HU217411B - Eljárás szteroidok biokémiai oxidációját katalizáló enzimeket kódoló DNS-eket tartalmazó expressziós kazetták, ezeket tartalmazó transzformált sejtek és az enzimek előállítására - Google Patents

Eljárás szteroidok biokémiai oxidációját katalizáló enzimeket kódoló DNS-eket tartalmazó expressziós kazetták, ezeket tartalmazó transzformált sejtek és az enzimek előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU217411B
HU217411B HU289/89A HU328989A HU217411B HU 217411 B HU217411 B HU 217411B HU 289/89 A HU289/89 A HU 289/89A HU 328989 A HU328989 A HU 328989A HU 217411 B HU217411 B HU 217411B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
steroid
priority
scc
hydroxylase
protein
Prior art date
Application number
HU289/89A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT54413A (en
HU893289D0 (en
Inventor
Gerardus Cornelis Maria Selten
Herman Slijkhuis
Eric Bastiaan Smaal
Original Assignee
HOECHST Marion Roussel S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HOECHST Marion Roussel S.A. filed Critical HOECHST Marion Roussel S.A.
Publication of HU893289D0 publication Critical patent/HU893289D0/hu
Publication of HUT54413A publication Critical patent/HUT54413A/hu
Publication of HU217411B publication Critical patent/HU217411B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/02—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12Y106/02004—NADPH-hemoprotein reductase (1.6.2.4), i.e. NADP-cytochrome P450-reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0023—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa substituted in position 16
    • C07J5/003—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group including 16-alkylidene substitutes
    • C07J5/0038—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group including 16-alkylidene substitutes by an alkyl group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J13/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17
    • C07J13/005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17 with double bond in position 16 (17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J13/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17
    • C07J13/007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17 with double bond in position 17 (20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J21/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having an oxygen-containing hetero ring spiro-condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
    • C07J21/005—Ketals
    • C07J21/006—Ketals at position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/005—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of only two carbon atoms, e.g. pregnane derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0015—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/001—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group
    • C07J7/0015—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa
    • C07J7/002—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/001—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group
    • C07J7/004—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group substituted in position 17 alfa
    • C07J7/0045—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/008—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms substituted in position 21
    • C07J7/009—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms substituted in position 21 by only one oxygen atom doubly bound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12N9/0042—NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0095—Oxidoreductases (1.) acting on iron-sulfur proteins as donor (1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01053—3-Alpha (or 20-beta)-hydroxysteroid dehydrogenase (1.1.1.53)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15004—Steroid 11-beta-monooxygenase (1.14.15.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15006—Cholesterol monooxygenase (side-chain-cleaving) (1.14.15.6), i.e. cytochrome P450scc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/99—Miscellaneous (1.14.99)
    • C12Y114/99009—Steroid 17-alpha-monooxygenase (1.14.99.9), i.e. cytochrome-P450-steroid-17-alpha-hydroxylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y118/00—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18)
    • C12Y118/01—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.18.1)
    • C12Y118/01002—Ferredoxin-NADP+ reductase (1.18.1.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás szterőidők szelektív biőkémiai őxidációjátkatalizáló enzimeket kódőló heterőlóg DNS-eket tartalmazó expresszióskazetták, ezeket tartalmazó plazmidőkkal transzfőrmált sejtek és ezensejtek által termelt, a kőleszterin pregnenőlőnná vagy pregnenőlőnprőgeszterőnná, vagy prőgeszterőn 17a-hidrőxi-prőgeszterőnná, vagy17a- hidrőxi-prőgeszterőn kőrtexőlőnná, vagy kőrtexőlőnhidrőkőrtizőnná való szelektív biőkémiai őxidációját katalizálóenzimek előállítására, valamint eljárás szterőidők ezen enzimekkelvégzett szelektív biőkémiai őxidációjára. ŕ

Description

A találmány egy olyan biokémiai oxidációs eljárásra vonatkozik, amely gyógyászatban alkalmazott szteroidok előállítására használható.
Részletesebben kifejtve, a találmány tárgya eljárás szteroidok szelektív biokémiai oxidációját katalizáló enzimeket kódoló heterológ DNS-szekvenciákat tartalmazó expressziós kazetták, ezen expressziós kazettákat tartalmazó plazmidokkal transzformált gazdasejtek, ezen sejtek által termelt, a koleszterin hidrokortizonná való biológiai átalakítása szelektív oxidációs lépéseit - konkrétan koleszterin pregnenolonná és/vagy pregnenolon progeszteronná és/vagy progeszteron 17a-hidroxi-progeszteronná és/vagy 17a-hidroxi-progeszteron kortexolonná és/vagy kortexolon hidrokortizonná való szelektív biológiai oxidációját - katalizáló enzimek előállítására, valamint eljárás szteroidok ezen enzimek alkalmazásával végzett in vivő vagy in vitro szelektív biokémiai oxidálására.
A 11 p,17ö.,21-trihidroxi-4-pregnén-3,20-dion (hidrokortizon) olyan gyógyászatilag fontos szteroid, amelyet farmakológiai tulajdonságai alapján kortikoszteroid gyanánt használnak, és kiindulási anyagként felhasználható számos hasznos szteroid - főként más kortikoszteroidok - előállítására. A hidrokortizon a gerincesek mellékvesekérgében termelődik, és először - bár csak kis mennyiségben - mellékvesekéreg-szövetből vonták ki, vesződséges munkával. Szerkezetének felderítése után új előállítási eljárásokat fejlesztettek ki, amelyeket kémiai szintetikus lépések és mikrobiológiai konverziók kombinációja jellemez. Mivel az alkalmazott kiindulási vegyületek - ilyenek a szterolok, epesavak és szapogeninek - bőven állnak rendelkezésre és olcsók, a jelenlegi eljárások ugyan kevésbé drága terméket eredményeznek, de még mindig meglehetősen bonyolultak. A jelenlegi eljárások javítására számos lehetőséget vizsgáltak meg és biokémiai megközelítésekkel is próbálkoztak.
Az egyik kísérlet arra irányult, hogy egy olyan megfelelő kiindulási szteroid álljon rendelkezésre, amely egy in vitro biokémiai rendszerben konvertálódik. Ebben a rendszerben olyan izolált mellékvesekéreg-proteineket használtak, amelyekről tudjuk, hogy in vivő felelősek a szteroidoknak hidrokortizonná történő enzimatikus konverziójáért. Azonban e proteinek izolálásának nehézségei és a szükséges kofaktorok magas ára gátat szabott a gazdaságilag előnyös nagybani eljárásnak. Egy másik kísérletben a katalizáló proteineket természetes környezetükben tartották, hogy a mellékvesekéreg-sejtek sejttenyészetben termeljék a kívánt hidrokortizont. Azonban mivel a gyakorlatban a sejteknek alacsony volt a termelékenysége, lehetetlennek tűnt, hogy egy ilyen biokémiai eljárás gazdaságilag előnyös legyen.
Az emlősök és más gerincesek mellékvesekérgében végbemenő in vivő folyamat egy olyan biokémiai reakciósorozatból áll, amely a koleszterinnel kezdődik, és különböző intermedier vegyületeken keresztül végeredményben hidrokortizont hoz létre (lásd az 1. ábrát). Nyolc protein közvetlen szerepet játszik ebben a folyamatban, ezek közül öt enzim - ebből négy citokróm P450 enzim -, és a többi három elektronátvivő protein.
Az első lépés a koleszterinnek 3P-hidroxi-5-pregnén-20-on-ná (pregnenolon) való konverziója. Ebben a konverzióban, mely mono-oxigenáz reakció, három protein vesz részt: oldallánchasító enzim (P450SCC, ez hem-Fe-tartalmú protein), adrenodoxin (ADX, ez F2S2tartalmú protein) és adrenodoxin reduktáz (ADR, egy FAD-tartalmú protein).
A reakció a koleszterin mint szubsztrátum mellett még molekuláris oxigént és NADPH-t is igényel.
Ezután a pregnenolon dehidrogénezés/izomerizálás révén 4-pregnén-3,20-dion-ná (progeszteron) konvertálódik. Ez a reakció, amelyet a 33-hidroxi-szteroid-dchidrogenáz/izomeráz (3β-Ηδϋ) katalizál, pregnenolont és NAD+-t igényel.
A hidrokortizont úgy kapjuk meg, hogy a progeszteronhoz - egymás után három pozícióba - hidroxilcsoportot kapcsolunk, s ezeket a konverziókat monooxigenázok katalizálják. A progeszteronnak 17a-hidroxi-progeszteronná való konverziójában két protein vesz részt:
a szteroid-17a-hidroxiláz (P450 1 7a; hem-Fe-tartalmú protein) és a NADPH citokróm P45o reduktáz (RED-, FAD- és FMN-tartalmú protein). A reakció progeszteront, molekuláris oxigént és NADPH-t fogyaszt.
A 17a-hidroxi-progeszteronnak 17a,21-hidroxi-4pregnén-3,20-dion-ná (kortexolon) való konverziójához ugyancsak két protein szükséges: szteroid-21-hidroxiláz (P450C21; hem-Fe-tartalmú protein), és az előbb említett RED. A reakció 17a-hidroxi-progeszteront, molekuláris oxigént és NADPH-t fogyaszt.
A kortexolonnak hidrokortizonná való konverziójában három protein vesz részt: szteroid-1 Ιβ-hidroxiláz (Ρ4501 1β; hem-Fe-tartalmú protein) és a fent említett két protein, az ADX és ADR.
Mint fent említettük, a citokróm P450 proteinek enzimek, amelyek esszenciálisak a koleszterinnek hidrokortizonná való biokémiai konverziója szempontjából. Ezek az enzimek a citokróm P450 proteinek (vagy röviden P450 proteinek) nagy csoportjához tartoznak. Ezek megtalálhatók a prokariótákban (különböző baktériumokban) és az eukariótákban (élesztőkben, penészekben, növényekben és állatokban). Az emlősöknél a mellékvesekéregben, petefészekben, herékben és a májban nagy mennyiségben találhatók P450 proteinek.
Ma már több ilyen proteint tisztítottak és j ól j ellemeztek. Specifikus aktivitásukat meghatározták. Az utóbbi időben ebben a tárgyban számos összefoglaló közlemény jelent meg, például K. Ruckpaul és H. Rein (szerk.) „Cytochrome P450” és P. R. Ortiz de Montellano (szerk.) „Cytochrome P450, structure, mechanism and biochemistry”. A citokróm P450 proteinekre jellemző specifikus abszorpciós maximum - szén-monoxiddal való redukció után - 450 nm-nél jelenik meg. Prokarióta szervezetekben a P45o proteinek vagy membránhoz kötöttek, vagy a citoplazmában vannak. A bakteriális P45o proteinek részletes tanulmányozása során (például P450meg és P450cam) kitűnt, hogy hidroxilező hatásukban ferredoxin és ferredoxin-reduktáz vesz részt. Az eukarióta szervezeteknél két P450 proteintípust, az I és II típust írtak le. Ezek két szempontból különböznek egymástól:
HU217411 Β
1. a sejten belüli helyzetük szempontjából: az I típus a mikroszomális frakcióban helyezkedik el, a II típus a mitokondriumok belső membránjában lokalizálódik.
2. az út szempontjából, amelyen keresztül az elektronok átkerülnek a P45O proteinre: az I típust az NADPH redukálja egy P450 reduktáz révén, míg a II típust az NADPH egy ferredoxin-reduktázon (például adrenodoxin-reduktáz) és egy ferredoxinon (például adrenodoxin) keresztül redukálja.
Az EP-A-0281245 számú európai szabadalmi bejelentés szerint a P450 enzimeket Streptomyces fajokból lehet előállítani, és ezek kémiai vegyületek hidroxilezésére használhatók.
Az enzimeket izolált formában használják fel, ami meglehetősen fárasztó és költséges eljárás.
A JP-A-62236485 (Derwent 87-331234) számú szabadalmi bejelentés leírja, hogy a máj citokróm P45o enzimek génjeit be lehet vezetni a Saccharomyces cerevisiae-be, és az így kifejeződő enzimek aktivitását fel lehet használni. A transzformált sejtek egyike kifejezett egy kiméra citokróm P450 gént, amely patkánymáj citokróm P450MC amino-terminális régiójából és más citokróm P45o-ek karboxi-terminális régiójából fuzionált kiméra proteint kódol.
A Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5626-5632 (1984) közleményben John és munkatársai leírják a P450SCC proteint kódoló cDNS-ek azonosítását, valamint azt a szabályzómechanizmust, amelynek révén a trofikus hormonok irányítják a citokróm P45o ezen formájának szintézisét, de koleszterin hidrokortizonná való átalakítására irányuló kísérleteket nem végeztek.
Nonaka és munkatársai [Biochem. Bioph. Rés. Comm., 145 (3), 1239-1247 (1987)] leírják a szarvasmarha- (bovine) mellékvesekéregből származó adrenodoxin (oxido) reduktázt (ADR) kódoló teljes hosszúságú cDNS szekvenciaanalízisét, elsősorban az aminosavszekvencia meghatározása céljából. A gén gazdasejtekbe való bevitelével vagy koleszterin hidrokortizonná való átalakítására irányuló kísérletekkel azonban már nem foglalkoztak.
Okamura és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (17), 5705-5709 (1985)] szarvasmarha (bovine) adrenodoxin reduktáz (ADR) egy prekurzorának aminosavszekvenciáját meghatározták, és a cDNS klónozását is leírják, de a protein termelését vagy nem tudták megvalósítani, vagy nem is próbálkoztak vele. Mindenesetre nem közölnek erre vonatkozó adatokat vagy utalásokat.
A 33-hidroxi-szteroid-5-én dehidrogenáz és szteroid-5-én-4-én izomeráz (3β HSDH vagy 33-HSD) bifunkciós enzim, amely pregnenolont progeszteronná átalakító két független reakciót katalizál. A 42 kD molekulatömegű proteint egyetlen nyitott leolvasási keret kódolja. cDNS-eket és/vagy géneket emberből [J. Bioi. Chem., 265, 20 469-20 475 (1990); DNA Cell Bioi., 10, 701-711 (1991)], szarvasmarhából [FEBS Lett., 259, 153-157 (1989)] és patkányból [J. Bioi. Chem., 266, 583-593 (1990); J. Bioi. Chem., 266, 14 842-14 845 (1991)] klónoztak. A meghatározott N-terminális rész megfelel a kikövetkeztetett aminosavszekvenciának.
Emberben két típust írtak le: az I típusú 3β HSDH-t méhlepényből izolálták, és a bőrben is kifejeződik; a II típusú 3β HSDH-t mellékveséből és nemi mirigyekből izolálták. Az 1-4 exonok közötti homológia 77,1%, 91,8%, 94%, illetve 94%, az aminosav szinten pedig 94%. A megfelelő cDNS-ek HeLa sejtekben való kifejezése után azt találták, hogy az I típusú enzim aktívabb (Vmax/Km) pregnenolonra, dehidroepiandroszteronra (DHEA) és dihidrotesztoszteronra (DHT). Ez elsődlegesen az alacsonyabb Km - például pregnenolonra 0,241,2 μΜ-nál - következménye. A 3βΗ8ϋΗ enzimek még a mitokondriális célzószekvencia távollétében is membránasszociált proteinekként ismertek, amelyek mikroszomális, valamint mitokondriális membránokban találhatók.
Zuber és munkatársai [Science 234, 1258-1261 (1968)] közük szarvasmarha-mellékvese szteroid-17ahidroxiláz (P450 1 7a) expresszióját nem szteroidogén Cosl sejtekben. A kifejezett protein in situ azonban mind 17a-hidroxiláz, mind 17,20-liáz aktivitást mutatott, így 17-helyzetben szén-oldalláncot nem tartalmazó szex-szteroidok termelésénél alkalmazható lenne, de hidrokortizon termelésénél nem hasznosítható.
A Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1986-1990 (1984) közleményben White és munkatársai szteroid 21-hidroxilezésre specifikus szarvasmarha citokróm P450 (azaz P450C21) E. coliban való kifejezését írják le. A termelt protein azonban a β-laktamázzal fuzionált citokróm P450C21-fragmentum, amely antigén determinánsokat is hordoz.
Olyan protein vagy proteinrendszer előállítására vonatkozó közleményt azonban eddig nem ismerünk, amely proteinnel vagy proteinrendszerrel megvalósítható lenne az olcsó szteroid nyersanyagnak tekinthető koleszterin drága végtermékké, például hidrokortizonná való egyszerű átalakítása.
A jelen találmány proteinek előállítására sokféle expressziós kazettát bocsát rendelkezésre, amelyekre sok gént magában foglaló (multigén) rendszer megszerkesztéséhez van szükség. Ez a rendszer egy lépésben konvertálja az olcsó szteroid kiindulási anyagokat a sokkal ritkább és drágább végtermékké, amikor is a konverzió természetes rendszerekben megy végbe, számtalan enzim által katalizált és kofaktorok révén közvetített konverziókon keresztül úgy, ahogyan a hidrokortizon képződik a koleszterinből. A találmány szerinti expreszsziós kazettákat olyan multigén rendszerek végleges előállításában használjuk, amelyek e soklépéses konverziókat irányítják.
Ennek megfelelően - egy szempontból - a találmány tárgyát olyan expressziós kazetta képezi, amely rekombináns gazdasejtben eredményesen fejez ki egy heterológ kódoló-DNS szekvenciát, s amelyben az említett kódolószekvencia olyan enzimet kódol, amely képes egyedül vagy kiegészítő proteinnel kooperációban a koleszterinnek hidrokortizonná történő konverziójának biológiai folyamatában egy oxidációs lépést katalizálni. A találmány szerinti expressziós kazetták tehát azokat a szekvenciákat tartalmazzák, amelyek rekombináns gazdasejtben a következő proteinek termelésére
HU217411 Β képesek: oldallánchasító enzim (P450SCC); adrenodoxin (ADX); adrenodoxin reduktáz (ADR); 3p-hidroxi-szteroid dehidrogenáz/izomeráz (33-HSD); szteroid-17a-hidroxiláz (P450 1 7a); NADPH citokróm P450 reduktáz (RED); szteroid-21-hidroxiláz (P450C21); és szteroid-11 β-hidroxiláz (P450l 1 β).
A találmány további tárgyát képezik azok a rekombináns gazdasejtek, amelyeket ezekkel a vektorokkal vagy a találmány szerinti expressziós kazettákkal transzformálunk, azok az eljárások, amelyekkel a fenti enzimeket előállítjuk, valamint ezeknek az enzimeknek a felhasználása oxidációhoz. Vonatkozik még a találmány olyan folyamatokra, amikor az említett gazdasejtet táptalajban specifikus oxidációkra használjuk.
Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik. Az ábrákon a következő rövidítéseket használjuk: R,=EcoRI, H=HindIII, Sc=ScaI, P=PstI, K=KpnI, St=StuI, Sp, Sphl, X = XbaI, N=NdeI, S = SmaI, Ss=SstI, Rv=EcoRV, S]=SacI, B=BamHI, Sn=SaclI, Xh=XhoI, Pv=Pvun, Bg=BglII és M=MluI.
Az 1. ábra sematikus áttekintést ad azokról a proteinekről, amelyek részt vesznek a koleszterinnek hidrokortizonná való konverziójában, mely egymást követő lépésekben megy végbe emlősök mellékvesekérgében.
A 2. ábra a pGBSCC-1 plazmid szerkezetét mutatja be. A P450SCC szekvenciákat a sraffozott keret mutatja be.
A 3. ábra az 5’-P450SCC szekvenciákat tartalmazó szintetikusan előállított Pstl/HindlII fragmentumnak a pTZ18R plazmidba való beépítését és ennek eredményét, a pTZ synlead plazmidot ábrázolja.
A 4. ábra egy teljes hosszúságú P450SCCcDNS szerkesztését ábrázolja, melyet a szintetikusan előállított és pTZ18R-be klónozott Κ·Ζ·, valamint a cDNS klónozással kapott Wf/ΛΆ P450SCC-szekvenciák felhasználásával végzünk. A szerkesztés eredménye a pGBSCC-2.
Az 5. ábrán a pBHA-1 plazmid teljes nukleotidszekvenciája látható.
A 6. ábra a pGBSCC-3 szerkesztésének sematikus képét mutatja be. A P450SCCcDNS-szekvenciákat a pGBSCC-2 plazmidból bevezetjük a Bacillus/E. coli pBHA-1 ingázóplazmidba. A sraffozott keretek jelentése ugyanaz, mint a 4. ábrán.
A 7. ábrán bemutatjuk, hogy az Ndel restrikciós helyet az ATG startkodonnal kombinálva bevezetjük a pGBSCC-3-ban lévő P450SCC-érési hely elé, s így kapjuk a pGBSCC-4-et.
A 8. ábrán a pGBSCC-5 fizikai térképe látható. A pGBSCC-5 plazmidot úgy kapjuk, hogy a pGBSCC4 plazmidból eltávolítjuk az E. coli-szekvenciákat.
A 9. ábrán egy P450SCC antitestekkel reagáltatott Western biot képe látható, amelyből kitűnik, hogy a B. subtilisbe (c sáv) és a B. licheniformisba (f sáv) bevezetett pGBSCC-5 plazmid P450SCC-t fejez ki. A B. subtilis és B. licheniformis kontrollkivonatokat az a, illetve d sáv mutatja. Összehasonlítás céljából tisztított mellékvesekéreg P450SCC-t (30 ng) adtunk e kontrollkivonatokhoz (b, illetve e sáv).
A 10. ábrán sematikusan ábrázoljuk a pGBSCC17 szerkesztését. A pGBSCC-4 plazmidból a kódoló
P450SCC-DNS-szekvenciákat bevezetjük a pTZ18RN E. coli expressziós vektorba. A P450SCC szekvenciákat sraffozott kerettel nzaüi ábrázoljuk.
A 11. ábra bemutatja, hogy E. coli JMlOl-ben a pGBSCC-17 P450SCC-t fejez ki.
A. E. coli kontrolltörzsből (3-as sáv) és transzformált E. coli SCC-301, illetve 302 törzsből (1-es, illetve 2-es sáv) készített sejt-protein frakciók (20 μΐ) SDS/PAGE analízise Coomassie brilliant blue festéssel. Összehasonlításul 400 ng tisztított bovin P450SCC van a 4-es sávban.
Β. E. coli JM101 kontrolitörzsből (2-es sáv) és transzformáit E. coli SCC-301 (3-as sáv), illetve SCC302 (4-es sáv) törzsből készített sejt-protein frakciók (5 μΐ) P450SCC elleni antitestekkel végzett Western biot analízise. Összehasonlításul 100 ng tisztított bovin P450SCC van felvive az 1-es sávba.
A 12. ábra a pUCG418 plazmid szerkesztését ábrázolja.
A 13. ábra a pGB950 élesztő expressziós vektor szerkesztését ábrázolja. A vektort úgy kapjuk, hogy a laktáz promoterét és multiklónozó helyeket tartalmazó terminátorát beépítjük a pUCG418-ba. A pGBSCC6-hoz úgy jutunk, hogy egy ATG startkodont tartalmazó szintetikus Sall/Xhol fragmentumot és a P450SCC első 8 aminosavát meghatározó kodonokat beépítjük a pGB950-be.
A 14. ábra sematikus ábrázolásban mutatja be a pGBSCC-7 élesztő P450SCC expressziós kazetta szerkesztését.
A 15. ábra egy P450SCC proteinre specifikus antitestekkel reagáltatott Western biot analízis képét mutatja be. Az A biot a következő kivonatokat tartalmazza: a pGBSCC-10-zel transzformált Saccharomyces cerevisiae 273-lOB-ből származó kivonatot (1-es sáv); kontrollként a S. cerevisiae 273-10B kivonatát (2-es sáv); a pGBSCC-7-tel transzformált Kluyveromyces lactis CBS 2360-ból származó kivonatot (3-as sáv); és kontrollként a K. lactis CBS 2360 kivonatát (4-es sáv). A B biot a K. lactis CBS 2360-ból mint kontroliból származó kivonatot (1-es sáv) és a pGBSCC-15-tel (2-es sáv), a pGBSCC-12-vel (3-as sáv) vagy a pGBSCC-7-tel (4es sáv) transzformált K. lactis CBS 2360-ból származó kivonatokat tartalmazza. A C biot a kontroll S. cerevisiae 273-lOB-ből származó kivonatot (1-es sáv) és ennek pGBSCC-16-tal (2-es sáv) vagy pGBSCC-13-mal (3-as sáv) transzformált sejtjeiből származó kivonatait tartalmazza.
A 16. ábra sematikusan ábrázolja a S. cerevisiae-ből származó izocitokróm Cl (cyc-1) promoterét tartalmazó pGBSCC-9 élesztő expressziós vektor szerkesztését.
A 17. ábra a S. cerevisiae-hez szolgáló P450SCCcDNS-t tartalmazó pGBSCC-10 expressziós vektor szerkesztését ábrázolja.
A 18. ábra a pGBSCC-12 P450SCC expressziós vektor szerkesztését ábrázolja. A vektorba egy pre-P450 szekvenciát V/üZOi kódoló szintetikus DNS-fragmentumot építünk be az érett P450SCC kódoló szekvenciájához képest 5’ felé.
A 19. ábra a pGBSCC-13 szerkesztését mutatja be. Ez a S. cerevisiae-hez készített P450SCC expressziós
HU217411 Β kazetta tartalmazza a pre-P450 SCCcDNS-szekvenciát a S. cerevisiae cyc-1 promoteréhez viszonyítva 3’-helyzetben.
A 20. ábra sematikusan ábrázolja a pGBSCC-14 és pGBSCC-15 plazmid szerkesztését. Ez utóbbi tartalmazza a P450SCC kódolószekvenciát a citokróm oxidáz VI (Cox VI) preszekvenciával együtt egy keretben.
A 21. ábra a pGBSCC-16 plazmid szerkesztését ábrázolja. Ebben a plazmidban a kódoló P450SCC szekvenciával fuzionált citokróm oxidáz VI preszekvencia VSííűi a cyc-1 promoterhez viszonyítva 3’-helyzetben van.
A 22. ábra a pGB17a-l (A) és pGB17a-2 (B) plazmidok fizikai térképét mutatja be. E plazmidok a P450 1 7acDNS 3’ 1,4 kb fragmentumát, illetve 5’ 345 bp fragmentumát tartalmazzák. A pGB17a-3-ban (C), amely a P45017acDNS teljes hosszúságú szekvenciát tartalmazza, az ATG startkodon helyzetét bejelöltük.
A 23. ábrán a pGB17a-3 in vitro mutagenezissel végzett mutációja látható. A kapott pGB17a-4 plazmid egy Sáli restrikciós helyet tartalmaz - amelyet optimális élesztő transzlációs szignálok követnek - az ATG iniciációs kodontól 5’ felé.
A 24. ábra sematikusan ábrázolja a pGB17a-5 élesztő P450l 7a expressziós kazetta szerkesztését.
A 25. ábrán a pGB17a-3-nak in vitro mutagenezissel végzett mutációja látható. A kapott pGB17a-6 plazmid egy Ndel restrikciós helyet tartalmaz az ATG iniciációs kodonnál.
A 26. ábra sematikusan ábrázolja a pGB17a-7 szerkesztését. A pGB17a-6 plazmidból származó P45()17cDNSszekvenciákat bevezetjük a pBHA-1 Bacillus/E. coli ingázóplazmidba.
A 27. ábrán a pGB17a-8 fizikai térképe látható. E plazmidhoz úgy jutunk, hogy a pGB17a-7 plazmidból eltávolítjuk az E. coli-szekvenciákat.
A 28. ábrán a pGBC21-l és 2 fizikai térképe látható. Ezek egy 1,53 kb 3’-P450C21cDNS-, illetve egy 540 bp 5’-P450C21cDNS-ffagmentumot tartalmaznak a pTZl 8R klónozóvektor EcoRI helyén.
A 29. ábra a pGBC21-2-nek polimeráz-láncreakcióval (PCR=polymerase chain reaction) végzett in vitro mutagenezisét mutatja, amelynek célja az EcoRV és Ndel restrikciós helyek beépítése a P450C21 ATG iniciációs kodonjától upstream, ezt követi molekuláris klónozása a pSP73 klónozóvektorba, s így kapjuk a pGBC21-3 plazmidot.
A 30. ábra a teljes hosszúságú P450C21cDNS-szekvenciát tartalmazó pGBC21-4 szerkesztését ábrázolja sematikusan.
A 31. ábra sematikusan ábrázolja a pGBC21-5 szerkesztését. A pGBC21-4 plazmidból származó P450C21cDNS-szekvenciát bevezetjük a pBHA-1 Bacillus/E. coli ingázóplazmidba.
A 32. ábrán a pGBC21-6 fizikai térképe látható, melyet úgy kapunk, hogy a pGBC21-5 plazmidból eltávolítjuk az E. coli-szekvenciákat.
A 33. ábra a pGBC21-2-nek in vitro mutagenezissel végzett mutációját ábrázolja. A kapott pGBC21-7 plazmid egy Sáli restrikciós helyet tartalmaz - ezt optimális élesztő transzlációs szignálok követik - az ATG iniciációs kodontól pontosan 5’ felé.
A 34. ábra a pGBC21-8 szerkesztését ábrázolja, mely egy teljes hosszúságú P450C21 cDNS-t tartalmaz olyan módosított restrikciós helyekkel határolva, amelyek alkalmasak élesztő expressziós vektorba való klónozáshoz.
A 35. ábra sematikusan ábrázolja a pGBC21-9 élesztő P450C21 expressziós kazetta szerkesztését.
A 36. ábra a ρΟΒΙΙβ-1-nek polimeráz-láncreakcióval (PCR) végzett in vitro mutagenezisét ábrázolja, amelynek célja, hogy megfelelő határoló restrikciós helyeket és egy ATG iniciációs kodont vezessünk be a teljes hosszúságú P450l ΙβεDNS-szekvenciába, ezt követi a pBHA-1 Bacillus-E. coli ingázóvektorba való molekuláris klónozás, melynek révén megkapjuk a pGB 11 β-2 plazmidot.
A 37. ábra a pGBl 1β-1-nek polimeráz-láncreakcióval (PCR) végzett in vitro mutagenezisét ábrázolja, melynek célja, hogy megfelelő határoló restrikciós helyeket és egy ATG iniciációs kodont vezessünk be a teljes hosszúságú P450l 1 β cDNS-szekvenciába, ezt követi apGB950 élesztő expressziós vektorba való molekuláris klónozás, s ennek révén jutunk a pGB 11 β-4 plazmidhoz.
A 39. ábrán egy ADX elleni antitestekkel reagáltatott Western biot látható, mely bemutatja, hogy a K. lactis CBS 2360 transzformált ADX-101 és 102 sejtjeiben (4-es, illetve 5-ös sáv) lévő pGBADX plazmidokban ADX fejeződik ki. A K. lactis CBS 2360 kontrolitörzs kivonatát a 3-as sáv tartalmazza. Összehasonlításul tisztított mellékvesekéreg-ADX-et (100 ng) is felvittünk ágéi 1-es sávjába.
A 40. ábra a pGB ADR-1-nek polimeráz-láncreakcióval végzett in vitro mutagenezisét ábrázolja, melynek célja, hogy megfelelő határoló restrikciós helyeket és egy ATG iniciációs kodont vezessünk be a teljes hosszúságú ADRcDNS-szekvenciába, ezt követi a pGB950 élesztő expressziós vektorba való molekuláris klónozás, s így kapjuk a pGBADR-2 plazmidot.
A 41. ábra a pTG7457 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
A 42. ábra a pTG7453 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
A 43. ábra a pTG10014 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
A 44. ábra a pTG 10004 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
A 45. ábra a pTG 10031 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
A 46. ábra a pTG10033 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
A 47. ábra a pTG10013 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
A 48. ábra a pTG10041 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
A 49. ábra a pTG10042 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
Az 50. ábra a pTG10045 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
HU 217 411 Β
Az 51. ábra a pTG 10046 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
Az 52. ábra a pTG10064 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
Az 53. ábra a pTG10065 plazmid szerkezetét és restrikciós hasítási térképét mutatja be.
A találmány olyan sejtek előállítására és tenyésztésére vonatkozik, amelyek alkalmasak nagyméretű biokémiai termelőreaktorokban való alkalmazásra. A találmány további tárgyát képezi ezeknek a sejteknek a felhasználása vegyületek oxidációjára, és főként az 1. ábrán bemutatott szteroidok termelésére. Az itt ábrázolt reakciók mindegyike külön kivitelezhető. A találmány magában foglalja a lépések felcserélését egy többlépéses reakcióban. Az előnybe helyezett gazdasejtek a mikroorganizmusok, de más sejtek is használhatók, mint például növényi vagy állati sejtek, ezeket adott esetben sejttenyészetben használva, vagy pedig élő, átvitt gént tartalmazó (transzgén) növények vagy állatok szöveteiben. A találmány szerinti sejteket úgy kapjuk meg, hogy alkalmas receptorsejteket, előnyösen megfelelő mikroorganizmus-sejteket genetikailag transzformálunk olyan DNS-szekvenciákat tartalmazó vektorokkal, amelyek a koleszterinnek hidrokortizonná történő konverziójában részt vevő proteineket kódolják. Ezek a proteinek a következők: oldallánchasító enzim (P450SCC), adrenodoxin (ADX), adrenodoxin reduktáz (ADR), 33-hidroxi-szteroid dehidrogenáz/izomeráz (33-HSD), szteroid-17a-hidroxiláz (P4501 7a), NADPH citokróm P450 reduktáz (RED), szteroid-21-hidroxiláz (O450C21) és szteroid-11 β-hidroxiláz (Ρ4501 1β). Néhány gazdasejt eleve termelheti megfelelő szinten a saját egy vagy több szükséges proteinjét, és ezeket ezért csak a többi DNSszekvenciákkal kell transzformálni. Az ilyen lehetséges saját proteinek a következők: ferredoxin, ferredoxin reduktáz, P450-reduktáz és a 3β-hidroxi-szteroid dehidrogenáz/izomeráz.
A koleszterinnek hidrokortizonná történő konverziójában részt vevő proteineket kódoló szekvenciák izolálása céljára megfelelő DNS-forrásokat választunk ki. A koleszterinnek hidrokortizonná történő konverziójában részt vevő összes proteint kódoló DNS-ek kinyeréséhez megfelelő forrásul szolgál a gerincesek mellékvesekéreg-szövete, például a szarvasmarhamellékvesekéregszövet. A kívánt DNS különböző mikroorganizmusokból is izolálható, például a 3β-1υ0Γθχί-3ΖΙεπ^ dehidrogenáz/izomerázt kódoló DNS-t a Pseudomonas testosteroniból, a Streptomyces griseocameusból vagy Brevibacterium sterolicumból és a kortexolon Ιΐβ-hidroxilezésében részt vevő proteineket kódoló DNS-t a Curvularis lunatából vagy a Cunninghamella blakesleenából izolálhatjuk. A szarvasmarha P450SCC proteint, a szarvasmarha Ρ4501 1β proteint vagy egy ennek megfelelő mikrobiális proteint, továbbá a szarvasmarha-adrenodoxint, a szarvasmarhaadrenodoxin-reduktázt, a szarvasmarha vagy mikrobiális eredetű 3-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz/izomerázt, a szarvasmarha P450 1 7cx-t, a szarvasmarha P450C21-et és a szarvasmarha vagy mikrobiális eredetű NADPH citokróm P450 reduktázt kódoló DNSszekvenciákat a következő lépések szerint izoláljuk.
1. Eukarióta szekvenciák (cDNS-ek)
a) Össz-RNS-t izolálunk megfelelő szövetből;
b) A poliA+-tartalmú RNS-t kétszálú cDNS-sé újuk át, és bakteriofág vektorokba ligáljuk;
c) A kapott cDNS-gyűjteményt a kívánt cDNS-re specifikus 32P-vel jelzett oligomerekkel szűrjük, vagy egy izopropil^-D-tiogalaktopiranoziddal (IPTGvel) indukált lambda-gtll cDNS-gyűjteményt szűrünk specifikus (i25I-al jelzett) antitesttel;
d) A pozitív plakk-képző egységeket tartalmazó cDNS inszertumokat a megfelelő vektorokba építjük be, és a cDNS teljes hosszát nukleotidszekvenálással ellenőrizzük.
2. Prokarióta gének
a) Genomiális DNS-t izolálunk egy megfelelő mikroorganizmusból;
b) DNS-gyűjtemény előállítása céljából DNS-fragmentumokat klónozunk be megfelelő vektorokba, és ezzel megfelelő E. coli gazdasejteket transzformálunk;
c) A DNS-gyűjteményt a kívánt génre specifikus 32Pvel jelzett oligomerekkel szűrjük, vagy egy IPTGvel indukált lambda gtll DNS-gyűjteményt szűrünk specifikus (125I-al jelzett) antitesttel;
d) A pozitív telepek plazmidjait izoláljuk, és az inszertált DNS-fragmentumokat újra klónozzuk megfelelő vektorokba, hogy meghatározzuk a gén teljes hoszszát.
Megjegyzés: egy javított módszer szerint a speciális cDNS-t (eukarióta szekvenciák) vagy gént (prokarióta szekvenciák) megnöveljük két specifikus oligomert használva a polimeráz-láncreakció (PCR) néven ismert módszerrel [Saiki és munkatársai, Science, 239, 487-491 (1988)]. Ezt követően a megnövelt cDNS-t vagy DNS-t megfelelő vektorokba építjük be.
A találmány egyik szempontja szerint olyan alkalmas expressziós kazettákat bocsátunk rendelkezésre, amelyekben a fenti módszer szerint izolált heterológ DNS-t megfelelő szabályozószekvenciák közé építjük be a transzkripció és transzláció érdekében. Ez lehetővé teszi, hogy a DNS egy alkalmas gazda sejtkömyezetében fejeződjék ki, s így ilyen módon megkaphassuk a kívánt proteint vagy proteineket. Az iniciációs szabályozószekvenciákat alkalmanként egy szekréciós szignálszekvencia követi.
Az alkalmas szabályozószekvenciákat a strukturális DNS-sel együtt kell bevezetni az említett expressziós kazettákba. Az expresszió úgy válik lehetővé, ha az alkalmas gazdasejtet olyan szabályozószekvenciákat tartalmazó vektorral transzformáljuk, amelyek az aktuális gazdasejttel kompatibilisek és funkcionális kapcsolatban vannak azokkal a kódolószekvenciákkal, amelyeknek a kifejeződését kívánjuk.
Egy másik alternatíva szerint a gazdasejt genomjában jelen lévő alkalmas szabályozószekvenciákat használjuk fel. Az expresszió úgy válik lehetővé, ha a megfelelő gazdasejtet a kívánt protein kódolószekvenciáit tartalmazó vektorral transzformáljuk, s ha e szekvenciákat olyan gazdasejt-szekvenciák határolják, amelyek lehetővé teszik a gazda genomjával való homológ rekombinációt olyan módon, hogy a gazdasejt szabá6
HU 217 411 Β lyozószekvenciái helyesen szabályozzák a bevezetett DNS expresszióját.
Általánosan ismert, hogy a szabályozószekvencia definíción minden olyan DNS-szegmentumot értünk, amelyek a kódolószekvencia kifejeződésének megfelelő szabályozásához szükségesek - a szegmentumok a kódolószekvenciához funkcionálisan kapcsolódnak -, ilyenek az operátorok, az erősítőszekvenciák (enhancerek), és főként a promoterek és azok a szekvenciák, amelyek a transzlációt irányítják.
Környezetének szabályozásával a promoter vagy irányítható, vagy nem. A prokarióták számára megfelelő promoterek közé tartozik például a trp promoter (triptofán elvonással indukálható), a lac promoter (a galaktózzal analóg IPTG-vel indukálható), a β-laktamáz promoter és a fág eredetű PL promoter (hőmérséklet-változtatással indukálhatok). Ezenkívül, főként Bacillusban való kifejeződéshez, a következő promoterek használhatók: az alfa-amiláz, proteáz promoterei, a Spo2, spac és 0105, valamint szintetikus szekvenciák. Előnyös promoter az 5. ábrán „HpaII”-vel jelölt promoter. Élesztőben való kifejeződéshez alkalmas promoterek között van a 3-foszfo-glicerát kináz pormoter, valamint más glükolitikus enzimek promoterei, továbbá az alkohol dehidrogenáz és az élesztőfoszfatáz promoterei. A transzkripció elongációs faktor (TEF) és a laktáz promoterei szintén alkalmasak. Emlős expressziós rendszerekben általában vírus eredetű promotereket használunk, ilyenek az adenovírus promoterek és az SV40 promoter, de ezek a rendszerek regulálható promotereket is tartalmazhatnak, mint például a metallotionein promotert, amely nehézfémekkel vagy a glükokortikoid koncentrációval irányítható. Jelenleg vírusra alapozott rovarsejt-expreszsziós rendszerek is használatosak, valamint növényi sejt promotereken - ilyenek a nopalin szintetáz promoterek - alapuló expressziós rendszerek.
Prokarióta rendszerekben a transzlációt irányító szekvenciák riboszóma-kötőhelyet (RBS=ribosome binding site) tartalmaznak, míg az eukarióta rendszerek transzlációját egy indítókodont - ilyen az AUG - tartalmazó nukleotidszekvencia irányíthatja.
A szükséges promoteren és a transzlációt irányító szekvenciákon kívül több különböző szabályozószekvenciát - beleértve azokat, amelyek a terminációt irányítják (például eukarióta rendszerekben poliadenilációs szekvenciák működnek) - lehet használni az expresszió szabályozásában. Néhány rendszer enhancer elemeket tartalmaz, amelyek ugyan kívánatosak, de legtöbbször nem elengedhetetlenek az expresszió szempontjából.
A találmány olyan expressziós kazettákra is vonatkozik, amelyek még más heterológ kódolószekvenciát is tartalmaznak. A heterológ kódolószekvencia olyan enzimet kódol, amely egyedül, vagy egy vagy több további proteinnel együttműködve az 1. ábra szerinti folyamat egy másik lépését katalizálja.
A vektorok egy csoportját pGBSCC-n-nel jelöljük, ahol „n” 1-17-ig bármely egész szám lehet, s ezeket a vektorokat speciálisan a P450 SCC enzimet kódoló DNS számára fejlesztettük ki.
A vektorok egy másik csoportját pGB17a-n-nel jelöljük, ahol „n” 1 — 5-ig bármelyik egész szám lehet, s e vektorokat speciálisan a P450 1 7a enzimet kódoló DNS számára fejlesztettük ki.
A vektorok egy további csoportjának jele pGBC21n, ahol „n” 1 -9-ig bármelyik egész számot jelenti, s e vektorokat speciálisan a P450C21 enzimet kódoló DNS számára fejlesztettük ki.
Még egy másik csoport vektort pGBl 1 β-n-nel jelöltünk, ahol „n” 1 —4-ig bármelyik egész szám lehet, s ezeket kifejezetten a P450l 1β enzimet kódoló DNS számára fejlesztettük ki.
A találmány egy másik szempontja alapján olyan alkalmas gazdasejteket választunk ki, amelyek a találmány szerinti vektorokat befogadják, és lehetővé teszik, hogy a bevitt DNS kifejeződjék. Ha tenyésztjük a transzformált gazdasejteket, a koleszterinnek hidrokortizonná történő konverziójában részt vevő proteinek megjelennek a sejt tartalmában. A kívánt DNS jelenlétét DNS hibridizációs eljárásokkal bizonyíthatjuk, expreszsziójukat immunológiai vizsgálatokkal, és aktivitásukat oly módon, hogy a kiindulási vegyülettel való in vitro és in vivő inkubáció után megállapíthatjuk az oxidált termékek jelenlétét.
A transzformált mikroorganizmusok előállításához előnyös gazdák különösen a baktériumok (a legelőnyösebbek az E. coli, a Bacillus és a Streptomyces fajok). További alkalmas gazdasejtek találhatók a növények és állatok között, ideértve a rovarokat is. Az ezekből izolált sejteket - melyek lehetnek COS sejtek, C127 sejtek, CHO sejtek és Spodoptera frugiperda (Sfg) sejtek sejttenyészetben használjuk fel. Más módszer szerint átvitt gént tartalmazó (transzgén) növényt vagy állatot is használhatunk.
A rekombináns gazdasejtek egy különleges típusát képviseli az a sejt, amelybe több találmány szerinti expressziós kazettát vezettünk be, vagy amelyet egy legalább két heterológ DNS-t tartalmazó expressziós kazettával transzformáltunk, mely lehetővé teszi, hogy a sejt legalább két olyan proteint termeljen, amelyek az 1. ábra szerinti folyamatban vesznek részt.
A találmány legfőbb sajátossága, hogy az előállított új sejtek nemcsak arra képesek, hogy a szteroidoknak végül hidrokortizont eredményező oxidatív konverziójában szerepet játszó proteineket megtermeljék, hanem az, hogy ezeket a proteineket ott helyben azonnal fel lehet használni a tápfolyadékhoz adott megfelelő szubsztrátum-vegyület kívánt oxidatív konverziójára. Az előnybe helyezett szubsztrátumok a szteroidok. A heterológ DNS-sel transzformált sejtek speciálisan alkalmasak arra, hogy az 1. ábrán feltüntetett szteroidokkal - ideértendők más szterolok is, mint a β-szitoszterol - együtt történjék a tenyésztésük, s az eredmény az lesz, hogy oxidált szteroidokat kapunk.
Attól függően, hogy az 1. ábra szerinti folyamatban részt vevő proteineket kódoló heterológ DNS-ekből több van-e jelen a gazdasejtben, úgy több biokémiai konverzió megy végbe, ilyen egy szterol oldallánchasítás és/vagy oxidatív modifikációk a Cll, Cl7, C3 és C21 helyen. Ennélfogva a találmány szerinti expressziós
HU217411 Β kazetták olyan multigén rendszerek szerkesztésénél használhatók, amelyek egymást követő intracelluláris transzformációkat eredményeznek az 1. ábra szerinti soklépcsős folyamatban. Szükséges lehet, hogy a kívánt gazdasejtbe olyan expressziós kazettákat vezessünk be, amelyek a kívánt proteinek összességét kódolják. Bizonyos esetekben a folyamatban részt vevő proteinek közül egy vagy több már jelen lehet a gazdasejtben, mint azonos aktivitást kifejtő természetes proteinek. Például a ferredoxin, a ferredoxin reduktáz és a P450 reduktáz már jelen lehet a gazdasejtben. Ilyen körülmények mellett csak a fennmaradó enzimekről kell gondoskodni rekombináns transzformáció révén.
Az in vivő biokémiai konverziók kivitelével szemben egy másik alternatíva, ha a koleszterin-hidrokortizon konverzióban szerepet játszó proteineket izoláljuk, tisztíthatjuk amennyire szükséges, és felhasználjuk a szteroidok in vitro konverziójához, sejtmentes rendszerben, például oszlopon immobilizáljuk. További lehetőség, hogy a folyamat egy vagy több enzimjét többé-kevésbé tisztított formában tartalmazó keverékét használjuk a szteroid konverzióhoz. Egy példaként szereplő gazdasejt két heterológ proteint kódoló DNS-t tartalmaz, mégpedig a pregnenolontermeléshez szükséges P450SCC enzimet és az ADX proteint kódoló DNSt. Ezt összehasonlítva a csak P45O SCC DNS-t tartalmazó gazdasejttel, a pregnenolon kihozatala sejtmentes kivonatban ADR, NADPH és koleszterin hozzáadása után itt jelentősen javul.
A jelen találmány tárgyát képezik az olyan expressziós kazetták, amelyek számos hasznos szteroid egylépcsős termelési eljárásnak megteremtéséhez szükségesek. Kiindulva olcsó és bőségesen rendelkezésre álló kiindulási vegyületekből, az eljárás különösen alkalmas a hidrokortizon és köztes vegyületei termelésére. A találmány következtében elavulttá válnak a hagyományos, drága kémiai reakciók. Nem szükséges a köztes terméket izolálni. Eltekintve az új gazdasejtektől, maga az eljárás, amelyet ezeknek a sejteknek a tenyésztésére használunk a szteroid konverziók érdekében, analóg a szakterületen jól ismert biotechnológiai eljárásokkal.
A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük, mindazonáltal ezekkel nem korlátozzuk a találmány oltalmi körét.
1. példa
A szarvasmarha citokróm •P450 oldallánc hasítóenzimet (F45OSCC) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása
A T. Maniatis és munkatársai kézikönyvében (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) leírt általános klónozási technikákat és DNS- és RNSanalíziseket használtunk. Hacsak másként nincs leírva, minden DNS-módosító enzimet, molekuláris klónozó hordozót és E. coli törzset kereskedő cégektől szereztünk be és az előállítók előírásai szerint használtuk fel. A DNS és RNS elválasztásához és tisztításához szükséges anyagokat és készülékeket a szállító cégek előírásai szerint használtuk.
A szarvasmarhamellékvesekéreg-szövetet frissen kivett szarvasmarhavesékből nyeljük, gyorsan lefagyasztjuk folyékony nitrogénben, és -80 °C-on tároljuk.
A fagyasztott mellékvesekéreg teljes sejt-RNS-tartalmát Auffrey és Rougeon [Eur. J. Biochem., 107, 303-314 (1980)] leírása szerint izoláljuk. A mellékvese-poliA+RNS-t úgy kapjuk, hogy a teljes RNS-mintát 65 °C-on hevítjük, majd a poliA elválasztását oligo(dT) kromatográfiával végezzük el.
A szarvasmarha-mellékvesekéregből származó poliA+RNS-sel komplementer DNS-eket a következőképpen szintetizáljuk: metil-merkuri-hidroxiddal kezelt 10 pg poliA+RNS-t béta-merkapto-etanollal neutralizálunk. Ezt a keveréket 50 mM trisz.HCl (pH=8,3,42 °Con), 40 mM KC1,6 mM MgCl2,10 mM DTT, 3000 egység RNasin/ml, 4 mM Na4P2O7, 50 pg actinomycin, D/ml, 0,1 mg oligo(dT12_18)/ml, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dATP, 0,5 mM dTTP, 0,25 mm dCTP és 400 pCi a-32PdCTP/ml tartalomra állítjuk be összesen 100 pl végtérfogatban. Az elegyet jégen tartjuk 10 percig, 2 percig 42 °C-on melegítjük, és a szintézist 150 egység AMV reverz transzkriptáz (Anglián Biotechnology Ltd.) hozzáadásával indítjuk meg; az inkubálás 1 órán át 42 °C-on történik.
A második szál szintézisét úgy végezzük, hogy a reakcióelegyhez hozzáadunk DNS polimerázt és RNázH-t, Gubler és Hoffinan szerint [Gene, 25, 263-269 (1983)]. A kettős szálú DNS-t (ds DNS) T4 DNS polimerázzal (BRL) kezeljük, hogy kialakítsuk a tompa végeket, majd dekamer (lOmer) EcoRI linkereket (Biolabs Inc.) ligálunk a ds DNS-ífagmentumokhoz. EcoRI-gyel (Boehringer) való emésztés után a kettős szálú cDNSffagmentumokat elválasztjuk a feleslegben lévő EcoRI linkerektől Biogel A15 m (Bio-Rad) kromatografálással. Körülbelül 200 ng EcoRI linkért tartalmazó kettős szálú cDNS-t ligálunk 10 pg EcoRI-gyel emésztett és borjúbél foszfatázzal (Boehringer) kezelt lambda gtl 1 vektor DNS-sel (Promega), T4 ligáz (Boehringer) segítségével, amint ezt Huynh és munkatársai leírták („DNA cloning techniques: A practical approach” 49-78 oldal, Oxford IRL-press, 1985). A ligálókeverék in vitro pakolása révén kapott fágokat használjuk az E. coli Y1090 gazdasejtek (Promega) fertőzésére.
Ebből a cDNS-gyűjteményből körülbelül 106 plakkképző egységet (pfu=plaques forming unit) szűrünk ki 32p_vel végjelzett SCC-1 szintetikus oligomerrel (5’GGC TGA AGT CCT GAG ACA CTG GAT TCA GCA CTGG-3’), amely szarvasmarha P450SCC DNSszekvenciákra specifikus, amint ezt Morohashi és munkatársai leírták [Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 4647-4651 (1984)]. Hat hibridizáló pfu-t kaptunk, és ezeket tovább tisztítottuk két további ráfertőzést, lemezre öntést és hibridizálást jelentő menetben. A P450SCCcDNS EcoRI inszertumokat a pTZ18R (Pharmacia) EcoRI helyére szubklónoztuk. A legnagyobb EcoRI inszertumot (1,4 kb) tartalmazó pGBSCC-1 kiónt (2. ábra), mely a lambda gtl 1 SCC-54-ből származott, tovább analizáltuk restrikciós enzimes térképezéssel és szekvenálással.
A szekvenciaadatok azt mutatták, hogy a pGBSCC-1 EcoRI inszertum identikus a P450SCCcDNS-térképen a
HU 217 411 Β
Morohashi és munkatársai leírása szerinti 251-1824 pozícióban lévő SCCcDNS nukleotidszekvenciával.
A fennmaradó 5’-P450SCCcDNS nukleotidokat szintetikus úton alakítjuk ki úgy, hogy a 3. ábrán látható, szintetikusan előállított 177 bp Pstl/HindlII fragmentumot beklónozzuk a pTZ18R PstI és HindlII közötti helyére, így keletkezik a 3. ábrán látható pTZ/synlead, amely a 118-273 pozíciókban az érett P450SCC proteint kódoló nukleotidokon kívül - lásd Morohashi és munkatársai közlését - további restrikciós helyeket tartalmaz az Seal, AvrII és Stul számára anélkül, hogy ezek befolyásolnák a P450SCC protein előre látható aminosavszekvenciáját. A teljes hosszúságú P450SCCcDNS szerkesztését úgy végezzük, hogy egy ligálókeveréket, amely az 1372 bp HindlII/KpnI pGBSCC-1 fragmentumot, a 177 bp Pstl/HindlII pTZ/synlead fragmentumot és a Petivel és KpnI-vel emésztett pTZ19R DNS-t tartalmazza, beklónozzuk az E. coli JMlOl-be (ATCC 33 876).
A kapott plazmid, a pGBSCC-2, amely az érett P45o oldallánchasító protein összes kódoló nukleotidszekvenciáját tartalmazza, a 4. ábrán látható.
2. példa
A P450 SCC szerkesztése, transzformációja és expressziója Bacillus subtilis bakteriális gazdasejtben
Annak érdekében, hogy a citokróm P450SCC expresszióját Bacillus gazdasejtben elérhessük, a P45oSCCcDNS-szekvenciákat átvisszük a pBHA-1 E. coli/Bacillus ingázóvektorba.
Az 5. ábra a pBHA-1 ingázó (A05160, EMBL+GenBank) plazmid nukleotidszekvenciáját mutatja be. A plazmid a következőket tartalmazza: a 11-105 és 121-215 pozícióban: FD bakteriofág terminátor (dupla); a 221-307 pozícióban: a pBR322 plazmid egy része (mint a 2069-2153 pozíció); a 313-768 pozícióban: FI bakteriofág, replikációs origó (mint az 5482-5943 pozíció); a 772-2571 pozícióban: a pBR322 plazmid egy része, azaz a replikációs origó és a β-laktamáz gén; a 2572-2685 pozícióban: a TN903 transzpozon, teljes genom; a 2719-2772 pozícióban: triptofán terminátor (dupla); a 2773-3729 pozícióban: Tn9 transzpozon, a klocamfenikol-acetiltranszferáz (cat) gén. A 3005 (A), 3038 (C), 3302 (A) és 3409 (A) pozícióban lévő nukleotidok különböznek a vad típusú cat kódoló szekvenciától. Ezeket a mutációkat úgy vezetjük be, hogy elimináljuk az Ncol, Ball, EcoRI és PvuII helyeket; a 3730-7264 pozícióban: a pUBllO plazmid része, amely a Bacillus „Hpall” promotert, a replikációs funkciót meghatározó gént és a kanamicin rezisztencia gént tartalmazza (EcoRI/PvuII fragmentum) [McKenzie és munkatársai, Plasmid, 15, 93-103 (1986) és McKenzie és munkatársai, Plasmid, 17, 83-85 (1987)]; a 7267-7331 pozícióban: sokszoros klónozóhely. A fragmentumokat ismert klónozótechnikák segítségével rakjuk össze, például: Klenowval betöltjük a ragadós helyeket; adapterklónozással stb. Minden adat a Genbank®-től (National Nucleic Acid Sequence Data Bank, NIH, USA) származik.
A pGBSCC-3-hoz E. coli JM101-ben végzett molekuláris klónozás révén jutunk úgy, hogy a pGBSCC-2ből származó 1,54 kb méretű P45()SCCcDNS KpnI/Sphl inszertumot (az 1. példa írja le) bevezetjük a 6. ábrán bemutatott módon a pBHA-1 (Genbank!®) KpnI és Sphl hasításával kapott 7,3 kb méretű fragmentum KpnI helyére.
Molekuláris klónozással E. coli JM101 sejtekbe visszük be pGBSCC-3-ba a metionin iniciációs kodont úgy, hogy a Stul/Sphl fragmentumot kicseréljük egy szintetikusan előállított SphI/StuI fragmentummal.
Sphl Stul
CATATGATCAGTACTAAGACCCCTAGG
GTACGTATACTAGTCATGATTCTGGGGATCC
Ndel
A fragarentum egy Ndel helyet tartalmaz az ATG iniciációs kodonnál. A kapott pGBSCC-4 plazmidot a 7. ábrán mutatjuk be. A „Hpall” Bacillus promotert a P450SCCcDNS-szekvenciától upstream vezetjük be oly módon, hogy a pGBSCC-4-et Ndel restrikciós enzimmel emésztjük, az ingázóplazmid 3,7 kb méretű E. coli részét agaróz gél elektroforézissel elválasztjuk, ezután újból ligálás következik és a Bacillus subtilis 1A40 (BGSC 1A40) (ATCC 33677) kompetens sejtjeinek a transzformálása. A neomicinrezisztens telepeket analizáljuk, és így kapjuk a pGBSCC-5 plazmidot (8. ábra). A szarvasmarha P450SCC expresszióját úgy vizsgáljuk, hogy egy 10 pg/ml neomicint tartalmazó TSB tápoldatban (Gibco) 37 °C-on végzett egy tenyésztésből sejtprotein frakciót készítünk. A tenyészet 100 μΐ-ében lévő sejteket - ez körülbelül 5 106 sejtnek felel meg - centrifugálással gyűjtjük össze, és 10 mmolos trisz.HCl (pH=7,5) oldatban reszuszpendáljuk. A lizálást lizozim hozzáadásával (1 mg/ml) és 15 percig 37 °C-on való inkubálással végezzük. A lizátumot 0,2 mg Dnáz/ml hozzáadásával kezeljük 5 percig 37 °C-on, majd a keveréket 1 χ SB pufferrel úgy állítjuk be Laemmli szerint [Natúré, 227, 680-685 (1970)], hogy végső térfogata 200 μΐ legyen. Az elegyet 5 percig hevítjük 100 °C-on, majd 15 μΐ-ét 7,5%-os SDS/poliakrilamid gélben elektroforetizáljuk. A 9. ábrán látható, hogy egy 53 kD sáv (c sáv) volt kimutatható, amikor a gél immunoblotot P450SCC specifikus antitesttel reagáltattuk.
A specifikus szarvasmarha P450SCC antitesteket úgy kapjuk, hogy nyulakat immunizálunk szarvasmarhamellékvesekéreg-szövetből izolált tisztított P45OSCC proteinnel. [Arch. Biochem. Biophys., 215, 478-485 (1982)].
3. példa
A P450SCC expressziója Bacillus licheniformis bakteriális gazdasejtben
A szarvasmarha P450SCC expresszióját B. licheniformisban úgy valósítjuk meg, hogy a megfelelő B. licheniformis T5 (CBS 470,83) gazdatörzset pGBSCC-5 plazmiddal transzformáljuk. A 2. példában leírtak szerint sejt protein frakciót készítünk - a sejteket 10 μg/ml neomicint tartalmazó Trypton Soy Broth (TSB; Trypton-szója leves; Oxoid) táptalajban tenyésztjük 37 °C-on egy éjszakán át -, s a frakciót SDS/PAGE és Western blotting módszerrel analizáljuk. A 9. ábrán látható, hogy egy 53 kD proteinsáv (f sáv) jelenik meg, miután a nitrocellulóz szűrőt P450SCC specifikus antitesttel inku9
HU 217 411 Β háltuk. Egy transzformált sejtet, az SCC-201 sejtet tovább vizsgáltuk in vivő P450SCC-aktivitásra nézve (lásd all. példát).
4. példa
A P450SCC expressziója Escherichia coli bakteriális gazdasejtben
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
Annak érdekében, hogy a P450SCC számára az E. coli gazdasejtben megfelelő expressziós vektorhoz jussunk, a pTZ18R-nél helyre irányuló mutagenezist végzünk Zoller és Smith [Methods in Enzymology, 100, 468-500 (1983) és Methods in Enzymology, 154, 329-350 (1987), valamint Kramer és Fritz [Methods in Enzymology, 154, 350-367 (1987)] leírása szerint. Az in vitro mutageneziskísérletekhez szükséges plazmidokat és törzseket a Pharmacia cégtől szereztük be.
Szintetikus oligomert állítunk elő, melynek szekvenciája az alábbi:
5’ -CAG GAA ACA ,CAT ATG, ACC ATG ATT- 3’ Ndel
Ezt a szekvenciát használjuk, hogy egy Ndel restrikciós helyet létesítsünk a pTZ18R-ben, a lac Z gén ATG iniciációs kodonjánál.
A kapott pTZ18RN plazmidot Ndel-gyel és Kpnlgyel emésztjük, és a kapott 2,82 kb fragmentumot és a pGBSCC-41,54 kb méretű Ndel/KpnI DNS fragmentumát, amely a teljes hosszúságú SCCcDNS-t tartalmazza, molekuláris klónozással építjük össze az Ndel helynél a 10. ábrán ismertetett módon.
Az előállított pGBSCC-17 plazmidban lévő P450SCCcDNS-szekvenciák transzkripcióját az E. coli lac-promoter fogja irányítani.
b) a P450SCC expressziója E. coli JM101 gazdasejtben
A pGBSCC-17 plazmidot E. coli JM101 kompetens sejtekbe visszük be, majd ampicillinrezisztens telepeket szelektálunk segítségével. A citokróm P450SCC expreszsziójának tanulmányozásához sejt-protein frakciót (lásd a 2. példát) készítünk az SCC-301 és 302 transzformált sejtek egy éjszakás tenyészetéből. A tenyésztést 37 °Con, 50 pg/ml ampicillintartalmú 2xTY tápoldatban végezzük, amely 1 liter ionmentes vízben 16 g Bacto Tryptont (Difco), 10 g élesztőkivonatot (Difco) és 5 g NaCl-ot tartalmaz.
SÁL 1
TCGACAAAAATGATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC
GTTTTTACTAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT, s így kapjuk a 13. ábrán látható pGBSCC-6 plazmidot. A P450SCC kódolószakaszát tartalmazó pGBSCC-2ből (lásd az 1. példát) izoláljuk a StuI-EcoRI fragmentumot, és a ragadós végeit betöltjük Klenow DNS polimerázt használva. Ezt a fragmentumot építjük be a Stulgyel hasított pGBSCC-6-ba, s azt a plazmidot, mely korrekt orientációban tartalmazza a fragmentumot, pGBSCC-7-nek neveztük el (lásd a 14. ábrát),
c) A K. lactis transzformálása
A K. lactis CBS 2360 törzset 100 ml YEPD táptalajban (1% élesztőkivonat, 2% pepton, 2% glükóz-moA protein frakciókat Coomassie brilliant blue-val festett SDS/PAGE módszerrel analizáltuk (11 A. ábra) vagy Western blottal, melyet szarvasmarha P450SCCre specifikus antitestekkel reagáltattunk (11B. ábra). Mindkét analízis a várt hosszúságú proteint mutatta ki (11A. ábra: 1-es és 2-es sáv; 11B. ábra: 3-as és 4-es sáv) az SCC-301, illetve SCC-302 transzformált sejteknél, de ez a protein nem volt jelen az E. coli JM101 kontrolltörzsben (11 A. ábra: 2-es sáv és 11B. ábra: 2-es sáv).
5. példa
A P450SCC szerkesztése, transzformációja és expressziója Kluyveromyces lactis élesztősejtben
a) Geneticin rezisztencia marker bevezetése a pUC 19be
Egy Tn5 gént [Reiss és munkatársai, EMBO J., 3, 3317-3322 (1984)] tartalmazó DNS-ragmentumot beépítünk a pUC19 Smal helyére [Yanisch-Perron és munkatársai, Gene, 33, 103-119 (1985)]. A Tn5 gén geneticinnel szembeni rezisztenciát biztosít a S. cerevisiae-ből származó alkohol-dehidrogenáz I (ADHI) promoterének irányítása alatt, hasonlóan a Bennetzen és Hall [J. Bioi. Chem., 257, 3018-3025 (1982)] által leírtakhoz. A kapott pUCG418 plazmid a 12. ábrán látható.
A pUCG418-at tartalmazó E. colit letétbe helyeztük a Centraal Bureau voor Schimmelculturea intézménynél, CBS 872.87 letéti szám alatt 1987. december 4-én.
b) Az expressziós kazetta szerkesztése
Vektort szerkesztünk, mely a következőket tartalmazza :
Xbal-gyel és HindlII-mal hasított pUCG418 4,67 kb fragmentuma [leírását lásd az 5. a) példában], a laktóz promotert tartalmazó pGB901 3,71 kb méretű Xbal-Sall fragmentuma (lásd J. A. van den Berg és munkatársai, Continuation-inpart, 572.414 sorozatszámú US szabadalmi bejelentés: Kluyveromyces as a hőst strain) és a K. lactis laktáz génje 3’ nem kódoló szakaszának részét tartalmazó szintetikus DNS. (Szekvenciáját lásd a 13. ábrán.) Ez a pGB950 plazmid, melyet a 13. ábrán mutatunk be.
A pGB950 plazmidot Sall-gyel és Xhol-gyel hasítjuk, beépítjük az alábbi szintetikus DNS-t.
STU 1 XHO 1 nohidrát) OD610=körülbelül 7-ig tenyésztjük. A táptalaj egy 6,7%-os (tömeg%) élesztő nitrogénbázisú oldatból (Difco, yeast nitrogén base) 2,5 ml-t tartalmaz. A tenyészet 10 ml-éből centrifugálással gyűjtjük össze a sejteket, TE pufferrel (10 ml trisz.HCl, pH=7,5; 0,1 mM EDTA) mossuk és 1 ml TE pufferben reszuszpendáljuk. Azonos térfogatú 0,2 molos lítium-acetátot adunk hozzá, és az elegyet 1 órán át 30 °C-os vízfürdőben, rázás mellett inkubáljuk. A pGBSCC-7 15 pg-ját a laktáz promoterben lévő egyetlen SacII helynél hasít60 juk, etanollal kicsapjuk és 15 μΐ TE pufferben reszusz10
HU 217 411Β pendáljuk. Ezt a DNS-készítményt adjuk az előinkubált sejtek 100 μΐ-éhez, és az inkubálást 30 percig tovább folytatjuk. Ezután azonos térfogatú 70%-os PEG 4000et adunk az elegyhez, melyet 1 órán át inkubálunk ugyanezen a hőmérsékleten, majd 5 percig 42 °C-on hősokkolást végzünk. Az elegyhez ezután hozzáadunk 1 ml YEPD tápoldatot, és a sejteket 1,5 órán át, rázás mellett 30 °C-on vízfürdőben inkubáljuk. Végül a sejteket centrifugálással gyűjtjük össze, 300 μΐ YEPD-ben reszuszpendáljuk, és agar lemezekre szélesztjük. A le- 10 mezek 300 pg/ml geneticintartalmú 15 ml YEPD agart tartalmaznak, s ezekre rétegezünk 1 órával a használat előtt 15 ml G418-at nem tartalmazó YEPD agart. A telepek 30 °C-on 3 napon át növekednek.
d) A transzformált sejtek vizsgálata
A transzformált sejteket és a CBS 2360 kontrolltörzset YEPD táptalajon tenyésztjük 64 órán át 30 °C-on.
A sejteket centrifugálással gyűjtjük össze, fiziológiás sóoldatban reszuszpendáljuk OD6|0=300 sűrűségben, majd Vortex keverőben, maximális sebességgel, üvegszemcsékkel való rázással tárjuk fel. A sejttörmelékeket úgy távolítjuk el, hogy GL minifugában (Haereus Christ) 4500 fordulat/perc mellett 10 percig centrifugálunk.
A felülúszóból 40 μΐ-es mintákat analizálunk immunbiotokban (15A. ábra: 3-as sáv; 15B. ábra: 4-es sáv).
Az eredmények azt mutatják, hogy a pGBSCC-7-tel a transzformált K. lactis-sejtekben a várt hosszúságú protein fejeződik ki. A transzformált sejt neve K. lactis SCC-101.
6. példa
A P45OSCC szerkesztése, transzformációja és kifejeződése Saccharomyces serevisiae élesztősejtekben a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A laktáz promoter törlése érdekében a pGB950-et [lásd az 1. példát] Xbal-gyel és SalI-gyel hasítjuk, a ragadós végeket Klenow DNS polimeráz segítségével betöltjük, majd ezután ligálunk. A kapott pGBSCC-8 plazmidban megsemmisült az Xbai hely, de a Sáli hely megmaradt.
A pGB161 Sáli fragmentumát (lásd: J. A. van den Berg és munkatársai, EP 96430), amely a S. cerevisiaeből származó izocitokróm Cl promotert (cyc 1) tartalmazza, izoláljuk és részlegesen emésztjük Xhol-gyel. Izoláljuk a 670 bp Xhol-Sall fragmentumot és beklónozzuk a pGBSCC-8 Sáli helyére. A szelektált, pGBSCC-9 plazmidban megmarad a Sáli hely a Cyc 1 promoter és a laktáz gén 3’ nem kódoló szakasza között (16. ábra).
A pGBSCC-71,62 kb méretű SalI-HindlII fragmentumát (HindlII-mal részlegesen emésztve, <1 egységig DNS; 1 óra), amely a P450SCC kódolószakaszt tartalmazza, beépítjük a SalI-gyel és HindlII-mal emésztett (5,24 kb 5 fragmentum) pGBSCC-9-be. A kapott pGBSCC-10 nevű plazmidban a P450SCC kódoló szakasz a cyc-1 promotertől downstream helyezkedik el (17. ábra).
b) A S. cerevisiae transzformálása
A S. cerevisiae D273-10B törzset (ATCC 24657)
100 ml YEPD tápoldatban tenyésztjük egy éjszakán át 30 °C-on, ezután friss tápoldattal hígítjuk (1:10000) és tovább tenyésztjük OD6I0=6 értékig. A tenyészet 10 ml-éből centrifugálással gyűjtjük össze a sejteket. A sejteket 1 ml TE pufferben szuszpendáljuk, és hozzá15 adunk 1 ml 0,2 molos lítium-acetátot. A sejteket 1 órán át rázás mellett 30 °C-os vízfürdőben inkubáljuk. A pGBSCC-1015 pg-ját a cac 1 promoterben lévő egyetlen Miül helynél hasítjuk, etanollal kicsapjuk és 15 ml TE pufferben reszuszpendáljuk. Ezt a DNS-készít20 ményt 100 μΐ előinkubált élesztősejthez adjuk, és 30 percig 30 °C-on (rázás közben) inkubáljuk. Ekkor hozzáadunk 115 μΐ 70%-os PEG 4000 oldatot, és az inkubálást tovább folytatjuk 60 percen át, rázás nélkül. Ekkor 5 perces hősokkot adunk a sejteknek 42 °C-on, hoz25 záadunk 1 ml YEPD tápoldatot, majd másfél órát inkubáljuk rázás közben, 30 °C-os vízfürdőben. Végül a sejteket centrifugálással gyűjtjük össze, 300 μΐ YEPD tápoldatban reszuszpendáljuk, majd geneticintartalmú (300 pg/ml) YEPD agar lemezekre öntjük.
A telepeket 3 napon át 30 °C-on hagyjuk növekedni.
c) A transzformált sejtek analízise
A transzformált és a kontrolitörzset YEPD tápoldatban [1% élesztőkivonat, 2% Bacto pepton, 3,48% K2HPO4 és 2,2% 90%-os L(+)-tejsav oldat; sterilizá35 lás előtt az oldat pH-ját 25%-os ammóniaoldattal 6,0ra állítjuk be] tenyésztjük 64 óra hosszat 30 °C-on. Ezután az 5. d) példában leírt módon végezzük a vizsgálatokat.
Immunbiot analízissel bizonyítjuk a P450SCC kife40 jeződését S. cerevisiae-ben (15A. ábra: 1-es sáv).
7. példa
A pre-P4i()SCC-t kódoló DNS szerkesztése, transzformálása és kifejeződése Kluyveromyces lactis élesztő45 sejtekben
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGB950 plazmidot [lásd az 5. b) példát] SalI-gyel és Xhol-gyel hasítjuk, majd beépítjük a következő szintetikus DNS-t
SÁL I
TCGACAAAAATGTTGGCTCGAGGTTTGCCATTGAGATCCGCTTTGGTTAAGGCTTGTCC
GTTTTTACAACCGAGCTCCAAACGGTAACTCTAGGCGAAACCAATTCCGAACAGG
ACCAATCTTGTCCACTGTTGGTGAAGGTTGGGGTCACCACAGAGTTGGTACTGGTGAAGG
TGGTTAGAACAGGTGACAACCACTTCCAACCCCAGTGGTGTCTCAACCATGACCACTTCC
STU 1 XHO 1
TGCTGGTATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC
ACGACCATAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT
HU 217411 Β
A beépítés eredményeként kapjuk a pGBSCC-11 plazmidot (18. ábra). A pGBSCC-2 P450SCC kódolószakaszát beépítjük a Stul-gyel hasított pGBSCC-ll-be, az 5. b) példában leírtakkal analóg módon. A fragmentumot korrekt orientációban tartalmazó plazmidot pGBSCC12-nek neveztük el.
b) A K. lactis transzformálása és a transzformált sejtek analízise
A K. lactist a pGBSCC-12-vel úgy transzformáljuk, ahogy azt az 5. c) példában leírtuk. A transzformált sejtek analízise az 5. d) példában leírtak szerint történt. Az analízis kimutatta, hogy a K. lactis P450SCC-t termel (15B. ábra, 3-as sáv).
8. példa
A pre-P45OSCC-t kódoló DNS szerkesztése, transzformálása és kifejeződése Saccharomyces cerevisiae élesztősejtekben
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGBSCC-12 SalI-HindlII (HindlII-mal részlegesen emésztve) fragmentumát, amely a pre- P450SCC-t kódoló szakaszt tartalmazza, beépítjük a SalI-gyel és HindlII-mal hasított pGBSCC-9-be. A kapott plazmidot pGBSCC-13-nak neveztük el (19. ábra), b) A S. cerevisiae transzformálása és a transzformált sejtek analízise
A S. cerevisiae D273-10B törzset pGBSCC-13-mal transzformáljuk a 6. b) példában leírtak szerint. A transzformáit sejteket az 5. c) példában leírtak szerint analizáljuk. Az eredmény, mely a 15C. ábrán (3-as sáv) látható, azt mutatja, hogy a S. cerevisiae P450SCC-t fejez ki. Az egyik transzformált sejtet - SCC-105 - tovább analizáltuk P450SCC-aktivitásra (lásd a 12. példát).
9. példa
A Saccharomyces cerevisiae-ből származó citokrómoxidáz VIpre-régiójávalfuzionált P4S<)SCC szekvenciák szerkesztése, transzformálása és kifejeződése Kluyveromyces lactisban
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGB950 plazmidot [lásd a 6. b) példát] SalI-gyel és Xhol-gyel hasítjuk, s beépítjük a következő szintetikus DNS-t:
SÁL I
TCGACAAAAATGTTGTCTCGAGCTATCTTCAGAAACCCAGTTATCAACAGAACTTTGTT
GTTTTTACAACAGAGCTCGATAGAAGTCTTTGGGTCAATAGTTGTCTTGAAACAA
GAGAGCTAGACCAGGTGCTTACCACGCTACTAGATTGACTAAGAACACTTTCATCCAATC
CTCTCGATCTCGTCCACGAATGGTGCGATGATCTAACTGATTCTTGTGAAAGTAGGTTAG
STU 1 XHO 1
CAGAAAGTACATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC
GTCTTTCATGTAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT
Az eredmény a pGBSCC-14 plazmid.
A citokróm-oxidáz VI (COX VI) preszekvenciájából 35 származó aminosavszekvenciát Wright és munkatársai [J. Bioi. Chem., 259, 15 401-15 407 (1984)] közleményéből vettük át. Megterveztük a szintetikus DNS-t előnyös élesztőkodonok használatával. A pGBSCC-2-ből a P450SCC kódolószakaszát beépítjük a Stul-gyel hasi- 40 tott pGBSCC-14-be, ahogyan ezt az 5. b) példában leírtuk. A plazmidot, amely a P450SCC kódolószekvenciát a COX VI preszekvenciával egy keretben tartalmazza, pGBSCC-15-nek neveztük el (20. ábra).
b) A K. lactis transzformálása és a transzformált sejtek 45 analízise
A K. lactis transzformálása a pGBSCC-15-tel az 5. c) példában leírtak szerint történt. A transzformált sejtek analízisét az 5. d) példában leírtak szerint végeztük. Az eredményekből kitűnt, hogy a P4J0SCC fejeződik ki (15B. ábra, 2-es sáv).
10. példa
Saccharomyces cerevisiae-ből származó citokróm-oxidáz VIprerégiójávalfuzionált P4S0SCC szekvenciák szerkesztése, transzformálása és kifejeződése Saccharomyces cerevisiae-ben
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGBSCC-15 SalI-HindlII (részlegesen emésztve HindlII-mal) fragmentumát, amely a COX VI preszekvenciával fuzionált P45()SCC kódolószakaszát tartalmazza, beépítjük a SalI-gyel és HindlII-mal hasított pGBSCC-9-be. A kapott plazmid neve: pGBSCC-16 (21. ábra).
b) A S. cerevisiae transzformálása és a transzformált sejtek analízise
A S. cerevisiae D273-10B törzset a 6. b) példában leírtak szerint transzformáljuk. A transzformált sejteket a 6. c) példában leírtak szerint analizáljuk. Az eredmény, amely a 15C. ábrán (2-es sáv) látható, bizonyítja, hogy a S.cerevisiae-ben P450SCC fejeződik ki.
11. példa
A P450SCC in vivő aktivitása Bacillus licheniformis SCC-201-ben
A B. licheniformis SCC-201 törzset a 3. példában 50 leírtak szerint állítjuk elő. A sejtekkel 100 ml A táptalajt oltunk be. Az A táptalaj összetétele:
Kalcium-klorid 6H2O 1 g
Ammónium-szulfát 5 g
Magnézium-klorid 6H2O 2,25 g
Mangán-szulfát 4H2O 20 mg
Kobalt-klorid 6H2O 1 mg
Citromsav-monohidrát 1,65 g
Desztillált víz 600 ml
Nyomelemtörzsoldat 1 ml
Habzásgátló (SÁG 5693) 0,5 mg
HU217411 Β
Nyomelemtörzsoldat összetétele 1 liter desztillált vízben:
CuSo4.5H2O 0,75 g
H3BO3 0,60 g
KJ 0,30 g
FeSO4(NH4)2SO4.2H2O 27 g
ZnSO4.7H2O 5 g
Citromsav.H2O 15 g
MnSO4.H2O 0,45 g
Na2MoO4.H2O 0,60 g
H2SO4 (96%) 3 ml
Sterilizálás után 30 °C-ra hűtjük az oldatot, s a táptalajt úgy készítjük el, hogy hozzáadunk 60 g maltózmonohidrátot 200 ml desztillált vízben oldva (sterilizálva 120 °C-on 20 percig), 200 ml 1 mólos kálium-foszfát puffért (pH=6,8; sterilizálva 120 °C-on 20 percig), 1,7 g Difco-féle élesztő nitrogén bázis 100 ml desztillált vízben oldva (sterilizálva membránszűréssel).
A tenyésztést 54 órán át 37 °C-on folytatjuk, majd ebből a tenyészetből 2 ml-t adunk inokulum gyanánt 100 ml A tápoldathoz, mely 10 mg koleszterint tartalmaz. A koleszterint a következő összetételű oldat formájában adagoljuk: 10 mg koleszterin, Tergitol™/etanol (1:1, térfogat/térfogat) 0,75 ml Tewen 8020μ1. A tenyésztést 48 órán át 37 °C-on folytatjuk, és ekkor a tenyészetet 100 ml metilén-dikloriddal extraháljuk. Az elegyet centrifugálással választjuk el, és a szerves, oldószeres fázist gyűjtjük össze. Az extrakciót még kétszer ismételjük, és a 3 χ 100 ml metilén-diklorid frakciót egyesítjük. A metilén-dikloridot vákuumdesztillálással távolítjuk el, és a száraz kivonatot (körülbelül 450 mg) pragnenolonra analizáljuk gázkromatográfia (GC)-tömeg-spektrométer (MS) kombinációjával. GC-MS analízis
A száraz kivonatból meghatározott mennyiségű mintát veszünk ki, majd piridin-bisz(trimetil-szilil)-trifluoracetamid és trimetil-klór-szilán keverékével szililezzük. A szililezett mintát GL-MS-DS kombinációval (Carlo Erba MEGA 5160-Finnigan MÁT 31 ÍA-Kratos DS 90) analizáljuk szelektált ionalakban. A gázkromatográfiát a következő feltételek mellett végeztük: az adagolótű 300 °C-on injektál; oszlop: M. cpsil29 0,35 belső átmérő df 0,2 pm 300 °C izoterma; közvetlen átvezetés MS-re.
A mintákat 800-as felbontás mellett pregnenolonból származó ionok (m/z 298) észlelésével analizáltuk. A mérések világosan mutatták, hogy a B. licheniformis T5 gazdatörzsben nem lehetett pregnenolont kimutatni (a kimutathatósági határ 1 pikogramm), míg a B. licheniformis SCC-201 esetében könnyen megfigyelhető volt a pregnenolontermelés.
12. példa
A Saccharomyces cerevisiae SCC- 105-ből izolált PtfoSCC in vitro aktivitása
A 8. példában leírtak szerint kapott S. cerevisiae SCC-105 sejteket 100 ml B tápoldatban oltottuk. A B táptalaj összetétele 1 liter desztillált vízben a következő: Élesztőkivonat 10 g
Bacto pepton (Oxoid) 20 g
Tejsav (90%) 20 g
Dikálium-foszfát 35 g pH=5,5 [25%-os (tömeg) ammóniával beállítva].
A tenyészetet 48 órán át 30 °C-on inkubáljuk, majd ezután ezt a tenyészetet használjuk a C táptalajt tartalmazó fermentorhoz inokulumként. A C táptalaj összetétele a következő:
Élesztőkivonat 100 g
Bacto pepton (Oxoid) 200 g
Tejsav (90%) 220 ml
Dikálium-foszfát 35 g
Desztillált víz 7800 ml
ApH-t 25%-os ammóniaoldattal 6,0-ra állítjuk be, és a fermentort a táptalajjal együtt sterilizáljuk 1 órán át 120 °C-on.
Lehűtés után 25 ml desztillált vízben oldott és membránszűréssel sterilizált geneticint adunk a táptalajhoz. A beoltott táptalajt keverő vei (800 fordulat/perc) ellátott reaktorban tenyésztjük 30 °C-on. Steril levegőt vezetünk át a fermentleven 300 liter/óra sebességgel és a pH-t 6,0-ra állítjuk 2M H2SO4 és 5%-os NH4OH automatikus adagolásával (az 5%-os NH4OH-oldatot desztillált vízzel készítjük és membránszűréssel sterilizáljuk). 48 óra múlva tej savbetáplálást (90%-os oldat, membránszűréssel sterilizálva) kezdünk 20 g/óra sebességgel. A fermentálást ezután még 40 órán át folytatjuk, s ekkor a sejteket centrifugálással gyűjtjük össze (4000 g, 15 perc).
Az üledéket 0,9%-os (tömeg) NaCl-dal mossuk, majd centrifugálunk (4000 g; 15 perc); az üledéket foszfát pufferrel (60 mM; pH=7,0) mossuk és a sejteket centrifugálással (4000 g; 15 perc) gyűjtjük össze. Az üledéket annyi foszfát pufferben (50 mM; pH=7,0) vesszük fel, hogy a kapott szuszpenzió ml-enként 0,5 g nedves tömeget tartalmazzon. A szuszpenziót Dyno® készülékben (Willy A. Bachofen Maschinenfabrik, Bázel, Svájc) tárjuk fel. Az ép sejteket centrifugálással (4000 g, 15 perc) távolítjuk el. A sejtmentes kivonatot (2250 ml, 15-20 mg protein/ml) -20 °C-on tároljuk.
A P450SCC-t durva tisztításnak vetjük alá a következő eljárással. A felolvasztott sejtmentes kivonat 50 miéből kapott nyers membránfrakciót ultracentrifugában (12 500 g, 30 perc) ülepítjük, az üledéket 50 ml 1% nátrium-kolát-tartalmú 75 mmolos kálium-foszfát-oldatban (pH=7,0) reszuszpendáljuk. A diszperz elegyet óvatosan kevertetjük 1 órán át 0 °C-on, s ezután lecentrifugáljuk (12 500 g, 60 perc). Az így kapott felülúszóhoz, amely a szolubilizált membránproteineket tartalmazza, ammónium-szulfátot adunk (3% tömeg/térfogat), s pHját 7,0-en tartjuk 6 n ammónium-hidroxid-oldat kis menynyiségeinek adagolásával. A szuszpenziót 20 percig 0 °C-on kevertetjük, s ezután a kicsapódott protein frakciót centrifugálással (15 000 g; 10 perc) gyűjtjük össze. Az üledéket 0,1 mM ditiotreitolt és 0,1 mM EDTA-t tartalmazó 100 mM kálium-foszfát pufferben (pH=7,0) reszuszpendáljuk úgy, hogy térfogata 2,5 ml legyen. A szuszpenziót gélszűrésre alkalmas oszlopról (PD10, Pharmacia) oldjuk le, amikor is 3,5 ml sótalanított protein frakciót kapunk (6 mg/ml), melyet P450SCC-aktivitásra vizsgálunk.
HU 217411 Β
A P450SCC-aktivitás meghatározását lényegében Doering módszere szerinti [Methods in Enzymology, 15, 591-596 (1969)] eljárással végezzük el. A vizsgálati anyag a következő oldatokból áll:
A oldat (természetes P450SCC elektrondonor-rendszer), mely egy 10 mM kálium-foszfát puffer (pH=7,0) a következő összetétellel: 3 mM EDTA, 3 mM fenilmetil-szulfonil-fluorid (PMSF), 20 μΜ adrenodoxin és μΜ adrenodoxin reduktáz (elektronhordozók; mindkettő szarvasmarha-mellékvesekéregből tisztítva), 1 mM NADPH (elektrondonor) és 15 mM glükóz-6-foszfát és 8 egység/ml glükóz-6-foszfát dehidrogenáz (NADPH regenerálórendszer).
B oldat (szubsztrátum): 37,5 μΜ koleszterintartalmú oldat, melyben a koleszterinrészecskék kétszeresen jelzettek {[26,27-13 14 *C] koleszterin (40 Ci/mol) és [7a3H] koleszterin (400 Ci/mol)}, oldószere 10%-os (térfogat/térfogat) Tergitol™-ben NP40/etanol (1:1, térfogat/térfogat).
A vizsgálatot úgy kezdjük, hogy 75 μΐ A oldatot összekeverünk 50 μΐ B oldattal és 125 μΐ durván tisztított P450SCC frakcióval (vagy pufferrel kontroll gyanánt). Mintákat (50 μΐ) vesszük a nulladik, 30-adik és 180-adik percben, s 100 μΐ vízzel hígítjuk e mintákat. A hígított mintákhoz 100 μΐ metanolt és 150 μΐ kloroformot adunk. Extrahálás és centrifugálás után (5000 g, perc) a kloroformos fázist gyűjtjük össze és szárítjuk. A száraz maradékot 0,5 mg szteroid keveréket [koleszterin, pregnonolon és progeszteron (1:1:1, tömeg)] tartalmazó 50 μΐ acetonban oldjuk fel, s az oldathoz 110 μΐ koncentrált hangyasavat adunk. A szuszpenziót 15 percig 120 °C-on hevítjük. Ezután meghatározzuk a 14C/3H arányt a kettős jelölés folyadékszcintillációs számolásával. Ez az arány az oldallánc-hasítási reakció közvetlen mértéke, mivel a l4C-vel jelzett oldallánc izokaprilsav formájában elpárolog a keverékből a hevítés folyamán.
A vizsgálattal megállapítottuk, hogy a S. cerevisiae SCC-105-ből nyers tisztítással nyert P450SCC frakciónak oldallánc-hasító aktivitása van. Három óra inkubálással a koleszterin 45%-a konvertálódott. Vékonyréteg-kromatográfíával megállapítottuk, hogy a termék pregnenolon.
13. példa
A citokróm szteroid 17a-hidroxilázt (P^17a) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása
Az 1. példában leírt mellékvesekéreg-cDNS-gyűjteményből körülbelül 106 plakk-képző egységet (pfu) szelektálunk P4501 7a-cDNS-szekvenciákat illetően oly módon, hogy két P450 1 7acDNS-re specifikus 32P-végjelzett szintetikus oligomerrel szűrjük a gyűjteményt. A 17α-1 oligomer (5’ -AGT GGC CAC TTT GGG ACG CCC AGA GAA TTC- 3’) és a 17a-2-oligomer (5’ -GAG GCT CCT GGG GTA CTT GGO ACC AGA GTG CTT GGT- 3’) komplementer a Zuber és munkatársai [J. Bioi. Chem., 261, 2475-2482 (1986)] szerinti P4501 7a-cDNS-szekvenciával a 349-320, illetve 139-104 pozíciókban.
A 17α-1-gyei való szelekciói 1500 hibridizáló pfu-t eredményezett. Számos hibridizáló pfu-t szelektáltunk, tisztítottunk és szaporítottunk fel fág DNS preparatív izolálása céljából. A rekombináns lambda-gtl 1 DNS-ek EcoRI inszertumait a pTZ18R EcoRI helyére szubklónoztuk. Egy kiónt, a pGB17a-l ki ónt, tovább vizsgáltunk restrikciós endonukleáz térképezéssel és DNSszekvenálással. A pGB17a-l plazmid egy olyan 1,4 kb EcoRI inszertumot tartalmaz, amely komplementer a Zuber és munkatársai által leírt P45017a 3’-részével a 320-as pozíciónál lévő EcoRI helytől az 1721-es pozíciónál lévő poliadenilációs helyig. A pGB17a-l térképét a 22A. ábra mutatja be.
A 17a-2-oligomerrel nyolc hibridizáló pfu-t kapunk a cDNS-gyűjtemény szűrésekor. A rekombináns fágok tisztítása, felszaporítása, majd a rec lambda-gtl 1 DNSek izolálása után az EcoRI inszertumokat a pTZ18R EcoRI helyére szubklónoztuk. Az EcoRI inszertumok hossza 270 bp-től 1,5 kb-ig váltakozott. Csak egy kiónt, a 345 bp EcoRI fragmentumot tartalmazó pGB17a-2 kiónt vizsgáltuk tovább nukleotidszekvenálással, és ezt hasonlítottuk a Zuber és munkatársai által publikált P4501 7acDNS-szekvencia-adatokhoz. A 22B. ábrán látható, hogy a pGB17a-2-ben lévő P45017acDNS-szekvencia az előrelátott AUG startkodontól 72 bp-al upstream a 42-es pozíciónál kezdődik, és teljes homológiát mutat a P45017a cDNS 5’ részével a 320-as pozíciónál lévő EcoRI helyig, mint ezt Zuber és munkatársai leírták.
A teljes hosszúságú szarvasmarha P45017acDNS-t úgy szerkesztjük meg, hogy a pGB17a-l EcoRI-gyel való részleges emésztéssel kapott 1,4 kb méretű fragmentumát és a pGB 17a-2 345 bp méretű EcoRI fragmentumát tartalmazó ligációs keveréket molekuláris klónozással bevisszük E. coli JM101 sejtekbe. A kapott pGB17a-3 klón egy teljes hosszúságú szarvasmarhaP450l 7acDNS-t tartalmaz, és a 22C. ábra mutatja be. (A pGB17a-3-at Bglü-vel végzett restrikciós enzimes analízissel és a génen belül levő EcoRI hely feletti szekvenálással ellenőriztük, hogy helyes orientációjú-e az 5’ P450 1 7a-fragmentum.)
14. példa
Egy teljes hosszúságú P^l 7o. cDNS-klón szerkesztése és transzformálása Kluyveromyces lactis élesztősejtekbe
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
Annak érdekében, hogy a szarvasmarha a P450 1 7a számára élesztősejtekben alkalmas expressziós vektort készítsünk, a pGB17a-3-ban helyre irányuló mutagenezissel mutációt hajtunk végre Zoller és Smith [Methods in Enzymol., 100, 468-500 (1983); Methods in Enzymol., 154, 329-350 (1987)] és Kramer és Fritz [Methods in Enzymol., 154, 350-367 (1987)] leírása szerint. Az in vitro mutagenezises kísérletekhez a plazmidokat és törzseket a Pharmacia cégtől szereztük be.
A 23. ábrán látható, hogy az ATG iniciációs kodontól közvetlen upstream 9 bp-t megváltoztattunk, hogy egy Sáli restrikciós helyet kapjunk és optimális élesztő transzlációs szignálokat az alábbi 17a-3 szintetikus oligomer segítségével:
HU217411 Β
SÁL 1
5’ -TCTTTGTCCTGACTGCTGCCAGTCGACAAAAATGTGGCTGCTC- 3’
A kapott pGB17a-4 plazmidot Sall-gyel és Smal-gyel emésztjük; a teljes hosszúságú P450 1 7(X cDNS-t tartalmazó DNS-fragmentumot gél elektroforézissel választjuk el, izoláljuk, és E. coli JM101 sejtekben való molekuláris klónozással visszük be a pGB950 vektorba (lásd az 5. példát), amelyet először Xhol-gyel emésztettünk, a ragadós végeket Klenow DNS polimerázzal betöltöttük, majd ezután Sall-gyel emésztettük, miáltal a 24. ábra szerinti pGB17a-5 plazmidhoz jutottunk.
b) A K. lactis transzformálása
A pGB17a-5-ből, melyet a laktáz promoterben lévő egyetlen SacII helynél elhasítottunk, 15 pg-ot használunk a K. lactis (CBS 2360) törzs transzformálására az 5. példa szerint. A transzformált sejteket Southem-analízissel vizsgáljuk a gazda genomjába integrált pGB17ct-5 szekvenciák jelenlétére. Egy transzformált sejtet, a 17a5’ -GCT GCC ACC CAG AQC_ Nde
A kapott pGB17a-6 plazmidot részlegesen emésztjük EcoRI-gyel (<1 egység/pg DNS, 1 óra): a teljes hoszszúságú P4501 7a cDNS-t tartalmazó 1,726 kb méretű DNS-fragmentumot gél elektroforézissel elválasztjuk, izoláljuk és az EcoRI-gyel emésztett pBHA-1 DNS-hez (7,336 kb fragmentum) ligáljuk, mint ezt a 26. ábrán bemutatjuk. A ligátumot molekuláris klónozással - ligációs keverék formájában - átvisszük E. coli JM101 sejtekbe, s így jutunk a pGB17a-7-hez.
b) AB. subtilis és B. licheniformis transzformálása
A „Hpall” Bacillus promotert a P450 1 7a cDNS-szekvenciáktól upstream vezetjük be a következőképpen: a pGB17a-6-ot az Ndel restrikciós enzimmel emésztjük, az ingázóplazmid 3,7 kb méretű E. coli részét agaróz gél elektroforézissel választjuk el, és ezután religáljuk és transzformáljuk a B. subtilis 1A40 (BGSC 1A40) kompetens sejteket. A neomicinrezisztens telepeket analizáljuk, és így jutunk a pGBl 7a-8 plazmidhoz (27. ábra).
A B. licheniformis T5 (CBS 470.83) gazdasejteket a pGB17a-8 plazmiddal transzformáljuk. A plazmid stabilan fennmarad a megfelelő Bacillus gazdasejtekben, amint ezt számos generáció után is megállapítottuk a pGB17a-8 restrikciós analízisével. 16
16. példa
A Piz.nl 7a in vivő aktivitása Kluyveromyces lactis
17a-101-ben
A K. lactis 17a-101 törzset a 14. példában leírtak szerint kapjuk meg. A mikroorganizmussal 100 ml D táptalajt oltunk be. A D táptalaj összetétele 1 liter desztillált vízben a következő:
Élesztőkivonat (Difco) 10 g
Bacto pepton (Oxoid) 20 g
Glükóz 20 g
Sterilizálás és 30 °C-ra való lehűtés után 40 ml desztillált vízben oldott 2,68 g élesztő nitrogén bázist (Difco:
101 sejtet, amely a pGB17a-5-ből legalább három má5 solatot tartalmazott a gazda genomiális DNS-ében, tovább vizsgáltunk P45017a in vivő aktivitására (lásd a 16. példát).
15. példa
A P450l 7a szerkesztése és transzformálása Bacillus subtilis és Bacillus licheniformis bakteriális gazdasejtekben
a) Az expressziós vektor szerkesztése
Annak érdekében, hogy Bacillus gazdasejtekben al15 kalmas expressziós vektorhoz jussunk, szarvasmarhaP45017a-3-ban helyre irányuló mutagenezissel mutációt hajtunk végre a 14. példában leírtak szerint.
A 25. ábrán látható, hogy az ATG iniciációs kodonnál egy Ndel restrikciós helyet vezettünk be az alábbi 17a-4 szintetikus oligomer használatával:
ATA TQT GGC TGC TCC T- 3’
I yeast nitrogén base; membránszűréssel sterilizálva) és 1 ml desztillált vízben oldott 50 mg neomicint (membránszűréssel sterilizálva) adunk a táptalajhoz. Ezután 1,5 ml dimetil-formamidban feloldott 50 mg progeszteront adunk 100 ml táptalajhoz. A tenyésztést 120 órán át 30 °C-on végezzük, majd 50 ml metilén-dikloriddal extrahálunk. Az elegyet lecentrifugáljuk, és elválasztjuk az organikus oldószerrétegeket. A metilén-dikloridot vákuumdesztillálással elpárologtatjuk, és a száraz kivonatot (körülbelül 200 mg) 0,5 ml kloroformban vesszük fel. Ez a kivonat 17a-hidroxi-progeszteront tartalmaz vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint. A vegyület szerkezetét H-MMR- és l3C-MMR-méréssel erősítettük meg. Az MMR-analízis azt is kimutatta, hogy a kivonatban a 17a-hidroxi-progeszteron/progeszteron arány körülbelül 0,3 volt.
17. példa
A szarvasmarha ^450 szteroid 21-hidroxilázt (P450C21) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása
Az 1. példában leírtak szerint előállított mellékvesekéreg-cDNS-gyűjteményből körülbelül 106 plakk-képző egységet (pfu) hibridizálunk egy 32P-végjelzett oligo C21-l-gyel. Ez az oligomer, mely az 5’ -GAT GAT
GCT GCA GGT AAG CAG AGA GAA TTC- 3’ szekvenciát tartalmazza, a szarvasmarha P450C21 gén specifikus szondája. A gén a P450C21cDNS-szekvenciában lévő EcoRI helytől downstream helyezkedik el, amint ezt Yoshika és munkatársai [J. Bioi. Chem., 261,4106-4109:
(1986)] leírták. A szűrés egy hibridizáló pfu-t eredményezett. E rekombináns lambda-gtl 1 DNS-ből az EcoRI inszertumot a pTZ18R EcoRI helyére szubklónozzuk, s így kapjuk a pGBC21-l elnevezésű szerkezetet. A 28. ábra bemutatja, hogy ez a plazmid egy 1,53 kb
EcoRI inszertumot tartalmaz, amely komplementer a
HU 217 411 Β
P450C21cDNS-szekvenciával a Yoshika és munkatársai szerinti 489-es EcoRI pozíciótól a poliadenilációs helyig, s ezt nukleotidszekvenálással mutattuk ki.
A P450C21cDNS fennmaradt 5’ részének (490 bp) izolálása céljából egy új szarvasmarhamellékvesekéreg-cDNS-gyűjteményt készítettünk az 1. példában leírt eljárás szerint, egyetlen módosítással. Az első cDNS-szál szintézise érdekében primerként egy kiegészítő oligomert használtunk, a C21-2 oligomert. Az 5’ -AAG CAG AGA GAA TTC- 3’ nukleotidszekvenciájú oligomer a P450C21cDNS EcoRI helyétől downstream, az 504-490 pozícióban helyezkedik el.
Ennek a cDNS-nek a szűrése a 32P-végjelzett C21-3 oligomerrel körülbelül 100 hibridizáló pfu-t eredményezett. A C21-3 oligomer az 5’ -CTT CCA CCG GCC CGA TAG CAG GTG AGC GCC ACT GAG3’ (72-37 pozíciók) P450C21-re specifikus szekvenciát tartalmazza. Csak egy rekombináns lambda-gtll DNS EcoRI inszertumát szubklónoztuk a pTZ18R EcoRI helyére, melynek eredménye a pGBC21-2 elnevezésű szerkezet lett.
Ez a plazmid (28. ábra) egy olyan 540 bp inszertumot tartalmaz, amely komplementer a P450C21cDNSszekvenciával a -50 pozíciótól a 489-es pozíciónál lévő EcoRI helyig, s ezt nukleotidszekvenálással igazoltuk.
18. példa
Egy P45()C21cDNS Bacillus expressziós vektor szerkesztése és a Bacillus subtilis és Bacillus licheniformis bakteriális gazdasejtek transzformálása e vektorral
a) Az expressziós vektor szerkesztése
Annak érdekében, hogy egy olyan teljes hosszúságú P450C21cDNS-t szerkesszünk, amelyet a pBHA-1 Bacillus expressziós vektor számára specifikus szekvenciák határolnak, a P450C21 gén 5’ részét először polimeráz lánc reakció (PCR=Polymerase Chain Reaction) módszer segítségével módosítjuk, templátként a pGBC21-2-t és primerek gyanánt a P45()C21 oligomereket használva. A C21-4 oligomer (5’ -CTC ACT GAT ATC CAT ATG GTC CTC GCA GGG GTG CTG- 3’) 21 olyan nukleotidot tartalmaz, amelyek a C21 szekvenciával az 1-21 pozícióban komplementerek, és 18 kiegészítő bázist, hogy egy EcoRV restrikciós helyet és egy Ndel restrikciós helyet képezzenek az ATG iniciációs kodonnal.
A C21-5 oligomer (5’ -AGC TCA GAA TTC CTT CTG GAT GGT CAC- 3’) 21 bázisa a 489-es pozícióban lévő EcoRI helytől upstream lévő mínusz szállal komplementer.
A PCR-t Saiki és munkatársai [Science, 239, 487-491) (1988)] leírása szerint, kisebb módosításokkal végeztük el. A PCR 100 μΐ térfogatban ment végbe, melynek összetétele a következő volt: 50 mM KC1, 10 mM írisz.HC1 (pH=8,3), 1,6 mM MgCl2, 0,01% (tömeg/térfogat) zselatin, 200-200 μΜ a dNTP-kből, 1-1 μΜ a C21 primerekből és 10 ng pGBC21-2 templát. Denaturálás után (7 perc 100 °C) és 2 egység Taqpolimeráz (Cetus) hozzáadása után a reakciót 25 amplifikációs cikluson (mindegyik ciklusban 2’ 55 °C, 3’ 72 °C és 1’ 94 °C) keresztül visszük végbe DNS-amplifier készülékben (Perkin-Elmer).
Az utolsó ciklusban kihagyjuk a denaturációs lépést. A P450C21cDNS megnövelésének (ampolification) sematikus képét a 29. ábrán mutatjuk be.
A megnövelt fragmentumot (330 bp) EcoRV-tel és EcoRI-gyel emésztjük, és molekuláris klónozás révén beépítjük EcoRV-tel és EcoRI-gyel emésztett pSP73 (Promega) EcoRI helyére. A kapott plazmid pGBC21-3 elnevezést kapott. A 30. ábrán látható, hogy a 3’ P450C21-EcoRI fragmentum jobb oldali irányítottsággal van beépítve a pGBC21-3 EcoRI helyére. A kapott pGBC21-4 vektort EcoRV-tel és KpnI-gyel (a KpnI a pSP73 többszörös klónozóhelyén található) emésztjük, és a teljes hosszúságú P450C21cDNS-t tartalmazó fragmentumot gél elektroforézissel izoláljuk, és molekuláris klónozással beépítjük a pBHA-1 megfelelő helyére. A kapott pGBC21-5 plazmidot a 31. ábra ábrázolja.
b) A Bacillus transzformálása
A „Hpall” Bacillus promotert a P450C21cDNS géntől upstream vezetjük be azáltal, hogy a pGBC21-5 plazmidot Ndel restrikciós enzimmel emésztjük, az ingázóplazmid 3,9 kb méretű E. coli részét elválasztjuk agaróz gél elektroforézissel, majd religálunk a fennmaradó 5,47 kb fragmentummal, és transzformáljuk a B. subtilis 1A40 (BGSC 1A40) kompetens sejteket. A neomicinrezisztens kolóniák vizsgálata révén jutunk a pGBC21-6 plazmidhoz (32. ábra).
A B. licheniformis T5 (CBS 470.83) gazdasejtek transzformálását szintén pGBC21-6-tal végezzük. A plazmid stabilan fennmarad a Bacillus gazdasejtekben, s ezt restrikciós analízissel mutattuk ki.
19. példa
P4S0C21 cDNS élesztő expressziós vektor szerkesztése és a Kluyveromyces lactis élesztőgazdasejtek transzformálása
a) Az expressziós vektor szerkesztése
Annak érdekében, hogy a P450C21 számára élesztőgazdasejtekben alkalmas expressziós vektorhoz jussunk, a pGBC21-2 plazmidban helyre irányuló mutagenezissel mutációs végzünk a 14. példában leírtak szerint. A mutációhoz a C21-6 oligomert (5’ -CCT CTG CCT GGG TCG ACA AAA ATG GTC CTC GCA GGG3’) használjuk, melynek révén egy Sáli restrikciós helyet hozunk létre és optimális élesztő transzlációs szignálokat az ATG iniciációs kodontól upstream, amint ezt a 33. ábrán bemutatjuk.
A kapott pGBC21-7 plazmid Sall/EcoRI fragmentumát a pGBC21-l 3’ P450C21-EcoRI fragmentumához ligáljuk, és ezt molekuláris klónozás révén beépítjük a pSP73 megfelelő Sáli és EcoRI helyére (lásd a 34. ábrát). Az így kapott pGBC21-8 plazmidot Sall-gyel és EcoRV-tel (az EcoRV hely a pSP73 sokszoros klónozóhelyén található) hasítjuk, és a teljes hosszúságú P450C21cDNS-t tartalmazó DNS-fragmentumot beépítjük a pGB950 élesztő expressziós vektorba. A kapott pGBC21-9 plazmid a 35. ábrán látható.
HU 217 411 Β
b) A K. lactis transzformálása
A pGBC21-9 15 pg-ját SacII-vel emésztjük, s a K. lactis CBS 2360 transzformálását az 5. c) példában leírt módon végezzük el.
20. példa
A szarvasmarha citokróm P450 szterőid 77βhidroxilázt (Ρ450//β) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása
Az 1. példában leírtak szerint szarvasmarhamellékvesekéreg-cDNS-gyűjteményt hozunk létre egy módosítással. Az első cDNS-szál szintézisének reakcióelegyéhez egy további P450l 1 β-specifikus prímért (11 β-1 oligomer) adunk, melynek nukleotidszekvenciája a következő: 5’ -GGC AGT GTG CTG ACA CGA- 3’. A 11 β-l oligomer a transzlációs stopkodontól közvetlenül downstream helyezkedik el az 1530-1513 pozíciókban. Az említett Ρ4501 1β oligomerek nukleotidszekvenciáit és térképi elhelyezkedését a Morohashi és munkatársai [J. Biochem., 702, 559-568 (1987)] által a P450l 1 β cDNS-re leírt szekvenciaadatokból származtatjuk. A cDNS-gyűjteményt egy olyan 27 * * * * 32P-vel jelzett 11β-2 oligomerrel (5’ -CCG CAC CCT GGC CTT TGC CCA CAG TGC CAT- 3’) szűrjük, amely a P450l 1 β cDNS 5’-végénél helyezkedik el, az 1-36 pozíciókban.
A 11 β-2-vel való szűrés 6 hibridizáló pfü-t eredményezett. Ezeket tovább tisztítottuk és a 11 β-3 oligomerrel (5’ -CAG CTC AAA GAG AGT CAT CAG CAA GGG GAA GGC TGT- 3’; 990-955 pozíciók) analizáltuk. A hat közül kettő adott pozitív hibridizációs szignált a 32P-vei jelzett 11 β-3 oligomerrel.
A két 1 Ιβ-lambda-gtl 1 rekombináns plazmid EcoRl inszertumát a pTZ18R EcoRl helyére szubklónoztuk. Egy 2,2 kb EcoRl inszertumot tartalmazó kiónt (pGBl 1 β-1) tovább vizsgáltunk restrikciós enzimes térképezéssel (lásd a 36. ábrát). A ρΟΒ11β-1- minden olyan kódolószekvenciát tartalmaz, amelyet Morohashi és munkatársai a P450l 1β cDNS-re meghatároztak.
27. példa
A P450C21cDNS Bacillus expressziós vektor szerkesztése és a Bacillus subtilis és Bacillus licheniformis bakteriális gazdasejtek transzformálása a) Az expressziós vektor szerkesztése
A pBHA-1 Bacillus expressziós vektorhoz teljes hosszúságú P450l 1β cDNS-t készítünk, módosított határszekvenciákkal. A 18. példában leírt PCR módszert alkalmaztuk, templátként a ρΟΒ11β-1 és primerként két specifikus P450l 1 β-oligomer használatával.
A 11 β-4 oligomer (5’ -TTT GAT ATC GAA TTC CAT ATG GGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC3’) 21 olyan bázist tartalmaz, amelyek komplementerek az érett P450l 1β cDNS-szekvenciával a 72-93 pozíciókban, és 21 bázist az EcoRV, EcoRl és Ndel restrikciós helyek és ATG iniciációs kodon létesítése céljára.
A 11β-5 oligomer (5’ -TAA CGA TAT CCT CGA GGG TAC CTA CTG GAT GGC CCG GAA GGT3’) 21 olyan bázist tartalmaz, amelyek a P4sol 1β cDNS mínusz szálával komplementerek az 1511-es pozícióban lévő transzlációs stopkodontól upstream, és 21 bázist az EcoRV, Xhol és Kpnl restrikciós helyek létesítése céljára.
A fent említett templáttal és P450l 1 β-primerekkel végzett PCR amplifikáció után a megnövelt fragmentumot (1,45 kb) EcoRI-gyel és KpnI-gyel emésztjük, és molekuláris klónozással bevisszük az EcoRI-gyel és KpnI-gyel hasított pBHA-1 Bacillus expressziós vektorba, miáltal a ρΟΒ11β-2 vektorhoz jutunk (lásd a 36. ábrát).
b) A Bacillus transzformálása
A „Hpall” Bacillus-promotert a Ρ45011β cDNSszekvenciáktól upstream építjük be oly módon, hogy a ρΟΒΙΙβ-2-t Ndel-gyel emésztjük, az ingázóplazmid E. coli részét elválasztjuk agaróz gél elektroforézissel, majd religálunk (ahogyan a 18. példában leírtuk) és B. subtilis 1A40 (BGSC 1A40) kompetens sejteket transzformálunk. Neomicinrezisztens telepeket analizálunk, és így kapjuk a pGBl 1 β-3 plazmidot. A kapott pGBl 1 β-3 plazmidot bevisszük B. lichaniformis T5 (CBS 470.83) gazdasejtekbe is.
22. példa
P^qII^ cDNS élesztő expressziós vektor szerkesztése és Kluyveromyces lactis élesztőgazdasejtek transzformálása
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGB950 élesztő expressziós vektor számára úgy kapunk módosított szekvenciákkal határolt teljes hosszúságú Ρ4501 1β cDNS-t, hogy a PCR módszert (a 18. példában írtuk le) alkalmazzuk, templátként használva a ρΟΒΙΙβ-1-et és primerként a két specifikus P450l 1 β-oligomert.
A 11 β-6 oligomer (5’ -CTT CAG TCG ACA AAA ATG GGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC- 3’) 21 olyan bázist tartalmaz, melyek komplementerek az érett P450I 1β cDNS-szekvenciával a 72-93 pozíciókban, és 18 további bázist egy Sáli restrikciós hely, egy optimális élesztő transzlációs szignál és egy ATG iniciációs kodon képzése céljából.
A 11 β-5 oligomert a 21. a) példa úja le. A fent említett templáttal és a P450l 1β primerekkel való PCR amplifikáció után a megnövelt fragmentumot (1,45 kb) Sallgyel és Xhol-gyel emésztjük, majd molekuláris klónozással beépítjük a Sall-gyel hasított pGB950 élesztő expressziós vektorba. így kapjuk a pGBl 1 β-4 vektort (37. ábra).
b) A K. lactis transzformálása
A pGBl 1β-415 pg-ját elhasítjuk a laktáz promoterben lévő egyetlen SacII helynél és a K. lactis CBS 2360 sejteket az 5. c) példában leírtak szerint transzformáljuk.
23. példa
Az adrenodoxint (ADX) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása és szerkesztése, s ezt követően Kluyveromyces lactis élesztősejtek transzformálása ADXcDNS-sel
a) Az ADX molekuláris klónozása
A pGB950 élesztő expressziós vektor számára módosított 5’ és 3’ határolószekvenciákkal rendelkező tel17
HU 217411 Β jes hosszúságú ADXcDNS-t közvetlenül szarvasmarhamellékvesekéreg-mRNS/cDNS poolból állítjuk elő (részletes leírást lásd az 1. példában) PCR módszerrel végzett amplifikációval (lásd a 18. példát).
Az ADXcDNS megnöveléséhez két szintetikus oligomert szintetizálunk.
Az ADX-1 oligomer (5’ -CTT CAG TCG ACA AAA ATG AGC AGC TCA GAA GAT AAA ATA- 3’) 21 bázist tartalmaz, amelyek az Okamura és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 5705-5709 (1985)] által leírt érett ADXcDNS-szekvencia 5’-végével a 173-194 pozíciókban komplementerek. Az ADX-1 oligomer 18 további nukleotidot tartalmaz 5’-végénél, egy Sáli restrikciós hely, egy optimális élesztő transzlációs szignál és egy ATG iniciációs kodon kialakítása érdekében.
Az ADX-2 oligomer (5’ -TGT AAG GTA CCC GGG ATC CTT ATT CTA TCT TTG AGG AGT T3’) az ADXcDNS mínusz szálának 3’-végével komplementer az 561-540 pozíciókban, és további nukleotidokat tartalmaz BamHI, Smal és KpnI restrikciós helyek képzése végett.
A PCR-t a 18. példában leírtak szerint végezzük 1-1 pmol ADX primer és 10 μΐ mRNS/cDNS keverék (lásd az 1. példát) mint templát felhasználásával.
Az ADXcDNS amplifikációjának sematikus ábrázolása a 38. ábrán látható.
A megnövelt fragmentum módosított határolószekvenciákkal ellátott teljes hosszúságú ADXcDNS-szekvenciát tartalmaz, amelyet restrikcióshely-analízissel és nukleotidszekvenálással azonosítottunk.
b) Az expressziós vektor szerkesztése
A megnövelt ADXcDNS-fragmentumot Sail-gyel és Smal-gyel emésztjük, és molekuláris klónozással beépítjük a Sall-gyel és EcoRV-tel hasított pGB950 élesztő expressziós vektorba. A kapott pGBADX-1 plazmidot a 38. ábra mutatja be.
c) A K. lactis transzformálása
A pGB ADX-1 15 pg-ját a laktáz promoterben lévő egyetlen SacII helynél hasítjuk, és a K. lactis CBS 2360 transzformálását az 5. c) példában leírtak szerint végezzük el.
d) A transzformált sejtek vizsgálata
Két transzformált sejtet, az ADX-101 és ADX-102 sejtet, valamint a kontroll CBS 2360 törzset választottuk a további vizsgálathoz. A törzseket YEPD táptalajban tenyésztjük körülbelül 64 órán át 30 °C-on. A sejtek összproteinjét izoláljuk az 5. d) példában leírtak szerint. A felülúszókból 8 μΐ-es mintákat veszünk immunobiot vizsgálathoz (lásd a 39. ábrán a 3-as, 4-es és 5-ös sávot).
Az eredmények azt mutatják, hogy a pGBADX-1gyel transzformált K. lactis-sejtek a várt hosszúságú proteint (14 kD) fejezik ki.
Az ADX-2 transzformált sejt in vitro aktivitásának vizsgálatát a 24. példa írja le.
24. példa
A Kluyveromyces lactis ADX-102-ből kapott adrenodoxin in vitro aktivitása
A 23. példában leírtak szerint előállított K. lactis ADX-102 sejteket és a kontroll K. lactis CBS 2360 törzset 100 ml YEPD táptalajban (1% élesztőkivonat, 2% glükóz-monohidrát) tenyésztjük, mely 6,7% (tömeg) élesztő nitrogén alapot (Difco; yeast nitrogén base) és 100 mg/1 geneticint (G418 szulfát; Gibco Ltd.) tartalmaz. A tenyésztést 56 órán át, 30 °C-on végezzük. A sejteket centriíugálással gyűjtjük össze (4000 g; 15 perc), fiziológiás sóoldatban reszuszpendáljuk, és foszfát pufferrel (pH=7,0; 50 mM) mossuk. Centrifugálás után az üledéket foszfát pufferben (pH=7,0; 50 mM) reszuszpendáljuk úgy, hogy egy 0,5 g nedves tömeg/ml-t tartalmazó sejtszuszpenziót kapjunk. A sejteket egy Braun-féle MSK homogenizátorban táljuk fel (6x15 másodperc; 0,45-0,50 mm-es üvegszemcsék). Az el nem roncsolódott sejteket centrifugálással (4000 g; 15 perc) távolítjuk el. A sejtmentes kivonatot (40 mg protein/ml) -20 °C-on tároljuk.
A sejtmentes kivonat ADX-aktivitását, azaz az adrenodoxin reduktáz elektrontranszfer kapacitását a citokróm P45()SCC-vel szemben egy P450SCC-aktivitás assay-vel határoztuk meg. Az assay-ben használt reakcióelegy a következő oldatokat tartalmazza:
Az oldat (természetes P450SCC elektrondonor rendszer ADX nélkül): 50 mM kálium-foszfát puffer (pH=7,0), amely 3 mM EDTA-t, 2 μΜ adrenodoxin reduktázt (szarvasmarha-mellékvesekéregből tisztítva), 15 mM glükóz-6-foszfátot és 16 egység/ml glükóz-6foszfát-dehidrogenázt (NADPH regenerálórendszer) tartalmaz.
B oldat (szubsztrátum és enzim): 75 μΜ összmenynyiségben kettős radioizotópos jelöléssel koleszterinrészecskéket {[26,27-14C] koleszterin (40 Ci/mól) és [7a3H] koleszterin (400 Ci/mol)} és 1,5 μΜ P450SCC-t (szarvasmarha-mellékvesekéregből tisztítva) tartalmazó 10% (térfogat/térfogat) Targitol™-tartalmú NP40/etanol (1:1, térfogat/térfogat) oldat.
A vizsgálatot úgy kezdjük, hogy összekeverünk 75 μΐ A oldatot, 50 μΐ B oldatot és 125 μΐ sejtmentes kivonatot vagy 125 μΐ kálium-foszfát puffért (50 mM; pH = 7,0), mely 10 μΜ ADX-et (szarvasmarha-mellékvesekéregből tisztítva) tartalmaz. A keveréket óvatosan kevertetjük 30 °C-on. Mintákat veszünk 15 perc inkubálás után, s a mintákat 100 μΐ vízzel hígítjuk. Egy mintából 100 μΐ metanollal és 150 μΐ kloroformmal extraháljuk a szubsztrátumot és a terméket (termékeket). Centrifugálás (5000 g; 2 perc) után a kloroformos fázist összegyűjtjük, és szárítjuk. A száraz maradékot 0,5 mg szteroidkeveréket [koleszterin, pregnenolon és progeszteron (1:1:1; tömeg)] tartalmazó 50 μΐ acetonban oldjuk fel, majd hozzáadunk 110 μΐ koncentrált hangyasavat. A szuszpenziót 15 percig 120 °C-on hevítjük. Ezután megmérjük a l4C/3H arányt kettős jelölésű folyadékszcintillációs számolással. Az arány közvetlen mértéke az oldallánc-hasítási reakciónak, mivel a 14C-vel jelzett oldallánc izokaprilsav alakjában elpárolog a keverékből a hevítési lépés folyamán.
Ezzel a vizsgálattal könnyen kimutatható az ADX elektronhordozó aktivitása a K. lactis ADX-102 sejtmentes kivonatában. A K. lactis sejtmentes kivonatával vagy a tiszta ADX-szel végzett vizsgálatokban a ko18
HU 217 411 Β leszterin oldallánca 15 percen belül 50%-os hozammal lehasadt, míg a kontroll K. lactis CBS 2360 törzs sejtmentes kivonatával végzett vizsgálatban nem volt észlelhető oldallánc hasítás.
25. példa
A szarvasmarha adrenodoxin oxidoreduktázt (ADR) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása és szerkesztése, és ezt követően a Kluyveromyces lactis élesztősejtek transzformálása ADRcDNS-sel
a) Az adrenodoxin oxidoreduktáz molekuláris klónozása
Az 1. példa szerinti szarvasmarhamellékvesekéregcDNS-gyűjteményt készítünk egy módosítással. Egy kiegészítő ADR-specifikus prímért (ADR-1 oligomer) adunk az első cDNS-szál szintézisének reakcióelegyéhez. Az ADR-1 oligomer nukleotidszekvenciája a következő: 5’-GGC TGG GAT CTA GGC- 3’. Az ADR-1 oligomer a transzlációs stopkodontól éppen downstream helyezkedik el, az 1494-1480 pozíciókban. Az említett ADR oligomerek nukleotidszekvenciáit és térkép szerinti helyzetét a Nonaka és munkatársai [Biochem. Biophys. Rés. Comm., 145, 1239-1247 (1987)] által leírt ADRcDNS-szekvenciaadatokból vettük.
A kapott cDNS-gyűjteményt a 32P-vel jelzett ADR-2 oligomeirel (5’ -CAC CAC ACA GAT CTG GGG GGT CTG CTC CTG TGG GGA- 3’) szüljük.
Négy hibridizáló pfü-t azonosítottunk, majd tisztítottunk, azonban csak 1 pfü adott pozitív jelet az ADR-3mal (5’ -TTC CAT CAG CCG CTT CCT CGG GCG AGC GGC CTC CCT- 3’) is, amely az ADRcDNS közepén (840-805 pozíciók) helyezkedik el. Az ADRcDNS inszertumot (körülbelül 2 kb) molekuláris klónozással a pTZl 8R EcoRI helyére klónozzuk be.
A kapott pGBADR-1 plazmid egy teljes hosszúságú ADRcDNS-t tartalmaz, amint ezt restrikciós enzimes térképezéssel és nukleotidszekvenálással kimutattuk. A pGB ADR-1 fizikai térképét a 40. ábrán mutatjuk be.
b) Az expressziós kazetta szerkesztése
Teljes hosszúságú ADRcDNS-t kapunk a pGB950 élesztő expressziós vektor számára módosított határolószekvenciákkal, PCR módszerrel (lásd a 18. példát), a pGB ADR-1-nek mint templátnak és a két specifikus ADR oligomemek mint primereknek a felhasználásával.
Az ADR-4 oligomer (5’ -CGA GTG TCG ACA AAA ATG TCC ACA CAG GAG CAG ACC- 3’) 18 olyan bázist tartalmaz, amelyek az érett ADRcDNSszekvenciával komplementerek a 96-114 pozíciókban, és 18 bázist abból a célból, hogy bevezessünk egy Sáli restrikciós helyet, egy optimális élesztő transzlációs szignált és egy ATG iniciációs kodont.
Az ADR-5 oligomer (5’ -CGT GCT CGA GGT ACC TCA GTC CCC CAG CAG CCG CAG- 3’) 18 olyan bázist tartalmaz, amelyek az ADRcDNS mínusz szálával komplementerek az 1479-es pozíciójú stopkodontól upstream és 15 bázist tartalmaz KpnI és Xhol restrikciós hely megteremtése érdekében, különböző expressziós vektorokba való molekuláris klónozás céljára.
A fent említett templáttal és ADR primerekkel végzett amplifikáció után a megnövelt fragmentumot (1,4 kb) Sall-gyel és Xhol-gyel emésztjük, és beépítjük molekuláris klónozással a Sall-gyel és Xhol-gyel hasított pGB950 élesztő expressziós vektorba.
A kapott pGBADR-2 plazmidot a 40. ábra ábrázolja,
c) A K. lactis transzformálása
A pGBADR-2 15 pg-ját a laktáz promoterben lévő egyetlen SacII helynél hasítjuk, és a K. lactis CBS 2360 sejtek transzformálását az 5. c) példákban leírtak szerint hajtjuk végre.
26. példa
A szarvasmarha NADPH-citokróm ^450 reduktázt (RED) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása
A 1. példában leírtak szerint szarvasmarhamellékvesekéreg-cDNS-gyűjteményt a 32P-vel jelzett 5’ -TGC CAG TTC GTA GAG CAC ATT GGT GCG TGG CGG GTT AGT GAT GTC CAG GT- 3’ szintetikus oligomeirel szűrjük, amely specifikus a patkány-, disznó- és nyúl-RED-ben lévő egy állandó aminosavszakaszra Katagari és munkatársai [J. Biochem., 100, 945-954) (1986)] és Murakami és munkatársai [DNA, 5, 1-10 (1986)] leírása szerint.
Öt hibridizáló pfu-t kaptunk, amelyeket tovább vizsgáltunk restrikciós enzimes térképezéssel és nukleotidszekvenálással. Egy teljes hosszúságú REDcDNS-t építettünk be expressziós vektorokba, és megfelelő gazdasejteket transzformáltunk a 2., 3. és 6. példában említettek szerint.
27. példa
A P450SCC és ADXproteint kódoló expressziós kazetta szerkesztése, transzformálása és kifejeződése Kluyveromyces lactis élesztősejtekben a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGBADX-1 expressziós kazettát (lásd a 23. példát) SacII-vel és HindlII-mal emésztjük (részlegesen) (<1 egység/pg DNS; 1 óra), és a 2,08 kb méretű fragmentum ragadós végét Klenow DNS polimeráz segítségével töltjük be. A laktáz promoter egy részét (mely még működőképes), a kódoló ADX szekvenciát és a laktáz terminátort tartalmazó, körülbelül 2,1 kb méretű DNS-fragmentumot elválasztjuk agaróz gél elektroforézissel, izoláljuk, majd beépítjük a pGBSCC-7-be, amelyet először Xbal-gyel való emésztéssel linearizáltunk [lásd az 5. b) példát], és ragadós végeit Klenow DNS polimerázzal betöltöttünk. A szerkezetet úgy állítottuk össze, hogy egyetlen olyan restrikciós helyet (SacII) kapjunk, amely ahhoz szükséges, hogy a plazmidot a K. lactisba vigyük át.
Ez az egyetlen SacII restrikciós hely az SCC szekvenciát határoló laktáz promoter szekvenciában helyezkedik el, minthogy az ADX szekvenciát határoló laktáz promoterben lévő SacII restrikciós hely a betöltési reakció révén tönkrement.
A kapott pGBSCC/ADX-1 expressziós kazetta mind az SCC-t, mind az ADX-et kódoló szekvenciát tartalmazza, mindkettőt a laktáz promoter irányítása alatt.
HU217411 Β
b) A K. lactis transzformálása
A K. lactis CBS 2360 transzformálását az 5. c) példában leírt módon végezzük 15 pg pGBSCC/ADX-1gyel, amelyet egyetlen SacII helyénél linearizáltunk. Egy transzformált sejtet (SCC/ADX-101) szelektáltunk SCC és ADX expressziós vizsgálatok céljára.
c) A K. lactis SCC/ADX-101 transzformált sejtek analízise
A SCC/ADX-101 és a CBS 2360 kontrolltörzs tenyészetéből sejt protein frakciókat izolálunk az 5. d) példában leírt módon, amelyeket SDS/PAGE és Western blotting segítségével analizálunk. A biotokat SCCre, illetve ADX-re specifikus antitestekkel szondázzuk.
Az SCC/ADX-101 transzformált sejtekből származó sejt protein frakció a kontrolltörzshöz viszonyítva plusz két sávot adott a várt méretekkel (53, illetve 14 kD), ami mindkét protein - SCC és ADX - expresszióját jelenti.
A két protein expressziójának szintje az SCC/ADX101 transzformált sejtekben a csupán egy proteint kifejező transzformált sejtekben megfigyelt szintekhez hasonlítható (SCC-re vonatkozóan lásd a 15A. ábrán a 3-as sávot és az ADX-re vonatkozóan a 39. ábrán az 5-ös sávot).
Az SCC/ADX-101 transzformált sejtek in vitro SCC- és ADX-aktivitását a 28. példában írjuk le.
28. példa
A Kluyveromyces lactis SCC/ADX-101-ből kapott P45(ISCC és adrenodoxin in vitro aktivitása
A 27. példában leírtak szerint kapott K. lactis SCC/ADX-101 sejteket és az 5. d) példa szerinti kontroll K. lactis SCC-101 törzset 1 liter 100 mg/1 geneticint (418szulfát; Gibco Ltd.) tartalmazó YEPD táptalajban (1% élesztőkivonat, 2% pepton, 2% glükóz-monohidrát) tenyésztjük 72 órán át 30 °C-on. A sejteket centrifugálással (4000 g; 15 perc) gyűjtjük össze, fiziológiás sóoldatban reszuszpendáljuk és foszfát pufferrel (pH=7,5; 75 mM) mossuk. Centrifugálás (4000 g; 15 perc) után az üledéket foszfát pufferben (pH=7,5; 75 mM) reszuszpendáljuk úgy, hogy a kapott szuszpenzió ml-enkénti nedves tömege 0,5 g sejt legyen. A sejteket Braun-féle MSK homogenizátorban (6x15 másodperc; 0,45-0,50 mm-es üvegszemcsék) tárjuk fel. Az el nem roncsolt sejteket centrifugálással (4000 g; 15 perc) távolítjuk el.
A sejtmentes kivonatban vizsgáljuk a P450SCC/ADX proteinkomplex aktivitását olyan mó- Anyagok és módszerek dón, hogy meghatározzuk a koleszterin oldallánc hasítási reakciót NADPH és ADR jelenlétében. A reakcióelegy a következő oldatokból áll:
Az oldat (természetes P450SCC elektron donor rendszer ADX nélkül): 3 mM EDTA-t, 2 pM adrenodoxin reduktázt (szarvasmarha-mellékvesekéregből tisztítva), mM NADPH-t (elektron donor), 15 mM glükóz-6foszfátot és 16 egység/ml glükóz-6-foszfát dehidrogenázt (NADPH regeneráló rendszer) tartalmazó 50 mM kálium-foszfát puffer (pH=7,0).
B oldat (szubsztrátum): 37,5 pM összmennyiségben kettős radioizotópos jelölésű koleszterinrészecskéket {[26,27-l4C] koleszterin (40 Ci/mol) és [7a-3H] koleszterin (400 Ci/mol)} tartalmazó 10% (térfogat/térfogat) Tergitol™-tartalmú NP40/etanol (1:1 térfogat/térfogat) oldat.
A vizsgálatot úgy kezdjük, hogy összekeverünk 75 pl A oldatot, 50 pl B oldatot és 125 pl sejtmentes kivonatot. Az elegyet óvatosan kevertetjük 30 °C-on. Hatvan perc inkubálás után mintákat veszünk, melyeket 100 pl vízzel felhígítunk. Egy mintából 100 pl metanollal és 15 pl kloroformmal extraháljuk a szubsztrátumot és a terméket (termékeket). Centrifugálás (5000 g;
perc) után a kloroformréteget levesszük és szárítjuk. A száraz maradékot 50 pl acetonban oldjuk fel, amely 0,5 mg szteroidkeveréket [koleszterin, pregnenolon és progeszteron (1:1:1, tömeg)] tartalmaz, s ezután 110 pl koncentrált hangyasavat adunk a reakcióelegyhez.
A szuszpenziót 15 percig 120 °C-on hevítjük. Ezután meghatározzuk a 14C/3H viszonyt kettős jelölésű folyadékszcintillációs számolással. Az arányszám az oldallánc-hasítási reakció közvetlen mértékét adja meg, mivel a 14C-vel jelzett oldallánc izokaprilsav formájában elpárolog a keverékből a hevítési lépés folyamán.
Ezzel a vizsgálattal a K. lactis SCC/ADX-101 sejtmentes kivonatában oldallánc-hasítási aktivitást mutattunk ki, míg a K. lactis SCC-101 sejtmentes kivonatában nem volt észlelhető aktivitás.
HPLC-analízissel kimutattuk, hogy a K. lactis SCC/ADX-101 sejtmentes kivonata által produkált reakciótermék pregnenolon.
29. példa
A humán 3β HSDH-t kódoló expressziós kazetta szerkesztése, transzformálása és kifejezése Saccharomyces cerevisiae élesztőben
AGAL10/CYC1 promoter esetében:
értelmes (sense) primer: OTG4535;
CCATCGATGGGCTTCGCTGATTAATTATCCCCAGAAATAAGGC reverz primer:
ACCCGGGGTCGACTAATTTATGCTACAAAGGACCTAATG adapterek:
új BamHI-SstI polilinker bevitele
OTG2792: GATCCGCAGATATCATCTAGATCCCGGGTAGAT OTG2794: CTTGAGCTCTACGCAGCTGGTCGACACCTAGGAG
HU 217 411 Β
OTG2795: AATTCTCCTAGGTGTCGACCAGCTGCGT Mlul/Avrll polilinker bevitele:
OTG2919: CAACGCGTCCTAGG OTG2920: AATTCCTAGGACGCGTTGAGCT SnaBI/NotI polilinker bevitele:
OTG2793: AATTGCGGCCGCGTACGTATG és OTG2796: AATTCATACGTACGCGGCCGC.
Piac promoter deléciója:
OTG4470: GGCCGCAAAACCAAA OTG4471: AGCTTTTGGTTTTGC Notl/Clal helyek bevitele:
OTG4478: GATCTATCGATGCGGCCGCG OTG4479: CGCGCGCGGCCGCATCGATA
Miül helyek bevitele:
EcoRI-be: OTG4539: AATTGGACGCGTCC
Xhol-be: OTG4433: TCGACGGACGCGTGG
OTG4434: TCGACCACGCGTCC oligonukleotidok helyre irányuló mutagenezishez:
NotI lacl-be OTG2805: GCGCTCAGCGGCCGCTTTCCAGTCG lacZ szekvenciák csökkentése:
OTG4431: TGGCCGTCGTTTTACTCCTGCGCCTGATGCGGTAT Xhol/Mlul eltávolítása:
OTG4410: GCGGATCTGCTCGAAGATTGCCTGCGCGTTGGGCTTGATC
- Eredmények
1. Új polilinker helyekkel rendelkező pUC származékok előállítása.
M13mpl9-et [Gene 33, 103-119 (1985)] mutagenizálunk OTG2805-tel, és egy NotI helyet viszünk be a lacl gén megmaradó szekvenciájába (M13TG724).
Utána egy EcoRI, SnabI és NotI helyeket tartalmazó polilinkert (OTG2793, OTG2796) viszünk be az
M13TG724 EcoRI helyére. A klónozási lépés alatt azonban az inszertum multiplikációja és módosulása fordul elő. A kapott M13TG7244 szekvenciája a következő:
GAATTCATACGTACGCGGCCGCAATTGCGGCCGGTACGTATAATTCACTGGCCGT
A szekvenciával kapcsolatban megjegyzendő, hogy az EcoRI, SnaBI és NotI helyeket aláhúzás jelöli, míg a pUC19 lacZ szekvenciáját (az utolsó 9 bázist) vastagított betűk jelölik.
Az M13TG7244-et EcoRI-gyel és Sstl-gyel hasítjuk, és az OTG2919 és OTG2920 felhasználásával egy linkért viszünk be, így az M13TG7246-ot kapjuk. Ez a linker Miül és AvrII hasítási helyeket biztosít. Az M13mp 19-nek egy, az M13TG7246 megfelelő restrikciós hasítási helyeit tartalmazó PvuII fragmentumát szubklónozunk pUC 19-be, így a pTG7457-hez (lásd 41. ábra) jutunk.
pUC19-et [Gene 33, 103-119 (1985)] emésztünk BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel, és OTG2792, OTG2797, OTG2794 és OTG2795 használatával egy polilinkert viszünk be, így a pTG7453-hoz jutunk (42. ábra).
A terminátorok szubklónozása
PGK terminátor:
A pTG7453-at BamHI-gyel Sstl-gyel hasítjuk, majd a pTG7453 BamHI és SstI hasítási helyei között levő polilinker hasítási helyeket bevisszük egy BamHI-gyel és Sstl-gyel hasított pTG7457 származékba. Ezen az új plazmidon a következő hasítási helyek hozzáférhetők:
PvuII, HindlII, BamHI, EcoRV, Xbal, Smal, BglII, SstI, Miül, AvrII, EcoRI, SnaBI, NotI, SnaBI, PvuII. Az új plazmidot BglII-vel és HindlII-mal hasítjuk, és egy, a
PGK terminátort tartalmazó, hasonlóképpen hasított fragmentummal [Nucleic Acids Rés., 10, 7791-7808 (1982); Yeast 5, 497-507 (1989)] ligáljuk. (A pTG7453-ban levő SstI a pTG7457ben levő Sacl-gyel izoskizomer, ezért a pTG7457 hasítható Sstl-gyel.) Az új plazmid a pTG10014 (lásd a 43. ábrát). A pTG10014et Clal-gyel hasítjuk, és a ragadós végeket Klenow polimerázzal feltöltve a pTGIOOl5-höz jutunk.
A promoterek szubklónozása a) A CYC1 promoter:
A pTG7453-at BamHI-gyel Sstl-gyel hasítjuk, majd a pTG7453 BamHI és SstI hasítási helyei között levő polilinker hasítási helyeket bevisszük egy BamHI-gyel és Sstl-gyel hasított pTG7457 származékba, és az új plazmidot SnaBI-gyel felnyitjuk, majd a pEMBL8-nak [Nucleic Acids Rés., 11, 1654-1655 (1983)] az fi fág replikációs origóját tartalmazó, 456 nukleotid hosszúságú Rsal/Dral fragmentumának bevitelével a pTG7503-hoz jutunk.
A leírás 6. példája szerint előállított pGBSCC-9-nek egy, a Saccharomyces cerevisiae CYC1 promoterét tar21
HU217411 Β talmazó 0,78 kb méretű BamHI/HindlII fragmentumát HindlII-mal és BamHI-gyel hasított pTG7503-ban szubklónozva a pTG 10004-hez jutunk (lásd a 44. ábrát).
A CYC1 promoter Xhol és Miül hasítási helyeit a pTG10004 ssDNS-én OTG4410 alkalmazásával végzett helyre irányuló mutagenezissel elimináljuk. A kapott pTG10005 plazmidot Sall-gyel és Xhol-gyel emésztjük, és egy Miül hasítási helyet viszünk be OTG4433 és OTG4434 használatával, így a pTG10006-hoz jutunk.
b) A GÁLI 0/C YC1 promoter:
A pYeDPl/8-2 plazmidot [Gene 65, 203-217 (1988)] Xhol-gyel felnyitjuk, a ragadós végeket Klenow polimerázzal feltöltjük, és a plazmidot religáljuk. A kapott pTG 10010-ben a GÁL 10/CYC1 promoter nem tartalmazza az Xhol hasítási helyet, és ez a plazmid szolgál templátként egy PCR sokszorozáshoz.
2. Az expressziós vektorok szerkesztése
Az expressziós vektorok egy (az élesztő CYC1 génből származó) erős élesztőpromotert vagy egy szabályozott promotert (egy GAL10/CYC1 hibridet, amely a CYC1 és GAL10 élesztőgénekből származik) és egy PGK transzkripciós terminátort tartalmaznak. Az élesztőben működő expressziós szignálok NotI expressziós kazettákon vannak. A plazmidokból, amelyek az expressziós kazettákat tartalmazzák, hiányzik az élesztő replikon, tartalmazzák a DNS-szekvenálásnál és mutagenezisnél sok előnyt nyújtó FI fág replikációs origót.
A pTG7503-ban a megmaradt lacZ kódolószekvencia részét OTG4431 alkalmazásával végzett helyre irányuló mutagenezissel eliminálva a pTG7549-hez jutunk. A pTG7549-ben meglévő lacZ promotert OTG4470 és OTG4471 alkalmazásával töröljük, amelyeket egy Notl/HindlII restrikció után inszertálunk, helyreállítva mindkét hasítási helyet. Az új szerkezetet pTG7553-nak nevezzük el.
A pTG10006 egy BamHI/MluI fragmentumát (amely a CYC1 promotert tartalmazza) és a pTG10015 egy MluI/HindlII fragmentumát (amely a PGK terminátort tartalmazza) ligáljuk egymással. A ligációs anyagot utána előzetesen Miül és HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pTG7553-hoz adjuk. Végül OTG4479-cel hibridizált OTG4478-at (Clal/NotI hasítási helyeket tartalmazó BamHI/MluI linkerek) adunk hozzá, és ligáljuk egymással. A kapott plazmidot pTG10031-nek nevezzük (lásd a 45. ábrát).
A pYeDPl/8-2-vel kapott PCR sokszorozott fragmentumot Clal-gyel és Sall-gyel emésztjük, és ugyanezen enzimekkel emésztett pTG10031-be visszük be, így a pTG 10033-hoz jutunk (lásd a 46. ábrát).
3. Az alapvektor szerkesztése
Az alapvektorok a 2 pm-es episzómának a replikációt és az élesztőben való kiválasztást lehetővé tevő fragmentumát és egy, a ColEl replikációs origót tartalmazó E. coli replikont, egy szelekciós markert (ampicillinnel szembeni rezisztenciát) és az FI fág replikációs origóját tartalmazzák. Az élesztő szelekciós markért mindegyik alapvektor a két lehetséges orientáció egyikében tartalmazza.
pTG3828-at [Gene 110, 25-31 (1992)] emésztünk BglII-vel és BamHI-gyel, és bevisszük BglII-vel és
BamHI-gyel hasított pPOLYIII-nak [Gene 57, 193-201 (1987)] egy, a BglII/BamHI hasítási helyeket fedő 105 kb méretű polilinker szegmensét. Azt az orientációt választjuk, amelyben elvesznek a BglII és BamHI hasítási helyek (pTG10012), A pTG10012-t Notl-gyel és EcoRI-gyel hasítjuk, és a pTG7549 nagy EcoRI/NotI fragmentumához ligáljuk, így a pTG10013 keletkezik (lásd a 47. ábrát). Az ezen a plazmidon levő URA3-D fragmentum HindlII hasítási helyekkel van határolva.
4. A rekombinációs vektorok szerkesztése
Az előbbiekben leírt élesztőpromoterek egyikét (a két lehetséges orientáció egyikében) és egy terminátort tartalmazó expressziós kazettának egy bázisvektorba való inszertálása eredményez egy rekombinációs vektort.
A CYC1 vagy a GÁLI 0/CYC1 promotert és a PGK terminátort tartalmazó NotI kazettákat az URA3-D gént tartalmazó vektorokba szubklónozzuk mindkét irányban, így a pTG10041-10042, illetve a pTGl 0045-10046 vektorokhoz jutunk:
pTG 10013-at hasítunk Notl-gyel, és a pTG 10031 expressziós blokkját tartalmazó NotI fragmentumokat ligálunk bele két irányban, így a pTG10041 (48. ábra) és a pTG10042 (49. ábra) plazmidokat kapjuk.
Hasonlóképpen kapjuk a pTG10045 (50. ábra) és a pTG10046 (51. ábra) plazmidokat pTG10033-ból és pTG10013-ból.
5. Transzfer vektorok szerkesztése
A transzfer vektorok olyan vektorok, amelyek a cDNS-eket az expressziós vektor expressziós kazettájába klónozva tartalmazzák. Az ilyen vektorokból hiányzik az élesztő replikon is.
Az I típusú humán 3β HSDH-t kódoló cDNS a pT7T3-19 vektor (Pharmacia) EcoRI hasítási helyein belül található. A kódolószekvencia megfelel a V. Luu The és munkatársai által korábban közölt [Mól. Endocrinol., 3, 1310-1312 (1989)] szekvenciának, azzal az eltéréssel, hogy az 5’-vég egy további GGG triplettet tartalmaz. Ezt a plazmidot módosítottuk, hogy lehetővé váljon a mi expressziós vektorainkban való közvetlen klónozás.
Először egy Miül hasítási helyet tartalmazó linkért (OTG4539) viszünk be a pTG10036 részleges EcoRI emésztése után a kódolószekvencia 3’-végére. A pTG10036 EcoRI hasítási helyét mung-bab (mung bean) nukleázzal kezeljük, és a kapott DNS-t Mlul-gyel emésztjük. Másrészt egy 1,7 kb méretű Sall/Mlul inszertumot klónozunk az 5. ábrán bemutatott pTG 10031 Sall/Mlul hasítási helyeire. Az 1,7 kb Sall/Mlul inszertumot a 14. példában leírtak szerint előállított, Xhol-gyel felnyitott és alkalikus foszfatázzal kezelt pGB 17a-5-ben szerkesztjük meg. Az Miül hasítási helyet OTG4433 és OTG4434 segítségével visszük be, így a pTGIO 104-hez jutunk. A pTG10104-et utána Sallgyel és Mlul-gyel hasítjuk, és bevisszük Sall-gyel és Mlul-gyel, majd alkalikus foszfatázzal kezelt pTG10031be. A vektort, amely a szarvasmarha-P450C17a-t kódoló cDNS-t tartalmazza, pTGl0058-nak nevezzük. A kapott pTG10058 (amely a CYC1 promotert tartalmazza) Sáli
HU217411 Β helyét Klenow polimerázzal feltöltjük, és a keletkező plazmidot Mlul-gyel emésztjük. Ezen fragmentumok ligálásával jutunk a pTG10064 plazmidhoz (52. ábra), amely a 3β HSDH kódolószekvenciáját Sáli és Miül hasítási helyekkel határolva tartalmazza. A pTG 10064ből kapott Sall/Mlul fragmentumot pTG 10033-ba szubklónozva kapjuk a pTG10065-öt (lásd az 53. ábrát; a 3β HSDH a GAL10/CYC1 ellenőrzése alatt).
6. 3β HSDH kifejezése S. cerevisiae-ben.
Az ebben a kísérletben modell törzsként használt élesztőtörzs a W303-1B [MATa,, +, ura3-l, leu2-3, -112, his3-ll, -15, trpl-1, ade2-l, canR(?), cyr+(?)] törzs [J. Bioi. Chem., 263, 14 323-14 333 (1988)] [letétbe helyezve a Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l’Institut Pasteur (25 rue du Docteur Roux, 75015 Paris) letéti helyen 1992. 07. 07-én; letéti szám 1-1230 és 1-1231]. A W303-1B törzs auxotróf uracilra, leucinra, hisztidinre, triptofánra, adeninre és rezisztens kanavaninra.
a) Élesztő - E. coli ingázó- (shuttle) vektor szerkesztése a 3β HSDH kifejezéséhez
A kívánt expressziós plazmid összeállítása rekombinációs vektorok használatával in vivő rekombináció útján végezhető. Az élesztőt elektrokompetenssé tesszük a következőképp. Az élesztőt YPD táptalajban [1 tömeg/térfogat% élesztőkivonat (Difco) + 2 tömeg/térfogat% bactopepton (Difco) + 2 tömeg/térfogat% glükóz] tenyésztjük, és az 1 éjszakán át szaporított tenyészetet friss YPD-vel hígítjuk. OD600=1 érték elérésekor a tenyészetet háromszor centrifugálva 1 M D-szorbitolban fokozatosan 40-szeresre koncentráljuk. Egy 1 M Dszorbitolban végzett utolsó tízszeres koncentrálás eredményezi OD600=400 értéknél az elektrokompetens sejteket. Az elektrokompetens élesztőt 100 ng (Sall-gyel és Mlul-gyel hasított) pTG10042 és (Notl-gyel hasított) pTG10065 használatával transzformáljuk. Elektroporáció után a sejteket 100 pg/ml adenint, triptofánt, leucint, hisztidint tartalmazó, de uraciltól mentes szelektív YNBG táptalajon [Yeast nitrogén base (Difco) + 2 tömeg/térfogat% glükóz] szélesztjük. 3-4 nap növekedés után a telepeket ugyanezen a táptalajon tisztítjuk.
A pTG 10065 plazmidból NotI restrikciós enzimmel végzett emésztéssel kivágunk egy 2,5 kb méretű lineáris DNS-fragmentumot (promGALlO/CYCl3βΗ8ϋΗ-ΡΟΚύ6πη), a Sáli és Miül restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel linearizált pTG10042-nek megfelelő lineáris DNS in vivő előfordul az élesztőben. A 2,6 kb méretű (PromCYCl^HSDH-PGKterm) fragmentumot tartalmazó pTG10201 Saccharomyces cerevisiae rekombináns expressziós plazmidot („SCREP”) a W3O3-1B törzsben a GAL10/CYC1 promoter és a CYC1 promoter közötti homológ rekombinációval kapjuk, helyreállítva a CYC1 promotert. A 3βΗ8ϋΗ kifejezését glükózt tartalmazó táptalajon végezzük.
b) 3β HSDH antigén detektálása élesztőben Western blotting segítségével
Antitestek
A humán 3β HSDH elleni nyúl Ηηύ-3β antitestet használjuk [Mól. Endocrinol., 3, 1310-1312 (1989)].
Western blotting
A Western blotting kivitelezését az irodalomban leírtak szerint [Gene 118, 47-53 (1992)] végezzük, azzal az eltéréssel, hogy anti^ HSDH antitesteket használunk.
c) Szerkezeti vizsgálat
A szerkezeti vizsgálatot SCREP pTG10201-gyel (CYC1 + 3β HSDH) transzformált W303-1B törzsön végeztük. A sejteket szétválasztjuk Cullin és Pompon módszere szerint [Gene 65, 203-217 (1988)] citoszolra, mitokondriumokra és mikroszómákra. Western biot vizsgálatokat és aktivitási méréseket végzünk a transzformálatlan és két transzformált törzsön. A kontrollt (transzformálatlan törzs) teljesen negatívnak találtuk. A többi törzs esetében az aktivitás legnagyobb részét a mitokondriális és a mikroszomális frakciókban találtuk. Ezeket az eredményeket megerősítette a Western biot is, mutatva a kifejezett géntermék helyes méretét.
d) 3β HSDH in vitro aktivitása minimáltáptalajban végzett indukció és sejtfrakcionálás után.
A sejteket kazaminosavakkal (0,5%) és triptofánnal, továbbá adeninnel, hisztidinnel és leucinnal kiegészített YNBG táptalajon addig növesztjük, amíg a 600 nm-nél mért optikai denzitás 2 és 5 közötti értéket ér el. A sejtek centrifugálással való learatása után Cullin és Pompon előbb említett módszere [Gene 65, 203-217 (1988)] szerint mikroszómákat preparálunk. A 3β HSDH-aktivitást Bauer és Bauer módszerével [J. Steroid Biochem 33, 643-646 (1989)] mérjük.
A mikroszómákat 50 mM trisz-HCl-t (pH=7,4), 2 mM EDTA-t, 20% glicerint tartalmazó oldatban szuszpendáljuk, és felhasználásig -20 °C-on tároljuk. A proteinkoncentráció 3,75 mg/ml. Az aktivitást DPBS+BSA (0,175 ml)-(-pregnenolont (0,005 ml; lpCi=40 nmol/ml) és csövenként 19 pg mikroszomális extraktumot tartalmazó elegyben méljük. (DPBS: Dulbecco phosphate buffer saline=Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldat; összetétele: 150 mM nátrium-klorid, 20 mM nátriumfoszfát, pH=7,0.)
A reakciót 10 mM NAD (0,015 pl) hozzáadásával indítjuk, és 37 °C-on 60 percig folytatjuk. Kontrollként olyan oldatokat használunk, amelyekben a reakciót a szubsztrátnak a teljes reakcióelegyhez való hozzáadása után (t=Oh) vagy a NAD-ot nem tartalmazó reakcióelegyhez való hozzáadása után (t=0H-NAD) azonnal leállítjuk.
A 3μ HSDH in vitro aktivitását radioaktív pregnenolon alkalmazásával méljük. A 37 °C-on végzett inkubálás után a pregnenolon fő tömegét digitoninnal kicsapjuk, és az oldható terméket (progeszteron) szcintillációs számlálóval mérjük. A W303-lB/pTG10201 (CYC1 + 3β HSDH) egy mikroszomális frakciója mutatott aktivitást csak NAD jelenlétében.
A 3β HSDH-aktivitás NAD-függése
t=Oh - (t=0h-NAD) 60’ - (t=0h-NAD)
+ NAD 17 000 463 000
NAD 0 0
HU217411 Β
Mértünk aktivitást sejtfrakcionálás után is (lásd előbb). Az aktivitást DPBS + BSA (0,077 ml) + pregnenolon (0,002 ml; lpCi=40 nmol/ml) + NAD (0,010 pl; 10 mM) és csövenként 7 pg citosol extraktumot, 9 pg mitokondriális extraktumot és 6 pg mikroszomális extraktumot tartalmazó elegyben mértük.
W303 Nettó CPM/t 5'/pg
Citoszol 213
Mitokondriumok 297
Mikroszómák 178
W303/pTG 10201 (CYC1 prom, 3β HSDH PGK term.) Százalék
Citoszol 6 577 9,7%
Mitokondriumok 42 308 62,7%
Mikroszómák 18 590 27,5%
Az aktivitásmérések jól egyeznek a Western biot eredményeivel: aktivitást a mitokondriális és a mikroszomális frakciókban találtunk. Nem volt aktivitás sem a citoszolban, sem pedig transzformálatlan élesztőből kapott bármely frakcióban. A pregnenolon progeszteronná való konverzióját 15 perc 37 °C-on végzett inkubálás során 0,8 μΜ oldatban a következőkben felsorolt frakciók 1 pg mennyiségeinek jelenlétében mérve a következő eredményeket kaptuk: mitokondriumok, 60% konverzió; mikroszómák, 15% konverzió; citoszol, 3% konverzió. A reakció nem lineáris az idővel, de ezt a kérdést tovább nem vizsgáltuk.
A pregnenolon progeszteronná való konverzióját in vivő is bemutattuk (lásd alább),
e) 3β HSDH in vivő aktivitása
Pregnenolon biokonverziója progeszteronná:
Transzformált élesztősejteket tenyésztünk 100 pg/ml pregnenolon jelenlétében, és a mintákat extraháljuk, és fordított fázisú HPLC-vel analizáljuk progeszteronná való átalakításra. Az eredmények progeszteronnak a transzformált élesztő tenyészetében való felhalmozódását mutatják. A pregnenolon 15%-a alakul át progeszteronná 2 nap alatt.
30. példa
A szarvasmarha 3β HSDH-t kódoló expressziós kazetta szerkesztése, transzformálása és kifejezése Saccharomyces cerevisiae élesztőben
a) Szarvasmarha 3β-Η8ϋΗ cDNS klónozása
A H. F. Zhao és munkatársai által leírt szarvasmarha 3β-Η8ϋΗ cDNS nukleotidszekvencia [FEBS Lett., 259, 153-157 (1989)] alapján tervezett oligonukleotidokat szerkesztünk az 1. példa szerint szarvasmarha-mellékvesekéregből előállított cDNS-könyvtár PCR-sokszorozására.
Egy Sáli hely bevitelére szolgáló „forward” prímért - OTG6412 CTGCTCGTCGACAAAAATGGCAGG GTGGAGCTGCCTC - és egy Miül hely bevitelére szolgáló „reverse” prímért - OTG6413 CCACGTACGCGTCATTGTCACTCCCAGGTCAGTG - használunk a cDNS Perkin Elmer Cetus kit-tel végzett sokszorozásához. 25 ciklust hajtunk végre (93 °C, 1 perc; 54 °C, 2 perc; 72 °C, 3 perc). A PCR anyagot, amely sokszorozva egy várt, körülbelül 1,1 kb-os sáv, a CYC1 promoter alatt szubklónozzuk közvetlenül egy 2 pm alapú ingázóvektorba (shuttle). A 29. példában az előbbiekben leírt pTG10042 rekombináns vektort (lásd a 49. ábrát) Sáli és Miül restrikciós enzimekkel hasítjuk, és alkalikus foszfatázzal kezeljük. A PCR anyagot hasonlóképpen kezeljük Sáli és Miül restrikciós enzimekkel, és a pTG10042-be ligáivá a pTG10458-at kapjuk. Ellenőrző emésztésekkel igazoltuk a restrikciós helyeket helyes sorrendben tartalmazó fragmentumok jelenlétét.
A szarvasmarha^-HSDH-t kódoló cDNS-t tartalmazó pTG10458 szekvenciáját meghatároztuk. Az 1150-ből kevesebb, mint 16 hely maradt bizonytalan, de a közzétett nukleotidszekvenciával való homológia körülbelül 99%.
b) S. cerevisiae transzformálása
W 303-1B élesztőtörzset [M. D. Crivellone et al., J. Bioi. Chem., 263, 14 323-14 333 (1988)] transzformálunk 1 pg pTG10458 alkalmazásával (hordozó DNS-t nem használunk) 5%-os etanolkoncentrációnál a V. Lauermann és munkatársai által leírt módszerrel [Current Génét., 20, 1-3 (1991)]. A sejteket szelekciós táptalajon (2% glükózt, 0,5% kazaminosavakat és 100100 pg/ml triptofánt, adenint, hisztidint és leucint tartalmazó YNB) szélesztjük.
c) Szarvasmarha^-HSDH in vivő aktivitása S. cerevisiae-ben
A biokonverziót a 0,1% glükózt, 2% glicerint, 0,5% kazaminosavakat és 100-100 pg/ml triptofánt, adenint, hisztidint és leucint tartalmazó YNB táptalajon 16 óra hosszat előtenyésztett transzformált sejtekhez adott 100 pg/ml (50 térfogat% etanol és 50 térfogat% tergitol elegyében oldott) pregnenolonnal mértük.
A szubsztráttal való 32 óra inkubálás után mintákat vettünk, majd extraháltuk, és fordított fázisú nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiával (RP-HPLC) analizáltuk progeszteronra.
Három párhuzamos adat alapján 65-80 pg/ml szteroidot extraháltunk és azonosítottunk progeszteronként.

Claims (10)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás nem emlős rekombináns gazdasejtben működőképes expressziós kazetta előállítására, amely a koleszterin hidrokortizonná való biológiai átalakítási folyamatának egy oxidációs lépését önmagában vagy egy vagy több további proteinnel együtt katalizáló proteint kódoló heterológ DNS-kódoló szekvenciát és az illető gazdasejtben működőképes megfelelő szabályozószekvenciát tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a szteroid oldallánchasító enzim (P450SCC), az adrenodoxin (ADX), az adrenodoxin reduktáz (ADR), a szteroid-17a-hidroxiáz (P450 1 7a), a NADPH citokróm P450 reduktáz (RED), a szteroid-21-hidroxiláz (P450C21) és a szteroid-11 β-hidroxiláz (P45011 β)
    II
    HU217411 Β által alkotott csoportból választott, egy, a tárgyi körben meghatározott oxidációs lépést katalizáló proteint kódoló heterológ DNS-szekvenciát a gazdasejttel kompatibilis, a protein érett formában való képződését is biztosító megfelelő szabályozószekvenciákkal ligálunk. (Elsőbbsége: 1988.05.06.)
  2. 2. Eljárás nem emlős rekombináns gazdasejtben működőképes expressziós kazetta előállítására, amely a koleszterin hidrokortizonná való biológiai átalakítási folyamatának egy oxidációs lépését önmagában vagy egy, vagy több további proteinnel együtt katalizáló proteint kódoló heterológ DNS-kódoló szekvenciát és az illető gazdasejtben működőképes megfelelő szabályozószekvenciákat tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a szteroid oldallánchasító enzim (P450SCC), az adrenodoxin (ADX), az adrenodoxin reduktáz (ADR), a szteroid-17a-hidroxiláz (P45017a), a 3 β-hidroxi-sz tereid dehidrogenáz/izomeráz Οβ-HSD), a NADPH citokróm P45O reduktáz (RED), a szteroid-21-hidroxiláz (P450C21) és a szteroid-11 β-hidroxiláz (P450l 1 β) által alkotott csoportból választott, egy, a tárgyi körben meghatározott oxidációs lépést katalizáló proteint kódoló heterológ DNS-szekvenciát a gazdasejttel kompatibilis, a protein érett formában való képződését is biztosító megfelelő szabályozószekvenciákkal ligálunk. (Elsőbbsége: 1994.05.03.)
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarha eredetű DNS-szekvenciát ligálunk megfelelő szabályozószekvenciákkal. (Elsőbbsége: 1988. 05. 06.)
  4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humán eredetű 3β-ΰίΰΓοχϊ-8ζΙεΓοίΰ dehidrogenáz/izomerázt (ΙηΒβ-Ηδϋ) kódoló DNS-szekvenciát ligáljuk megfelelő szabályozószekvenciákkal. (Elsőbbsége: 1994.05.03.)
  5. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szteroid oldallánchasító enzimet (P450SCC) és adrenodoxint (ADX) kódoló heterológ DNS-szekvenciákat ligálunk megfelelő szabályozószekvenciákkal. (Elsőbbsége: 1988.05.06.)
  6. 6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szteroid oldallánchasító enzimet (P450SCC) kódoló heterológ DNS-szekvenciát megfelelő szabályozószekvenciákkal a Bacillus fajokban működőképes pGBSCC-5; E. coliban működőképes pGBSCC-17; Kluyveromyces lactisban működőképes pGBSCC-7, pBGSCC-12 vagy pGBSCC-15; és Saccharomyces cerevisiae-ben működőképes pGBSCC-10, pGBSCC-13 vagy pGBSCC16 plazmiddá ligáljuk. (Elsőbbsége: 1988. 05.06.)
  7. 7. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szteroid-17a-hidroxiláz enzimet (P450 1 7a) kódoló heterológ DNS-szekvenciát megfelelő szabályozószekvenciákkal Kluyveromyces lactisban működőképes pGB17a-5 vagy a Bacillus fajokban működőképes pGB17ct-8 plazmiddá ligáljuk. (Elsőbbsége: 1988. 05. 06.)
  8. 8. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szteroid-11 β-hidroxiláz enzimet (P450l 1 β) kódoló heterológ DNS-szekvenciát megfelelő szabályozószekvenciákkal a Kluyveromyces lactisban működőképes ρΟΒ11β-4 plazmiddá ligáljuk. (Elsőbbsége: 1988. 05. 06.)
    5 9. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szarvasmarha eredetű 3β-ΰί0Γθχί-5ΖΐεΓθίΰ dehidrogenáz/izomerázt (3β-Ηδϋ) kódoló heterológ DNSszekvenciát megfelelő szabályozószekvenciákkal a Saccharomyces cerevisiae-ben működőképes pTG10458
    10 plazmiddá ligáljuk. (Elsőbbsége: 1994. 05. 03.)
    10. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humán eredetű 3β-ΰίΰτοχί-8ζΙεΓθίΰ dehidrogenáz/izomezárt (hu33-HSD) kódoló heterológ DNS-szakaszt megfelelő szabályozószekvenciákkal a Saccharo15 myces cervisiae-ben működőképes pTG 10201 plazmiddá ligáljuk. (Elsőbbsége: 1994. 05. 03.)
    11. Eljárás legalább egy, a koleszterin hidrokortizonná való biológiai átalakítási folyamatának egy oxidációs lépését önmagában vagy egy, vagy több további
    20 proteinnel együtt katalizáló, a szteroid oldallánchasító enzim (P450SCC), az adrenodoxin (ADX), az adrenodoxin reduktáz (ADR), a szteroid-17a-hidroxiláz (P450 1 7a),
    25 a NADPH citokróm P450 reduktáz (RED), a szteroid-21-hidroxiláz (P450C21) és a szteroid-11 β-hidroxiláz (P450l 1 β) által alkotott csoportból választott protein termelésére képes nem emlős rekombináns gazdasejt előállítására,
    30 azzal jellemezve, hogy egy mikroorganizmus gazdasejtet egy, az 1., 3., 5-8. igénypontok bármelyike szerint előállított expressziós kazettát tartalmazó vektorral transzformálunk. (Elsőbbsége: 1988. 05. 06.)
    12. Eljárás legalább egy, a koleszterin hidrokorti35 zonná való biológiai átalakítási folyamatának egy oxidációs lépését önmagában vagy egy, vagy több további proteinnel együtt katalizáló, a szteroid oldallánchasító enzim (P450SCC), az adrenodoxin (ADX),
    40 az adrenodoxin reduktáz (ADR), a 33-hidroxi-szteroid dehidrogenáz/izomeráz (3β-ΗδΟ), a szteroid-17a-hidroxi láz (P450 1 7a), a NADPH citokróm P450 reduktáz (RED), a szteroid-21-hidroxiláz (P450C21) és
    45 a szteroid-11 β-hidroxiláz (P4501 1 β) által alkotott csoportból választott protein termelésére képes nem emlős rekombináns gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy mikroorganizmus gazdasejtet egy, a 2., 4., 9., 10. igénypontok bármelyike szerint
    50 előállított expressziós kazettát tartalmazó vektorral transzformálunk. (Elsőbbsége: 1994. 05. 03.)
    13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy bakteriális vagy gomba gazdasejtet transzformálunk. (Elsőbbsége: 1988. 05. 06.)
    55 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy Saccharomyces, Kluyveromyces, Bacillus vagy Escherichia coli gazdasejtet transzformálunk. (Elsőbbsége: 1988. 05. 06.)
    15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezét) ve, hogy egy Saccharomyces cerevisiae gazdasejtet egy
    II
    HU 217 411 Β
  9. 9. igénypont szerint előállított és szarvasmarha eredetű 33-hidroxi-szteroid dehidrogenáz/izomerázt (3P-HSD) kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós kazettát tartalmazó vektorral transzformálunk. (Elsőbbsége: 1994. 05. 03.)
    16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy Saccharomyces cerevisiae gazdasejtet egy
  10. 10. igénypont szerint előállított és humán eredetű 3βhidroxi-szteroid dehidrogenáz/izmerázt (hu33-HSD) kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós kazettát tartalmazó vektorral transzformálunk. (Elsőbbsége: 1994. 05. 03.)
    17. Eljárás a koleszterin hidrokortizonná való biológiai átalakítási folyamatának egy oxidációs lépését katalizáló, a szteroid oldallánchasító enzim (P450SCC), az adrenodoxin (ADX), az adrenodoxin reduktáz (ADR), a szteroid-17a-hidroxiláz (P450 1 7a), a NADPH citokróm P450 reduktáz (RED), a szteroid-21-hidroxiláz (P450C21) és a szteroid-1 Ιβ-hidroxiláz (P450l 1β) által alkotott csoportból választott exogén protein termelésére, azzal jellemezve, hogy egy 11., 13. vagy 14. igénypontok bármelyike szerint előállított transzformált gazdasejtet alkalmas táptalajban tenyésztünk, és a felhalmozódott proteint izoláljuk a tenyészetből. (Elsőbbsége: 1988.05.06.)
    18. Eljárás a koleszterin hidrokortizonná való biológiai átalakítási folyamatának egy oxidációs lépését katalizáló, a szteroid oldallánchasító enzim (P450SCC), az adrenodoxin (ADX), az adrenodoxin reduktáz (ADR), a 3β-hidroxi-szteroid dehidrogenáz/izomeráz (33-HSD), a szteroid-17a-hidroxiláz (P450 1 7a), a NADPH citokróm P450 reduktáz (RED), a szteroid-21-hidroxiláz (P450C21) és a szteroid-1 Ιβ-hidroxiláz (Ρ45θ11 β) által alkotott csoportból választott exogén protein termelésére, azzal jellemezve, hogy egy 12., 15. vagy 16. igénypontok bármelyike szerint előállított transzformált gazdasejtet alkalmas táptalajban tenyésztünk, és a felhalmozódott proteint izoláljuk a tenyészetből. (Elsőbbsége: 1994.05.03.)
    19. Eljárás szarvasmarha eredetű szteroid oldallánchasító enzim (P450SCC) és adrenodoxin (ADX) keverékének előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 11. igénypont szerint előállított transzformált gazdasejtet alkalmas táptalajban tenyésztünk, és a proteineket izoláljuk a tenyészetből. (Elsőbbsége: 1988. 05. 06.)
    5 20. Eljárás szarvasmarha eredetű exogén 3β-1ιϊΰroxi-szteroid dehidrogenáz/izomeráz (33-HSD) előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 15. igénypont szerint előállított transzformált sejtet alkalmas táptalajban tenyésztünk, és a tenyészetben felhalmozódott proteint
    10 izoláljuk. (Elsőbbsége: 1994.05.03.)
    21. Eljárás humán eredetű exogén 33-hidroxi-szteroid dehidrogenáz/izomeráz (ht^-HSD) előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 16. igénypont szerint előállított transzformált sejtet alkalmas táptalajban tenyész15 tünk, és a tenyészetben felhalmozódott proteint izoláljuk. (Elsőbbsége: 1994.05.03.)
    22. Eljárás koleszterin pregnenolonná való szelektív oxidálására, azzal jellemezve, hogy egy 11., 13. vagy 14. igénypontok bármelyike szerint előállított, P450SCC-t és
    20 ADX-et kódoló DNS-t tartalmazó transzformált gazdasejtet koleszterin jelenlétében az említett oxidációt lehetővé tevő körülmények között tenyésztünk, és a termelt pregnenolont izoláljuk a tenyészetből. (Elsőbbsége: 1988.05.06.)
    25 23. Eljárás progeszteron 17a-hidroxi-progeszteronná való szelektív oxidálására, azzal jellemezve, hogy egy 11., 13. vagy 14. igénypontok bármelyike szerint előállított, P4501 7a-t kódoló DNS-t tartalmazó transzformált gazdasejtet progeszteron jelenlétében az említett oxidá30 ciót lehetővé tevő körülmények között tenyésztünk, és a termelt 17a-hidroxi-progeszteront izoláljuk a tenyészetből. (Elsőbbsége: 1988.05.06.)
    24. Eljárás pregnenolon progeszteronná való szelektív oxidálására, azzaljellemezve, hogy egy 15. igénypont
    35 szerint előállított, 3t-HSD-t kódoló DNS-t tartalmazó transzformált Saccharomyces cerevisiae-sejtet pregnenolon jelenlétében az említett oxidációt lehetővé tevő körülmények között tenyésztünk, és a termelt progeszteront izoláljuk a tenyészetből. (Elsőbbsége: 1994.05.03.)
    40 25. Eljárás pregnenolon progeszteronná való szelektív oxidálására, azzal jellemezve, hogy egy 16. igénypont szerint előállított, ln^-HSD-t kódoló DNS-t tartalmazó transzformált Saccharomyces cerevisiae-sejtet pregnenolon jelenlétében az említett oxidációt lehetővé
    45 tevő körülmények között tenyésztünk, és a termelt progeszteront izoláljuk a tenyészetből. (Elsőbbsége:
HU289/89A 1988-05-06 1989-05-08 Eljárás szteroidok biokémiai oxidációját katalizáló enzimeket kódoló DNS-eket tartalmazó expressziós kazetták, ezeket tartalmazó transzformált sejtek és az enzimek előállítására HU217411B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP88200904 1988-05-06
EP88202080 1988-09-23

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU893289D0 HU893289D0 (en) 1990-12-28
HUT54413A HUT54413A (en) 1991-02-28
HU217411B true HU217411B (hu) 2000-01-28

Family

ID=26115083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU289/89A HU217411B (hu) 1988-05-06 1989-05-08 Eljárás szteroidok biokémiai oxidációját katalizáló enzimeket kódoló DNS-eket tartalmazó expressziós kazetták, ezeket tartalmazó transzformált sejtek és az enzimek előállítására

Country Status (16)

Country Link
JP (2) JP2963711B2 (hu)
KR (1) KR100256025B1 (hu)
CN (1) CN1038667A (hu)
AT (1) ATE201235T1 (hu)
AU (1) AU635494B2 (hu)
CA (1) CA1340616C (hu)
DE (1) DE68929296T2 (hu)
DK (1) DK175573B1 (hu)
ES (1) ES2157883T3 (hu)
FI (1) FI109605B (hu)
HU (1) HU217411B (hu)
IL (1) IL90207A (hu)
NO (1) NO314267B1 (hu)
NZ (1) NZ229032A (hu)
PT (1) PT90484B (hu)
WO (1) WO1989010963A1 (hu)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1042567A (zh) * 1988-09-23 1990-05-30 吉斯特-布罗卡迪斯公司 类固醇多步氧化方法和所用的遗传工程细胞
DE69122016T2 (de) * 1990-09-26 1997-04-30 Sumitomo Chemical Co Mitochondriales P450
US5420027A (en) * 1991-01-10 1995-05-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the expression of biologically active fusion proteins comprising a eukaryotic cytochrome P450 fused to a reductase in bacteria
US5240831A (en) * 1991-01-10 1993-08-31 Board Of Regents, The University Of Texas Methods and compositions for the expression of biologically active eukaryotic cytochrome p45os in bacteria
US9255256B2 (en) 1996-07-17 2016-02-09 Btg International Limited Expression of functional cytochorome P450 monooxygenase system in enterobacteria
GB9615032D0 (en) 1996-07-17 1996-09-04 Univ Dundee Enzyme system
FR2820145B1 (fr) * 2001-01-31 2004-01-23 Aventis Pharma Sa Souche de levure produisant des steroides de facon autonome
CN102272304B (zh) * 2009-01-07 2013-10-23 三菱化学株式会社 切断固醇侧链的酶蛋白质及其应用
KR20160019451A (ko) * 2013-06-17 2016-02-19 사노피 시토크롬 p450 모노옥시게나제 생체촉매작용을 위한 전세포 시스템
DK3097113T3 (en) * 2014-01-20 2019-04-23 Sanofi Sa HOW TO UNKNOWN CYTOCHROM P450 POLYPEPTIDE WITH INCREASED ENZYMATIC ACTIVITY
JP5800040B2 (ja) * 2014-01-29 2015-10-28 三菱化学株式会社 ステロール側鎖切断酵素蛋白質およびその利用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4720454A (en) * 1984-04-18 1988-01-19 White Perrin C Genetic probe used in the detection of adrenal hyperplasia

Also Published As

Publication number Publication date
KR100256025B1 (ko) 2000-05-01
KR900702022A (ko) 1990-12-05
DE68929296T2 (de) 2001-12-06
NZ229032A (en) 1992-06-25
IL90207A0 (en) 1989-12-15
DK264890A (da) 1990-11-05
PT90484A (pt) 1989-11-30
FI109605B (fi) 2002-09-13
DK264890D0 (da) 1990-11-05
CN1038667A (zh) 1990-01-10
DK175573B1 (da) 2004-12-13
NO314267B1 (no) 2003-02-24
ATE201235T1 (de) 2001-06-15
JP2963711B2 (ja) 1999-10-18
JPH04500303A (ja) 1992-01-23
WO1989010963A1 (en) 1989-11-16
IL90207A (en) 1994-07-31
NO904791L (no) 1991-01-04
HUT54413A (en) 1991-02-28
PT90484B (pt) 1994-08-31
FI905464A0 (fi) 1990-11-05
DE68929296D1 (de) 2001-06-21
CA1340616C (en) 1999-06-29
ES2157883T3 (es) 2001-09-01
NO904791D0 (no) 1990-11-05
JPH11308991A (ja) 1999-11-09
AU3575989A (en) 1989-11-29
HU893289D0 (en) 1990-12-28
AU635494B2 (en) 1993-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7977065B2 (en) Yeast strains autonomously producing steroids
HU217411B (hu) Eljárás szteroidok biokémiai oxidációját katalizáló enzimeket kódoló DNS-eket tartalmazó expressziós kazetták, ezeket tartalmazó transzformált sejtek és az enzimek előállítására
FI120877B (fi) DNA-sekvenssi, joka koodaa A. thaliana -proteiinia, jolla on delta-5,7-steroli, delta-7-reduktaasiaktiivisuutta, delta-7-Red-proteiinia, menetelmä sen valmistamiseksi, muunnettuja hiivakantoja sekä sovellutuksia
HU218111B (hu) Eljárás szteroidok többszörös oxidálására, valamint ehhez alkalmazható, genetikailag módosított sejtek
EP0340878B1 (en) Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
US5869283A (en) Expression cassette operable in a recombinant host
DE69918752T2 (de) Hefestämme mit unterbrochenem atf2-gen und deren verwendungen
IE83307B1 (en) Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
US20030108982A1 (en) Process for oxidation of steroids and genetically engineered cells used therein
US20040067579A1 (en) Process for oxidation of steroids and genetically engineered cells used therein

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: ROUSSEL UCLAF, FR

DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: HOECHST MARION ROUSSEL S.A., FR

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: AVENTIS PHARMA S.A., FR