FR2730494A1 - Sequence d'adn codant pour une proteine d'a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta7-red, procede de production, souches de levures transformees, applications - Google Patents
Sequence d'adn codant pour une proteine d'a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta7-red, procede de production, souches de levures transformees, applications Download PDFInfo
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Abstract
Séquence d'ADNc codant pour une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase (séquence SEQ ID No 1). Procédé de clonage. Procédé de réduction d'un stérol insaturé en position C-7. Procédé de production de pregnénolone.
Description
Séquence d'ADN codant pour une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase, protéine delta-7Red, procédé de production, souches de levures transformées, applications.
La présente invention concerne une séquence d'ADN codant pour une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase, la protéine delta-7Red, leur procédé de production, les souches de levures transformées et leurs applications.
La delta-5,7 stérol,delta-7 réductase (E.C.1.3.1.21) est une enzyme microsomale dont la présence a été mise en évidence par son activité dans des homogénats de foie de rat (M. E. Dempsey et al., Methods Enzymol., 15, 501-514, 1969) ainsi que dans des préparations de plants de Zea mays (M. Taton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181, 465473, 1991). Cette réductase est dépendante du NADPH et réduit in vitro le 7-déhydrocholestérol en cholestérol.
Les stérols sont les constituants principaux des membranes chez les eucaryotes mais présentent des différences de structure selon les espèces. Dans les cellules d'eucaryotes tels que les levures, le stérol principal est l'ergostérol qui contient une double insaturation en C-S et C-7, une channe latérale ramifiée en C-24 et une insaturation en C-22 tandis que chez les mammifères le cholestérol est caractérisé par une insaturation en C-S et une chaîne latérale saturée.
Le sitostérol, le stigmastérol et le campestérol, qui représentent les stérols les plus communs chez les plantes, ont une channe latérale ramifiée mais saturée et, comme les stérols des vertébrés, n'ont pas une insaturation en C-7.
L'enzyme responsable de cette différence de structure du noyau stérol est la delta-5,7 stérol,delta-7 réductase.
La delta-5,7 stérol,delta-7 réductase n'a jamais été purifiée à l'homogénéité et une purification partielle a été seulement décrite (M. E. Dempsey et al. ; M. Taton et al., déjà cité). La protéine n'a pas été caractérisée par ses propriétés physicochimiques. Aucune information sur la séquence de la protéine et aucun anticorps dirigé contre celle-ci n'ont été décrits. Par ailleurs, une apparente déficience en 7-déhydrocholestérol réductase a été décrite chez l'homme associée au syndrome RSH/Smith-Lemli-Opitz (SLO) (J. M. Opitz et al., Am. J. Med. Genet., 50, 326-338, 1994).
Le clonage d'un ADNc codant pour la delta-5,7 stérol, delta-7 réductase, qui peut permettre d'identifier la séquence de la protéine correspondante ainsi que la caractérisation du gène humain ou la mise en évidence d'une déficience congénitale de celui-ci, n'est donc pas réalisable avec les méthodes connues qui font l'usage par exemple des techniques d'hybridation ou/et de détection immunologique.
L'obtention de méthodes de criblage inventives permettant de réaliser le clonage, notamment en absence d'informations sur la protéine, est donc particulièrement recherchée.
L'ergostérol, principal stérol des membranes des cham- pignons, contient une paire de double liaisons conjuguées en
C-5,7 qui confère une activité antimycotique aux composés de la famille des polyènes tel que la nystatine (R. Bittman et al., J. Biol. Chem., 260, 2884-2889, 1985). La forte dépendance de l'action de la nystatine à la concentration membranaire en stérols insaturés en C-5,7 a permis de sélectionner chez S. cerevisiae des souches de mutants vis à vis des stérols accumulés (S. W. Molzahn et al., J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972). Ainsi les mutants erg2 et erg3 accumulent des stérols qui n'ont pas les doubles liaisons conjuguées en
C-5,7 en raison d'une déficience en stérol delta-8,7 isomérase (W. Ashman et al., Lipids, 26, 628, 1991) et en stérol delta-5 deshydrogénase (B. Arthinton et al., Gene, 102, 39, 1991) respectivement.De tels mutants sont viables parce que l'ergostérol, le stérol naturel principal de la levure, peut être remplacé dans certaines conditions par différents stérols de substitution incluant le cholestérol.
C-5,7 qui confère une activité antimycotique aux composés de la famille des polyènes tel que la nystatine (R. Bittman et al., J. Biol. Chem., 260, 2884-2889, 1985). La forte dépendance de l'action de la nystatine à la concentration membranaire en stérols insaturés en C-5,7 a permis de sélectionner chez S. cerevisiae des souches de mutants vis à vis des stérols accumulés (S. W. Molzahn et al., J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972). Ainsi les mutants erg2 et erg3 accumulent des stérols qui n'ont pas les doubles liaisons conjuguées en
C-5,7 en raison d'une déficience en stérol delta-8,7 isomérase (W. Ashman et al., Lipids, 26, 628, 1991) et en stérol delta-5 deshydrogénase (B. Arthinton et al., Gene, 102, 39, 1991) respectivement.De tels mutants sont viables parce que l'ergostérol, le stérol naturel principal de la levure, peut être remplacé dans certaines conditions par différents stérols de substitution incluant le cholestérol.
L'avantage de l'accroissement de la résistance à la nystatine de souches de levure enrichies en stérols n'ayant pas la double insaturation en C-5,7 a été perçu par les inventeurs pour cloner un ADNc codant une protéine hétérologue ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase avec une méthode de criblage utilisant une interférence métabolique dans S. cerevisiae. Le succès de cette approche qui offre l'avantage d'être indépendante de la connaissance de séquences de l'ADN ou de la protéine ainsi que d'une détection seulement basée sur l'activité enzymatique, n'est cependant pas prévisible en raison de nombreuses difficultés techniques à surmonter.
Une première limitation vient du fait que le mode d'action de la nystatine n'est pas entièrement élucidé (L. W.
Parks et al., CRC Critical Reviews in Microbiology, 301-304, 1978). Par exemple, la faible spécificité de la sélection par la nystatine est prévisible en raison de la nature indirecte de celle-ci conduisant chez la levure à la sélection de mutations génomiques spontanées telles que les mutants erg (S. W.
Molzahn et al. déjà cité) ou des mutations génomiques entraI- nant des résistances indépendantes de la voie des stérols. De même, les cellules transformées par une banque peuvent exprimer des gènes hétérologues conférant une résistance à la nystatine sans relation avec la voie des stérols.
Un autre exemple de limitation attendue concerne le fait que la protéine hétérologue puisse être faiblement active dans la cellule, conduisant à l'absence ou à une faible résistance à la nystatine par exemple pour l'une des raisons suivantes : 1) le gène codant pour la delta-5,7 stérol,delta7 réductase est faiblement exprimé ; 2) la protéine est peu ou pas active parce que mal repliée ou résultant d'un adressage subcellulaire incorrect ; 3) la protéine de plante ne reconnait pas les stérols propres de la levure comme substrats ou 4) les stérols qui peuvent être des substrats sont sous forme estérifiée ou stockés dans des vésicules et ne sont pas au contact de l'enzyme.Il peut donc être prévu que les stérols ainsi accumulés échappent à l'action de la delta5,7 stérol,delta-7 réductase qui, dans les eucaryotes, est réputée localisée dans les microsomes.
La présente invention concerne le clonage d'un ADNc d'A. thaliana codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase, désignée delta-7Red, selon un procédé de clonage réalisé dans une levure par interférence métabolique basée sur la résistance à la nystatine. La protéine delta-7Red permet de réduire des stérols ayant une insaturation en C-7 par un procédé de réduction biologique qui fournit de plus une solution avantageuse au problème de la réduction sélective en C-7 de stérols ou de stéroïdes ayant une double insaturation en C-5,7 que les méthodes de réduction par voie chimique ne permettent pas.
L'invention concerne également des cellules de levure transformées exprimant la delta-7Red qui, de façon surprenante, accumulent des produits saturés en C-7 et éventuellement saturés en C-22 qui, contrairement à l'ergostérol, sont des substrats de l'enzyme de clivage de la channe latérale du cholestérol, c'est-à-dire le cytochrome P450SCC.
Ces propriétés inattendues permettent une utilisation des levures transformées de l'invention dans un procédé de préparation de stérols ou de stéroïdes ayant un intérêt industriel et/ou pharmacologique, en particulier la préparation de pregnénolone par oxydation biologique des stérols endogènes de levure, réduits en C-7, par le cytochrome P450
SCC (P450SCC) en présence d'adrénodoxine réductase (ADR) et d'adrénodoxine (ADX). Les levures transformées de l'invention peuvent être aussi utilisées dans un procédé de préparation des stéroïdes intermédiaires de la voie de métabolisation du cholestérol en hydrocortisone chez les mammifères et autres vertébrés.Cette utilisation présente l'avantage de permettre la préparation de 1'hydrocortisone ou de ses intermédiaires dans un procédé d'oxidation biologique ne nécessitant pas l'emploi d'un stérol exogène tel que le cholestérol comme substrat initial et de contourner ainsi le problème de la pénétration d'un stérol dans la levure dont l'imperméabilité aux stérols exogènes sous des conditions d'aérobiose a été décrite (R. T. Lorentz et al., J. Bacteriology, 981-985, 1986).
SCC (P450SCC) en présence d'adrénodoxine réductase (ADR) et d'adrénodoxine (ADX). Les levures transformées de l'invention peuvent être aussi utilisées dans un procédé de préparation des stéroïdes intermédiaires de la voie de métabolisation du cholestérol en hydrocortisone chez les mammifères et autres vertébrés.Cette utilisation présente l'avantage de permettre la préparation de 1'hydrocortisone ou de ses intermédiaires dans un procédé d'oxidation biologique ne nécessitant pas l'emploi d'un stérol exogène tel que le cholestérol comme substrat initial et de contourner ainsi le problème de la pénétration d'un stérol dans la levure dont l'imperméabilité aux stérols exogènes sous des conditions d'aérobiose a été décrite (R. T. Lorentz et al., J. Bacteriology, 981-985, 1986).
L'invention concerne aussi l'utilisation des séquences nucléiques obtenues à l'aide du procédé de clonage de l'invention. Une séquence ARN ou ADN codant pour la delta-5,7 stérol,delta-7 réductase peut être utilisée pour le diagnostic ou le traitement d'affections impliquant le produit du gène de la delta-5,7 stérol,delta-7 réductase. Par exemple, une déficience en delta-5,7 stérol,delta-7 réductase qui convertit le 7-déhydro cholestérol en cholestérol est présumée impliquée dans le syndrome RSH/SLO. Ainsi une séquence d'ADN humain peut être utilisée comme sonde pour diagnostiquer une déficience en delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et peut être aussi utilisée en thérapie génique pour corriger une telle déficience.
La présente invention a donc pour objet une séquence d'acide nucléique contenant une séquence codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase, ledit acide nucléique étant un ADN ou un ARN et particulièrement étant un ADNc.
L'activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase peut être mise en évidence par exemple à l'aide d'un test enzymatique in vitro décrit plus loin dans la partie expérimentale.
L'invention a plus particulièrement pour objet une séquence d'ADNc dans laquelle la séquence codante code pour une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant la séquence nucléotidique de la séquence SEQ ID NO 1
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr
1 5 10
GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159
Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu
15 20 25
CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe
30 35 40
GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255
Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro
45 50 55 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303
Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe
65 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351
Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro
80 85 90
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala
95 100 105
GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447
Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly
110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495 il. Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser 125 130 135 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543
Ala Leu il. Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys
145 150 155
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591
Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cyl Gly Asn Leu
160 165 170
ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys
175 180 185
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687
Ser Phe Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser
190 195 200
TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735
Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn 205 210 215 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783
Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val
225 230 235
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TCG AAC ACC ATG 831
Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met
240 245 250
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TCG GGT TGT CTA 879
Asp Ile Ala Hie Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly cy. Leu
255 260 265
GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927
Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn
270 275 280
CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975
Hie Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala 285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023
Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gin
305 310 315
GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TCG GGA AGA GCC CCG 1071
Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro
320 325 330
TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119
Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr
335 340 345
AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TCG TCG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167
Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg Hie Phe Hie
350 355 360
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu 365 370 375 380
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263
Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe
385 390 395
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys
400 405 410
TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359
Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
415 420 425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415
Ile Tyr
430
GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475 TTCTTTTGCT GAAAAAAAA A 1496 ainsi que les variants alléliques de cette séquence.
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr
1 5 10
GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159
Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu
15 20 25
CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe
30 35 40
GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255
Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro
45 50 55 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303
Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe
65 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351
Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro
80 85 90
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala
95 100 105
GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447
Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly
110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495 il. Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser 125 130 135 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543
Ala Leu il. Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys
145 150 155
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591
Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cyl Gly Asn Leu
160 165 170
ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys
175 180 185
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687
Ser Phe Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser
190 195 200
TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735
Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn 205 210 215 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783
Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val
225 230 235
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TCG AAC ACC ATG 831
Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met
240 245 250
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TCG GGT TGT CTA 879
Asp Ile Ala Hie Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly cy. Leu
255 260 265
GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927
Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn
270 275 280
CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975
Hie Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala 285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023
Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gin
305 310 315
GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TCG GGA AGA GCC CCG 1071
Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro
320 325 330
TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119
Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr
335 340 345
AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TCG TCG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167
Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg Hie Phe Hie
350 355 360
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu 365 370 375 380
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263
Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe
385 390 395
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys
400 405 410
TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359
Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
415 420 425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415
Ile Tyr
430
GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475 TTCTTTTGCT GAAAAAAAA A 1496 ainsi que les variants alléliques de cette séquence.
La séquence d'ADNc ci-dessus qui code pour une protéine ayant 430 acides aminés correspondant à la séquence montrée & BR< la figure 3 (SEQ ID NO 2) est une séquence d'ADNc qui peut être obtenue par exemple par clonage dans une levure, à partir d'une banque d'expression d'A. thaliana, en utilisant une méthode de criblage fondée sur l'apparition d'une résistance de la levure à la nystatine, selon des conditions opératoires dont une description détaillée est donnée plus loin.
La connaissance de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1 ci-dessus permet de reproduire la présente invention par des méthodes connues de l'homme du métier, par exemple par synthèse chimique ou par criblage d'une banque génomique ou d'une banque d'ADNc à l'aide de sondes d'oligonucléotides de synthèse par les techniques d'hybridation ou par amplification par PCR.
L'invention a aussi pour objet une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol, delta-7 réductase et qui hybride à la séquence nucléotidique
SEQ ID NO 1 dans des conditions de stringence moyenne ou élevée ou qui présente une identité de séquence d'environ 60 % et plus avec cette séquence.
SEQ ID NO 1 dans des conditions de stringence moyenne ou élevée ou qui présente une identité de séquence d'environ 60 % et plus avec cette séquence.
Les séquences qui hybrident de façon détectable à la séquence SEQ ID NO 1 hybrident dans des conditions standards de stringence moyenne, par exemple une hybridation à 420C, pendant 12 heures dans une solution 50 % formamide, SSCX6 suivie de lavages ou de stringence moins élevée, par exemple une hybridation à 420C pendant 24 heures dans une solution 20 % formamide, SSCX6 suivie de lavages dans les conditions standards connues (T. Maniatis et al., Molecular cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Le pourcentage d'identité de séquence nucléotidique peut être déterminé en utilisant par exemple le programme BLAST "basic local alignment search tool" (S. F. Altschul et al.,
J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) sur le serveur NCBI.
J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) sur le serveur NCBI.
L'invention concerne aussi une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ampli fiable par la technique de PCR en utilisant comme amorces des oligonucléotides codant pour une séquence consensus ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 3
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 dans laquelle Xaa en position 7 est Trp ou Tyr et Xaa en position 12 est His ou Lys.
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 dans laquelle Xaa en position 7 est Trp ou Tyr et Xaa en position 12 est His ou Lys.
La séquence SEQ ID NO 3 ci-dessus correspond à une séquence consensus nouvelle qui a été définie par alignement d'identité de séquences en acides aminés entre la séquence nouvelle SEQ ID NO 2, déduite de la séquence nucléotidique
SEQ ID NO 1, et des séquences connues soit d'autres stérol réductases ayant une spécificité d'action à une position autre que la position C-7, soit de récepteurs à la lamin B, comme cela est détaillé plus loin dans la partie expérimentale.A partir de l'information donnée par la séquence en acides aminés SEQ ID NO 3, une amorce constituée d'au plus 45 nucléotides peut être définie et synthétisée qui, associée à une deuxième amorce oligodT (17 nucléotides) comme séquence de rebond, permettra à laide d'une trousse PCR du commerce (par exemple Stratagène) d'amplifier un ADN codant pour une protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase.
SEQ ID NO 1, et des séquences connues soit d'autres stérol réductases ayant une spécificité d'action à une position autre que la position C-7, soit de récepteurs à la lamin B, comme cela est détaillé plus loin dans la partie expérimentale.A partir de l'information donnée par la séquence en acides aminés SEQ ID NO 3, une amorce constituée d'au plus 45 nucléotides peut être définie et synthétisée qui, associée à une deuxième amorce oligodT (17 nucléotides) comme séquence de rebond, permettra à laide d'une trousse PCR du commerce (par exemple Stratagène) d'amplifier un ADN codant pour une protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase.
L'invention concerne aussi une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val lie Leu Leu Trp Tyr Thr
20 25 30
Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Ph. Trp
35 40 45
Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu
50 55 60
Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Il. Leu
65 70 75 80 Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ber Pro Ala
85 90 95
Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val
100 105 110
Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro
115 120 125
Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe
130 135 140
Gly Ber Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly Hie Val Ala 145 150 155 160
Pro Ser Ser Ser Asp Ber Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe
165 170 175
Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp lie
180 185 190
Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu
195 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser
210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys 225 230 235 240
Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala His
245 250 255
Aep Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cye Leu Val Trp Val Pro
260 265 270
Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro Val Glu
275 280 285
Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cye
290 295 300
Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg 305 310 315 320
Thr Aen Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ber Lys île Val
325 330 335
Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu
340 345 350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu
355 360 365
Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Aen Phe
370 375 380
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lye 385 390 395 400
Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu
405 410 415
Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr
420 425 430 ainsi que les variants alléliques et analogues de cette séquence.
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val lie Leu Leu Trp Tyr Thr
20 25 30
Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Ph. Trp
35 40 45
Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu
50 55 60
Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Il. Leu
65 70 75 80 Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ber Pro Ala
85 90 95
Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val
100 105 110
Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro
115 120 125
Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe
130 135 140
Gly Ber Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly Hie Val Ala 145 150 155 160
Pro Ser Ser Ser Asp Ber Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe
165 170 175
Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp lie
180 185 190
Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu
195 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser
210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys 225 230 235 240
Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala His
245 250 255
Aep Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cye Leu Val Trp Val Pro
260 265 270
Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro Val Glu
275 280 285
Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cye
290 295 300
Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg 305 310 315 320
Thr Aen Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ber Lys île Val
325 330 335
Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu
340 345 350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu
355 360 365
Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Aen Phe
370 375 380
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lye 385 390 395 400
Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu
405 410 415
Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr
420 425 430 ainsi que les variants alléliques et analogues de cette séquence.
Par allèles et analogues, on inclut les séquences modifiées par substitution, délétion ou addition d'un ou plusieurs acides aminés pour autant que ces produits conservent la même fonction. Les séquences modifiées peuvent être par exemple préparées en utilisant la technique de mutagenèse dirigée connue de l'homme du métier.
L'invention a spécialement pour objet une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2 ci-dessus et désignée delta-7Red.
L'invention concerne aussi une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase ayant une séquence en acides aminés présentant une identité de séquence d'environ 60 % et plus avec la séquence SEQ ID NO 2.
Le pourcentage d'identité peut être déterminé par exemple en utilisant le programme BLAST indiqué ci-dessus.
L'invention concerne également une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant une réactivité immunologique croisée avec la protéine d'A. thaliana delta-7Red définie ci-dessus.
La protéine peut être détectée par exemple par immunoprécipitation à l'aide d'un anti-sérum dirigé contre la protéine delta-7Red, préparé selon des méthodes connues.
Un des aspects de l'invention concerne une protéine ayant une activité delta 5,-7 stérol,delta-7 réductase telle qu'obtenue par expression dans une cellule hôte contenant une séquence d'ADN définie précédemment et concerne spécialement une protéine d'A. thaliana telle qu'obtenue par expression dans une cellule hôte contenant une séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2 ci-dessus.
Lorsque la protéine de l'invention est obtenue par expression dans une cellule hôte, celle-ci est réalisée selon les méthodes de génie génétique et de culture cellulaire connues de l'homme du métier.
L'expression peut être réalisée dans une cellule hôte procaryote, par exemple E. coli ou dans une cellule hôte eucaryote, par exemple une cellule de mammifère, une cellule d'insecte ou une levure contenant la séquence codant pour la delta-7 Red de l'invention précédée d'un promoteur convenable.
La protéine recombinante obtenue peut être glycosylée ou non glycosylée.
L'invention concerne notamment une protéine selon l'invention telle qu'obtenue par expression dans une levure.
L'invention concerne aussi un anticorps dirigé contre une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase définie précédemment. L'anticorps peut être un anticorps polyclonal ou un anticorps monoclonal préparé selon les méthodes connues de l'homme du métier.
L'invention concerne aussi un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN définie précédemment ainsi qu'une cellule hôte transformée par ce vecteur.
Les vecteurs d'expression sont des vecteurs connus permettant l'expression de la protéine sous le contrôle d'un promoteur convenable. Pour les cellules procaryotes, le promoteur peut être par exemple le promoteur lac, le promoteur trp, le promoteur tac, le promoteur ss-lactamase ou le promoteur PL. Pour les cellules de mammifères, le promoteur peut être le promoteur SV40 ou les promoteurs de l'adénovirus. Des vecteurs type Baculovirus peuvent être aussi utilisés pour l'expression dans des cellules d'insectes. Pour les cellules de levure, le promoteur peut être par exemple le promoteur PGK, le promoteur ADH, le promoteur CYC1 ou le promoteur GAL1O/CYC1.
Les cellules hôtes peuvent être des cellules procaryotes ou des cellules eucaryotes. Les cellules procaryotes sont par exemple E. coli, Bacillus ou Streptomyces. Les cellules hôtes eucaryotes comprennent des levures et des champignons filamenteux ainsi que des cellules d'organismes supérieurs, par exemple des cellules de mammifères ou des cellules d'insectes. Les cellules de mammifères peuvent être des cellules CHO de hamster ou des cellules Cos de singe. Les cellules d'insectes sont par exemple des cellules SF9. Les cellules de levure peuvent être par exemple Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe ou Kluyveromyces lactis.
Schizosaccharomyces pombe ou Kluyveromyces lactis.
L'invention a aussi pour objet un procédé de clonage d'un acide nucléique codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase dans un microorganisme comprenant une méthode de criblage choisie parmi - la résistance du microorganisme à la nystatine ou à un composé analogue dont la toxicité dépend de la présence de stérols portant une insaturation en position C-7, - l'hybridation de l'acide nucléique avec la séquence nucléotidique de la séquence SEQ ID NO 1 ci-dessus, - l'identification de l'acide nucléique par voie informatique parmi des séquences d'ADN isolées au hasard, - l'expression directe de la protéine suivie d'immunodétection & l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2 ci-dessus.
Par microorganisme, on entend une levure telle que par exemple S. cerevisiae, S. pombe ou K. lactis.
Les composé analogues à la nystatine comprennent par exemple l'amphotéricine B ou la filipine.
Par hybridation, on entend une hybridation dans des conditions de stringence moyenne ou élevée selon les conditions standards connues (T. Maniatis et al., déjà cité).
L'identification par voie informatique peut être réalisée par exemple selon le programme BLAST indiqué ci-dessus.
Un exemple de procédé de clonage ci-dessus dans lequel la méthode de criblage utilise la résistance à la nystatine dans une levure est décrit plus loin dans la partie expérimentale.
L'invention a aussi pour objet une séquence d'acide nucléique, ADN ou ARN, tel qu'obtenu par le procédé de clonage ci-dessus. La séquence d'acide nucléique peut être d'origine procaryote ou eucaryote selon le matériel à partir duquel est réalisé le clonage, par exemple d'origine humaine.
L'invention a aussi pour objet une cellule hôte transformée par un vecteur contenant une séquence d'ADN tel qu'obtenu par le procédé de clonage ci-dessus. La cellule hôte peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Des exemples de cellules hôtes et de vecteurs ont été indiqués précédemment.
L'invention a spécialement pour objet une cellule hôte, choisie parmi une levure ou un champignon filamenteux, transformée par un vecteur contenant une séquence d'ADN de l'invention définie précédemment ou une séquence d'ADN tel qu'obtenu par le procédé de clonage ci-dessus.
L'un des objets de l'invention concerne aussi un procédé de préparation d'une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase dans lequel on cultive une cellule hôte transformée de l'invention et on isole la protéine exprimée et concerne particulièrement un procédé dans lequel la cellule hôte est une levure transformée dans laquelle la séquence d'ADN codante est placée sous le contrôle d'un promoteur de levure.
L'un des objets de l'invention concerne aussi un procédé de réduction in vitro d'un stérol insaturé en position C-7 dans lequel on incube le stérol à réduire avec la protéine obtenue par le procédé ci-dessus et on isole éventuellement le stérol réduit obtenu.
L'un des objets de l'invention concerne aussi un procédé de réduction in vivo d'un stérol exogène insaturé en position
C-7 dans lequel on incube le stérol avec une cellule hôte transformée de l'invention et on isole éventuellement le stérol réduit obtenu. La cellule hôte peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote, en particulier une levure ou un champignon filamenteux.
C-7 dans lequel on incube le stérol avec une cellule hôte transformée de l'invention et on isole éventuellement le stérol réduit obtenu. La cellule hôte peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote, en particulier une levure ou un champignon filamenteux.
L'un des objets de l'invention concerne aussi un procédé de réduction in vivo d'un stérol endogène insaturé en position C-7 dans lequel on cultive une souche hôte transformée de l'invention choisie parmi une levure ou un champignon filamenteux et on isole éventuellement le stérol réduit accumulé.
L'invention concerne particulièrement un procédé de réduction in vitro ou in vivo défini ci-dessus dans lequel le stérol réduit obtenu est un substrat de l'enzyme de clivage de la chaine latérale du cholestérol (P450SCC) et concerne tout particulièrement un procédé de réduction in vivo dans lequel le stérol endogène à réduire est l'ergosta 5,7 diène 3-ol, l'ergosta 5,7,24(28) triène 3-ol ou l'ergosta 5,7,22 triène 3-ol ou un mélange de ceux-ci.
L'invention a aussi pour objet un procédé de production de pregnénolone dans lequel on cultive une cellule hôte transformée de l'invention choisie parmi une levure ou un champignon filamenteux, on isole éventuellement le ou les stérols endogènes réduits en position C-7 accumulés, on incube les stérols réduits en présence de P450SCC, et éventuellement en présence d'adrénodoxine réductase (ADR) et d'adrenodoxine (ADX), et on isole éventuellement la pregnéno lone obtenue.
L'invention a particulièrement pour objet un procédé de production de la pregnénolone défini ci-dessus dans lequel la cellule hôte est une levure.
L'invention concerne aussi un procédé de production de pregnénolone dans lequel on cultive une levure transformée par un ou plusieurs vecteurs permettant la coexpression d'une protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et de P450SCC et éventuellement de l'ADR et de l'ADX et on isole éventuellement la pregnénolone libre ou estérifiée.
La levure transformée utilisée pour la réalisation du procédé de production de pregnénolone ci-dessus peut être par exemple une levure co-transformée par un vecteur d'expression de l'invention contenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et un vecteur d'expression du cytochrome P450SCC et éventuellement de l'ADX et de 1'ADR. Des vecteurs d'expression du cytochrome P450SCC et/ou de l'ADX sont connus et des préparations sont décrites par exemple dans la demande de brevet européen EP 0340878.
La levure transformée utilisée peut être également une levure dans laquelle la séquence d'ADN codant pour la pro téine ayant l'activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase est intégrée dans un locus particulier du génome, par exemple au locus ADE2 et dans laquelle l'ergostérol n'est plus le stérol majoritaire dans les conditions d'expression de la delta-7 réductase. La levure "intégrée" obtenue peut être ensuite transformée par des cassettes d'expression intégratives ou par des vecteurs d'expression contenant une séquence d'ADN codant pour le cytochrome P450SCC et éventuellement pour l'ADX et l'ADR.
Des exemples de production de pregnénolone selon l'invention sont donnés plus loin dans la partie expérimentale.
L'invention s'étend aussi à une séquence d'ADN humain tel qu'obtenu selon le procédé de clonage défini ci-dessus, utilisée comme sonde pour diagnostiquer une déficience congénitale en delta-5,7 stérol,àelta-7 réductase. La déficience en delta-5,7 stérol,delta-7 réductase comprend par exemple la déficience en 7-déhydrocholestérol réductase responsable de taux anormalement bas en cholestérol dans le plasma.
L'invention concerne également une méthode de détection de la déficience en delta-5,7 stérol,delta-7 réductase qui comprend l'incubation d'un échantillon contenant de l'ADN génomique humain avec la sonde définie ci-dessus dans des conditions d'hybridation standards et la mise en évidence de la fixation ou de l'absence de fixation de la sonde & l'ADN génomique, l'absence de fixation ou la réduction de celle-ci indiquant une déficience congénitale en delta-5,7 stérol, delta-7 réductase.
La méthode de l'invention peut permettre par exemple de détecter une déficience congénitale en delta-5,7 stérol, delta-7 réductase prénatale ou chez le nouveau-né ainsi que chez les patients atteints d'affections variées et notamment chez les patients ayant les manifestations cliniques du syndrome RSH/SLO.
Les figures ci-annexées illustrent certains aspects de l'invention
La figure 1 représente le profil en stérols totaux extraits à partir du clone F22 résistant à la nystatine obtenu par criblage de la banque d'A. thaliana dans la levure FY 1679. L'analyse est faite par RP-HPLC à 205 nm ou à 285 nm (figure 1A) ou par CPG comparativement à la levure FY1679 non transformée (figure 1B).
La figure 1 représente le profil en stérols totaux extraits à partir du clone F22 résistant à la nystatine obtenu par criblage de la banque d'A. thaliana dans la levure FY 1679. L'analyse est faite par RP-HPLC à 205 nm ou à 285 nm (figure 1A) ou par CPG comparativement à la levure FY1679 non transformée (figure 1B).
La figure 2 représente une carte de restriction du fragment Not I du plasmide p22 et la stratégie de séquençage.
La figure 3 représente la séquence nucléotidique de l'ADNc delta-7Red (SEQ ID NO 1) et la séquence en acides aminés correspondante (SEQ ID NO 2).
La figure 4 illustre la mesure in vitro de l'activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase d'une fraction microsomale de FY1679 transformée avec le vecteur d'expression inductible "delta-7/V8". L'analyse est faite par CPG et montre la transformation du substrat 7-déhydrocholestérol (TR=16,528) en cholestérol (TR=15,887) en présence des stérols endogènes ergosta 5,22 diène 3-ol (TR=16,682) ; ergostérol (TR = 17,249) ; ergosta 5-ène3-ol (TR=17,664).
La figure 5 illustre la production de pregnénolone in vitro par clivage d'ergosta 5-ène 3-ol (fig. 5A) ; d'ergosta 5,24(28) diène 3-ol (5B) ou d'ergosta 5,22 diène 3-ol (5C) purifié à partir d'une levure transformée exprimant la delta7Red, puis incubé avec P450SCC, ADX et ADR. L'analyse est faite par CPG comparativement à un clivage témoin de cholestérol (trait plein).
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter.
BSEHPLE 1 : Clonage d'ADNc codant pour la delta-5,7 stérol, delta-7 réductase (delta-7Red) d'A. thaliana
A - Criblage de la banque d'expression d'A. thaliana dans la levure
La banque d'expression d'ADNc de départ est la banque décrite par M. Minet et al. (Plant J., 2, 417-422, 1992) qui a été préparée à partir d'ARNm d'A. thaliana au stade de germination au stade à deux feuilles et dont les ADNc bordés par le site Not I ont été insérés au site Bst XI de la cassette d'expression du vecteur navette E. coli/S. cerevisiae pFL61. Cette cassette contient les séquences du promoteur et du terminateur du gène de la phosphoglycérate kinase (PGK).
A - Criblage de la banque d'expression d'A. thaliana dans la levure
La banque d'expression d'ADNc de départ est la banque décrite par M. Minet et al. (Plant J., 2, 417-422, 1992) qui a été préparée à partir d'ARNm d'A. thaliana au stade de germination au stade à deux feuilles et dont les ADNc bordés par le site Not I ont été insérés au site Bst XI de la cassette d'expression du vecteur navette E. coli/S. cerevisiae pFL61. Cette cassette contient les séquences du promoteur et du terminateur du gène de la phosphoglycérate kinase (PGK).
L'origine de réplication de la levure dérivée de la séquence 2 et un marqueur de sélection URA3 assurent la propagation du vecteur dans la levure. La propagation du vecteur dans
E. coli est dérivée du plasmide pUC19.
E. coli est dérivée du plasmide pUC19.
La souche de levure FY 1679 (Mata), qui est une souche isogénique de la souche S288C décrite par A. Thierry et al.
(Yeast, 6, 521-534, 1990), a été transformée par la banque d'ADNc en utilisant la méthode à l'acétate de lithium décrite par D. Gietz et al. (Nucleic Acids Res., 20, 1425, 1992).
Les cellules ont été étalées sur un milieu synthétique
SGI contenant 7 g/l de "yeast nitrogen base" (Difco), 1 g/l de bactocasaminoacides (Difco), 20 g/l de glucose, 20 mg/l de tryptophane et qui est dépourvu d'uracile. 105 transformants prototrophes pour l'uracile ont été obtenus puis groupés et étalés à nouveau sur le même milieu synthétique dépourvu d'uracile et contenant 2 ou 5 pg/ml de nystatine à raison de 5x104 cellules par boite. 106 cellules pour chaque concentration en nystatine ont été ainsi criblées.Après 3 jours d'incubation à 280C, environ 100 clones, qui ont poussé & la concentration de 2 Hg/ml en nystatine, ont été récupérés en constituant des groupes de 5 clones dont la composition en stérols a été analysée par chromatographie liquide à haute performance en phase inversée (noté RP-HPLC dans ce qui suit) alors qu'un seul clone résistant, dénommé F22, a été obtenu à la concentration de 5 pg/ml en nystatine.
SGI contenant 7 g/l de "yeast nitrogen base" (Difco), 1 g/l de bactocasaminoacides (Difco), 20 g/l de glucose, 20 mg/l de tryptophane et qui est dépourvu d'uracile. 105 transformants prototrophes pour l'uracile ont été obtenus puis groupés et étalés à nouveau sur le même milieu synthétique dépourvu d'uracile et contenant 2 ou 5 pg/ml de nystatine à raison de 5x104 cellules par boite. 106 cellules pour chaque concentration en nystatine ont été ainsi criblées.Après 3 jours d'incubation à 280C, environ 100 clones, qui ont poussé & la concentration de 2 Hg/ml en nystatine, ont été récupérés en constituant des groupes de 5 clones dont la composition en stérols a été analysée par chromatographie liquide à haute performance en phase inversée (noté RP-HPLC dans ce qui suit) alors qu'un seul clone résistant, dénommé F22, a été obtenu à la concentration de 5 pg/ml en nystatine.
B - Analyse des stérols accumulés dans le clone P22
Les stérols totaux de la levure sont préparés selon la méthode de saponification alcaline décrite par L. Parks et al. (Methods in Enzymol., 111, 333-346, 1985), puis analysés par RP-HPLC ou/et par chromatographie en phase gazeuse (noté
CPG).
Les stérols totaux de la levure sont préparés selon la méthode de saponification alcaline décrite par L. Parks et al. (Methods in Enzymol., 111, 333-346, 1985), puis analysés par RP-HPLC ou/et par chromatographie en phase gazeuse (noté
CPG).
Le résidu de stérols obtenu est dissout dans le mélange éthanol-tétrahydrofurane-eau (65:10:25 v/v) puis analysé par
RP-HPLC sur une colonne de silice greffée C18 Applied Biosystems (100 x 2,1 mm) au débit de 1 ml/mn et à 550C à l'aide d'un gradient linéaire de méthanol dans de l'eau (50 % & BR< 100 % sur 18 mn) et une détection photométrique à 205 nm et 285 nm comparativement à des standards d'ergostérol, campes térol et cholestérol.
RP-HPLC sur une colonne de silice greffée C18 Applied Biosystems (100 x 2,1 mm) au débit de 1 ml/mn et à 550C à l'aide d'un gradient linéaire de méthanol dans de l'eau (50 % & BR< 100 % sur 18 mn) et une détection photométrique à 205 nm et 285 nm comparativement à des standards d'ergostérol, campes térol et cholestérol.
La composition en stérols est aussi analysée par CPG sur une colonne capillaire SE-30 Alltech (30 m x 0,32 mm) avec de l'hélium comme gaz porteur, une température de 2800C et 3100C pour l'injecteur et le détecteur respectivement, avec une augmentation initiale de la température de 110 0C à 2450C à la vitesse de 450C/mn, puis de 3"C/mn pour atteindre 2800C.
L'analyse par RP-HPLC (figure 1A) et l'analyse par CPG (figure 1B) montrent le profil des stérols accumulés dans le clone F22 obtenu ci-dessus caractérisé par la disparition presque complète de 1'ergostérol, stérol majoritaire de la souche non transformée FY 1679, et son remplacement par deux stérols majeurs et en quantité analogue qui n'absorbent pas & BR< 285 nm et ne possèdent donc plus une double insaturation conjuguée selon l'analyse par RP-HPLC.
A la figure 1A, le campestérol Sigma (24-R-ergosta 5-éne 3-ol) contient environ 35 % de dihydrobrassicastérol (24-Sergosta 5-ène 3-ol).
C - Clonage de l'ADNc delta-7Red
Les plasmides provenant du clone F22 ont été amplifiés dans E. coli selon la méthode décrite par J. N. Strathern et al. (Methods in Enzymol., 194, 319-329, 1991), puis digérés par Not I. Un fragment de 600 paires de bases (bp) environ et un fragment de 1,6 kbp ont été obtenus. La souche FY1679 a été transformée avec chacun des fragments ci-dessus respectivement. La composition en stérols de chaque clone de levure transformée a été analysée comme indiqué ci-dessus et a permis de distinguer le plasmide portant le gène responsable du profil modifié en stérols. Le plasmide ainsi identifié a été dénommé pF22.
Les plasmides provenant du clone F22 ont été amplifiés dans E. coli selon la méthode décrite par J. N. Strathern et al. (Methods in Enzymol., 194, 319-329, 1991), puis digérés par Not I. Un fragment de 600 paires de bases (bp) environ et un fragment de 1,6 kbp ont été obtenus. La souche FY1679 a été transformée avec chacun des fragments ci-dessus respectivement. La composition en stérols de chaque clone de levure transformée a été analysée comme indiqué ci-dessus et a permis de distinguer le plasmide portant le gène responsable du profil modifié en stérols. Le plasmide ainsi identifié a été dénommé pF22.
D - Détermination de la séquence de l'ADNc delta-7Red
L'insert ADNc de pF22 a été sous cloné au site Not I du vecteur pUC9N dérivé de pUC9 (Pharmacia) dans lequel le site
Eco RI du site multiple de clonage est remplacé par insertion d'un site de restriction Not I tout en conservant la phase de lecture du gène LacZ. Une carte de restriction a été ensuite déterminée (figure 2).
L'insert ADNc de pF22 a été sous cloné au site Not I du vecteur pUC9N dérivé de pUC9 (Pharmacia) dans lequel le site
Eco RI du site multiple de clonage est remplacé par insertion d'un site de restriction Not I tout en conservant la phase de lecture du gène LacZ. Une carte de restriction a été ensuite déterminée (figure 2).
Des fragments de restriction ayant le site externe Not I et les sites internes EcoRI, PvuII ou HindîlI respectivement ont été sous clonés dans le plasmide pBluescript. La séquence nucléotidique a été déterminée par la méthode de Sanger avec l'ADN polymérase Sequanase (kit Stratagène) sur les deux brins en utilisant les amorces directe et inverse de pUC9, T3 et T7 de pBluescript ou des amorces spécifiques déduites de la séquence nucléotidique de l'ADNc.
La compilation de l'ensemble des séquences obtenues donne la séquence nucléotidique de l'ADNc delta-7Red d'A. thaliana (SEQ ID NO 1) représentée à la figure 3. Elle comporte 1496 nucléotides se terminant par une séquence de polyadényîation. Elle présente une phase de lecture ouverte débutant par une méthionine initiatrice au nucléotide 76 et se terminant par un codon de terminaison au nucléotide 1366.
Il en résulte une phase de lecture ouverte de 1290 nucléotides codant pour une protéine de 430 acides aminés. La région codante de l'ADNc delta-7Red code pour la protéine delta-7Red dont la séquence déduite en acides aminés (SEQ ID NO 2) est montrée à la figure 3. La séquence de la protéine comprend 430 acides aminés ayant un poids moléculaire calculé de 49,286 kDa.
Un échantillon de souche E. coli DH5 contenant l'ADNc delta-7Red dans le vecteur pUC9N (désigné ADNc delta7red/ pUC9N) a été déposé à la CNCM le 10 février 1995 sous le numéro I-1535.
E - Détermination de la séquence consensus 8EQ ID M 3
Par recherche informatisée dans les bases de séquences (Genbank et EMBL), il a été mis en évidence que la séquence de la protéine delta-7Red d'A. thaliana présente certaines similarités de séquence avec d'autres stérol réductases, en particulier la stérol C-14 réductase et la stérol C-24(28) réductase de S. cerevisiae décrites par R. T. Lorentz et al.
Par recherche informatisée dans les bases de séquences (Genbank et EMBL), il a été mis en évidence que la séquence de la protéine delta-7Red d'A. thaliana présente certaines similarités de séquence avec d'autres stérol réductases, en particulier la stérol C-14 réductase et la stérol C-24(28) réductase de S. cerevisiae décrites par R. T. Lorentz et al.
(DNA Cell Biol., 11, 685-692, 1992) et W. Chen et al. (Yeast, 7, 305-308, 1991) respectivement ainsi que le produit du gêne sts 1+ de S. pombe décrit par M. Shimanuki et al. (Mol. Biol.
Cell, 3, 263-273, 1992) et de la stérol C-14 réductase de
Neurospora crassa (NO X77955 dans la base EMBL). De plus, la protéine delta-7Red montre une similarité avec les 400 acides aminés de l'extrémité C-terminale du récepteur de la lamine B de poulet et avec celle du récepteur humain correspondant décrits par H. J. Worman et al. (J. Cell Biol., 111, 1535-1542, 1990) et E. Schuler et al. (J. Biol. Chem., 269, 11312-11317, 1994).
Neurospora crassa (NO X77955 dans la base EMBL). De plus, la protéine delta-7Red montre une similarité avec les 400 acides aminés de l'extrémité C-terminale du récepteur de la lamine B de poulet et avec celle du récepteur humain correspondant décrits par H. J. Worman et al. (J. Cell Biol., 111, 1535-1542, 1990) et E. Schuler et al. (J. Biol. Chem., 269, 11312-11317, 1994).
Des alignements d'identité de séquence ont été établis entre la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2 déduite de l'ADNc delta-7Red obtenu ci-dessus et celles des trois stérol réductases de levure et des deux récepteurs de lamine B, puis une séquence consensus nouvelle ayant la séquence en acides aminés (SEQ ID NO 3)
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 dans laquelle Xaa en position 7 est Trp ou Tyr et Xaa en position 12 est His ou Lys, a été définie pour préparer des oligonucléotides utilisables comme amorces pour amplifier par PCR de nouvelles séquences d'ADN génomique ou d'ADNc codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase.
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 dans laquelle Xaa en position 7 est Trp ou Tyr et Xaa en position 12 est His ou Lys, a été définie pour préparer des oligonucléotides utilisables comme amorces pour amplifier par PCR de nouvelles séquences d'ADN génomique ou d'ADNc codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase.
F - Expression de la protéine delta-7Red dans la levure.
a) construction du vecteur d'expression delta-7/V8 inductible dans la levure
La délétion des régions non codantes de l'ADNc de pF22 a été effectuée par la technique d'amplification PCR en utilisant les oligonucléotides spécifiques suivants 5'CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 3' (SEQ ID NO 4) et 5'CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3' (SEQ ID NO 5) qui ont été définis pour introduire un site de restriction
BamH I immédiatement en amont du codon d'initiation et un site Kpn I immédiatement en aval du codon stop.
La délétion des régions non codantes de l'ADNc de pF22 a été effectuée par la technique d'amplification PCR en utilisant les oligonucléotides spécifiques suivants 5'CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 3' (SEQ ID NO 4) et 5'CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3' (SEQ ID NO 5) qui ont été définis pour introduire un site de restriction
BamH I immédiatement en amont du codon d'initiation et un site Kpn I immédiatement en aval du codon stop.
L'ADNc a été amplifié à partir de 1 ng de plasmide "ADNc delta7red/pUC9N" en présence de 2 unités de Pfu polymérase et 0,2 M de chacune des amorces ci-dessus en utilisant les conditions d'amplification suivantes : 940C, 10s ; 520C, 50s ; 740C, 90s ; 33 cycles avec la trousse PCR de
Stratagène.
Stratagène.
Un fragment de 1300 bp environ a été obtenu, puis digéré par les enzymes de restriction BamH I et Kpn I et inséré aux sites BamH I et Kpn I du vecteur navette E. coli/S. cerevisiae pYeDP1/8-2 (dénommé V8) décrit par C. Cullin et al.
(Gene, 65, 203-217, 1988). V8 porte le marqueur de sélection
URA3 et contient une cassette d'expression dans la levure contenant le promoteur GAL10/CYC1 et la séquence terminateur du gène PGK. Le vecteur ainsi obtenu, dénommé delta-7/V8, permet l'expression inductible par le galactose de la protéine delta-7Red.
URA3 et contient une cassette d'expression dans la levure contenant le promoteur GAL10/CYC1 et la séquence terminateur du gène PGK. Le vecteur ainsi obtenu, dénommé delta-7/V8, permet l'expression inductible par le galactose de la protéine delta-7Red.
b) Production de la protéine delta-7red
La souche de levure FY 1679 (Mata) a été transformée avec le plasmide delta-7/V8 obtenu ci-dessus en utilisant la méthode à l'acétate de lithium décrite par D. Gietz et al.
La souche de levure FY 1679 (Mata) a été transformée avec le plasmide delta-7/V8 obtenu ci-dessus en utilisant la méthode à l'acétate de lithium décrite par D. Gietz et al.
(déjà cité).
La levure transformée a été cultivée à 270C, en milieu sélectif SGI décrit ci-dessus mais dans lequel la concentration en glucose est de 5 g/l, jusqu'à l'obtention d'une saturation de densité cellulaire (DO600ni=12). La culture est ensuite diluée par addition d'un volume de milieu complet YP (10 g/l en extrait de levure (Difco) et 10 g/l en bactopeptone (Difco)), puis addition d'éthanol (1,5 % v/v) comme source de carbone. Quand la croissance a permis d'atteindre une concentration cellulaire d'au moins 7x107 cellules/ml, l'expression de la delta-7Red a été induite par addition de galactose à la concentration de 20 g/l.
L'induction a été aussi réalisée en milieu minimum sélectif SLI, qui correspond au milieu SGI dans lequel le glucose est remplacé par le galactose (20 g/l), jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire de 2 x cellules/ml.
c) Test ensymatique in vitro de l'activité delta-5,7 stérol, delta-7 réductase
L'expression de la protéine delta-7Red a été mise en évidence en utilisant un test enzymatique décrit par M. Taton et al. (Biochem. Bioph. Commun. Res., 181, 465-473, 1991) mais sans système de régénération du NADPH, avec des préparations cellulaires microsomales ou cytosoliques de la levure induite ci-dessus.
L'expression de la protéine delta-7Red a été mise en évidence en utilisant un test enzymatique décrit par M. Taton et al. (Biochem. Bioph. Commun. Res., 181, 465-473, 1991) mais sans système de régénération du NADPH, avec des préparations cellulaires microsomales ou cytosoliques de la levure induite ci-dessus.
Les fractions cellulaires ont été obtenues par cassage mécanique de cellules induites et isolement des fractions par ultracentrifugation selon la méthode décrite par P. Urban et al. (Eur. J. Biochem., 222, 843-850, 1994). Les cellules sont collectées puis lavées deux fois avec le tampon TE-KC1 (Tris HC1 50mM, pH 7,4 ; EDTA lmM, KC1 0,1 M) et remises en suspension dans le tampon de lyse TE-sorbitol 0,6 M. Des billes de verre de 0,45-0,5 mm de diamètre (Braun) sont ajoutées jus qu'à affleurer la surface de la suspension cellulaire que l'on agite ensuite pendant 5 mn à 40C. Le lysat cellulaire en surface est récupéré et les billes de verre sont lavées trois fois avec le tampon de lyse.Le lysat et les lavages sont réunis puis centrifugés à 20.000 G pendant 13 mn à 40C de façon à éliminer les fractions mitochondriales. Le surnageant recueilli est centrifugé pendant 1 h à 100.000 G et b 40C. Le culot qui contient la fraction microsomale et le surnageant qui représente la fraction cytosolique sont recueillis séparément.
La fraction microsomale ou la fraction cytosolique obtenues sont respectivement incubées pendant 90 mn b 370C dans du tampon Tris/HCl 100 mM à pH 7,3 contenant comme substrat du 7-déhydrocholestérol 150 ZM émulsifié avec du tween 80 (1,5 g/l) et en présence de NADPH 2 mM. Les stérols sont extraits par addition de 3 volumes de mélange méthanoldichlorométhane (50:50, v/v) puis analysés en CPG comparativement aux produits standards.
La formation de cholestérol (TR = 15,887 mn) à partir de 7-déhydrocholestérol (TR = 16,528 mn) est montrée à la figure 4 avec une fraction microsomale (3,5 mg/ml en protéine) obtenue ci-dessus à partir de la levure FY 1679 transformée avec le vecteur delta-7/V8, induite pendant 3 h et dont les stérols endogènes ont des temps de rétention supérieurs (TR = 16,682 mn pour l'ergosta 5-22 diéne 3-ol ;
TR = 17,249 mn pour l'ergostéroî et TR = 17,664 mn pour 1'ergosta 5-ène 3-ol).
TR = 17,249 mn pour l'ergostéroî et TR = 17,664 mn pour 1'ergosta 5-ène 3-ol).
Ces résultats montrent que la protéine delta-7Red, d'une part est exprimée dans la levure transformée, d'autre part possède une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase.
EXEMPLE 2 : Réduction in vivo de stérols endogènes de levure insaturés en position C-7
Des souches de levure dont les stérols majoritaires ont une double liaison en position C-5,7 ont été transformées avec le vecteur delta-7/V8 obtenu à l'exemple 1, puis cultivées et induites comme indiqué à l'exemple 1. Les stérols endogènes, dont le profil est analysé par CPG, ont été extraits et purifiés par RP-HPLC comme indiqué à l'exemple 1 en utilisant une colonne C18 préparative (100 X 4,6 mm), puis identifiés par IR, UV, SM et RMN.Les trois souches suivantes ont été respectivement utilisées - La souche FY1679 décrite à l'exemple 1 - La souche mutant erg5, dénommée PLC 1051, caractérisée par une déficience en stérol C-22 désaturase, qui a été construite par croisement entre la souche FY1679 et la souche originale pol5 décrite par S. W. Molzahn et al. (J. Gen.
Des souches de levure dont les stérols majoritaires ont une double liaison en position C-5,7 ont été transformées avec le vecteur delta-7/V8 obtenu à l'exemple 1, puis cultivées et induites comme indiqué à l'exemple 1. Les stérols endogènes, dont le profil est analysé par CPG, ont été extraits et purifiés par RP-HPLC comme indiqué à l'exemple 1 en utilisant une colonne C18 préparative (100 X 4,6 mm), puis identifiés par IR, UV, SM et RMN.Les trois souches suivantes ont été respectivement utilisées - La souche FY1679 décrite à l'exemple 1 - La souche mutant erg5, dénommée PLC 1051, caractérisée par une déficience en stérol C-22 désaturase, qui a été construite par croisement entre la souche FY1679 et la souche originale pol5 décrite par S. W. Molzahn et al. (J. Gen.
Microbiol., 72, 339-348, 1972) et qui accumule de l'ergosta 5,7-diène 3-01.
- La souche double mutant erg4,5, dénommée PLC 1451, caractérisée par une déficience en stérol C-22 désaturase (erg5) et stérol C-24(28) réductase (erg4), a été obtenue par croisement entre la souche FY1679 et une souche pol5 décrite par S.
W. Molzahn et al. (déjà cité) ayant acquis une résistance spontanée à la nystatine au cours d'un criblage systématique de levures mutants de stérols et qui accumule de l'ergosta 5,7,24(28) triène 3-01. La souche haploïde résultante, qui porte la double mutation erg4, erg5, croIt en présence de galactose et de substrat non fermentable et est auxotrophe pour l'uracile, le tryptophane et l'histidine. Les souches
PLC 1051 et PLC 1451 ont été déposées à la CNCM le 10 février 1995 sous les numéros I-1536 et I-1537 respectivement.
PLC 1051 et PLC 1451 ont été déposées à la CNCM le 10 février 1995 sous les numéros I-1536 et I-1537 respectivement.
Les stérols réduits majeurs identifiés respectivement à partir des trois souches transformées ci-dessus sont indiqués dans le tableau suivant
Souche Stérol endogène Stérol endogène initiale majeur initial majeur réduit en C-7
FY 1679 ergosta 5,7,22 triène 3-01 ergosta 5-ène 3-01
(ergostérol) (dihydrobrassicastérol)
ergosta 5,22 diène 3-01
(brassicastérol) erg5 ergosta 5,7 diène 3-ol ergosta 5-ène-3-ol
PLC 1051 erg4,5 ergosta 5,7,24(28)triène- ergosta 5,24(28) diène
PLC 1451 3-01 3-01 (ostréastérol)
EXEMPLE 3 : Production de pregnénolone in vitro par clivage de stérols endogènes de levure réduits en C-7
La production de pregnénolone est réalisée en utilisant le test enzymatique de clivage de la channe latérale du cholestérol in vitro décrit par Wada et al. (Arch. Biochem.
Souche Stérol endogène Stérol endogène initiale majeur initial majeur réduit en C-7
FY 1679 ergosta 5,7,22 triène 3-01 ergosta 5-ène 3-01
(ergostérol) (dihydrobrassicastérol)
ergosta 5,22 diène 3-01
(brassicastérol) erg5 ergosta 5,7 diène 3-ol ergosta 5-ène-3-ol
PLC 1051 erg4,5 ergosta 5,7,24(28)triène- ergosta 5,24(28) diène
PLC 1451 3-01 3-01 (ostréastérol)
EXEMPLE 3 : Production de pregnénolone in vitro par clivage de stérols endogènes de levure réduits en C-7
La production de pregnénolone est réalisée en utilisant le test enzymatique de clivage de la channe latérale du cholestérol in vitro décrit par Wada et al. (Arch. Biochem.
Biophys., 290, 376-380, 1991) dans lequel 260 IrM d'un stérol réduit en C-7 obtenu à l'exemple 2 sont incubés dans 150 Al de tampon phosphate 10 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, tween 20 0,3 % en présence de 140 nM d'adrénodoxine réductase, de 1,16 ZM d'adrénodoxine et de 0,68 UM de cytochrome P450SCC d'origine bovine obtenus à partir de glandes surrénales par exemple selon D. W. Seybert et al., J.B.C., 254, 12088-12098, 1979.
La réaction est déclenchée par addition de 150 AM de
NADPH. Après une incubation de 80 mn à 370C, la réaction est arrêtée par addition d'un volume de mélange methanol-dichlo- rométhane (50:50 v/v). Les stérols sont extraits et analysés par CPG comme indiqué à l'exemple 1.
NADPH. Après une incubation de 80 mn à 370C, la réaction est arrêtée par addition d'un volume de mélange methanol-dichlo- rométhane (50:50 v/v). Les stérols sont extraits et analysés par CPG comme indiqué à l'exemple 1.
La figure 5 montre respectivement que l'ergosta 5-ène 3-01 (fig. SA), l'ergosta 5,24(28) diène 3-ol (fig. 5B) ou l'ergosta 5,22 diène 3-ol (fig. 5C) est substrat du cytochrome P450SCC et conduit à un produit ayant un TR identique à celui de la pregnénolone obtenue dans les mêmes conditions par clivage du cholestérol.
Les résultats obtenus montrent qu'une levure transformée exprimant la delta-7Red accumule des stérols utilisables directement pour préparer de la pregnénolone par oxidation biologique in vitro.
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOn: ROUSSEL UCLAF
(B) RUE: 35, Boulevard des Invalides
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75007
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Sequence d'ADN codant pour une proteine de
A.
(i) DEPOSANT:
(A) NOn: ROUSSEL UCLAF
(B) RUE: 35, Boulevard des Invalides
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75007
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Sequence d'ADN codant pour une proteine de
A.
thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7
reductase, proteine delta-7Red, procede de production,
souche de levures transformees, applications.
reductase, proteine delta-7Red, procede de production,
souche de levures transformees, applications.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release S1.0, Version S1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1496 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Arabidopsis thaliana
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDB
(B) EMPLACEMENT:76..1365
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1:
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTCGCCGAG ACGAAGAGAA 60
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111
Met Ala Glu Thr Val Hie Ser Pro Ile Val Thr Tyr
1 5 10
GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159
Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu
15 20 25
CTA TCG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe
30 35 40
GGC TTC TTT TCG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TCG CCA 255
Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro
45 50 55 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303
Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe
65 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351
Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro
80 85 90
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala
95 100 105
GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TCG TTT CGA 447
Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly
110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495
Ile Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser 125 130 135 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543
Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr île Lys
145 150 155
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT CGT AAC CTA 591
Gly Hie Val Ala Pro Ser Ser Ser Aep Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu
160 165 170
ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Ile Ile Aep Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys
175 180 185
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687
Ser Ph. Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Het Ser
190 195 200
TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735
Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Aen 205 210 215 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783
Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val
225 230 235
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TCG AAC ACC ATG 831
Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr net
240 245 250
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TOC TCG GGT TGT CTA 879
Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu
255 260 265
GTG TCG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA CGC ATG TAC CTT GTG AAC 927
Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Aen
270 275 280
CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975
His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala île Tyr Ile Leu Val Ala 285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023
Gly Ile Leu Cys Ile Tyr île Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln
305 310 315
GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TCG GGA AGA GCC CCG 1071
Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro
320 325 330
TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119
Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr
335 340 345
AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TCG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167
Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg Hie Phe Hie
350 355 360
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu 365 370 375 380
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263
Phe Asp Aen Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe
385 390 395
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys
400 405 410
TAT TCG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AOC ATC ATT CCG CGA 1359
Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
415 420 425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415
Ile Tyr
430 GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAOCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475
TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A A 1496 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 430 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2:
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr
20 25 30
Met Val Hie Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Trp
35 40 45
Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu
50 55 60
Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu
65 70 75 80 Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala
85 90 95
Gly Aen Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val
100 105 110
Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro
115 120 125
Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu île Phe
130 135 140
Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala 145 150 155 160
Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe
165 170 175
Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp île
180 185 190
Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu
195 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser
210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys 225 230 235 240
Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala Hie
245 250 255
Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro
260 265 270
Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn Hie Pro Val Glu
275 280 285
Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly île Leu Cye
290 295 300
Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg 305 310 315 320
Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val
325 330 335
Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu
340 345 350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu
355 360 365
Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Phe
370 375 380
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys 385 390 395 400
Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu
405 410 415
Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr
420 425 430 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE:Peptide
(B) EMPLACEMENT:7
(D) AUTRES INFORMATIONS:/note= "residu 7 = Trp ou Tyr"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: Peptide
(B) EMPLACEMENT:12
(D) AUTRES INFORHATIONS:/notes "residu 12 = His ou Lys"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr
1 5 10 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc~feature
(B) EMPLACEMENT:10..29
(D) AUTRES INFORMATIONS:/note= "SEQUENCE ID No 1 DE 76 A
95"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 29 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: misc~feature
(B) EMPLACEMENT:complement (10..28) (D) AUTRES INFORHATIONS:/note= "SEQUENCE ID No 1
COMPLEMENTAIRE DE 1350 A 1368" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 28
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release S1.0, Version S1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1496 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Arabidopsis thaliana
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDB
(B) EMPLACEMENT:76..1365
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1:
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTCGCCGAG ACGAAGAGAA 60
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111
Met Ala Glu Thr Val Hie Ser Pro Ile Val Thr Tyr
1 5 10
GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159
Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu
15 20 25
CTA TCG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe
30 35 40
GGC TTC TTT TCG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TCG CCA 255
Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro
45 50 55 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303
Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe
65 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351
Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro
80 85 90
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala
95 100 105
GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TCG TTT CGA 447
Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly
110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495
Ile Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser 125 130 135 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543
Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr île Lys
145 150 155
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT CGT AAC CTA 591
Gly Hie Val Ala Pro Ser Ser Ser Aep Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu
160 165 170
ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Ile Ile Aep Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys
175 180 185
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687
Ser Ph. Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Het Ser
190 195 200
TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735
Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Aen 205 210 215 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783
Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val
225 230 235
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TCG AAC ACC ATG 831
Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr net
240 245 250
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TOC TCG GGT TGT CTA 879
Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu
255 260 265
GTG TCG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA CGC ATG TAC CTT GTG AAC 927
Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Aen
270 275 280
CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975
His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala île Tyr Ile Leu Val Ala 285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023
Gly Ile Leu Cys Ile Tyr île Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln
305 310 315
GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TCG GGA AGA GCC CCG 1071
Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro
320 325 330
TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119
Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr
335 340 345
AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TCG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167
Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg Hie Phe Hie
350 355 360
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu 365 370 375 380
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263
Phe Asp Aen Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe
385 390 395
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys
400 405 410
TAT TCG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AOC ATC ATT CCG CGA 1359
Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
415 420 425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415
Ile Tyr
430 GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAOCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475
TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A A 1496 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 430 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2:
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr
20 25 30
Met Val Hie Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Trp
35 40 45
Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu
50 55 60
Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu
65 70 75 80 Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala
85 90 95
Gly Aen Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val
100 105 110
Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro
115 120 125
Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu île Phe
130 135 140
Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala 145 150 155 160
Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe
165 170 175
Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp île
180 185 190
Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu
195 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser
210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys 225 230 235 240
Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala Hie
245 250 255
Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro
260 265 270
Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn Hie Pro Val Glu
275 280 285
Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly île Leu Cye
290 295 300
Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg 305 310 315 320
Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val
325 330 335
Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu
340 345 350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu
355 360 365
Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Phe
370 375 380
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys 385 390 395 400
Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu
405 410 415
Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr
420 425 430 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE:Peptide
(B) EMPLACEMENT:7
(D) AUTRES INFORMATIONS:/note= "residu 7 = Trp ou Tyr"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: Peptide
(B) EMPLACEMENT:12
(D) AUTRES INFORHATIONS:/notes "residu 12 = His ou Lys"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr
1 5 10 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc~feature
(B) EMPLACEMENT:10..29
(D) AUTRES INFORMATIONS:/note= "SEQUENCE ID No 1 DE 76 A
95"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 29 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: misc~feature
(B) EMPLACEMENT:complement (10..28) (D) AUTRES INFORHATIONS:/note= "SEQUENCE ID No 1
COMPLEMENTAIRE DE 1350 A 1368" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 28
Claims (31)
- REVENDICATIONS 1) Séquence d'acide nucléique contenant une séquence codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase, ledit acide nucléique étant un ADN ou un ARN.
- 2) Séquence d'acide nucléique selon la revendication 1 dans laquelle l'acide nucléique est un ADNc.
- 3) Séquence d'ADNc selon la revendication 2 dans laquelle la séquence codante code pour une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant la séquence nucléotidique de la séquence SEQ ID NO 1GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60 AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr1 5 10GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu15 20 25CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Ph.Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Ph.TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu 365 370 375 380TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215350 355 360Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg Hie Ph. HieAGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TCG TCG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167335 340 345Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys ThrTCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119320 325 330Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala ProGAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG CGA AGA GCC CCG 1071305 310 315Gly île Leu Cys île Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg GlnGGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala île Tyr Ile Leu Val Ala 285 290 295 300CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975270 275 280Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val AenGTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927255 260 265Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys LeuGAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TCG GGT TGT CTA 879240 245 250Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr MetTAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831225 230 235Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu ValGGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn 205 210 215 220TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735190 195 200Ser Phe Asp il. Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met SerAGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687175 180 185Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly LysATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639160 165 170Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn LeuGGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591145 150 155Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr île LysGCA CTA ATA TTC CGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543Ile Phe Asn Pro Ala île Val Tyr Aep Hie Leu Gly Glu Ile Ph. Ser 125 130 135 140ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495110 115 120Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Ph. GlyGCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 44795 100 105Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu AlaATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 39980 85 90Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly ProGAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 35165 70 75Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala PheAGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 30345 50 55 60Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp ProGGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 25530 35 40430 GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GOCATAGACA 1475 TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496 ainsi que les variants alléliques de cette séquence.Ile TyrATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415415 420 425Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro GlyTAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG CGA 1359400 405 410Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly LysGAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG ARA 1311385 390 395
- 4) Séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et qui hybride & la séquence définie à la revendication 3 dans des conditions de stringence moyenne ou élevée ou qui présente une identité de séquence d'environ 60 % et plus avec cette séquence.
- 5) Séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et amplifiable par la technique de PCR en utilisant comme amorces des oligonucléotides codant pour une séquence consensus ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 3Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 dans laquelle Xaa en position 7 est Trp ou Tyr et Xaa en position 12 est His ou Lys.
- 6) Protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu1 5 10 15Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr20 25 30Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Trp35 40 45Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu50 55 60Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu65 70 75 80 Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala85 90 95Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val100 105 110Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly île Phe Asn Pro115 120 125Ala Ile Val Tyr Asp Hie Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe130 135 140Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala 145 150 155 160Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu île île Asp Phe165 170 175Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp île180 185 190Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu195 200 205Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser210 215 220Asp Ser Met Leu Val Asn Thr île Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys 225 230 235 240Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala His245 250 255Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro260 265 270Ser Val Tyr Thr Ber Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn Hie Pro Val Glu275 280 285Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly île Leu Cys290 295 300Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg 305 310 315 320Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val325 330 335Ala Ber Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu340 345 350Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu355 360 365Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Phe370 375 380Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys 385 390 395 400Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu405 410 415Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr420 425 430 ainsi que les variants alléliques et analogues de cette séquence.
- 7) Protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2 et désignée delta-7Red.
- 8) Protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase ayant une séquence en acides aminés présentant une identité de séquence d'environ 60 % et plus avec la séquenceSEQ ID NO 2 définie à la revendication 7.
- 9) Protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant une réactivité immunologique croisée avec la protéine d'A. thaliana delta-7Red définie à la revendication 7.
- 10) Protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase telle qu'obtenue par expression dans une cellule hôte contenant une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
- 11) Protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase telle qu'obtenue par expression dans une cellule hôte contenant une séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2.
- 12) Protéine selon la revendication 10 ou la revendication 11 dans laquelle la cellule hôte est une levure.
- 13) Anticorps dirigé contre une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase selon l'une quelconque des revendications 6 à 12.
- 14) Vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
- 15) Cellule hôte transformée par un vecteur selon la revendication 14.
- 16) Procédé de clonage d'un acide nucléique codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase dans un microorganisme comprenant une méthode de criblage choisie parmi - la résistance du microorganisme à la nystatine ou à un composé analogue dont la toxicité dépend de la présence de stérols portant une insaturation en position C-7, - l'hybridation de l'acide nucléique avec la séquence nucléotidique de la séquence SEQ ID NO 1, - l'identification de l'acide nucléique par voie informatique parmi des séquences d'ADN isolé(es) au hasard, - l'expression directe de la protéine suivie d'immunodétection à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2.
- 17) Séquence d'acide nucléique, ADN ou ARN, tel qu'obtenu par le procédé défini à la revendication 16.
- 18) Cellule hôte transformée par un vecteur contenant une séquence d'ADN selon la revendication 17.
- 19) Cellule hôte transformée selon la revendication 15 ou la revendication 18 dans laquelle l'hôte est une levure ou un champignon filamenteux.
- 20) Procédé de préparation d'une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase dans lequel on cultive une cellule hôte transformée selon l'une quelconque des revendications 15, 18 ou 19 et isole la protéine exprimée.
- 21) Procédé selon la revendication 20 dans lequel la cellule hôte est une levure transformée dans laquelle la séquence d'ADN codante est placée sous le contrôle d'un promoteur de levure.
- 22) Procédé de réduction in vitro d'un stérol insaturé en position C-7 dans lequel on incube le stérol à réduire avec la protéine obtenue selon la revendication 20 ou la revendication 21 et on isole éventuellement le stérol réduit obtenu.
- 23) Procédé de réduction in vivo d'un stérol exogène insaturé en position C-7 dans lequel on incube le stérol avec une cellule hôte transformée selon l'une quelconque des revendications 15, 18 ou 19 et on isole éventuellement le stérol réduit obtenu.
- 24) Procédé de réduction in vivo d'un stérol endogène insaturé en position C-7 dans lequel on cultive une souche hôte transformée selon la revendication 19 et on isole éventuellement le stérol réduit accumulé.
- 25) Procédé de réduction in vitro ou in vivo selon l'une quelconque des revendications 22 à 24 dans lequel le stérol réduit obtenu est un substrat de l'enzyme de clivage de la channe latérale du cholestérol (P450SCC).
- 26) Procédé de réduction in vivo selon la revendication 25 dans lequel le stérol endogène à réduire-est l'ergosta 5,7 diène 3-01, l'ergosta 5,7,24(28) triène 3-01 ou l'ergosta 5,7,22 triène 3-01 ou un mélange de ceux-ci.
- 27) Procédé de production de pregnénolone dans lequel on cultive une cellule hôte transformée selon la revendication 19, on isole éventuellement le ou les stérols endogènes réduits en position C-7 accumulés, on incube les stérols réduit en présence de P450SCC, et éventuellement d'adrénodoxine (ADR) et d'adrénodoxine réductase (ADX), et on isole éventuellement la pregnénolone obtenue.
- 28) Procédé selon la revendication 27 dans lequel la cellule hôte est une levure.
- 29) Procédé de production de pregnénolone dans lequel on cultive une levure transformée par un ou plusieurs vecteurs permettant la coexpression d'une protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et de P450SCC, et éventuellement de 1'ADR et de 1'ADX, et on isole éventuellement la pregnénolone libre ou estérifiée.
- 30) Séquence d'ADN humain selon la revendication 17 utilisée comme sonde pour diagnostiquer une déficience congénitale en delta-S, 7 stérol, delta-7 réductase.
- 31) Méthode de détection de la déficience en delta-5,7 stérol,delta-7 réductase qui comprend l'incubation d'un échantillon contenant de 1'ADN génomique humain avec la sonde selon la revendication 30 dans des conditions d'hybridation standards et la mise en évidence de la fixation ou de l'absence de fixation de la sonde à 1'ADN génomique, l'absence de fixation ou la réduction de celle-ci indiquant une déficience congénitale en delta-5,7 stérol,delta-7 réductase.
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| SK188-96A SK283656B6 (sk) | 1995-02-15 | 1996-02-13 | Sekvencia DNA kódujúca proteín organizmu A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol, delta-7-reduktázy, proteín delta-7-Red, spôsob ich výroby, kmene transformovaných kvasiniek, aplikácie |
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| BRPI9600729-0 BRPI9600729B8 (pt) | 1995-02-15 | 1996-02-14 | vetor de expressão, microorganismo transgênico, processo de clonagem de um ácido nucléico e processo para preparação de uma proteína e cepa de levedura transformada |
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