮＡ（真核生物配列）
または遺伝子（原核生物配列）を２つの特異的オリゴマ
ーを用い、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（サイキ（Sa
iki)ら、Science,２３９，４８７−４９１，１９８８）
として知られた方法によって増幅した。ついで増幅した
ｃＤＮＡまたはＤＮＡを適当なベクターに挿入した。
【００１３】本発明の１面によれば、前記手法により単
離された異種ＤＮＡが転写及び翻訳のための適当なコン
トロール配列の間に入れられており、該ＤＮＡが適当な
宿主の細胞環境において発現され、目的とする単一もし
くは複数のタンパク質を与えることを可能にする適当な
発現カセットが提供される。該開始コントロール配列は
任意的に分泌シグナル配列によって伴われる。適当なコ
ントロール配列は構造ＤＮＡと共に該発現カセットによ
って導入されなければならない。発現は、当面の宿主と
適合性があり、その発現が望まれるコード配列に対し作
用し得るように結合しているコントロール配列を含むベ
クターによる、適当な宿主細胞の形質転換によって可能
となる。別法として宿主ゲノムに存在する適当なコント
ロール配列が用いられる。発現は、宿主コントロール配
列が導入ＤＮＡの発現を適当にコントロールするような
方法における宿主ゲノムによる相同組換えを可能にする
宿主配列によってフランクされた（franked ）目的とす
るタンパク質配列をコードするベクターで適当な宿主細
胞を形質転換することによって可能となる。
【００１４】一般に理解されるごとく、コントロール配
列はそれらが働けるように結合するコード配列の発現の
適当な調節に必要なすべてのＤＮＡ断片、例えばオペレ
ーター、エンハンサー、及び特にプロモーター及び翻訳
を制御する配列を包含する。プロモーターはその環境を
調節することによって制御可能であっても不可能であっ
てもよい。原核生物について適当なプロモーターは例え
ばｔｒｐプロモーター（トリプトファン欠乏によって誘
導し得る）、ｌａｃプロモーター（ガラクトースアナロ
グＩＰＴＧを用いて誘導し得る）、β−ラクタマーゼプ
ロモーター、及びファージ由来Ｐ2 プロモーター（温度
変化によって誘導し得る）を包含する。さらにバチルス
における発現に特に有用なプロモーターはα−アミラー
ゼ、プロテアーゼ、Ｓpo２、spac及びφ１０５のための
プロモーター及び合成プロモーター配列を包含する。好
ましいプロモーターは図５に示すプロモーターであり、
「ＨpaII」で表す。酵母における発現に適したプロモー
ターは３−ホスホグリセレート（glycerate)キナーゼプ
ロモーター及び他の糖分解酵素のためのプロモーター、
及びアルコールデヒドロゲナーゼ及び酵素ホスファター
ゼのためのプロモーターを包含する。転写伸長因子（Ｔ
ＥＦ）及びラクターゼのためのプロモーターも適当であ
る。哺乳類発現系では一般にウイルス由来のプロモータ
ー例えばアデノウイルスプロモーター及びＳＶ４０プロ
モーターを用いるが、重金属やグルココルチコイド濃度
によって制御されるメタロチオネイン等の調節可能プロ
モーターも用い得る。ノパリンシンセターゼプロモータ
ー等の植物細胞プロモーターに基づく発現系、及びウイ
ルスベース昆虫細胞発現系も適当である。
【００１５】翻訳制御配列は原核生物系ではリボソーム
結合部位（ＲＢＳ）を含み、真核細胞翻訳系はＡＵＧ等
の開始コドンを含むヌクレオチド配列によって制御でき
る。必要なプロモーター及び翻訳コード配列に加え、そ
れらの終結調節（例えば真核生物系におけるポリアデニ
ル化配列に帰結する）を含む他の種々なコントロール配
列を発現制御のため用いることができる。いくつかの系
は発現を行うのに望ましいが大抵の場合必須でないエン
ハンサー要素を含有する。本発明はまた単独でまたは１
以上の付加的タンパク質と共同で図１の経路の別の工程
を触媒する酵素をコードする、さらに別の異種コード配
列を含有する発現カセットを開示する。
【００１６】ｐＧＢＳＣＣ−ｎ（ここでｎは１〜１７の
整数である）で表される一群のベクターが特にＰ450 Ｓ
ＣＣ酵素をコードするＤＮＡのために開発されている。
ｐＧＢ１７α−ｎ（ここでｎは１〜５の整数である）で
表される別の群のベクターが特にＰ450 １７α酵素をコ
ードするＤＮＡのために開発されている。ｐＧＢＣ２１
−ｎ（ここでｎは１〜９の整数である）で表されるさら
なる群のベクターが特にＰ450 Ｃ21酵素をコードするＤ
ＮＡのために開発されている。ｐＧＢ１１β−ｎ（ここ
でｎは１〜４の整数である）で表されるさらに別の群の
ベクターが特にＰ450 １１β酵素をコードするＤＮＡの
ために開発されている。
【００１７】本発明のさらなる面によれば本発明のベク
ターを受容し、導入されたＤＮＡが発現されるのを可能
にする適当な宿主細胞が選択される。形質転換された宿
主細胞を培養すると、コレステロールからヒドロコルチ
ゾンへの変換に関与するタンパク質が細胞内容物中に出
現する。目的とするＤＮＡの存在は、ＤＮＡハイブリダ
イジング操作、ＲＮＡハイブリダイゼーションによる転
写、免疫アッセイによるそれらの出現、及び出発化合物
と生体外または生体内でインキュベーション後の酸化産
物の存在の査定によるそれらの活性によって証明でき
る。好ましい宿主は形質転換される微生物、特に細菌
（より好ましくはエシェリキア・コリ及びバチルス及び
ストレプトミセス・スピーシーズ）及び酵母（例えばサ
ッカロミセス及びクルイベロミセス（Kluyveromyces)）
である。他の適当な宿主生物はその単離された細胞を細
胞培養において用いる、ＣＯＳ細胞、Ｃ127 細胞、ＣＨ
Ｏ細胞及びスポドプテラ・フルギペルダー（Spodoptera
frugiperda)（Sfg)細胞等の昆虫を含む、植物及び動
物中に見い出される。
【００１８】組換え宿主細胞の特別のタイプは本発明の
２以上の発現カセットが導入されたもの、または少なく
とも２つの異種タンパク質をコードする発現カセットに
よって形質転換されたものであって、細胞が図１の経路
に関与する少なくとも２つのタンパク質を生産すること
を可能にするタイプである。本発明の主たる特徴は調製
された新規細胞がステロイドの究極的にヒドロコルチゾ
ンへの酸化的変換に関与するタンパク質を生産すること
ができるだけでなく、培養液に加えた対応する基質化合
物の目的とする酸化的変換においてこれらのタンパク質
を直ちに使用することもできることである。
【００１９】図１の経路に関与するタンパク質をコード
する、増殖した異種ＤＮＡの宿主細胞中における存在に
より、Ｃ１１、Ｃ１７、Ｃ３及びＣ２１でのステロール
側鎖の切断及び／または酸化的修飾を含むいくつかの生
化学的変換が起こる。従って、本発明による発現カセッ
トは図１に示した連続多段工程の連続的細胞内形質転換
を行うことができる多遺伝子系を構築するのに有用であ
る。目的とする宿主中に、必要とされるタンパク質をこ
とごとくコードする発現カセットを導入することは必要
であるかも知れない。ある場合には、経路に関与する１
以上のタンパク質が同じ活性を発揮する天然タンパク質
として宿主中にすでに存在するかも知れない。例えば、
フェレドキシン、フェレドキシンリダクターゼ及びＰ
450 リダクターゼは宿主中にすでに存在するかも知れな
い。これらの状況下では残りの酵素のみを組換え形質転
換によって供給しなければならない。
【００２０】生体内生化学的変換に対する別法として
は、コレステロールのヒドロコルチゾンへの変換に関与
するタンパク質を集め、必要程度に精製し、無細胞系で
例えばカラムに固定化してステロイドの生体外変換のた
めに用いる。別法として、経路の１以上の酵素を含有す
る多少精製した混合物をそのままステロイド変換に用い
る。１つの例示される宿主は２つのプレグネノロンの生
産に必要な２つの異種タンパク質、すなわち酵素Ｐ450
ＳＣＣ及びタンパク質ＡＤＸをコードするＤＮＡを含有
する。Ｐ450 ＳＣＣＤＮＡのみを有する宿主と比較する
とＡＤＲ、ＮＡＤＰＨ及びコレステロールを加えた後の
無細胞抽出液中のプレグネノロンの収量はかなり改善さ
れている。
【００２１】本発明はいくつかの有用なステロイドの１
工程生産プロセスの構築に必要な発現カセットを提供す
る。それは、安価で豊富に入手し得る出発化合物からス
タートしてヒドロコルチゾン及び中間化合物を生産する
のに特に適している。本発明は伝統的な高価な化学反応
を旧式化する。中間化合物は単離を必要としない。新規
宿主を除き、ステロイド変換のためのこれらの細胞培養
に用いられるプロセス自体は当分野で周知の生化学的方
法と同様である。本発明を以下の実施例によってさらに
説明するが、これらは本発明を制限するものと解すべき
でない。
【００２２】
【実施例】実施例１ ウシチトクロームＰ450 側鎖切断酵素（Ｐ450 ＳＣＣ）
をコードする全長ｃＤＮＡの分子クローニング Ｔ．マニアティス（Maniatis）らのハンドブック、Mole
cular Cloning （分子クローニング）、コールドスプリ
ングハーバー研究所、１９８２に記述された一般的クロ
ーニング技術及びＤＮＡ及びＲＮＡ分析を用いた。別に
記述がない場合、すべてのＤＮＡ修飾酵素、分子クロー
ニング媒体及びＥ．コリ菌株は販売者から購入し、製造
業者の指示に従って用いた。ＤＮＡ及びＲＮＡの分離及
び精製のための物質及び器具は供給者の指示に従って用
いた。ウシ副腎皮質組織は新たに入手したウシ腎臓から
調製し、液体窒素中で迅速凍結し、−８０℃に貯蔵し
た。凍結したウシ副腎皮質からアウフレイ（Auffrey)及
びロウギョン（Rougeon)（Eur. J. Biochem., １０７，
３０３−３１４，１９８０）に記述されたようにして全
細胞ＲＮＡを調製した。オリゴ（ｄＴ）クロマトグラフ
ィーでのポリＡ選択前に全ＲＮＡサンプルを６５℃で加
熱して副腎ポリＡ+ ＲＮＡを得た。
【００２３】ウシ副腎皮質からのポリＡ+ ＲＮＡに相補
的なＤＮＡを以下のようにして合成した：水酸化メチル
水銀で処理した１０μｇのポリＡ+ ＲＮＡをβ−メルカ
プトエタノールで中和した。この混合物を１００μｌの
最終容量において５０mMトリス／HCｌ（４２℃でｐＨ
８．３）、４０mM KCｌ、6 mM MgCｌ2 、１０mMＤＴ
Ｔ、３０００Ｕ ＲＮasin／ｍｌ、４mM Na4P2O7、５
０μｇアクチノマイシンＤ／ｍｌ、０．１ｍｇオリゴ
（ｄＴ12-18)／ｍｌ、0.５mM ｄＧＴＰ、0.５mMｄＡＴ
Ｐ、0.５mM ｄＴＴＰ、0.２５mM ｄＣＴＰ及び４００
μＣｉα32Ｐ−ｄＣＴＰ／ｍｌに調整した。混合物を氷
上に１０分置き、４２℃で２分加熱し、１５０ＵのＡＭ
Ｖ逆転写酵素（アングリアンバイオテクノロジー（ Ang
lianBiotechology）社）の添加によって合成を開始させ
た。インキュベーションは４２℃で１時間行った。
【００２４】二次鎖の合成はＤＮＡポリメラーゼ及びＲ
Ｎase Ｈを添加し、ガブラー（Gubler) 及びホフママ
（Hoffman)(Gene,２５，２６３−２６９，１９８３）に
従って行った。ｄs ＤＮＡのＴ4 ＤＮＡポリメラーゼ
（ＢＲＬ）による処理により平滑末端を得た後、該ｄs
ＤＮＡにデカマーＥcoＲＩリンカー（Biolabs 社）を連
結した。ＥcoＲＩ（ベーリンガー）で消化後、バイオゲ
ルＡ１５ｍ（バイオラッド）クロマトグラフィーによっ
て豊富なＥcoＲＩリンカーから二本鎖ｃＤＮＡ断片を分
離した。約２００ngのＥcoＲＩリンカー含有二本鎖ｃＤ
ＮＡを、消化されたＥcoＲＩ１０μｇ、及びラムダgt１
１ベクターＤＮＡ（プロメガ(promega))で処理した子牛
腸ホスファターゼ（ベーリンガー）を用いＴ4 −ＤＮＡ
リガーゼ（ベーリンガー）によってヒヌ（Huynh)ら
（「ＤＮＡ cloning techniques : A practical appr
oach」（ＤＮＡクローニング技術：実用的アプロー
チ）、４９−７８頁、オックスフォードＩＲＬプレス、
１９８５）によって記述されたようにして連結した。連
結混合物の生体外パッケージング後に得られたファージ
をＥ．コリＫ１０９０宿主（プロメガ社）を感染させる
のに用いた。
【００２５】このｃＤＮＡライブラリーから約１０6 プ
ラーク形成単位（pfu's)をウシＰ450 ＳＣＣＤＮＡ配列
に特異的な32Ｐ未満ラベル化合成オリゴマーＳＣＣ−１
（５′−ＧＧＣ ＴＧＡ ＣＧＡ ＡＧＴ ＣＣＴ Ｇ
ＡＧ ＡＣＡ ＣＴＧＧＡＴ ＴＣＡ ＧＣＡ ＣＴＧ
Ｇ−３′）を用い、モロハシら（Proc. Natl.Acad. Sc
i. USA，８１，４６４７−４６５１，１９８４）に記述
されたようにしてスクリーニングした。６つのバイブリ
ッドするpfu を得、２つの別の回の感染、平板培養（pl
ating)及びハイブリッド形成によってさらに精製した。
Ｐ450 ＳＣＣｃＤＮＡ ＥcoＲＩ挿入物をｐＴＺ１８Ｒ
（ファーマシア社）のＥcoＲＩ部位にサブクローン化し
た。クローンラムダーｇｔ１１ＳＣＣ−５４由来の、最
大のＥcoＲＩ挿入物（1.４kb）を含有するクローンｐＧ
ＢＳＣＣ−１（図２）を制限酵素マップ化及び配列決定
によってさらに分析した。
【００２６】配列データから、ｐＧＢＳＣＣ−１ＥcoＲ
Ｉ挿入物がモロハシらによって記述されたＰ450 ＳＣＣ
ｃＤＮＡ上の２５１位と１８２４位の間のＳＣＣｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列と等しいことが判明した。残りの
５′−Ｐ450 ＳＣＣｃＤＮＡヌクレオチドは、177 bp
Ｐst／Ｈind III 断片をｐＴＺ１８Ｒの適当な部位にク
ローン化し、図３に示す、モロハシらによって発表され
た１１８〜２７３位の成熟Ｐ450 ＳＣＣタンパク質をコ
ードするヌクレオチドに加え、ＳcaＩ、ＡvrII及びＳtu
Ｉに対する付加的制限部位をＰ45 0 ＳＣＣタンパク質の
予言されたアミノ酸配列に影響を与えることなく有する
ｐＴＺ／シンリード（synlead)とする。全長Ｐ450 ＳＣ
ＣｃＤＮＡは１３７２bpのＨind III ／ＫpnＩｐＧＢＳ
ＣＣ−１断片、１７７bp Ｐst／Ｈind III ｐＴＺ／シ
ンリード断片及びＰstＩ及びＫpnＩで消化したｐＴＺ１
９Ｒ ＤＮＡを含有する連結混合物のＥ．コリＪＭ１０
１ （ＡＴＣＣ３３８７６）中での分子クローニングに
よって構築した。得られた完熟ウシＰ450 側鎖切断タン
パク質をコードするすべてのヌクレオチド配列を含むプ
ラスミドｐＧＢＳＣＣ−２を図４に示す。
【００２７】実施例２ 細菌バチルス・ズブチリス中でのＰ450 ＳＣＣの構築、
形質転換及び発現 バチルス宿主でのチトクロームＰ450 ＳＣＣの発現を導
くために、Ｐ450 ＳＣＣｃＤＮＡ配列をＥ．コリ／バチ
ルスシャトルベクターｐＢＨＡ−１に移した。図５はシ
ャトルプラスミドｐＢＨＡ−１のヌクレオチド配列を示
す。プラスミドは１１−１０５及び１２１−２１５位：
バクテリオファージＦＤターミネーター（二重（doubl
e））；２２１−３０７位：プラスミドｐＢＲ３２２の
一部（すなわち２０６９−２１５３位）；３１３−７６
８位：バクテリオファージＦ１、複製の開始点（origi
n）（すなわち５４８２−５９４３位）；７７２−２５
７１位：プラスミドｐＢＲ３２２の一部、すな複製の開
始点及びβ−ラクタマーゼ遺伝子；２５７２−２６８５
位：トランスポゾンＴＮ９０３、完全ゲノム；２７１９
−２７７２位：トリプトファンターミネーター（二
重）；２７７３−３７２９位：トランスポゾンＴｎ９、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子よりなる。これらのヌクレオチドは３００５（Ａ）、
３０３８（Ｃ）、３３０２（Ａ）及び３４０９（Ａ）で
野性型ネコ（cat)コード配列と異なる。これらの変異
は、ＮcoＩ、ＢalＩ、ＥcoＲＩ及びＰvuII部位；３７３
０−３８０４位：多重クローニング部位；３８０７−７
２６４位：バチルス「ＨpaII」プロモーター、複製機能
及びカナマイシン抵抗遺伝子を含有するプラスミドｐＵ
Ｂ１１０の一部（ＥcoＲＩ−ＰvuII断片）（マッケンジ
ー（McKenzie）ら、Plasmid １５，９３−１０３、１９
８６及びマッケンジーら、Plasmid １７，８３−８５，
1987）；７２６７−７３３１位；多重クローニング部位
を除去するように導入した。断片は既知のクローン化技
術、例えばクレノーによる粘着末端の充填、アダプター
クローニング等によって結合した。すべてのデータはジ
ーンバンクR 、National Nucleic Acid Sequence Data
Bank （国立核酸配列データバンク）、ＮＩＨ、ＵＳＡ
から得た。
【００２８】ｐＧＢＳＣＣ−３は図６に示すごとくｐＢ
ＨＡ−１中の適当な部位中へのｐＧＢＳＣＣ−２（実施
例１に記述）のＫpnＩ／ＳphＩＰ450 ＳＣＣｃＤＮＡ挿
入物のＥ．コリＪＭ１０１中での分子クローニングによ
って得た。Ｅ．コリＪＭ１０１中での分子クローニング
によって、ｐＧＢＳＣＣ−３中のＳtuＩ／ＳphＩ断片
を、ＡＴＧ開始コドンでＮdeＩ部位を有する合成誘導Ｓ
phＩ／ＳtuＩ断片 と取り替えることによってメチオニン開始コドンを導入
した。得られたプラスミドｐＧＢＳＣＣ−４を図７に示
す。「ＨpaII」バチルスプロモーターは、制限酵素Ｎde
ＩによるｐＧＢＳＣＣ−４の消化、シャトルプラスミド
のＥ．コリ部分のアガロースゲル電気泳動による分離及
び引き続いてのバチルス・ズブチリス１Ａ４０（ＢＧＳ
Ｃ １Ａ４０）受容細胞への再連結及び形質転換によ
り、Ｐ450 ＳＣＣｃＤＮＡ配列の上流に導入した。ネオ
マイシン抵抗性コロニーを分析し、プラスミドｐＧＢＳ
ＣＣ−５（図８）を得た。ウシＰ450 ＳＣＣの発現を、
１０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含有するＴＳＢ培地
（ギブコ（Gibco)社）に３７℃で一夜培養した菌体タン
パク質画分を調製して研究した。約５．１０6 菌体を含
有する１００μｌ培養物の菌体を遠心分離によって回収
し、１０mMトリス／HCｌ pH 7.５に再懸濁した。溶菌は
リゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１５分イ
ンキュベートすることによって行った。0.２ｍｇのＤＮ
ase ／ｍｌを用い３７℃で５分間処理した後、混合物を
レムリ（Laemmli)、Nature２２７，６８０−６８５、１
９７０に記述された方法に従って１×ＳＢバッファーに
最終容量200μｌで調整した。１００℃で５分間加熱し
た後、１５μｌの混合物を7.５％のＳＤＳ／ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に付した。図９（レーンＣ）に示
すごとく、Ｐ450 ＳＣＣ特異的抗体でプローブしたゲル
の免疫ブロッティング後に５３ｋＤａの帯が検出でき
た。ウシ副腎皮質組織から単離した精製Ｐ450 ＳＣＣタ
ンパク質によるウサギの免疫化によってウシＰ450 ＳＣ
Ｃ特異的抗体を得た。
【００２９】実施例３ 細菌宿主バチルス・リケニホルミスでのＰ450 ＳＣＣの
発現 Ｂ．リケニホルミス中でのウシＰ450 ＳＣＣの発現は適
当な宿主株Ｂ．リケニホルミスＴ５（ＳＢＳ４７0.８
３）のプラスミドｐＧＢＳＣＣ−５′による形質転換に
よって行った。１０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含有す
るトリプトンソイブロス（Trypton Soy Broth)（ＴＢ
Ｓ）培地（オキソイド（Oxoid)社）中で３７℃で一夜の
培養物から実施例２と同様にして調製した菌体タンパク
質画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥ及びウエスタン−ブロッティ
ングによって分析した。図９（レーンｆ）に示されるご
とく、ウシＰ450 ＳＣＣに特異的な抗体を有するニトロ
セルロースフィルターのインキュベーション後、５３ｋ
Ｄａサイズのタンパク質バンドが視覚化された。１つの
形質転換体ＳＣＣ−２０１をさらにＰ450 ＳＣＣの生体
内活性についてさらに分析した（実施例１１参照）。
【００３０】実施例４ 細菌宿主エシェリキア・コリ中でのＰ450 ＳＣＣの発現 (a) 発現カセットの構築 ウシＰ450 ＳＣＣのための適当な発現ベクターを宿主
Ｅ．コリにおいて誘導するため、ｐＴＺ１８Ｒをゾラー
（Zoller）及びスミス（Smith)(Enzymology 100,４６８
−５００，１９８３）；ゾラー及びスミス（Enzymology
１５４，３２９−３５０，１９８７）及びクラマー（Kr
amer）及びフリッツ（Fritz)(Enzymology１５４，３５
０−３６７，１９８７）に記述された部位特異的突然変
異によって突然変異した。生体外突然変異誘発実験のた
めのプラスミド及び菌外はファーマシア社から得た。
【００３１】 を有する合成誘導オリゴマーを用いてｐＴＺ１８Ｒのla
c Ｚ遺伝子のＡＴＧ開始コドンにＮdeＩ制限部位を作出
した。得られたプラスミドｐＴＺ１８ＲＮをＮdeＩ及び
ＫpnＩで消化し、全長ＳＣＣｃＤＮＡを含有するｐＧＢ
ＳＣＣ−４のＮdeＩ／ＫpnＩ ＤＮＡ断片を図１０に示
す分子クローニングによって挿入した。誘導されたプラ
スミドｐＧＢＳＣＣ−１７中のＰ450 ＳＣＣｃＤＮＡ配
列の転写はＥ．コリlac プロモーターによって駆動され
る。
【００３２】（ｂ） 宿主Ｅ．コリＪＭ１０１中でのＰ
450 ＳＣＣの発現 ｐＧＢＳＣＣ−１７をアンピシリン抵抗性コロニーを選
択することによってＥ．コリＪＭ１０１受容細胞に導入
した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＴ
Ｙ培地（脱イオン水リットルあたりバクトトリプトン
（ディフコ社）１６ｇ、酵母エキス（ディフコ社）１０
ｇ及び NaCｌ５ｇを含有）中３７℃で一夜培養物からの
形質転換体ＳＣＣ−３０１及び３０２の菌体タンパク質
画分（実施例２に記述）を調製して、チトクロームＰ
450 ＳＣＣの発現を研究した。タンパク質画分をクーマ
シーブリリヤントブルーで染色したＳＤＳ／ＰＡＧＥ
（図１１Ａ）またはウエスタンブロットで分析し、ウシ
Ｐ450 ＳＣＣに特異的な抗体でプローブした（図１１
Ｂ）。両分析ともＥ．コリＪＭ１０１コントロール株
（図１１Ａ、レーン３及び図１１Ｂ、レーン２）に存在
しない、それぞれ形質転換体ＳＣＣ−３０１及びＳＣＣ
−３０２に対して予想された長さのタンパク質（図１１
Ａ、レーン１及び２及び図１１Ｂ、レーン３及び４）を
示す。
【００３３】実施例５ 酵母クルイベロマイセス・ラクティスにおけるＰ450 Ｓ
ＣＣの構築、形質転換及び発現 （ａ）ゲネティシン（geneticin)抵抗マーカーのｐＵＣ
１９への導入 ベネッツェン（Bennetzen)及びホール（Hall)(Ｊ．Bio
l. Chem.,２５７，３０１８−３０２５，１９８２）に
記述されたと同様な、Ｓ．セレビシェからのアルコール
デヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨＩ）プロモーターの管理下
にゲネティシンに対する抵抗性を与えるＴn ５遺伝子
（ロイス（Reiss)ら、ＥＭＢＯＪ.,３，３３１７−３３
２２，１９８４）を含有するＤＮＡ断片をｐＵＣ１９
（ヤニッシュ−ペロン（Yanisch-Perron）ら、Gene, ３
３，１０３−１１９，１９８５）のＳmaＩ部位に挿入し
た。得られたプラスミドｐＵＣＧ４１８を図１２に示
す。ｐＵＣＧ４１８を含有するＥ．コリはセントラル・
ヒューロー・ボーア・シメルカルチャーズ（Centraal B
ureau Voor Schimmel-cultures）にＣＢＳ８７２．８７
の下に寄託した。
【００３４】（ｂ）発現カセットの構築 ＸbaＩ及びＨind III で切断したｐＵＣＧ４１８（実施
例５（ａ）参照）、ラクトースプロモーターを含有する
ｐＧＢ９０１（Ｊ．Ａ．ファンデンベルグ(vanden Ber
g）ら、米国特許出願第５７２，４１４号の一部継続出
願、宿主株としてクルイベロマイセス）からのＸbaＩ−
ＳalＩ断片、及びＫ．ラクティスのラクターゼ遺伝子の
３´−非コード領域の部分よりなる合成ＤＮＡを含有す
るベクターを構築した。このプラスミドｐＧＢ９５０を
図１３に示す。ｐＧＢ950 をＳalＩ及びＸhoＩで切断
し、合成ＤＮＡ SAL 1 STU 1 XHO 1 TCGACAAAAATGATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC GTTTTTACTAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT を挿入し、図１３に示すプラスミドｐＧＢＳＣＣ−６を
得た。Ｐ450 ＳＣＣコード領域を含有するｐＧＢＳＣＣ
−２（実施例１参照）からのＳtuＩ−ＥcoＲＩ断片を単
離し、粘着末端をクレノーＤＮＡポリラーゼを用いて埋
めた。この断片をＳtuＩで切断したｐＧＢＳＣＣ−６に
挿入した。正しい方向性で断片を含有するプラスミドを
ｐＧＢＳＣＣ−７（図１４参照）と名づけた。
【００３５】(c) Ｋ．ラクティスの形質転換 Ｋ．ラクティス株ＣＢＳ２３６０を６．７％（ｗ／ｗ）
酵母窒素ベース(base)（ディフコ研究所）溶液２．５ml
を含有するＹＥＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプト
ン、２％グルコース１水和物）１００ml中で増殖させ、
ＯＤ610約７とした。培養物１０mlから菌体を遠心分離
で回収し、ＴＥバッファー（１０mMトリス−ＨＣｌpH7.
５、０．１ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄し、１mlＴＥバッファ
ーに再懸濁した。等容量の０．２Ｍ酢酸リチウムを加
え、混合物を振盪水浴中３０℃で１時間インキュベート
した。ｐＧＢＳＣＣ−７１５μｇをラクターゼプロモー
ター中の唯一のＳacII部位で切断し、エタノール沈殿
し、１５μｌのＴＥバッファーに再懸濁した。このＤＮ
Ａ調製物を前インキュベートした菌体１００μｌに加
え、インキュベーションを３０分延長した。ついで等容
量の７０％ＰＥＧ４０００を加え、混合物を同じ温度で
１時間インキュベートし、４２℃で５分熱ショックを与
えた。ついでＹＥＰＤ培地１mlを加え、菌体を３０℃の
振盪水浴中で1.５時間インキュベートした。最後に菌体
を遠心分離して集め、３００μｌのＹＥＰＤに再懸濁
し、ゲネティシン３００μｇ／mlを含有するＹＥＰＤ寒
天１５mlを含有する寒天平板に散布し、使用１時間前に
Ｇ４１８を含有しないＹＥＰＤ寒天１５mlで上塗りし
た。３０℃で３日間コロニーを増殖させた。
【００３６】(d) 形質転換体の分析 形質転換体及びコントロール株ＣＢＳ２３６０をＹＥＰ
Ｄ培地中３０℃で約６４時間増殖させた。菌体を遠心分
離によって回収し、生理的食塩水( a physiological sa
lt solution)にＯＤ610 ３００で再懸濁し、ボルテック
ス（Vortex）シェーカー上最大スピードで３分間ガラス
ビーズと振盪して破砕した。菌体破片をヒアレウス・ク
リスト・ミニヒュージＧＬ．( a HearaeusChrist minif
uge GL.)中４５００rpm で１０分遠心分離して除去し
た。上清から４０μl のサンプルを取り出し、免疫ブロ
ット分析に供した（図１５Ａ、レーン３及び図１５Ｂ、
レーン４）。結果はｐＧＢＳＣＣ−７で形質転換した
Ｋ．ラクティス菌体中で予想された長さのタンパク質が
発現されたことを示している。
【００３７】実施例６ 酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるＰ450 ＳＣＣ
の構築、形質転換及び発現 (a) 発現カセットの構築 ラクターゼプロモーターを除去するため、ｐＧＢ９５０
（実施例４(b) 参照）をＸbaＩ及びＳalＩで切断し、粘
着末端をクレノーＤＮＡポリメラーゼを用いて埋め、つ
いで連結した。得られたプラスミドｐＧＢＳＣＣ−８中
ではＸbaＩ部位は破壊されているが、ＳalＩ部位は維持
されている。Ｓ．セレビシエからのイソチトクロームＣ
Ｉ（cys １）プロモーターを含有するｐＧＢ１６１
(Ｊ．Ａ．ファンデンベルグら、ＥＰ９６４３０)からＳ
alＩ断片を単離し、ＸhoＩで部分的に消化した。６７０
bpのＸhoＩ−ＳalＩ断片を単離し、ｐＧＢＳＣＣ−８の
ＳalＩ部位にクローン化した。選択されたプラスミドｐ
ＧＢＳＣＣ−９においてはcyc １プロモーターとラクタ
ーゼ遺伝子の３´非コード領域の間のＳalＩ部位は維持
されている（図１６）（Ｈind IIIで部分的に消化）。
ｐＧＢＳＣＣ−７からのＰ450 ＳＣＣコード領域を含む
ＳalＩ−Ｈind III断片をＳalＩ及びＨind III で切断
したｐＧＢＳＣＣ−９に挿入した。得られたプラスミド
ｐＧＢＳＣＣ−１０中でＰ450 ＳＣＣコード領域はcyc
１プロモーターの下流にある（図１７）。
【００３８】(b) Ｓ．セレビシエの形質転換 Ｓ．セレビシエ株Ｄ２７３−１０Ｂ（ＡＴＣＣ２５６５
７）を１００mlのＹＥＰＤ中３０℃で一夜増殖させ、新
鮮培地で１：１００００に希釈し、ＯＤ61 0 ６まで増殖
させた。培養物１０mlから遠心分離によって菌体を集
め、５mlのＴＥバッファーに懸濁した。遠心分離によっ
て菌体を再度回収し、ＴＥバッファー１mlに懸濁し、
０．２Ｍ酢酸リチウム１mlを加えた。菌体を３０℃の振
盪水浴中１時間インキュベートした。１５μｇのｐＧＢ
ＳＣＣ−１０をcyc １プロモーター中の唯一のＭluＩ部
位で切断し、エタノール沈殿し、１５μl のＴＥに再懸
濁した。このＤＮＡ調製物を前インキュベートした酵母
菌体１００μl に加え、３０℃で３０分インキュベート
（振盪）した。７０％ＰＥＧ４０００溶液１１５μl の
添加後振盪なしにインキュベーションを６０分続けた。
ついで４２℃で５分の熱ショックを菌体に与え、１mlの
ＹＥＰＤ培地を加え、さらに振盪水浴中３０℃で１1/2
時間インキュベーションを続けた。最後に菌体を遠心分
離により回収し、３００μｌのＹＥＰＤに再懸濁し、ゲ
ネティシン（３００μｇ／ml）を含有するＹＥＰＤ寒天
平板上に散布した。コロニーを３０℃で３日間増殖させ
た。
【００３９】(c) 形質転換体の分析 形質転換体及びコントロール株をＹＥＰＬ培地（１％酵
母エキス、２％バクトペプトン、３．４８％K2HPO4、及
び９０％Ｌ−（＋）−乳酸溶液２．２％；殺菌前にpHを
２５％アンモニア溶液を用いて６．０に調整した）中３
０℃で６４時間増殖させた。さらなる分析は実施例５
(d) と同様にして行った。免疫ブロット分析はＳ．セレ
ビシエ中でのＰ450 ＳＣＣの発現を実証している（図１
５Ａ、レーン１）。
【００４０】実施例７ 酵母クルイベロマイセス・ラクティス中での前(pre−）
Ｐ450 ＳＣＣコードＤＮＡの構築、形質転換及び発現 (a) 発現カセットの構築 プラスミドｐＧＢ９５０（実施例５(b) 参照）をＳalＩ
及びＸhoＩで切断し、合成ＤＮＡ SAL I TCGACAAAATGTTGGCTCGAGGTTTGCCATTGAGATCCGCTTTGGTTAAGGCTTGTCC GTTTTTACAACCGAGCTCCAAACGGTAACTCTAGGCGAAACCAATTCCGAACAGG ACCAATCTTGTCCACTGTTGGTGAAGGTTGGGGTCACCACAGAGTTGGTACTGGTGAAGG TGGTTAGAACAGGTGACAACCACTTCCAACCCCAGTGGTGTCTCAACCATGACCACTTCC STU 1 XHO 1 TGCTGGTATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC ACGACCATAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT を挿入し、プラスミドｐＧＢＳＣＣ−１１（図１８）を
得た。実施例５(b) と同様にして、ｐＧＢＳＣＣ−２の
Ｐ450 ＳＣＣコード領域をＳtuＩで切断したｐＧＢＳＣ
Ｃ−１１に挿入した。正しい方向に断片を含むプラスミ
ドをｐＧＢＳＣＣ−１２（図１８）と名づけた。
【００４１】(b) Ｋ．ラクティスの形質転換及び形質
転換体の分析 ｐＧＢＳＣＣ−１２によるＫ．ラクティスの形質転換を
実施例５(c) と同様にして行った。形質転換体を実施例
５(d) と同様にして分析した。分析はＫ・ラクティスに
よるＰ450 ＳＣＣの生産を実証する（図１５Ｂ、レーン
３）。
【００４２】実施例８ 酵母サッカロミセス・セレビシエ中での前Ｐ450 ＳＣＣ
コードＤＮＡの構築、形質転換及び発現 (a) 発現カセットの構築 前Ｐ450 ＳＣＣコード領域を含有する、ｐＧＢＳＣＣ−
１２からのＳalＩ−Ｈind III （Ｈind III で部分的に
消化した）断片をＳalＩ及びＨind III で切断したｐＧ
ＢＳＣＣ−９に挿入した。得られたプラスミドをｐＧＢ
ＳＣＣ−１３と名づけた（図１９）。 (b) Ｓ．セレビシエの形質転換及び形質転換体の分析 Ｓ．セレビシエ株Ｄ２７３−１０Ｂを実施例６(b) と同
様にしてｐＧＢＳＣＣ−13で形質転換した。形質転換体
を実施例５(c) と同様にして分析した。図15ｃ（レーン
３）に示した結果はＳ．セレビシエによるＰ450 ＳＣＣ
の発現を実証する。１つの形質転換体ＳＣＣ−１０５を
Ｐ450 ＳＣＣの生体外活性についてさらに分析した（実
施例１２参照）。
【００４３】実施例９ サッカロミセス・セレビシエからのチトクロームオキシ
ダーゼVIの前領域（pre-region) に融合させたＰ450 Ｓ
ＣＣ配列のクルイベロマイセス・ラクティス中での構
築、形質転換及び発現 (a) 発現カセットの構築 プラスミドｐＧＢ９５０（実施例６(b) 参照）をＳalＩ
及びＸhoＩで切断し、合成ＤＮＡ SAL I TCGACAAAAATGTTGTCTCGAGCTATCTTCAGAAACCCAGTTATCAACAGAACTTTGTT GTTTTTACAACAGAGCTCGATAGAAGTCTTTGGGTCAATAGTTGTCTTGAAACAA GAGAGCTAGACCAGGTGCTTACCACGCTACTAGATTGACTAAGAACACTTTCATCCAATC CTCTCGATCTCGTCCACGAATGGTGCGATGATCTAACTGATTCTTGTGAAAGTAGGTTAG STU 1 XHO 1 CAGAAAGTACATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC GTCTTTCATGTAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT を挿入してプラスミドｐＧＢＳＣＣ−１４を得た。
【００４４】チトクロームオキシダーゼVI（ＣＯＸ V
I）前配列からのアミノ酸配列はライト（Wright）ら(J.
Biol. Chem.,２５９，１５４０１−１５４０７、198
4）らの論文から得た。好ましい酵母コドンを用いる合
成ＤＮＡをデザインした。ｐＧＢＳＣＣ−２のＰ450 Ｓ
ＣＣコード領域を実施例５(b) におけると同様にしてＳ
tuＩで切断したｐＧＢＳＣＣ−１４に挿入した。ＣＯＸ
VI前配列とフレーム状態にある（in frame with)Ｐ
450 ＳＣＣコード配列を含有するプラスミドをｐＧＢＳ
ＣＣ−１５（図２０）と名づけた。
【００４５】(b) Ｋ．ラクティスの形質転換及び形質
転換体の分析 ｐＧＢＳＣＣ−１５によるＫ．ラクティスの形質転換を
実施例５(c) と同様にして行った。形質転換体を実施例
５(d) と同様にして分析した。結果（図１５Ｂ、レーン
２）はＰ450 ＳＣＣが発現されることを示す。
【００４６】実施例１０ サッカロミセス・セレビシエからのチトクロームオキシ
ダーゼVIの前領域に融合したＰ450 ＳＣＣ配列のサッカ
ロミセス・セレビシエ中での構築、形質転換及び発現 (a) 発現カセットの構築 ＣＯＸ VI前配列に融合したＰ450 ＳＣＣについてのコ
ード領域を含有する、ｐＧＢＳＣＣ−１５からのＳalＩ
−Ｈind III （Ｈind III で部分的に消化) 断片をＳal
Ｉ及びＨind III で切断したｐＧＢＳＣＣ−９に挿入し
た。得られたプラスミドをｐＧＢＳＣＣ−１６（図２
１）と名づけた。
【００４７】(b) Ｓ．セレビシエの形質転換及び形質
転換体の分析 Ｓ．セレビシエ株Ｄ２７３−１０Ｂを実施例６(b) にお
けると同様にしてｐＧＢＳＣＣ−１６で形質転換した。
形質転換体を実施例６(c) におけると同様にして分析し
た。図１５ｃ（レーン２）に示す結果はＳ．セレビシエ
中でのＰ450 ＳＣＣの発現を実証する。
【００４８】実施例１１ バチルス・リケニホルミスＳＣＣ−２０１中でのＰ450
ＳＣＣの生体内活性実施例３と同様にしてＢ．リケニホ
ルミスＳＣＣ−２０１を得た。微生物を培地Ａ１００ml
中でインキュベートした。培地Ａは以下の組成を有して
いた。 塩化カルシウム・６水和物 １ｇ 硫酸アンモニウム ５ｇ 塩化マグネシウム・６水和物 ２．２５ｇ 硫酸マンガン・４水和物 ２０mg 塩化コバルト・６水和物 １mg クエン酸・１水和物 1.６５ｇ 蒸留水 ６００ml 微量元素ストック溶液 １ml 消泡剤（ＳＡＧ５６９３） ０．５mg 微量元素ストック溶液は蒸留水リットルあたり以下の組成であった。 CuSO4 ・5H2O ０．７５ｇ H3BO3 ０．６０ｇ k1 ０．３０ｇ FeSO4(NH4)2SO4・2H2O ２７ｇ ZnSO4 ・7H2O ５ｇ クエン酸・H2O １５ｇ MnSO4 ・H2O ０．４５ｇ Na2MoO4 ・H2O ０．６０ｇ H2SO4 （９６％） ３ml
【００４９】培地を完成させるために殺菌し、３０℃に
冷却した後、蒸留水２００mlに溶解したマルトース１水
和物６０ｇ（１２０℃、２０分殺菌）、１Ｍリン酸カリ
ウムバッファー（pH６．８、１２０℃、２０分殺菌）２
００ml、蒸留水１００mlに溶解した酵母窒素ベース（Ye
ast Nitrogen base)（ディフコ社）1.７ｇ（膜濾過で無
菌化）を培地に加えた。培養菌を３７℃で６４時間増殖
させ、培養物２mlをコレステロール１０mgを含有する培
地Ａ１００ml１に植菌した。コレステロールはコレステ
ロール１０mg、テルギトール（Tergitol) TM／エタノー
ル（１：１、ｖ／ｖ）０．７５ml及びツイーン８０TM２
０μl を含有する溶液として加えた。培養菌を３７℃で
４８時間増殖させ、ついで培養物をジクロロメタン１０
０mlで抽出した。混合物を遠心分離で分離し、有機溶媒
層を回収した。この抽出操作を２回繰り返し、３×１０
０mlのジクロロメタン画分をプールした。ジクロロメタ
ンを真空蒸留により蒸発させ、乾燥抽出物（約４５０m
g）をガスクロマトグラフ−マススペクトロメーターの
組合せによりプレグネノロンについて分析した。
【００５０】ＧＣ−ＭＳ分析 乾燥抽出物から一定量を採取し、ピリジンビス−（トリ
メチルシリル）−トリフルオロアセタミド及びトリメチ
ルクロロシランの混合物を加えてシリル化した。シリル
化サンプルを、選択されたイオンモードでＧＬ−ＭＳＤ
Ｓの組合せ（カルロ・エルバ・ＭＥＧＡ５１６０−フィ
ニガンＭＡＴ３１１Ａ−クラトスＤＳ９０（CarloErba
ＭＥＧＡ５１６０−Finnigan ＭＡＴ３１１Ａ−Kratos
ＤＳ９０))によって分析した。ガスクロマトグラフィー
は以下の条件で行った：注入移動針３００℃ ；カラム
Ｍ cpsil２９ ０．２５内径df０．２μｍ、３００℃等
温で運転；ＭＳ源（ＭＳ−source）中へ直接導入。プレ
グネノロンからのイオンｍ／ｚ２９８を解像度８００で
監視することによってサンプルを分析した。この測定か
ら、宿主株Ｂ．リケニホルミスＴ５の場合にはプレグネ
ノロンは検出されなかった（検出限界１ピコグラム）
が、Ｂ．リケニホルミスＳＣＣ−２０１の場合にはプレ
グネノロンの生産が容易に監視できた。
【００５１】実施例１２ サッカロミセス・セレビシエＳＣＣ−１０５から得られ
たＰ450 ＳＣＣの生体外活性 実施例８と同様にして得られたＳ．セレビシエＳＣＣ−
１０５を培地Ｂ１００mlに植菌した。培地Ｂは蒸留水リ
ットルあたり以下の組成であった。 酵母エキス １０ｇ バクトペプトン（オキソイド（Oxoid)社） ２０ｇ 乳 酸（９０％） ２０ｇ リン酸ジカリウム ３５ｇ pH 5.5（アンモニア２５％ｗ／ｗで調整） この培養菌を３０℃で４８時間増殖させ、ついで以下の
組成よりなる培地ｃを入れた発酵槽のための植菌物とし
て用いた： 酵母エキス １００ｇ バクトペプトン（オキソイド社） ２００ｇ 乳 酸（９０％） ２２０ml リン酸水素ジカリウム ３５ｇ 蒸留水 ７８００ml pHはアンモニア（２５％）で6.０に調整し、培地を入れ
た発酵槽を殺菌した（１２０℃、１時間）。
【００５２】冷却後、蒸留水２５mlに溶解したゲネティ
シン2.４ｇを膜濾過によって滅菌し、培地に加えた。植
菌混合物を、培養液を通して３００リットル／ｈの速度
で無菌空気を通じながら、かつ４Ｎ H2SO4 及び５％ N
H4OH（蒸留水中５％ NH4OH、膜濾過で滅菌）でpHを自動
的に6.０に保ちながら、攪拌反応器（８００rpm ）中３
０℃で増殖させた。４８時間後、２０ｇ／ｈの速度で乳
酸（９０％、膜濾過により滅菌）の供給を開始した。発
酵をさらに４０時間行い、ついで遠心分離（４０００×
ｇ、１５分）によって菌体を回収した。ペレットを0.９
％（ｗ／ｗ）NaClで洗浄し、遠心分離した（４０００×
ｇ、１５分）。ペレットをリン酸バッファー（５０ m
Ｍ、pH＝7.０）で洗浄し、菌体を遠心分離（４０００×
ｇ、１５分）によって回収した。ペレットをリン酸バッ
ファー（５０ mＭ、pH＝7.０）に取り、0.5g湿重量／ml
を含有する懸濁液とした。この懸濁液をダイノミル (Dy
noR−mill) （ウィリーＡ．バコフェンマシネンファブ
リック（Willy A. BachofenMaschinen fabrik),バーゼ
ル(Basel),シュバイツ(Schweiz))で処理した。破壊され
なかった菌体を遠心分離（４０００×ｇ、１５分）によ
って除去した。無菌体抽出液（２２５０ml、１５−２０
mgタンパク質／ml）を−２０℃で貯蔵した。Ｐ450 ＳＣ
Ｃを以下の手順によりラフに精製した。融解した無菌体
抽出液５０mlから超遠心（１２５０００×ｇ、３０分）
によって粗膜画分をペレット化し、コール酸ナトリウム
１％を含有する７５ mＭリン酸カリウム溶液（pH7.０）
５０mlに再懸濁した。この分散液を０℃で１時間緩やか
に攪拌し、遠心分離した）（１２５０００×ｇ、６０
分）。得られた、可溶化膜タンパク質を含有する上清
に、少量の NH4OH溶液（６Ｎ）を加えてpHを7.０に保ち
ながら（NH4)2SO4を加えた（３０％ｗ／ｖ）。懸濁液を
０℃で２０分攪拌後、沈殿したタンパク質画分を遠心分
離（１５０００×ｇ、１０分）によって回収した。ペレ
ットを、0.１ mＭジチオスレイトール及び0.１ mＭ Ｅ
ＤＴＡを含有する１００ mＭリン酸カリウムバッファー
（pH7.０）に再懸濁して2.５mlとした。この懸濁液をゲ
ル濾過カラム（ＰＤ１０、ファーマシア）上で溶出し
て、脱塩タンパク質画分（６mg／ml）3.５mlを得、これ
をＰ450 ＳＣＣ活性についてアッセイした。
【００５３】Ｐ450 ＳＣＣ活性は本質的にドエリング
（Doering)(Methods Enzymology,15.５９１−５９６、
１９６９）の方法に基くアッセイによって求めた。アッ
セイ混合物は以下の溶液よりなっていた： 溶液Ａ（天然Ｐ450 ＳＣＣ電子供与系）：３ mＭＥＤＴ
Ａ、３mMフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭ
ＳＦ）、２０μＭアドレノドキシン及び１μＭアドレノ
ドキシンリダクターゼ（共に電子担体（carriers) 、両
者ともウシ副腎皮質から精製）、１ mＭ ＮＡＤＰＨ
（電子供与体）、及び１５ mＭグルコール−６−リン酸
及び８units/mlグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＮＡＤＰＨ再生系）を含有する１０ mＭリン酸カリ
ウムバッファー（pH7.０） 溶液Ｂ（基質）：１０％（ｖ／ｖ）テルギトール（Terg
itolR ) ＮＤ４０／エタノール（１：１、ｖ／ｖ）中３
7.５μＭのコレステロール（〔２６、２７−14Ｃ〕コレ
ステロール（４０Ci/mol) 及び〔７α− 3Ｈ〕コレステ
ロール（４００Ci/mol）で２重に放射ラベル）のミセル
【００５４】溶 液 ７５μl の溶液Ａと５０μl の溶液Ｂ及び１２５μl の
粗に精製したＰ450 ＳＣＣ画分（または参照としてのバ
ッファー）とを混合してアッセイを開始させた。混合物
を３０℃で緩やかに攪拌した。0.３０及び１８０分後に
サンプル（５０μl ）を取り出し、水１００μl で希釈
した。メタノール（１００μl ）及びクロロホルム（１
５０μl ）を希釈サンプルに加えた。抽出及び遠心分離
（５０００×ｇ、２分）後、クロロホルム層を回収し、
乾燥した。乾燥残渣をステロイド混合物（コレステロー
ル、プレグネノロン及びプロゲステロン（１：１：１、
ｗ／ｗ／ｗ））0.５mgを含有する５０μl のアセトンに
溶解し、ついで濃ギ酸１１０μl を加えた。懸濁液を１
２０℃で１５分過熱した。ついで14Ｃ／ 3Ｈ比を２重ラ
ベル液体シンチレーション計測によって求めた。14Ｃラ
ベル化側鎖は過熱操作中イソカプリル酸として混合物か
ら蒸発するので、この比は側鎖切断反応の直接の指標と
なる。このアッセイにより、Ｓ．セレビシエＳＣＣ−１
０５から粗精製されたＰ450ＳＣＣ画分が側鎖切断活性
を示すことが見い出された。３時間のインキュベーショ
ンによって４５％のコレステロールが変換されていた。
薄層クロマトグラフィーによって、反応生成物はプレグ
ネノロンと同定された。
【００５５】実施例１３ ウシチトクロームＰ450 ステロイド１７α−ヒドロキシ
ラーゼ（Ｐ450 17α）をコードする全長ｃＤＮＡの分子
クローニング 実施例１に記述したウシ副腎皮質ｃＤＮＡライブラリー
の約１０6 のpfu's を、Ｐ450 １７αｃＤＮＡに特異的
な２つの32Ｐ末端ラベル化合成オリゴマーでスクリーニ
ングすることによりＰ450 １７αｃＤＮＡについて選択
した。オリゴマー１７α−１（５′−ＡＧＴ ＧＧＣ
ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＧＧ ＡＣＧ ＣＣＣ ＡＧＡ Ｇ
ＡＡ ＴＴＣ−３′）及びオリゴマー１７α−２（５′
−ＧＡＧＧＣＴ ＣＣＴ ＧＧＧ ＧＴＡ ＣＴＴ Ｇ
ＧＣ ＡＣＣ ＡＧＡ ＧＴＧＣＴＴ ＧＧＴ−３′）
はズバー（Zuber)ら（J. Biol. Chem., ２６１，２４７
５−２４８２、１９８６）に記述されたそれぞれ３４９
−３２０位及び１３９−１０４位のウシＰ450 １７αｃ
ＤＮＡ配列に相補的である。オリゴマー１７α−１によ
る選択は±１５００のハイブリッドするpfu's を明らか
にした。いくつかのハイブリッドするpfu を選択し、精
製し、予備的（preparative)ファージＤＮＡ単離のため
にスケールアップした。組換えラムダgt 1１ＤＮＡ'sの
ＥcoＲＩ挿入物をｐＴＺ１８ＲのＥcoＲＩ部位でサブク
ローン化した。１つのクローンｐＧＢ１７α−１を制限
エンドヌクレアーゼマップ化及びＤＮＡ配列決定によっ
てさらに特徴付けた。プラスミドｐＧＢ１７α−１はズ
バーラによって記述された３２０位のＥcoＲＩ部位から
１７２１位のポリアデニル化部位のＰ450 １７αの３′
部分に相補的な1.４kbのＥcoＲＩ挿入物を含有する。ｐ
ＧＢ１７α−１のマップを図２２Ａに示す。
【００５６】ｃＤＮＡライブラリーをオリゴマー１７α
−２で選択することにより８つのハイブリッドするpfu
が得られた。精製、組換えファージのスケールアップ及
びrec ラムダgt 1１ＤＮＡの単離後、ＥcoＲＩ挿入物を
ｐＴＺ１８ＲのＥcoＲＩ部位でサブクローン化した。Ｅ
coＲＩ挿入物の長さは２７０bp〜1.５kbp に亘ってい
た。３４５bpのＥcoＲＩ断片を含有する唯一のクローン
ｐＧＢ１７α−２をヌクレオチド配列決定によってさら
に調べ、ズバーらによって発表されたＰ450 １７αｃＤ
ＮＡ配列と比較した。図２２（Ｂ）に示すごとく、ｐＧ
Ｂ１７α−２中のＰ450 １７αｃＤＮＡ配列は予見され
た４７位のＡＵＧ開始コドンの７２bp上流から始まり、
ズバーらによって記述された３２０位のＥcoＲＩ部位ま
でＰ450 １７αｃＤＮＡの５′部分と完全な相同性を示
す。ｐＧＢ１７α−１の部分的ＥcoＲＩ消火物及び３４
５bpのｐＧＢ１７α−２のＥcoＲＩ断片を含有する連結
混合物のＥ．コリＪＭ１０１中での分子クローンニング
によって全長ウシＰ450 １７αｃＤＮＡを構築した。得
られたクローンｐＧＢ１７α−３は全長のウシＰ450 １
７αｃＤＮＡを含有し、図２２（Ｃ）に示す。
【００５７】実施例１４ 酵母クルイベロマイセス・ラクティス中への全長Ｐ450
１７αｃＤＮＡの構築及び性質転換 (a) 発現ベクターの構築 酵母宿主中でウシＰ450 17αについての適当な発現ベク
ターを誘導するため、ゾラー及びスミス（Methods in E
nzymol.,１００, ４６８−５００、１９８３);ゾラー及
びスミス（Methods in Enzymol.,１５４，３２９−３５
０，１９８７）及びクラマー及びフリッツ（Methods in
Enzymol.,１５４，３５０−３６７，１９８７）によっ
て記述された部位特異的突然変異誘発によってｐＧＢ１
７α−３を突然変異させた。生体外突然変異誘導実験の
ためのプラスミド及び菌株はファーマシアから得た。
【００５８】図２３に示すごとく、ＡＴＧ開始コドンの
すぐ上流の９bpを、合成オリゴマー１７α−３ SAL 1 5′-TCTTTGTCCTGACTGCTGCCAGTCGACAAAAATGTGGCTGCTC-３′ を用いて変化させてＳalＩ制限部位及び最適酵母翻訳シ
グナルを得た。得られたプラスミドｐＧＢ１７α−４を
ＳalＩ及びＳmaＩで消化した。全長のＰ450 １７αｃＤ
ＮＡを含有するＤＮＡ断片をゲル電気泳動によって分離
し、単離し、Ｅ．コリＪＭ１０１中での分子クローニン
グによってｐＧＢ９５０ベクター（実施例５参照）中に
移した。このベクターをまずＸhoＩで消化し、粘着末端
をクレノーＤＮＡポリメラーゼで埋め、ついでＳalＩで
消化して図２４に示すプラスミドｐＧＢ１７α−５を得
た。
【００５９】(b) Ｋ．ラクティスの形質転換 ラクターゼプロモーター中の唯一のＳac II 部位で切断
したｐＧｂ１７α−５１５μg を用いて実施例５と同様
にしてＫ．ラクティス株ＣＢＳ２３６０を形質転換させ
た。形質転換体を宿主ゲノム中に組込まれたｐＧＢ１７
α−５配列の存在についてサザーン分析により分析し
た。ゲノム宿主ＤＮＡ中に少なくとも３つのｐＧＢ１７
α−５のコピーを含有する１つの形質転換体１７α−１
０１をＰ 450 １７αの生体内活性についてさらに分析し
た（実施例１６）。
【００６０】実施例１５ 細菌宿主バチルス・ズブチリス及びバチルス・リケニホ
ルミス中でのＰ450１７αの構築及び形質転換 (a) 発現ベクターの構築 バチルス宿主中でのウシＰ450 １７αについての適当な
発現ベクターを得るため、ｐＧＢ１７α−３を実施例１
４と同様にして部位特異的突然変異によって突然変異さ
せた。図２５に示すごとく、合成オリゴマー−１７α−
４ ５′GCT GCC ACC CAG ACC ATA TGT GGC TGC TCC T-３′ NdeI を用いてＡＴＧ開始コドンの位置にＮdeＩ制限部位を導
入した。得られたプラスミドｐＧＢ１７α−６をＥcoＲ
Ｉで部分消化した。全長Ｐ450１７αｃＤＮＡを含有す
るＤＮＡ断片をゲル電気泳動によって分離し、単離し、
図２６に示すごとくＥcoＲＩ消化ｐＢＭＡ−１ＤＮＡに
連結した。連結混合物をＥ．コリＪＭ１０１中に移すこ
とによって連結物（ligate) をクローン化してｐＧＢ１
７α−７を得た。
【００６１】(b) Ｂ．ズブチリス及びＢ．リケニホルミ
スの形質転換 制限酵素ＮdeＩによるｐＧＢ１７α−６の消化、アガロ
ースゲル電気泳動によるシャトルプラスミドのＥ．コリ
部分の分離及びひき続いての再連結及びＢ．ズブチリス
１Ａ４０（ＢＧＳＣ １４Ａ４０）受容細胞の形質転換
によって「ＨpaII」バチルスプロモーターをＰ450 １７
αｃＤＮＡ配列の上流に導入した。ネオマイシン抵抗性
コロニーを分析し、プラスミドｐＧＢ１７α−８（図２
７）を得た。宿主Ｂ．リケニホルミスＴ５（ＣＢＳ４７
0.８３）の形質転換をｐＧＢ１７α−８を用いて行っ
た。多くの世代後でのｐＧＢ１７α−８の制限分析によ
って明らかにされたごとく、このプラスミドは適当なバ
チルス宿主中で安定に残存する。
【００６２】実施例１６ クルイベロマイセス・ラクティス１７α−１０１中での
Ｐ450 １７αの生体内活性 Ｋ．ラクティス１７α−１０１は実施例１４におけると
同様にして得た。この微生物を培地Ｄ１００mlに植菌し
た。培地Ｄは蒸留水リットルあたり以下の組成 を含んでいた： 酵母エキス（ディフコ社） １０ｇ バクトペプトン（オキソイド社） ２０ｇ デキストロース ２０ｇ
【００６３】滅菌及び３０℃への冷却後、蒸留水４０ml
中に溶解した酵母窒素ベース（Yeast Nirtogen Source)
（ディフコ社）2.６８ｇ（膜濾過で滅菌）及び蒸留水１
ml中に溶解したネオマイシン５０mg（膜濾過で滅菌）を
培地に加えた。ついでジメチルホルムアミド1.５mlに溶
解したプロゲステロン５０mgを培地１００mlに加えた。
培養菌を３０℃で１２０時間増殖し、ついで培養液５０
mlをジクロロメタン５０mlで抽出した。混合物を遠心分
離し、有機溶媒層を分離した。ジクロロメタンを真空蒸
留で蒸発させ、乾燥抽出物（約２００mg）クロロホルム
0.５mlに取った。この抽出物は薄層クロマトグラフィー
に示されるごとく１７α−ヒドロキシプーゲステロンを
含有していた。化合物の構造をＨ−ＮＭＲ及び13Ｃ−Ｎ
ＭＲで確認した。ＮＭＲ分析はまた抽出物中の１７α−
ヒドロキシプロゲステロン／プロゲステロン比が約0.３
であることを示した。
【００６４】実施例１７ ウシチトクロームｐ450 ステロイド２１−ヒドロキシラ
ーゼ（Ｐ450 Ｃ２１）をコードする全長ｃＤＮＡの分子
クローニング実施例１と同様にして調製した約１０6 pf
u's のウシ副腎皮質ｃＤＮＡライブラリーを32Ｐ末端ラ
ベル化オリゴ（２１−１とハイブリッドさせた。配列
５′−ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＧＴ ＡＡ
Ｇ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＡＴＴＣ−３′を含有するこ
のオリゴは、ヨシオカから（J. Biol. Chem., ２６１，
４１０６−４１０９、１９８６）に記述されるごとく、
Ｐ450 Ｃ２１ｃＤＮＡ配列中にＥcoＲＩ部位の下流に位
置するウシＰ450 Ｃ２１に対する特異的プローブであ
る。このスクリーニングにより１つのハイブリッドする
pfu が得られた。この組換えラムダgt 1１ＤＮＡのＥco
ＲＩ挿入物をｐＴＺ１８ＲのＥcoＲＩ部位でサブクロー
ン化し、ｐＧＢＣ２１−１と名づけた構築物を得た。図
２８に示すごとく、このプラスミドはヨシオカらに記述
された、４８９位でのＥcoＲＩ部位からポリアデニル化
部位からポリアデニル化部位に至るＰ450 Ｃ２１ｃＤＮ
Ａ配列に相補的な1.５３kbのＥcoＲＩ挿入物を含有する
（ヌクレオチド配列決定によった）。
【００６５】Ｐ450 Ｃ２１ｃＤＮＡの残余の５′部分
（４９０bp）を単離するため、唯１つの修飾を加えた実
施例１の手法に従って新規ウシ副腎皮質ｃＤＮＡライブ
ラリーを調製した。最初のｃＤＮＡ鎖合成のためのプラ
イマーとしてオリゴマーＣ２１−２を追加して加えた。
ヌクレオチド配列５′−ＡＡＧ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＡ
Ａ ＴＴＣ−３′を有するオリゴマーＣ２１−２は５０
４から４９０位のＰ450Ｃ２１ｃＤＮＡのＥcoＲＩ部位
の下流に位置している。Ｐ450 Ｃ２１に特異的な配列
５′−ＣＴＴ ＣＣＡ ＣＣＧ ＧＣＣ ＣＧＡＴＡＧ
ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＧＣ ＧＣＣ ＡＣＴ ＧＡＧ−
３′を含有する 32Ｐ末端ラベル化オリゴマーＣ２１−３
（７２から３７位）によるこのｃＤＮＡライブラリーの
スクリーニングは約１００個のハイブリッドするpfu を
明らかにした。唯一つの組換えラムダgt 1１ＤＮＡのＥ
coＲＩ挿入物をｐＴＺ１８ＲのＥcoＲＩ部位でサブクロ
ーン化し、ｐＧＢＣ２１−２と名づけた構築物を得た。
このプラスミド（図２８）はヌクレオチド配列決定によ
って明らかにされた、−５０位から４８９位のＥcoＲＩ
部位までのＰ450 Ｃ２１ｃＤＮＡ配列に相補的な５４０
bpの挿入物を含有する。
【００６６】実施例１８ Ｐ450 Ｃ２１ｃＤＮＡバチルス発現ベクターの構築及び
細菌宿主バチルス・ズブチリス及びバチルス・リケニホ
ルミスに対する形質転換 (a) 発現ベクターの構築 バチルス発現ベクターｐＢＨＡ−１に特異的なフランキ
ング配列を有する全長Ｐ450 Ｃ２１ｃＤＮＡを構築する
ために、Ｐ450 Ｃ２１遺伝子の５′部分を、まず鋳型と
してｐＧＢＣ２１−２及びプライマーとして２つの特異
的Ｐ450 Ｃ２１オリゴマーを用いポリメラーゼ連鎖反応
（Polymcrase Chain Reaction)（ＰＣＲ）法によって修
飾した。オリゴマーＣ２１−４（５′−ＣＴＧ ＡＣＴ
ＧＡＴＡＴＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＴＣ ＣＴＣ Ｇ
ＣＡ ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＴＧ−３′）は１から２１位
までのＣ２１配列に相補的な２１のヌクレオチド及びＥ
coＲＶ制限部位及びＡＴＧ開始コドンでのＮdeＩ制限部
位を作出するための１８の追加の塩基を含有する。オリ
ゴマーＣ２１−５（５′−ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＡ Ｔ
ＴＣ ＣＴＴ ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＧＴ ＣＡＣ−
３′）は４８９位でのＥcoＲＩ部位の上流のマイナス鎖
に相補的な２１の塩基である。
【００６７】ＰＣＲはサイキら（Science ２３９，４８
７−４９１，１９８８）によって記述てされた方法に若
干の修飾を付して行った。ＰＣＲは５０ mＭ ＫＣl 、
１０mＭトリス−ＨＣl pH 8.3、1.５ mＭ MgCl2、0.０
１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１
μＭの各Ｃ２１プライマー及び１０ngのｐＧＢＣ２１−
２鋳型を含有する１００μl の容量中で行った。変性
（１００℃、７分）及び２ＵのＴaqポリメラーゼ（シー
タス社）の添加後、反応混合物をＤＮＡ増幅装置（ＤＮ
Ａ−amplifier apparatus)（パーキン・エルマー社）
（Perkin-Elmer) 中２５回の増幅サイクル（各５５℃２
分、７２℃３分、９４℃１分）に付した。最後のサイク
ルにおいては変性工程を省いた。このＰ450 Ｃ２１ｃＤ
ＮＡ増幅の概略図を図２９に示す。
【００６８】増幅した断片をＥcoＲＶ及びＥcoＲＩで消
化し、分子クローニングによってｐＳＰ７３（プロメガ
（Promega)社）の適当な部位に挿入した。得られたプラ
スミドをｐＧＢＣ２１−３と名づけた。図３０に示すご
とく、ｐＧＢＣ２１−１の３′Ｐ450 Ｃ２１−ＥcoＲＩ
断片をｐＧＢＣ２１−３のＥcoＲＩ部位に正しい方向に
挿入した。得られたベクターｐＧＢＣ２１−４をＥcoＲ
Ｖ及びＫpnＩ社はｐＳＰ７３の多量（multiple) クロー
ニング部位に位置している）で消化し、全長Ｐ 450 Ｃ２
１ｃＤＮＡを含有する断片をゲル電気泳動によって単離
し、分子クローニングによってｐＢＨＡ−１の適当な部
位に挿入した。誘導されたプラスミドｐＧＢＣ２１−５
を図３１に示す。
【００６９】(b) バチルスの形質転換 「Ｈpa II 」バチルスプロモーターをｐＧＢＣ２１−５
の制限酵素ＮdeＩによる消化、アガロースゲル電気泳動
によるシャトルプラスミドのＥ．コリ部分の分離及び引
き続いての再連結及びＢ．ズブチリス１Ａ４０（ＢＧＳ
Ｃ１Ａ４０）受容菌体の形質転換によってＰ450 Ｃ２１
ｃＤＮＡ遺伝子の上流に導入した。ネオマイシン抵抗性
コロニーを分析してｐＧＢＣ２１−６（図３２）を得
た。ｐＧＢＣ２１−６を用いて宿主Ｂ．リケニホルミス
Ｔ５（ＣＢＳ４７0.８３）の形質転換も行った。制限分
析で明らかにされたごとく、このプラスミドは両方のバ
チルス宿主中で安定に存続する。
【００７０】実施例１９ Ｐ450 Ｃ２１ｃＤＮＡ酵母発現ベクターの構築及び酵母
宿主クルイベロマイセス・ラクティスへの形質転換 (a) 発現ベクターの構築 酵母宿主におけるウシＰ450 Ｃ２１についての適当な発
現ベクターを導くために、ｐＧＢＣ２１−２を実施例１
４におけると同様にして部位特異的突然変異によって変
異させた。この突然変異のためオリゴマーＣ２１−６
（５′−ＣＣＴＣＴＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＴＣＧ ＡＣ
Ａ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＴＣ ＣＴＣＧＣＡ ＧＧＧ−
３′）を用いて図３３に示すごとくＡＴＧ開始コドンの
上流にＳalＩ制限部位及び最適酵母翻訳シグナルを作出
した。導かれたプラスミドｐＧＢＣ２１−７のＳalＩ／
ＥcoＲＩ ＤＮＡ断片をｐＧＢＣ２１−１の３′Ｐ450
Ｃ２１−ＥcoＲＩ断片に連結し、図３４に示すごとく分
子クローニングによってｐＳＰ７３の適当な部位に挿入
した。導かれたｐＧＢＣ２１−８をＳalＩ及びＥcoＲＶ
（ＥcoＲＶ部位はｐＳＰ７３の多重クローニング部位に
存在する）で切断し、全長Ｐ450 Ｃ２１ｃＤＮＡを含有
するＤＮＡ断片を酵母発現ベクターｐＧＢ９５０に挿入
した。導かれたｐＧＢＣ２１−９を図３５に示す。 (b) Ｋ．ラクティスの形質転換 １５μg のｐＧＢＣ２１−９をＳac II で消化し、実施
例５(c) におけると同様にしてＫ．ラクティスＣＢＳ２
３６０の形質転換を行った。
【００７１】実施例２０ ウシチトクロームＰ450 ステロイド１１β−ヒドロキシ
ラーゼ（Ｐ450 11β）をコードする全長ｃＤＮＡの分子
クローニング １つの修飾を加える以外実施例１と同様にしてウシ副腎
皮質ｃＤＮＡライブラリーを調製した。ヌクレオチド配
列５′−ＧＧＣ ＡＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＡ Ｃ
ＧＡ−３′を有するP450１１β特異的プライマー（オリ
ゴマー１１β−１）を第一鎖（first strand) ｃＤＮＡ
合成の反応混合物に加えた。オリゴマー１１β−１は１
５３０から１５１３位の翻訳停止コドンのすぐ下流に位
置している。上記Ｐ450 １１βオリゴマーのヌクレオチ
ド配列及びマップ位置はモロハシら（J. Biochem. １０
２（３），５５９−５６８，１９８７）に記述されたＰ
45 0 １１βｃＤＮＡ配列データにすべて由来する。該ｃ
ＤＮＡライブラリーを32Ｐラベル化オリゴマー１１β−
２（５′−ＣＣＧ ＣＡＣ ＣＣＴ ＧＧＣ ＣＴＴ
ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＴＧＣ ＣＡＴ−３′）でス
クリーニングしたが、３６から１位のＰ450 １１βｃＤ
ＮＡの５′末端に位置している。オリゴマー１１β−２
によるスクリーニングは６つのハイブリッドするpfu を
明らかにした。これらをさらに精製し、オリゴマー１１
β−３（５′−ＣＡＧＣＴＣ ＡＡＡ ＧＡＧ ＡＧＴ
ＣＡＴ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＧＧ ＧＡＡＧＧＣ Ｔ
ＧＴ−３′、９９０から９５５位）で分析した。６つの
うち２つが32Ｐラベル化オリゴマー１１β−３と陽正の
（positive) ハイブリッドシグナルを示した。
【００７２】両１１β−ラダムgt 1１組換え体のＥcoＲ
Ｉ挿入物をｐＴＺ１８ＲのＥcoＲＩ部位にサブクローン
化した。2.２kb（ｐＧＢ１１β−１）のＥcoＲＩ挿入物
を有する１つのクローンを制限酵素マップ化によってさ
らに分析したが、これを図３６に示す。ｐＧＢ１１β−
１はモロハシらによって決定されたすべてのＰ450 １１
βｃＤＮＡコード配列を含む。
【００７３】実施例２１ Ｐ450 Ｃ２１ｃＤＮＡバチルス発現ベクターの構築及び
細菌宿主バチルス・ズブチリス及びバチルス・リケニホ
ルミスへの形質転換 (a) 発現ベクターの構築 バチルス発現ベクターｐＢＨＡ−１に対する修飾したフ
ランキング配列を有する全長Ｐ450 １１βｃＤＮＡを鋳
型としてｐＧＢ１１β−１及びブライマーとして２つの
特異的Ｐ450 １１β−オリゴマーを用いるＰＣＲ法（実
施例１８に記述）によって得た。オリゴマー１１β−４
（５′−ＴＴＴ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＡＡ ＴＴＣ Ｃ
ＡＴ ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＣ
Ｔ ＧＣＡ ＧＣＣ−３′）は７２から９３位の成熟Ｐ
450 １１βｃＤＮＡ配列に相補的な２１塩基及びＥcoＲ
Ｖ、ＥcoＲＩ及びＮdeＩ制限部位及びＡＴＧ開始コドン
を作出するための２１塩基を含有する。
【００７４】オリゴマー１１β−５（５′−ＴＡＡ Ｃ
ＧＡ ＴＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＧＧ ＴＡＣ ＣＴ
Ａ ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＧＴ
−３）は１５１１位の翻訳停止コドンの上流のマイナス
Ｐ450 １１βｃＤＮＡ鎖に相補的な２１塩基及びＥcoＲ
Ｖ、ＸhoＩ及びＫpnＩの制限部位を作出するための２１
塩基を含有する。上述の鋳型及びＰ450 １１β−プライ
マーによるＰＣＲ増幅後、増幅された断片（1.４５kb）
をＥcoＲＩ及びＫpnＩで消化し、ＥcoＲＩ及びＫpnＩで
切断したバチルス発現ベクターｐＢＨＡ−１中に分子ク
ローニングによって挿入してベクターｐＧＢ１１β−２
を得た（図３６）。
【００７５】(b) バチルスの形質転換 ＮdeＩによるｐＧＢ１１β−２の消化、アガロースゲル
電気泳動によるシャトルプラスミドのＥ．コリ部分の分
離、及び引き続いての再連結（実施例１８の手法によ
る）及びＢ．ズブチリス１Ａ４０（ＢＧＳＣ１Ａ４０）
受容菌体の形質転換によって「Ｈpa II 」バチルスプロ
モーターをＰ450 １１βｃＤＮＡ配列の上流に導入し
た。ネオマイシン抵抗性コロニーを分析し、プラスミド
ｐＧＢ１１β−３を得た。得られたプラスミドｐＧＢ１
１β−３をＢ．リケニホルミス宿主株Ｔ５（ＣＢＳ４７
0.８３）に感染させた（transmitted)。
【００７６】実施例２２ Ｐ450 １１βｃＤＮＡ酵母発現ベクターの構築及び酵母
宿主クルイベロマイセス・ラクティスへの形質転換 (a) 発現カセットの構築 酵母発現ベクターｐＧＢ９５０に対する修飾されたフラ
ンキング配列を有する全長Ｐ450 １１βｃＤＮＡを鋳型
としてｐＧＢ１１β−１及びプライとして２つの特異的
Ｐ450 １１β−オリゴマーを用いるＰＣＲ法（実施例１
８参照）によって得た。オリゴマー１１β−６（５′−
ＣＴＴ ＣＡＧ ＴＣＧ ＡＣＡ ＡＡＡ ＡＴＧ Ｇ
ＧＣ ＡＣＡ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＣ
Ｃ−３′）は７２から９３位までの成熟Ｐ450 １１βｃ
ＤＮＡ配列に相補的な２１塩基、及びＳalＩ制限部位、
最適酵母翻訳シグナル及びＡＴＧ開始コドンを作出する
ための１８の追加の塩基を含有する。オリゴマー１１β
−５は実施例２１（ａ）に記述されている。上記鋳型及
びＰ 450 １１βプライマーを用いるＰＣＲ増幅後、増幅
した断片（1.４５kb）をＳalＩ及びひＸhoＩで消化し、
ＳalＩで切断した酵母発現ベクターｐＧＢ９５０中に分
子クローニングにより挿入してベクターｐＧＢ１１β−
４を得た（図３７）。
【００７７】(b) Ｋ．ラクティスの形質転換 １５μg のｐＧＢ１１β−４をラクターゼプロモーター
中の唯一のＳac II 部位で切断し、実施例５（ｃ）と同
様にしてＫ．ラクティスＣＢＳ２３６０の形質転換を行
った。
【００７８】実施例２３ 分子クローニング及びウシアドレノドキシン（ＡＤＸ）
をコードする全長ｃＤＮＡの構築、及び引き続いての形
質転換及び酵母クルイベロマイセス・ラクティス中での
ＡＤＸｃＤＮＡの発現 (a) ＡＤＸの分子クローニング 酵母発現ベクターｐＧＢ９５０に対して修飾された５′
及び３′フランキング配列を有する全長ＡＤＸｃＤＮＡ
をＰＣＲ法（実施例１８参照）を用いる増幅によってウ
シ副腎皮質ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡプール（詳細な記述は実
施例１参照）から直接得た。ＡＤＸｃＤＮＡ増幅のため
２つの合成オリゴマープライマーを合成した。オリゴマ
ーＡＤＸ−１（５′−ＣＴＴ ＣＡＧ ＴＣＧ ＡＣＡ
ＡＡＡ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＡ
ＧＡＴ ＡＡＡ ＡＴＡ−３′）はオカムラら（Proc.
Natl. Acad. Sci.米国、８２，５７０５−５７０９，１
９８５）によって記述された、１７３−１９４位の成熟
ＡＤＸｃＤＮＡ配列の５′末端に相補的な２１塩基を含
有する。オリゴマーＡＤＸ−１はＳalＩ制限部位、最適
酵母翻訳シグナル及びＡＴＧ開始コドンを作出するため
の１８の追加配列を５′末端に含有する。
【００７９】オリゴマーＡＤＸ−２（５′−ＴＧＴ Ａ
ＡＧ ＧＴＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＴＴ ＡＴ
Ｔ ＣＴＡ ＴＣＴ ＴＴＧ ＡＧＧ ＡＧＴ Ｔ−
３′）は５６１−５４０位のＡＤＸｃＤＮＡのマイナス
鎖の３′末端に相補的であり、ＢamＨＩ、ＳmaＩ及びＫ
pnＩの制限部位を作出するための追加のヌクレオチドを
含有する。ＰＣＲは各ＡＤＸプライマー１μＭと鋳型と
しての１０μl ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ混合物（実施例１に
記述）を用い実施例１８に記述したと同様にして行っ
た。このＡＤＸｃＤＮＡ増幅の概略図を図３８に示す。
増幅された断片は制限部位分析及びヌクレオチド配列決
定によって特徴づけられた、修飾されたフランキングを
有する全長ＡＤＸｃＤＮＡ配列を含有する。
【００８０】(b) 発現ベクターの構築 増幅したＡＤＸｃＤＮＡ断片をＳalＩ及びＳmaＩで消化
し、分子クローニングによってＳalＩ及びＥcoＲＶで切
断した酵母発現ベクターｐＧＢ９５０に挿入した。得ら
れたプラスミドｐＧＢＡＤＸ−１を図３８に示す。 (c) Ｋ．ラクティスの形質転換 ｐＧＢＡＤＸ−１ １５μg をラクターゼプロモーター
中の唯一のＳac II 部位で切断し、実施例５（ｃ）と同
様にしてＫ．ラクティスＣＢＳ２３６０の形質転換を行
った。
【００８１】(d) 形質転換体の分析 ２つの形質転換体ＡＤＸ−１０１及びＡＤＸ−１０２及
びコントロール株ＣＢＳ２３６０をさらなる分析のため
選んだ。これらの株をＹＥＰＤ培地中３０℃で約６４時
間増殖させた。全菌体タンパク質を実施例５（ｄ）と同
様にして単離した。上清から８μl のサンプルを取り出
し、免疫プロット分析に付した（図３９、レーン３、４
及び５）。結果は予想された長さ（１４ｋＤａ）のタン
パク質がｐＧＢＡＤＸ−１で形質転換されたＫ．ラクテ
ィス菌体中で発現されたことを示す。形質転換体ＡＤＸ
−１０２の生体外ＡＤＸ活性を実施例２４に示す。
【００８２】実施例２４ クロイベロマイセス・ラクティスＡＤＸ−１０２から得
られたアドレノドキシンの生体外活性 実施例２３と同様にして得たＫ．ラクティスＡＤＸ−１
０２及びコントロール株Ａ．ラクティスＣＢＳ２３６０
を6.７％（ｗ／ｗ）酵母窒素ベース（ディフコラボラト
リーズ社）溶液2.５ml及びゲネティシン（Ｇ４１８硫酸
塩、ギブコ(Gibco) 社）１００mg／ｌを含有するＹＥＰ
Ｄ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコー
ス・１水和物）１００ml中３０℃で５６時間増殖させ
た。菌体を遠心分離（４０００×ｇ、１５分）によって
集菌し、生理的塩溶液に再懸濁し、リン酸バッファー
（pH7.０、５０ mＭ）で洗浄した。遠心分離（４０００
×ｇ、１５分）後、ペレットをリン酸バッファー（pH7.
０、５０ mＭ）に再懸濁し、0.５ｇ菌体湿重量／mlを含
有する懸濁液を得た。菌体をブラウン（Braun)ＭＳＫホ
モゲナイザーを用いて破砕した（６×１５秒、0.４５−
0.５０mmガラスビーズ）。未破砕菌体を遠心分離によっ
て除去した（４０００×ｇ、１５分）。無菌体抽出液
（４０mgタンパク質／ml）を−２０℃で貯蔵した。
【００８３】無菌体抽出液のＡＤＸ活性、すなわちアド
レノドキシンリダクターゼからチトクロームＰ450 ＳＣ
Ｃへの電気伝達容量をＰ450 ＳＣＣ活性アッセイによっ
て測定した。アッセイ混合物は以下の溶液よりなってい
た： 溶液Ａ（ＡＤＸを除いた天然Ｐ450 ＳＣＣ電子供与系：
３ mＭ ＥＤＴＡ、２μＭアドレノドキシンリダクター
ゼ（ウシ副腎皮質から精製）、１ mＭ ＮＡＤＰＨ（電
子供与体）、１５ mＭグルコース−６−リン酸及び１６
units/mlグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｎ
ＡＤＰＨ再生系）を含有する５０mMリン酸カリウムバッ
ファー（pH7.０） 溶液Ｂ（基体及び酵素）：１０％（ｖ／ｖ）テルギトー
ル（TergitolTM) ＮＰ４０／エタノール（１：１、ｖ／
ｖ）中７５μM コレステロール（〔２６、２７−14Ｃ〕
コレステロール（４０Ｃi ／mol)及び〔７α− 3Ｈ〕コ
レステロール（４００Ｃi ／mol)で二重に放射ラベル
化）及び1.５μM Ｐ450 ＳＣＣ（ウシ副腎皮質から精
製）のミセル溶液
【００８４】７５μl の溶液Ａと５０μl の溶液Ｂ及び
１２５μl の無菌体抽出液もしくは１２５μl の１０μ
l ＡＤＸ（ウシ副腎皮質から精製）含有リン酸カリウム
バッファー（５０ mＭ、pH7.０）とを混合してアッセイ
を開始した。混合物を緩やかに３０分攪拌した。１５分
間インキュベーション後サンプルを取り出し、１００μ
l の水で希釈した。サンプルから基質及び生成物をメタ
ノール１００μl 及びクロロホルム１５０μl で抽出し
た。遠心分離（５０００×ｇ、２分）後、クロロホルム
層を回収し、乾燥した。乾燥残渣をステロイド混合物
（コレステロール、プレグネノロン及びプロゲステロン
（１：１：１、ｗ／ｗ／ｗ））0.５mgを含有する５０μ
l のアセトンに溶解し、ついで１１０μl の濃ギ酸を加
えた。懸濁液を１２０℃で１５分加熱した。ついで14Ｃ
／ 3Ｈ比を二重ラベル液体シンチレーション計測により
求めた。14Ｃ−ラベル化側鎖は加熱操作中イソカプリル
酸として混合物から蒸発するので、この比は側鎖切断反
応の直接の指標となる。このアッセイを用いて、ＡＤＸ
電子担体（carrier)活性をＫ．ラクティスＡＤＸ１０２
の無菌体抽出液中で容易に実証できた。Ｋ．ラクティス
ＡＤＸ−１０２の無菌体抽出液または精製ＡＤＸを用い
るアッセイにおいては、コレステロールの側鎖は１５分
以内に５０％の収率で切断されたが、コレステロール株
Ｋ．ラクティスＣＢＳ２３６０の無菌体抽出液を用いる
アッセイでは側鎖切断は検出できなかった。
【００８５】実施例２５ ウシアドレノドキシンオキシドリダクターゼ（ＡＤＲ）
をコードする全長ｃＤＮＡの分子クローニング及び構
築、及びＡＤＲｃＤＮＡの酵母クルイベロマイセス・ラ
クティス中での形質転換 (a) アドレノドキシンオキシドリダクターゼの分子クロ
ーニング １つの修飾を加えた実施例１の手法によってウシ副腎皮
質ｃＤＮＡライブラリーを調製した。ヌクレオチド配列
５′−ＧＧＣ ＴＧＧ ＧＡＴ ＣＴＡ ＧＧＣ−３′
を有する追加のＡＤＲ特異的プライマー（オリゴマーＡ
ＤＲ−１）を一次鎖（the first strand) ｃＤＮＡ合成
の反応混合物に加えた。オリゴマーＡＤＲ−１は１４９
４から１４８０位の翻訳停止コドンのすぐ下流に位置し
ている。上記ＡＤＲオリゴマーのヌクレオチド配列及び
マップ位置はすべてノナカら、Biochem. Biophys. Res.
Comm.１４５（３），１２３９−１２４７，１９８７に
記述されたＡＤＲｃＤＮＡ配列データに由来する。
【００８６】得られたｃＤＮＡライブラリーを32Ｐラベ
ル化オリゴマーＡＤＲ−２（５′−ＣＡＣ ＣＡＣ Ａ
ＣＡ ＧＡＴ ＣＴＧ ＧＧＧ ＧＧＴ ＣＴＧ ＣＴ
ＣＣＴＧ ＴＧＧ ＧＧＡ−３′）を用いてスクリーニ
ングした。４つのハイブリッドするpfu を同定し、つい
で精製した。しかしながら、ＡＤＲｃＤＮＡの中程（８
４０から８０５位）に位置する１つのpfu のみがオリゴ
マーＡＤＲ−３（５′−ＴＴＣ ＣＡＴ ＣＡＧ ＣＣ
Ｇ ＣＴＴ ＣＣＴ ＣＧＧ ＧＣＧ ＡＧＣ ＧＧＣ
ＣＴＣ ＣＣＴ−３′）と陽性のシグナルを示した。
このＡＤＲｃＤＮＡ挿入物（約２kb）をｐＴＺ１８Ｒの
ＥcoＲＩ部位に分子クローン化した。得られたプラスミ
ドｐＧＢＡＤＲ−１は制限酵素マップ化及びヌクレオチ
ド配列決定から全長ＡＤＲｃＤＮＡを含有することが判
明した。ｐＧＢＡＤＲ−１の物理マップを図４０に示
す。
【００８７】(b) 発現カセットの構築 酵母発現ベクターｐＧＢ９５０に対する修飾フランキン
グ配列を有する全長ＡＤＲｃＤＮＡを鋳型としてｐＧＢ
ＡＤＲ−１及びプライマーとして２つの特異的ＡＤＲオ
リゴマーを用いるＰＣＲ法（実施例１８参照）によって
得た。オリゴマーＡＤＲ−４（５′−ＣＧＡ ＧＴＧ
ＴＣＧ ＡＣＡ ＡＡＡ ＡＴＧ ＴＣＣ ＡＣＡ Ｃ
ＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＣＣ−３′）は９６から１１
４位の成熟ＡＤＲｃＤＮＡ配列に相補的な１８塩基、及
びＳalＩ制限部位、最適酵母翻訳シグナル及びＡＴＧ開
始コドンを導入するための１８塩基を含有する。
【００８８】オリゴマーＡＤＲ−５（５′−ＣＧＴ Ｇ
ＣＴ ＣＧＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＣＡ ＧＴＧ ＣＣ
Ｃ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＣＧ ＣＡＧ−３′）は１４７
９位の翻訳停止コドンの上流のＡＤＲｃＤＮＡのマイナ
ス鎖に相補的な１８塩基、及び種々の発現ベクターの分
子クローニングのためのＫpnＩ及びＸhoＩ制限部位を作
出するための１５塩基を含有する。上記鋳型及びＡＤＲ
プライマーを用いて増幅後、増幅断片（1.４kb）をＳal
Ｉ及びＸhoＩで消化し、ＳalＩ及びＸhoＩで切断した酵
母発現ベクターｐＧＢ９５０中に分子クローニングによ
って挿入した。得られたプラスミドｐＧＢＡＤＲ−２を
図４０に示す。
【００８９】(c) Ｋ．ラクティスの形質転換 １５μg のｐＧＢＡＤＲ−２をラクターゼプロモーター
中の唯一のＳac II 部位で切断し、実施例５（ｃ）にお
けると同様にしてＫ．ラクティスＣＢＳ２３６０の形質
転換を行った。
【００９０】実施例２６ ウシＮＡＤＰＨチトクロームＰ450 リダクターゼ（ＲＥ
Ｄ）をコードする全長ｃＤＮＡの分子クローニング 実施例１に記述したウシ副腎皮質ｃＤＮＡライブラリー
を、カタガリら（J. Biochem.,１００，９４５−９５
４，１９８６）及びムラカミら（ＤＮＡ，５，１−１
０，１９８６）によって記述されたラット、ブタ及びウ
サギのＲＥＤ内の保存（conserved)アミノ酸領域に特異
的な32Ｐ−ラベル化合物オリゴマー５′−ＴＧＣ ＣＡ
Ｇ ＴＴＣ ＧＴＡ ＧＡＧ ＣＡＣ ＡＴＴ ＧＧＴ
ＧＣＧ ＴＧＧ ＣＧＧ ＧＴＴ ＡＧＴ ＧＡＴ
ＧＴＣ ＣＡＧ ＧＴ−３′を用いてスクリーニングし
た。５つのハイブリッドするpfu が得られ、制限酵素マ
ップ化及びヌクレオチド配列決定によってさらに特徴づ
けた。全長ＲＥＤｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、実
施例２、３及び６と同様にして適当な宿主に形質転換し
た。
【００９１】実施例２７ タンパク質Ｐ450 ＳＣＣ及びＡＤＸをコードする発現カ
セットの構築、形質転換及び酵母クルイベロマイセス・
ラクティス中での発現 (a) 発現カセットの構築 発現カセットｐＧＢＡＤＸ−１（実施例２３参照）をＳ
ac II 及びＨind III（部分的に）で消化し、粘着末端
をクレノーＤＮＡポリメラーゼを用いて埋めた。ラクタ
ーゼプロモーターの一部（しかし依然として機能的であ
る）、コードＡＤＸ配列及びラクターゼターミネーター
を含有するＤＮＡ断片を電気泳動によって分離、単離
し、ついでまずＸbaＩで消化により線形にし（実施例５
（ｂ）参照）、ついでその粘着末端をクレノーＤＮＡポ
リメラーゼを用いて埋めたｐＧＢＳＣＣ−７に挿入し
た。構築はそのプラスミドをＫ．ラクティスに移行させ
るのに必要な唯一つの制限部位（Ｓac II)が得られる方
法で行った。ＡＤＸ配列にフランキングな（ＡＤＸ配列
の側面に立つ）ラクターゼプロモーター中のＳac II 制
限部位は埋込み反応（the fill-in reaction) によって
破壊されるので、この唯一のＳac II 制限部位はＳＣＣ
配列にフランキングなラクターゼプロモーター配列中に
位置している。得られた発現カセットｐＧＢＳＣＣ／Ａ
ＤＸ−１はそれぞれラクターゼプロモーターによって駆
動される（driven) 、ＡＤＸのみならずＳＣＣのコード
配列を含有する。
【００９２】(b) Ｋ．ラクティスの形質転換 Ｋ．ラクティスＣＢＳ２３６０の形質転換は、唯一のＳ
ac II 制限部位で線形化した１５μg のｐＧＢＳＣＣ／
ＡＤＸ−１を用いて実施例５（ｃ）と同様にして行っ
た。ＳＣＣ及びＡＤＸ発現研究用に１つの形質転換体
（ＳＣＣ／ＡＤＸ−１０１）を選択した。
【００９３】(c) 形質転換Ｋ．ラクティスＳＣＣ／ＡＤ
Ｘ−１０１の分析 実施例５（ｄ）と同様にして、ＳＣＣ／ＡＤＸ−１０１
及びコントロール株ＣＢＳ２３６０の培養菌から菌体タ
ンパク質画分を調製し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ及びウエスタ
ンプロッティングにより分析した。プロットをＳＣＣ及
びＡＤＸにそれぞれ特異的な抗体を用いてプローブし
た。コントロール株に比べ、形質転換体ＳＣＣ／ＡＤＸ
−１０１の菌体タンパク画分は、タンパク質ＳＣＣ及び
ＡＤＸの両者の発現を示す、予想される長さ（それぞれ
５３及び１４ｋＤａ）の２つの追加のバンドを示す。形
質転換ＳＣＣ／ＡＤＸ−１０１中の両タンパク質の発現
レベルは一方のタンパク質のみを発現する形質転換体に
おいて観察されるレベルと匹敵し得る（ＳＣＣについて
図１５Ａ、レーン３、ＡＤＸについて図３９、レーン５
参照）。形質転換体ＳＣＣ／ＡＤＸ−１０１の生体外Ｓ
ＣＣ及びＡＤＸ活性を実施例２８に記述する。
【００９４】実施例２８ クルイベロマイセス・ラクティス ＳＣＣ／ＡＤＸ−１
０１から得られたＰ450 ＳＣＣ及びアドレノドキシンの
生体外活性 実施例２７と同様にして得られたＫ．ラクティスＳＣＣ
／ＡＤＸ−１０１及び実施例５（ｄ）に記述したような
コントロール株Ｋ．ラクティスＳＣＣ−１０１を１００
mg／リットルのゲネティシン（Ｇ４１８サルフェート、
ギブコ社）を含有するＹＥＰＤ培地（１％酵母エキス、
２％ペプトン、２％グルコース・１水和物）１リットル
中３０℃で７２時間増殖させた。菌体を遠心分離（４０
００×ｇ、１５分）によって集菌し、生理的塩溶液に再
懸濁し、リン酸バッファー（pH7.５、７５ mＭ）で洗浄
した。遠心分離（４０００×ｇ、１５分）後、ペレット
をリン酸バッファー（pH7.５、７５ mＭ）に再懸濁し、
0.５菌体湿重量／mlを含有する懸濁液とした。ブラウン
（Barun)ＭＳＫホモゲナイザー（６×１５秒、0.４５−
0.５０mmガラスビーズ）を用いて菌体を破砕した。未破
砕菌体を遠心分離（４０００×ｇ、１５分）によって除
去した。
【００９５】ＮＡＤＰＨ及びＡＤＲの存在下でのコレス
テロール側鎖切断反応を調べることによって、無菌体抽
出液中のタンパク質複合体Ｐ450 ＳＣＣ／ＡＤＸの活性
をアッセイした。アッセイ混合物は以下の溶液よりなっ
ていた。 溶液Ａ（ＡＤＸを除いた天然Ｐ450 ＳＣＣ電子供与
系）：３ mＭ ＥＤＴＡ、２μM アドレノドキシンリダ
クターゼ（ウシ副腎皮質から精製）、１ mＭ ＮＡＤＰ
Ｈ（電子供与体）、１５ mＭグルコース−６−リン酸及
び１６units ／mlグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＮＡＤＰＨ再生系）を含有する５０mMリン酸カリ
ウムバッファー（pH7.０） 溶液Ｂ（基質）：１０％（ｖ／ｖ）テルギトール（Terg
itolTM) ＮＰ４０／エタノール（１：１、ｖ／ｖ）中３
7.５μM コレステロール（〔２６、２７−14Ｃ〕コレス
テロール（４０Ｃi ／mol)及び〔７α− 3Ｈ〕コレステ
ロール（４００Ci／mol)) のミセル溶液
【００９６】溶液Ａ７５μl と溶液Ｂ５０μl 及び無菌
体抽出液１２５μl とを混合することにより、アッセイ
を開始させた。混合物を３０℃で緩やかに攪拌した。イ
ンキュベーション６０分後にサンプルを採取し、水１０
０μl で希釈した。サンプルから基質及び生成物をメタ
ノール１００μl 及びクロロホルム１５０μl で抽出し
た。遠心分離（５０００×ｇ、２分）後、クロロホルム
層を回収し、乾燥した。乾燥残渣をステロイド混合物
（コレステロール、プレグネノロン及びプロゲステロン
（１：１：１、ｗ／ｗ／ｗ））0.５mgを含有する５０μ
l のアセトンに溶解し、ついで１１０μl の濃ギ酸を加
えた。懸濁液を１２０℃で１５分加熱した。ついで二重
ラベル液体シンチレーション計測によって14Ｃ／ 3Ｈ比
を求めた。 14Ｃ−ラベル化側鎖は加熱操作中イソカプリ
ル酸として混合物から蒸発するので、この比は側鎖切断
反応の直接の指標となる。このアッセイを用いて、Ｋ．
ラクティスＳＣＣ／ＡＤＸ−１０１の無菌体抽出液のコ
レステロール側鎖切断活性を実証した。一方、Ｋ．ラク
ティスＳＣＣ−１０１の無菌体抽出液には活性は検出さ
れなかった。Ｋ．ラクティスＳＣＣ／ＡＤＸ−１０１の
無菌体抽出液によって生産された反応生成物はＨＰＬＣ
分析によってプレグネノロンと同定された。
【図面の簡単な説明】
すべての図面中で短縮して用いられる： Ｒ1 ＥcoＲＩ、 Ｈ Ｈind III 、 Ｓｃ
ＳcaＩ、 Ｐ ＰstＩ、 Ｋ ＫpnＩ、 Ｓｔ
ＳtuＩ、 Ｓｐ ＳphＩ、 Ｘ ＸbaＩ、 Ｎ
ＮdeＩ、 Ｓ ＳmaＩ、 Ｓｓ ＳstＩ、 Ｒｖ
ＥcoＲＶ、 ＳI ＳacＩ、 Ｂ ＢamＨＩ、 ＳII
ＳacII、 Ｓal ＳalＩ、 Ｘｈ ＸhoＩ、 Ｐｖ
ＰvuII、 Ｂｇ ＢglII、 Ｍ ＭluＩ。
【図１】哺乳類の副腎皮質で起こるコレステロールのヒ
ドロコルチゾンへの変換工程に関与するタンパク質の図
式的概観を示す。
【図２】プラスミドｐＧＢＳＣＣ−１の構造を示す。Ｐ
450 ＳＣＣ配列はボックス
【外１】
【図３】５′−Ｐ450 SCC 配列を含有する、合成的に導
かれたＰstＩ／Ｈind III 断片のプラスミドｐＴＺ１８
Ｒへの押入によるプラスミドｐＴＺシンリード（synlea
d)の取得を示す。
【図４】
【外２】 ＧＢＳＣＣ−２の取得を示す。
【図５Ａ】プラスミドｐＢＨＡ−１の完全なヌクレオチ
ド配列を示す。図５Ｂに続く。
【図５Ｂ】プラスミドｐＢＨＡ−１の完全なヌクレオチ
ド配列を示す。図５Ｃに続く。
【図５Ｃ】プラスミドｐＢＨＡ−１の完全なヌクレオチ
ド配列を示す。
【図６】ｐＧＢＳＣＣ−３の構造の図式的表示である。
プラスミドｐＧＢＳＣＣ−２からのＰ450 ＳＣＣｃＤＮ
Ａ配列をバシラス／Ｅ．コリシャトルプラスミドｐＢＨ
Ａ−１に導入した。ボックス中の表示は図４で説明した
と同様である。
【図７】ｐＧＢＳＣＣ−３のＰ450 ＳＣＣ成熟部位の前
へのＡＴＧ開始コドンと組み合わせてのＮdeＩ制限部位
の導入によるｐＧＢＳＣＣ−４の取得を示す。
【図８】プラスミドｐＧＢＳＣＣ−４からＥ．コリ配列
を除去して得られるｐＧＢＳＣＣ−５の制限酵素地図を
示す。
【図９】Ｂ．スブチリス（レーンｃ）及びＢ．リケニホ
ルミス（レーンｆ）に導入したプラスミドｐＧＢＳＣＣ
−５のＰ450 ＳＣＣ発現を実証する、抗Ｐ450 ＳＣＣ抗
体でプローブしたウェスタンブロットを示す。Ｂ．スブ
チリス及びＢ．リケニホルミスからのコントロール抽出
物はそれぞれレーンａ及びｄに示す。比較のためこれら
のコントロール抽出物に精製副腎皮質Ｐ450 ＳＣＣ（３
０ng）を加えた（それぞれレーンｂ及びｅ）。
【図１０】ｐＧＢＳＣＣ−１７構造の図式的表示であ
る。プラスミドｐＧＢＳＣＣ−４からのコードＰ450 Ｓ
ＣＣ−ＤＮＡ配列をＥ．コリ発現ベクターｐＴＺ１８Ｒ
Ｎに
【外３】
【図１１】Ｅ．コリＪＭ１０１におけるｐＧＢＳＣＣ−
１７のＰ450 ＳＣＣ発現を示す： (a) コリコントロール株（レーン３）及びＥ．コリ形
質転換体ＳＣＣ−301 及び３０２（それぞれレーン１及
び２）から調製された細胞タンパク質画分（２０μｌ）
のＳＤＳ／ＰＡＧＥ及びコマシーブリリアントブルー染
色。400 ngの精製ウシＰ450 ＳＣＣ（レーン４）を比較
に示す。 (b) コントロール株Ｅ．コリＪＭ１０１（レーン２）
及びＥ．コリ形質転換体ＳＣＣ−３０１（レーン３）及
びＳＣＣ−３０２（レーン４）から調製された細胞タン
パク質画分（５μｌ）の、抗Ｐ450 ＳＣＣ抗体でプロー
ブした、ウエスタンブロット分析。１００ngの精製ウシ
Ｐ450 ＳＣＣ（レーン１）を比較に示す。
【図１２】プラスミドｐＵＣＧ４１８の構造を示す。
【図１３】
【外４】 ーミネーターのｐＵＣＧ４１８への挿入による酵母発現
ベクターｐＧＢ９５０の構築を示す。ｐＧＢＳＣＣ−６
を誘導するため、ＡＴＧ開始コドン及びＰ450 ＳＣＣの
最初の８アミノ酸のコドンを含有する合成ＳalＩ／Ｘha
Ｉ断片をｐＧＢ９５０に挿入する。
【図１４】酵母Ｐ450 ＳＣＣ発現カセットｐＧＢＳＣＣ
−７の構造を示す図式的表示である。
【図１５】Ｐ450 ＳＣＣに対して特異的な抗体でプロー
ブしたウエスタンブロットを示す。ブロットＡはｐＧＢ
ＳＣＣ−１０（レーン１）で形質転換したサッカロマイ
セス・セレビシア２７３−１０Ｂから、コントロール
（レーン２）としてＳ．セレビシア２７３−１０Ｂか
ら、ｐＧＢＳＣＣ−７（レーン３）で形質転換したクル
イベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis)
ＣＢＳ２３６０から及びコントロール（レーン４）とし
てＫ．ラクティスＣＢＳ２３６０から得た抽出物を含有
する。ブロットＢはコントロール（レーン１）として
Ｋ．ラクティスＣＢＳ２３６０、及びｐＧＢＳＣＣ−１
５（レーン２）、ｐＧＢＳＣＣ−12（レーン３）もしく
はｐＧＢＳＣＣ−７（レーン４）で形質転換したＫ．ラ
クティスＣＢＳ２３６０から得た抽出物を含有する。ブ
ロットＣはコントロール（レーン１）としてのＳ．セレ
ビシア２７３−１０Ｂ、及びｐＧＢＳＣＣ−１６（レー
ン２）もしくはｐＧＢＳＣＣ−１３（レーン３）で形質
転換したＳ．セレビシア２７３−１０Ｂから得た抽出物
を含有する。
【図１６】Ｓ．セレビシアからのイソチトクロームＣＩ
（ｃｙｃ−１）プロモーターを含有する酵母発現ベクタ
ーｐＧＢＳＣＣ−９の構造の図式的表示である。
【図１７】Ｓ．セレビシアのための発現ベクターｐＧＢ
ＳＣＣ−１０を含有するＰ450 ＳＣＣｃＤＮＡの構造ダ
イヤグラムを示す。
【図１８】
【外５】 Ｐ450 ＳＣＣのコード配列の５′に挿入したＰ450 ＳＣ
Ｃ発現ベクターｐＧＢＳＣＣ−１２の構造を示す。
【図１９】ｐＧＢＳＣＣ−１３の構造を示す。このＳ．
セレビシア用のＰ450 ＳＣＣ発現カセットはＳ．セレビ
シアのｃｙｃ−１プロモーターの３′に位置するプレＰ
45 0 ＳＣＣｃＤＮＡ配列を含有する。
【図２０】プラスミドｐＧＢＳＣＣ−１４及びｐＧＢＳ
ＣＣ−１５の構造の図式的表示を
【外６】 して（in frame with)Ｐ450 ＳＣＣコード配列を含有す
る。
【図２１】プラスミドｐＧＢＳＣＣ−１６の構築を示
す。このプラスミドではコードＰ45 0 ＳＣＣ配列に融合
したＳ．セレビシアのチトクロームオキシダーゼＶＩプ
レ配
【外７】
【図２２】
【外８】 をそれぞれ含有するプラスミドｐＧＢ１７α−１（Ａ）
及びｐＧＢ１７α−２（Ｂ）の物理マップ（physical m
aps)を示す。全長のＰ450 １７α ｃＤＮＡ配列を含有
するｐＧＢ１７α−３（Ｃ）ではＡＴＧ開始コドンの位
置が示されている。
【図２３】生体外突然変異誘発によるｐＧＢ１７α−３
の突然変異を示す。得られたプラスミドｐＧＢ１７α−
４はＡＴＧ開始コドンのすぐ上流の最適酵母翻訳シグナ
ルが後に続くＳalＩ制限部位を含有する。
【図２４】酵母Ｐ450 １７α発現カセットｐＧＢ１７α
−５の構築の図式的概観である。
【図２５】生体外突然変異誘発によるｐＧＢ１７α−３
の突然変異を示す。
【図２６】ｐＧＢ１７α−７の構築の図式的表示であ
る。プラスミドｐＧＢ１７α−６からのＰ450 １７αｃ
ＤＮＡ配列をバチルス／Ｅ．コリシャトルプラスミドｐ
ＢＨＡ−１に導入した。
【図２７】プラスミドｐＧＢ１７α−７からのＥ．コリ
配列の除去によって得られるｐＧＢ１７α−８の物理マ
ップを示す。
【図２８】クローニングベクターｐＴＺ１８ＲのＥcoＲ
Ｉ部位内に、1.５３kb ３′−Ｐ 450 Ｃ２１ｃＤＮＡ及
び５４０bp５′−Ｐ450 Ｃ２１ｃＤＮＡＥcoＲＩ断片を
それぞれ含有するｐＧＢＣ２１−１及び２の物理マップ
を示す。
【図２９】ｐＧＢＣ２１−２のポリメラーゼ鎖反応（Ｔ
ＣＲ）によるＰ450 Ｃ２１ＡＴＣ開始コドンの上流
へのＥcoＲＶ及ＮdeＩ制限部位の導入、及び引き続いて
のクローニングベクターｐＳＰ７３への分子クローニン
グによるｐＧＢＣ２１−３の誘導による生体外突然変異
誘発を示す。
【図３０】全長のＰ450 Ｃ２１ｃＤＮＡ配列を含有する
ｐＧＢＣ２１−４の構築の図式的概観である。
【図３１】ｐＧＢＣ２１−５の構築の図式的表示であ
る。プラスミドｐＧＢＣ21−４からのＰ450 Ｃ２１ｃＤ
ＮＡ配列をバチルス／Ｅ．コリシャトルプラスミドｐＢ
ＨＡ−１に導入した。
【図３２】プラスミドｐＧＢＣ２１−５からのＥ．コリ
配列の除去によって得られたｐＧＢＣ２１−６の物理マ
ップを示す。
【図３３】生体外突然変異誘発によるｐＧＢＣ２１−２
の突然変異を示す。得られたプラスミドｐＧＢＣ２１−
７はＡＴＧ開始コドンのすぐ上流の最適酵母翻訳シグナ
ルが後に続くＳalＩ制限部位を含有する。
【図３４】酵母発現ベクター中へのクローニングに適し
た修飾フランキング（flanking）制限部位を有する全長
Ｐ450 Ｃ２１ｃＤＮＡを含有するｐＧＢＣ21−８の構築
を示す。
【図３５】酵母Ｐ450 Ｃ２１発現カセットｐＧＢＣ２１
−９の構築を示す図式的表示である。
【図３６】ｐＧＢ１１β−１のポリメラーゼ鎖反応によ
る適当なフランキング制限部位及びＡＴＧ開始コドンの
全長Ｐ450 １１βｃＤＮＡ配列への導入、及び引き続い
てのバチルス／Ｅ．コリシャトルベクターｐＢＨＡ−１
中への分子クローニングによるプラスミドｐＧＢ１１β
−２の誘導による生体外突然変異誘発を示す。
【図３７】ｐＧＢ１１β−１のポリメラーゼ鎖反応によ
る全長Ｐ450 １１βｃＤＮＡ配列への適当なフランキン
グ制限部位及びＡＴＧ開始コドンの導入、及び引き続い
ての酵母発現ベクターｐＧＢ９５０中への分子クローニ
ングによるプラスミドｐＧＢ１１β−４の誘導による生
体外突然変異誘発を示す。
【図３８】ウシ副腎皮質ポリＡ+ ＲＮＡ／ｃＤＮＡ混合
物からのＡＤＸｃＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応法による
分子クローニングの図式的概観である。成熟ＡＤＸタン
パク質をコード化するｃＤＮＡ配列を酵母発現ベクター
ｐＧＢ９５０の適当な部位に挿入してプラスミドｐＧＢ
ＡＤＸ−１を得た。
【図３９】Ｋ．ラクティスＣＢＳ２３６０形質転換体Ａ
ＤＸ−１０１及び１０２（それぞれレーン４及び５）中
のプラスミドｐＧＢＡＤＸ−１のＡＤＸ発現を実証する
抗ＡＤＸ抗体でプローブしたウエスタンブロットを示
す。コントロール株Ｋ．ラクティスＣＢＳ２３６０の抽
出物をレーン３に示す。比較のため、精製副腎皮質ＡＤ
Ｘ（１００ng）をゲルに供給した（レーン１）。
【図４０】ｐＧＢＡＤＲ−１のポリメラーゼ鎖反応によ
る全長ＡＤＲｃＤＮＡ配列への適当なフランキング制限
部位及びＡＴＧ開始コドンの導入、及び引き続いての酵
母発現ベクターｐＧＢ９５０中への分子クローニングに
よるｐＧＢＡＤＲ−２の誘導による生体外突然変異誘発
を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年４月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 33/16 Ｃ１２Ｐ 33/16 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:85） (72)発明者 セルテン ヘラルデュス コルネリス マ リア オランダ国 エヌエル−2651ハーゼット ベルケル エン ローデンレイス ステレ ンウェッヒ 81 (72)発明者 スマール エリック バスチアーン オランダ国 エヌエル−2611エヌエス デ ルフト ドゥーレンストラート 93

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酸化しようとする化合物を１以上のタン
    パク質の存在下かかる酸化及び酸化された化合物の培養
    液中への蓄積を可能にする条件の下にインキュベート
    し、ついで酸化された化合物を回収することよりなる、
    生体外選択的生化学的酸化方法であって、該タンパク質
    が請求の範囲１７または１８の方法で生産されたことを
    特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 組換え細胞を選ばれた化合物の存在下、
    目的とする酸化が起こり、酸化された化合物が培養液中
    に蓄積する条件下に培養し、ついで該酸化された化合物
    を回収することよりなる該選ばれた化合物を酸化する方
    法であって、該組換え細胞が請求の範囲１３−１６のい
    ずれか１つの組換え宿主細胞であることを特徴とする方
    法。
  3. 【請求項３】 酸化がステロール化合物の側鎖切断によ
    るプレグネノロンの生成、プレグネノロンのプロゲステ
    ロンへの変換、プロゲステロンの１７α−ヒドロキシプ
    ロゲステロンへの変換、１７α−ヒドロキシプロゲステ
    ロンのコルテキソロンへの変換及びコルテキソロンのヒ
    ドロコルチゾンへの変換よりなる群から選ばれた１つで
    ある請求の範囲１または２の方法。
  4. 【請求項４】 酸化がステロール化合物の側鎖切断によ
    るプレグネノロンの生成である請求の範囲３の方法。
  5. 【請求項５】 酸化がプロゲステロンの１７α−ヒドロ
    キシル化である請求の範囲３の方法。
  6. 【請求項６】 該群からの少なくとも２つの酸化を１つ
    の工程中で同じ基質分子に行う請求の範囲３の方法。
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