CZ294860B6 - Sekvence DNA kódující protein A. thaliana s aktivitou delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, protein delta-7 Red, primer, protein A. thaliana, způsob jejich výroby, kmenové struktury transformovaných kvasinek a použití - Google Patents

Sekvence DNA kódující protein A. thaliana s aktivitou delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, protein delta-7 Red, primer, protein A. thaliana, způsob jejich výroby, kmenové struktury transformovaných kvasinek a použití Download PDF

Info

Publication number
CZ294860B6
CZ294860B6 CZ1996432A CZ43296A CZ294860B6 CZ 294860 B6 CZ294860 B6 CZ 294860B6 CZ 1996432 A CZ1996432 A CZ 1996432A CZ 43296 A CZ43296 A CZ 43296A CZ 294860 B6 CZ294860 B6 CZ 294860B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
leu
ile
gly
delta
tyr
Prior art date
Application number
CZ1996432A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ43296A3 (en
Inventor
Xavier Dr. Chenivesse
Catherine Dr. Ing. Duport
Eric Dr. Lecain
Denis Pompon
Original Assignee
Aventis Pharma S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9501723A external-priority patent/FR2730494B1/fr
Priority claimed from FR9506517A external-priority patent/FR2734839B1/fr
Application filed by Aventis Pharma S.A. filed Critical Aventis Pharma S.A.
Publication of CZ43296A3 publication Critical patent/CZ43296A3/cs
Publication of CZ294860B6 publication Critical patent/CZ294860B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Popisuje se sekvence nukleové kyseliny, obsahující sekvenci kódující protein organismu A. thaliana, mající aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy (sekvence SEQ ID No. 1), primer pro amplifikaci, protein A. thaliana, protilátky, způsob klonování, způsob redukce sterolů nenasycených v poloze C-7, způsob výroby pregnenolonu, kdy hostitelská buňka je kvasinka, transformovaný kmen kvasinek, označený EC01/pCD63 pod přístupovým číslem CNCM I-1538 a použití.ŕ

Description

Sekvence DNA kódující protein A. thaliana s aktivitou delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, protein delta-7 Red, primer, protein A.thaliana, způsob jejich výroby, kmenové struktury transformovaných kvasinek a použití
Oblast techniky
Vynález se týká sekvence DNA kódující protein organizmu A.Thaliana s aktivitou delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, protein delta-7 Red, primeru, proteinu A.thaliana, způsobu jejich výroby, kmenové struktury transformovaných kvasinek a použití.
Dosavadní stav techniky
Delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasa (E.C. 1.3.1.21) je mikrosomální enzym, jehož přítomnost byla prokázána na základě jeho účinku v homogenátech krysích jater (Μ. E. Dempsey a kol. Methods Enzymol., 15, 501-514, 1969) stejně tak jako v přípravcích rostlin Zea mays (M. Taton a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181, 465-473, 1991). Tato reduktasa je závislá na NADPH a redukuje in vitro 7-dehydrocholesterol na cholesterol.
Steroly jsou základní složky membrán eukaryotů, ale jejich struktura vykazuje rozdíly podle druhů. V buňkách eukaryotů jako jsou například kvasinky je hlavním sterolem ergosterol, který vykazuje dvojnásobnou vazbu na C-5 a C-7, postranní rozvětvený řetězec na C-24 a nenasycenost C-22, zatímco u savců je to cholesterol, mající nenasycenost na C-5 a nasycený boční řetězec. Sitosterol, stigmasterol a campesterol, nejčastější steroly rostlin, mají postranní řetězec rozvětvený, ale nasycený a, stejně tak jako je tomu u obratlovců, postrádají nenasycenost na C-7. Enzym způsobující tyto strukturní rozdíly sterolového jádra je delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasa.
Delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasa nebyla nikdy připravena v dokonale čisté podobně a částečně čistá forma byla pouze popsána (Μ. E. Dempsey a kol.; M. Taton a kol. citované výše). Protein nebyl nikdy charakterizován svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi. Nebyla podána žádná písemná informace o sekvenci proteinu ani o protilátkách, které proti němu působí. Na druhé straně byla popsána zjevná defícience 7-dehydrocholesterol reduktasy u člověka, vázaná k syndromu RSH/Smith-Lemli-Opitz (SLO) (J. M. Opitz a kol., Am. J. Med. Genet., 50, 326-338, 1994).
Klonování cDNA, kódující delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasu, které dovoluje identifikovat odpovídající proteinovou sekvenci stejně tak jako charakterizovat lidský gen nebo prokázat jeho vrozenou defícienci, tedy není možné provést známými metodami, používajícími například hybridizační techniky a/nebo imunologickou detekci. Je tedy obzvláště důležité vypracovat meto dy hybridizačního prohledávání, dovolující provedení klonování, a to zejména při nedostatku informace o proteinu.
Ergosterol, základní sterol membrán hub, obsahuje pár dvojných konjugovaných vazeb na C-5,7 což dává sloučeninám ze skupiny polyenů jako je například nystatin, antimykotický účinek (R. Bittman a kol., J. Biol. Chem., 260, 2884-2889, 1985). Silná závislost účinku nystatinu na koncentraci sterolů nenasycených v C-5,7 v membránách umožňuje u S.cerevisiae vypěstovat kmeny mutantů vzhledem k akumulovaným sterolům (S. W. Molzahn a kol., J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972). Mutanti erg2 a erg3 akumulují steroly, které mají konjugované dvojné vazby v C-5,7, a to vzhledem k defícienci sterolu delta-8,7izomerázy (W. Ashman a kol., Lipids, 26, 628, 1991) a nebo sterolu delta-5 dehydrogenázy (B. Arthington a kol., Gene, 102, 39, 1991). Tito mutanti jsou životaschopní, neboť ergosterol, přirozený základní sterol kvasinek, může být za jistých podmínek nahražen jinými substitučními steroly, zahrnujícími cholesterol.
-1 CZ 294860 B6
Podstata vynálezu
Podstatou předkládaného vynálezu je sekvence nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující protein A. thaliana mající aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy, kdy kyselina je buď DNA, 5 nebo RNA, výhodně cDNA; kde kódující sekvence odpovídá nukleotidová sekvenci
SEQ ID No. 1:
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGA TCAG aaT' ÍTGAGGC TTTGGCCGAG A. 1GAAGAGAA 60
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111
Met Ala Glu Thr val Hle Ser Pro Ile val Thr Tyr
1 5 10
GCA TCG Ala Ser ATG Met 15 TTA TCG Leu Ser CTT CTC Leu Leu GCC Ala 20 TTC Phe TGT Cys CCA Pro CCT TTC Pro Phe 25 GTC ATT CTC Leu
Val Ile
CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT
Leu Trp Tyr Thr Met Val Hle Gin Asp Gly Ser Val Thr Gin Thr Phe
30 35 40
GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA
Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gin Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro
45 50 55 60
AGA ccc ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT
Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe
S5 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA
Glu Ala Ile Leu Gin Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg val Glu Gly Pro
80 65 90
159
207
255
303
351
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT
Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala
95 100 105
399
-2CZ 294860 B6
GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT ctt GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447
Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr Hi a Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly
110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCC
Ile Ph· Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly G1U ile Phe Ser
125 130 135 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ΑΤΑ AAA 543
Ala Leu Ile Phe Gly Ser 145 Phe Ile Phe Cys Val 150 Leu Leu Tyr Ile Lys 155
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591
Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Cly Asn Leu
160 165 170
ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Ile Ile Aep Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys
17S 180 185
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATC ATG TCT 687
Ser Phe Asp Ile Lyg Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Cly Met Met Ser
190 195 200
TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TCC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735
Trp Ala val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gin Tyr Glu Ile Asn
205 210 21S 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA Ser ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG Val
Gly Lys Val Ser Asp 225 Met Leu Val Asn 230 Thr Ile Leu Met Leu 235
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG
Tyr val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met
240 245 250
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GCA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA
A«P Ile Ala His Aep Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu
255 2 60 265
GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC
Val Trp Val Pro Ser val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu val Asn
270 275 280
783
831
879
927
975
CAC crc GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAS ATT CTC -TT CCA
His Pro val Glu Leu Gly Thr Gin Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala
285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA
Gly ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gin Arg Gin
305 310 315
GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG
Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cye Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro
320 325 330
TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT
Ser Lye Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr
345
335
340
1023
1071
1119
AGT CTT CTC Ser Leu Leu 350 ΤΤΆ ACG TCT GGA TGG Trp TGG Trp GGA Gly TTG Leu GCT Ala 360 CGT Arg CAT His TTC Phe CAT HiS 1167
Leu Thr Ser Gly 355
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu
365 370 375 380
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263
Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr val Leu Thr Leu Leu Leu Phe
385 390 395
GAT CGA GCC AAG AGA CAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
Aep Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys
400 405 410
TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359
Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
420
42S
415
ATT
TAT
TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT
ACGTTAATTC
1415
Ile
Tyr
430
GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA
TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A
1475
1496 stejně tak jako alelické variace této sekvence, jakož i sekvence DNA kódující protein mající 5 aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy, která hybridizuje se sekvencí definovanou výše za podmínek střední nebo vysoké stringence a nebo se shoduje se sekvencí definovanou výše na alespoň 60 %.
Dalším předmětem vynálezu je primer pro amplifikaci sekvence DNA kódující protein mající 10 aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy technikou polymerázové řetězové reakce (PCR),
-4CZ 294860 B6 kterým je oligonukleotid který má sekvenci, které odpovídá následující sekvence aminokyselin SEQ ID No. 3:
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 515 1015 ve které Xaa v poloze 7 je Trp nebo Tyr a Xaa v poloze 12 je His nebo Lys.
Dalším předmětem vynálezu je protein A. thaliana, mající aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 10 reduktasy a mající sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 2:
Met Ala Glu Thr Val Hle Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala ser Met Leu 15 1015
Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr 20 2530
Met Val His Gin Asp Gly Ser val Thr Gin Thr Phe Gly Phe Phe Trp 35 4045
Glu Asn Gly Val Gin Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu 50 5560
Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala IleLeu
70 7580
Gin Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser ProAla
9095
Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val
100 105110
Thr Leu Ale Thr Hie Leu sly Leu Trp Trp Phe Glv Ile Phe Asn Pro
115 120 12 5
Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe
130 135 140
Gly Ser Phe Ile Phe Cys val Leu Leu Tyr Ile Lye Gly His Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Ser Ser ASp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe
165 170 175
Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp Ile
180 185 190
Lya Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu
195 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gin Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser 210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile ' Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys
225 230 235 240
Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala His
245 250 255
Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro
260 265 270
Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro Val Glu
275 280 285
Leu Gly Thr Gin Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cys
290 295 300
Ile Tyr Ile Lya Tyr Asp Cys Asp Arg Gin Arg Gin Glu Phe Arg Arg
305 310 315 320
Thr Asn i Gly Lys i Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val
325 330 335
Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu
340 345 350
Thr ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu
355 360 365
-6CZ 294860 B6
Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Aep Abh Phe
370 375 330
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys
385 390 395 400
Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu
405 410 415
Tyr Cya Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Oly Ile Tyr
420 425 430
stejně tak jako alelické varianty a analogy této sekvence, které mají aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy nebo protein mající aktivitu delta-5,7sterol,delta-7 reduktasy a mající sekvenci aminokyselin, která se shoduje se sekvencí SEQ ID No. 2 na alespoň 60 %.
Dalším předmětem vynálezu je použití DNA sekvence pro expresi proteinu, majícího aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, v hostitelské buňce. Hostitelskou buňkou je kvasinka.
Dalším předmětem vynálezu jsou protilátky proti proteinu majícímu aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy. Vektor exprese obsahuje sekvenci DNA uvedenou výše.
Dalším předmětem vynálezu je hostitelská buňka transformovaná vektorem exprese obsahujícím DNA sekvencí, popsanou výše.
Dalším předmětem vynálezu je způsob klonování nukleové kyseliny kódující protein mající aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy v mikroorganizmu, který zahrnuje metodu prohledávání pomocí hybridizace a odpovídající jedné z následujících možností:
- rezistence mikroorganizmu na nystatin nebo na analogickou sloučeninu, jejíž toxicita závisí na přítomnosti sterolů nesoucích nenasycenost v poloze C-7,
- hybridizace nukleové kyseliny s nukleotidovou sekvencí SEQ ID No. 1,
- identifikace nukleové kyseliny informatickou metodou mezi náhodně izolovanými sekvencemi DNA,
- přímá exprese proteinu následovaná imunodetekcí s pomocí protilátek proti proteinu, majícímu sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 2.
Dalším předmětem vynálezu je způsob výroby proteinu majícího aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy kdy je kultivována transformovaná hostitelská buňka a je izolován exprimovaný protein. Hostitelská buňka je transformovaná kvasinka, ve které je kódující sekvence DNA řízena promotorem kvasinky.
Dalším předmětem vynálezu je způsob redukce in vitro sterolu nenasyceného v poloze C-7, kdy se sterol inkubuje s proteinem a popřípadě se izoluje získaný redukovaný sterol.
Dalším předmětem vynálezu je způsob redukce in vivo exogenního sterolu nenasyceného v poloze C-7, kdy se sterol inkubuje s transformovanou hostitelskou buňkou a popřípadě se izoluje získaný redukovaný sterol.
Endogenní sterol určený k redukci je ergosta-5,7-dien-3-ol, ergosta-5,7,24(28)-trien-3-ol nebo ergosta-5,7,22-trien-3-ol a nebo jejich směs.
Dalším předmětem vynálezu je způsob výroby pregnenolonu, kdy se kultivují transformované hostitelské buňky, popřípadě se izoluje akumulovaný endogenní sterol nebo steroly redukované v poloze C-7, redukované steroly se inkubují v přítomnosti P450SCC a popřípadě i adrenodoxin reduktasy, ADR, a adrenodoxinu, ADX, a popřípadě se izoluje získaný pregnenolon.
Dalším předmětem vynálezu je transformovaný kmen kvasinek, koexprimující protein definovaný výše, mající aktivitu deIta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy, P450SCC, ADR a ADX a akumulující volný nebo esterifikovaný pregnenolon.
Kmen kvasinek označený EC01/pCD63, uložený pod přístupovým číslem CNCM 1-1538, ve kterém protein mající aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy je protein A. thaliana delta-7Red.
Výhody zvýšení rezistence kmenů kvasinek, obohacených steroly neobsahujícími dvojitou nenasycenost v C-5,7, nystatin byly v předloženém vynálezu využity ke klonování cDNA kódující heterologický protein mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy metodou prosévání, využívající metabolické interference v S. cerevisiae. Úspěšnost této metody, výhodné tím, že nevyžaduje znalost sekvence DNA popřípadě proteinu a kromě toho umožňuje detekci založenou výhradně na enzymatické aktivitě, však není zaručena, neboť sejí staví do cestyřada technických překážek.
První omezení vychází z toho, že způsob působení nystatinu není dosud úplně objasněn (L. W. Parks a kol. CRC Critical Reviews in Microbiology, 301-304, 1978). Tak například lze očekávat slabou specificitu selekce pomocí nystatinu vzhledem k její nepřímé povaze, která vede u kvasinek ke spontánní selekci genomických mutací, jako jsou například mutanty erg (S. W. Molzahn a kol. citovaní výše) a nebo genomických mutací, vykazujících rezistenci nezávislou na povaze sterolů. Takto mohou buňky přeměněné bankou exprimovat heterologické geny udělující rezistenci na nystatins bez ohledu na povahu sterolů.
Další příklad omezení uvedené metody vychází z toho, že heterologické proteiny mohou být v buňce slabě aktivní, což vede k absenci nebo oslabení rezistence na nystatin například z následujících důvodů:
1) gen kódující delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy je slabě vyjádřen,
2) protein je málo aktivní nebo neaktivní, protože je špatně replikován nebo vzniká z nesprávné subcelulární adresace,
3) rostlinné proteiny nepřijímají vlastní steroly kvasinek jako substrát a nebo
4) steroly, které mohou být jako substrát, se nacházejí v esterifíkované podobě a nebo jsou uloženy ve vesiculech a nejsou v kontaktu s enzymem.
Je tedy možno očekávat, že takto akumulované steroly se vyhnou působení delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, o které se uvádí, že je u eukaryotů lokalizována v mikrosomech.
Předkládaný vynález se týká klonování cDNA organizmu A. thaliana, kódující protein mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy a nazvaný delta-7Red, a to klonováním pomocí metabolické interference v kvasinkách, založené na rezistenci na nystatin. Protein delta-7Red dovoluje redukovat steroly, mající nenasycenou vazbu v C-7 pomocí biologické redukce, která navíc nabízí výhodné řešení problému selektivní redukce vazby C-7 u sterolů nebo steroidů, majících dvojnásobnou nenasycenost v C-5,7, což metody redukce chemickou cestou neumožňují.
-8CZ 294860 B6
Vynález se také týká buněk transformovaných kvasinek exprimujících protein delta-7Red, které, což je překvapivé, akumulují látky nasycené v poloze C-7 a popřípadě i v C-22 které, na rozdíl od ergosterolu, jsou substráty pro štěpení postranního řetězce cholesterolu, to jest cytochromu P450SCC.
Tyto neočekávané vlastnosti dovolují použití transformovaných kvasinek podle vynálezu pro výrobu sterolů nebo steroidů, které jsou průmyslově nebo farmakologicky významné, speciálně výrobu pregnenolonu biologickou oxidací endogenních sterolů kvasinek, redukovaných v C-7, působením cytochromu P450SCC (P450SCC) za přítomnosti adrenodoxin reduktasy (ADR) a adrenodoximu (ADX). Transformované kvasinky podle vynálezu též mohou být používány při výrobě steroidů, které jsou meziprodukty metabolického řetězce přeměny cholesterolu na hydrokortizon u savců a dalších obratlovců. Výhodou tohoto způsobu výroby je skutečnost, že dovoluje přípravu hydrokortizonu nebo meziproduktů biologickou oxidací, ve které není třeba jako výchozí látku používat exogenní sterol, jako je například cholesterol, čímž je možné vyhnout se problémům spojeným s pronikáním sterolů do kvasinek, jejichž nepropustnost pro exogenní steroly za podmínek aerobiosy byla popsána (R. T. Lorentz a kol., J. Bocteriology, 981-985, 1886).
Vynález se také týká použití posloupností nukleotidů získaných klonováním podle vynálezu. Sekvence RNA nebo DNA kódující delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy může být používány pro diagnostiku nebo léčení chorob, u kterých hrají roli produkty genu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy. Například se předpokládá, že nedostatek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, která přeměňuje 7-dehydrocholesterol na cholesterol, se vyskytuje v případě syndromu RSH/SLO. Sekvence lidské DNA tedy může používat jako diagnostická sonda pro diagnózu deficience delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy a může také být používána v genové terapii, korigující takovou deficienci.
Předkládaný vynález se tedy týká sekvence nukleové kyseliny, obsahující sekvenci kódující protein, mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, přičemž uvedená nukleová kyselina je DNA nebo RNA a s výhodou cDNA.
Enzymatický účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy může být prokázán například pomocí enzymatických testů in vitro popsaných dále v experimentální části popisu.
Vynález se obzvláště týká sekvence DNA, ve které kódující protein A. thaliana má účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy a má nukleotidovou sekvenci SEQ ID No. 1:
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC WTGGCCGAG ACGAAGAGAA
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr
GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT WC GTC ATT CTC
Ala Ser Met Leu
Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val
Ile Leu
111
159
-9CZ 294860 B6
CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp 30 Tyr Thr Met Val His 35 Gin Asp Gly Ser Val 40 Thr Gin Thr Phe
GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255
Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gin Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro
45 50 55 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303
Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe
65 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351
Glu Ala Ile Leu Gin Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro
80 85 90
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala
95 100 105
GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447
Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly
110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495
Ile Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser
125 130 135 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543
Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys
145 150 155
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591
Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu
160 165 170
ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys
175 180 185
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687
Ser Phe Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser
190 195 200
10CZ 294860 B6
TGG GCA GTT CTI GCA GTC ACG TAC TGC ΑΤΑ AAA CAG TAT GAA ΑΤΑ AAT Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gin Tyr Glu Ile Asn 735
205 210 215 220
GGC AAA GTA TCT GAT . TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783
Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val
225 230 235
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831
Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met
240 245 250
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879
Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu
255 260 265
GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927
Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu val Asn
270 275 280
CAC ccc GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975
His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gin Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala
285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023
Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys . Asp Arg Gin Arg Gin
305 310 315
GAG Glu TTC Phe AGG AGG ACA AAC Thr Asn GGG AAA TGT Cys 325 TTG GTT TGG GGA AGA GCC Ala CCG Pro 1071
Arg Arg 320 Gly Lys Leu Val Trp Gly Arg 330
TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119
Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr
335 340 345
AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT ttc CAT 1167
Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His
350 355 360
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu
365 370 375 380
- 11 CZ 294860 B6
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC Tyr GTC CTC ACC CTT CTT CTC Leu 395 TTT Phe 1263
Phe Asp Asn Phe Leu Ala 385 Tyr Phe Val 390 Leu Thr Leu Leu
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys
400 405 410
TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG CGA 1359
Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
415 420 425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415
Ile Tyr
430
GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475
TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A
1496 stejně tak jako alelické modifikace této sekvence.
Sekvence DNA popsaná výše kóduje protein, skládající se z 430 aminokyselin a odpovídající sekvenci, znázorněné na obrázku 3 (SEQ ID No. 2), je sekvence cDNA, která může být získána například klonováním v kvasinkách, vycházejíce z genové banky úseků expresí A. thaliana, využívajíce při tom metodu hybridizačního prohledávání založené na vzniku rezistence kvasinek na nystatinu, a to za podmínek, které jsou podrobněji popsány dále.
Znalost nukleotidické sekvence SEQ ID No. 1 popsané výše dovoluje reprodukovat postupy podle vynálezu metodami známými odborníkům v oboru, například chemickou syntézou nebo pomocí prosévání genové banky nebo banky cDNA pomocí sondování syntetizovaných oligonukleotidů technikami hybridizace nebo amplifíkace pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce).
Vynález se také týká sekvence DNA kódující protein, mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, hybridizující posloupnost SE Q ID No. 1 v podmínkách průměrné nebo zvýšené stringence a který se s touto sekvencí shoduje na 60 nebo více procent.
Sekvence, které zjistitelným způsobem hybridizují sekvenci SEQ ID No. 1, ji hybridují za standardních podmínek průměrné stringence, například hybridace při 42 °C, po 12 hodin v 50
Procento shody nukleotidických sekvencí může být určeno například programem BLAST „basic local alignment search tool“ (S. F. Altschul a kol., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) na serveru NCBI.
Vynález se také týká sekvence DNA, kódující protein mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy a amplifíkovaný technikou PCR, přičemž jako primery se používají oligonukleotidy kódující společnou sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 3:
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr
10 15
-12 CZ 294860 B6 ve které Xaa v pozici 7 je Trp nebo Tyr a Xaa v pozici 12 je His nebo Lys.
Sekvence SEQ ID No. 3 popsaná níže odpovídá nové společné sekvenci, která byla definovaná pomocí srovnání sekvencí aminokyselin mezi novou sekvencí SEQ ID No. 2, odvozenou 5 z nukleotidické sekvence SEQ ID No. 1, a sekvencemi známými buď z jiných sterolových reduktas, majících specifické působení na jinou polohu než je poloha C-7, a nebo zreceptorů laminu B, tak, jak je to podrobněji popsáno dále v experimentální části. Vycházejíce z informace obsažené v sekvenci SEQ ID No. 3 je možno definovat a syntetizovat primery, představované nejvýše 45 nukleotidy, který spolu s druhým primerem oligodT (17 nukleotidů) jako výchozí 10 sekvencí dovoluje s využitím komerční soupravy pro PCR (například Stratagenu) amplifikovat
DNA kódující protein mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy.
Vynález se také týká také proteinu A, thaliana, který má účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, který má sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 2:
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr
20 25 30
Met Val Híb Gin Asp Gly Ser Val Thr Gin Thr Phe Gly Phe Phe Trp
35 40 45
Glu Asn Gly Val Gin Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu
50 55 60
- 13 CZ 294860 B6
Ile Ala Trp Lya Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu
70 7580
Gin Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala
9095
Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lya Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val
100 105110
Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro 115 120125
Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe 130 135140
Gly Ser Phe ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His ValAla
145 150 155160
Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ile Ile AspPhe
165 170175
Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile 185 Gly Lys Ser Phe 190 Asp Ile
180
Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu
195 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gin Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser
210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys
225 230 235 240
Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala His
245 250 255
Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro
260 265 270
Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro Val Glu
275 280 285
14CZ 294860 B6
Leu Gly 290 Thr Gin Leu Ala Ile Tyr Ile Leu 295 Val Ala 300 Gly Ile Leu Cys
Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gin Arg Gin Glu Phe Arg Arg
305 310 315 320
Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val
325 330 335
Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu
340 345 350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg Hxb Phe His Tyr Val Pro Glu
355 360 365
Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Phe
370 375 380
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys
385 390 395 400
Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu
405 410 415
Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr
420 425 430
stejně tak jako alelické obměny a analogy této sekvence.
Mezi alely a analogy jsou zahrnovány sekvence modifikované substitucí, vynecháváním a nebo přidáváním jedné nebo více aminokyselin tak, aby vzniklý produkt si zachovával původní funkci. Modifikované sekvence mohou být například připraveny užívajíce techniky řízené mutageneze, dobře známé odborníkům.
Vynález se obzvláště týká proteinu A. thaliana, který má účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy a má sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 2 popsanou výše a je nazvaný delta-7Red.
Vynález se také týká proteinu, který má účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy a má sekvenci aminokyselin, která se na 60 nebo více procent shoduje se sekvencí SEQ ID No. 2.
Procento shodnosti může být určeno například programem BLAST zmíněným výše.
Vynález se také týká proteinu, majícího účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy a majícího vzájemnou imunologickou reaktivitu s proteinem A. thaliana delta-7Red, definovanou výše.
Protein může být detekován například imunoprecipitací pomocí antiséra směrovaného proti proteinu delta-7Red, připraveného známými metodami.
- 15CZ 294860 B6
Jeden z nároků vynálezu se týká proteinu, majícího účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy a získaného expresí v hostitelské buňce obsahující sekvenci DNA, definovanou výše a obzvláště se týká proteinu A. thaliana, získaného expresí v hostitelské buňce obsahující sekvenci DNA, kódující sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 2 popsanou výše.
Pokud je protein podle vynálezu získán expresí v hostitelské buňce, je připravován metodami genového inženýrství a přípravy buněčných kultur, které jsou známy odborníkům voboru.s
Exprese může být realizováno v prokaryotní hostitelské buňce, například v E. coli a nebo v hostitelské buňce eukaryotní, například v buňce savce, v buňce hmyzu nebo kvasinek, obsahující sekvenci kódující delta-7Red podle vynálezu, připravované vhodným promotorem.
Získaný rekombinační protein může být glykosylovaný a nebo neglykosylovaný.
Vynález se jmenovitě týká proteinu podle vynálezu, získaného expresí vkvasinkách.
Vynález se také týká protilátek proti proteinu, majícímu účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, který byl definován výše. Protilátky mohou být polyklonální protilátky nebo monoklonální protilátky, připravené způsobem, známým odborníkům.
Vynález se také týká vektoru exprese, který obsahuje sekvenci DNA definovanou výše stejně tak jako hostitelské buňky, transformované tímto vektorem.
Vektory exprese jsou známé vektory, které dovolují expresi proteinu pod kontrolou vhodného promotoru. V prokaryotních buňkách může být promotor například promotor lac, promotor trp, promotor tac, promotor β-laktamázy nebo promotor PL. V buňkách savců může promotor být promotor SV40 nebo promotor adenoviru. Pro expresi v buňkách hmyzu mohou být také použity vektory typu Baculovirus. V buňkách kvasinek může promotor být například promotor PGK, promotor ADH, promotor CYC1 nebo promotor GAL10/CYC1.
Hostitelské buňky mohou být buňky prokaryotní nebo buňky eukaryotní. Prokaryotní buňky jsou například E. coli, Bacillus nebo Streptomyces. Eukaryotní hostitelské buňky obsahující kvasinky a vláknité houby stejně jakož i buňky vyšších organizmů, například buňky savců nebo buňky hmyzu. Buňky savců mohou být buňky CHO křečka nebo buňky Cos opice. Buňky hmyzu mohou být například buňky SF9. Buňky kvasinek mohou být například Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe nebo Kluyveromyces lactis.
Vynález se také týká postupu klonování nukleové kyseliny, kódující protein, mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy v mikroorganizmu, který zahrnuje metodu prosévání zvolenou mezi následuj ícími postupy:
- rezistence mikroorganizmu na nystatin nebo na analogickou sloučeninu, jejíž toxicita závisí na přítomnosti sterolů, nesoucích nenasycenost v poloze C-7,
- hybridizace nukleové kyseliny s nukleotidickou sekvencí SEQ ID No. 1 popsanou výše,
- identifikací nukleové kyseliny informatickými metodami mezi náhodně izolovanými sekvencemi DNA,
- přímou expresí proteinu následovaným imunodetekcí za použití protilátek proti proteinu, majícím sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 2 popsanou výše.
Mikroorganizmem se míní kvasinky jako jsou například S. cerevisiae, S. pombe nebo K. lactis.
Sloučeninami analogickými nystatinu se rozumí například amphotericin B nebo fílipin. Hybridizací se rozumí hybridizace za podmínek střední nebo zvýšené stringence za standardních a známých podmínek (T. Maniatis a kol., citovaný výše).
-16CZ 294860 B6
Identifikace informatickou cestou může být prováděna například pomocí programu BLAST, zmíněného výše.
Příklad postupu klonování popisovaného výše ve kterém použitá metoda prosévání využívá rezistence na nystatin v kvasinkách je popsána dále v experimentální části.
Předmětem vynálezu je též sekvence nukleových kyselin, DNA nebo RNA, získaných klonováním popsaným výše. Sekvence nukleové kyseliny může být prokaryotního nebo eukaryotního původu podle toho, který výchozí materiál byl pro klonování použit, může být například lidského původu.
Vynález se také týká hostitelských buněk, transformovaných vektorem, obsahujícím sekvenci DNA, získanou výše popsaným klonováním. Hostitelská buňka může býti prokaryotní nebo eukaryotní. Příklady hostitelských buněk a vektorů již byly uvedeny výše.
Vynález má speciálně za předmět hostitelské buňky, zvolené mezi kvasinkami nebo vláknitými houbami, transformovanými vektorem obsahujícím sekvenci DNA podle vynálezu definovanou výše nebo sekvenci DNA, získanou výše popsaným klonováním.
Vynález se také týká způsobu výroby proteinu, majícího účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, ve kterém se kultivuje transformovaná hostitelská buňka podle vynálezu a izoluje se odpovídající protein a týká se obzvláště způsobu výroby, ve kterém hostitelská buňka je transformovaná kvasinka, ve které je kódující sekvence DNA podrobena působení promotoru kvasinek.
Vynález se také týká redukce in vitro sterolu nenasyceného v poloze C-7, ve kterém se inkubuje sterol určený k redukci s proteinem, získaným výše popsaným postupem a izoluje se popřípadě získaný redukovaný sterol.
Vynález se také týká způsobu redukce in vivo exogenního sterolu nenasyceného v poloze C-7, při kterém se inkubuje sterol s transformovanými hostitelskými buňkami podle vynálezu a izoluje se popřípadě získaný redukovaný sterol. Hostitelská buňka může být prokaryotní nebo eukaryotní buňka, obzvláště kvasinka nebo vláknitá houba.
Vynález se také týká způsobu redukce in vivo endogenního sterolu nenasyceného v poloze C-7, ve kterém se kultivuje transformovaný hostitelský kmen podle vynálezu, zvolený mezi kvasinkami a vláknitými houbami a popřípadě se izoluje redukovaný akumulovaný sterol.
Vynález se obzvláště týká redukce in vitro nebo in vivo popsané výše, ve které je získaný redukovaný sterol je substrát enzymu štěpení postranního řetězce cholesterolu (P450SSC) a speciálně se týká způsobu redukce in vivo ve kterém endogenní sterol určený k redukci je ergosta-5,7-dien-3-ol, ergosta-5,7,24(28)-trien-3-ol nebo ergosta-5,7,22-trien-3-ol nebo také jejich směs.
Vynález se také týká způsobu výroby pregnolonu, ve kterém se kultivuje transformovaná hostitelská buňka podle vynálezu, zvolená mezi kvasinkami nebo vláknitými houbami, popřípadě se izoluje akumulovaný endogenní sterol nebo steroly, redukované v poloze C-7, redukované steroly se inkubují v přítomnosti P450SCC, popřípadě v přítomnosti adrenohexin reduktasy (ADR) a adrenohexinu (ADX) a popřípadě se izoluje získaný pregnenolon.
Vynález se také týká způsobu výroby pregnenolonu popsaného výše, ve kterém hostitelské buňky jsou kvasinky.
Vynález se také týká způsobu výroby pregnenolonu ve kterém se kultivuje transformovaná kvasinka jedním nebo více vektory dovolujícími koexpresi proteinu, majícího účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy a P450SCC, ADR, ADX, obzvláště způsob výroby, ve kterém
- 17CZ 294860 B6 protein mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy je protein A. thaliana delta-7Red a obzvláště takovéhoto způsobu výroby, ve kterém kmen kvasinek je kmen EC01/pCD63.
Příklady výroby pregnenolonu podle vynálezu jsou podány dále v experimentální části.
Transformované kvasinky, používané pro provádění způsobu výroby pregnenolonu podle vynálezu popsaného výše, mohou být například kvasinky kotransformované vektorem exprese podle vynálezu, obsahujícím sekvenci DNA, kódující protein mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy a vektor exprese cytochromu P450SCC a popřípadě ADX nebo ADR. Vektory exprese cytochromu P450SCC a/nebo ADX jsou známy a způsoby jejich výroby jsou popsány například v přihlášce evropského patentu EP 0340878 stejně tak, jako dále v experimentální části.
Používané transformované kvasinky mohou také být kvasinky, ve kterých sekvence DNA, kódující protein mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy je integrován do určitého místa genomu, například do místa ADE2 s ve kterém ergosterol již není majoritní sterol v podmínkách exprese delta-7 reduktasy. Získané „integrované“ kvasinky mohou potom být transformovány geny exprese nebo vektory exprese, obsahujícími sekvenci DNA, kódující cytochrom P450SCC a popřípadě i ADX a ADR.
Příklad vytvoření kmene kvasinek, produkujícího in vivo pregnenolon nebo jeho ester s kyselinou octovou, je podán dále v experimentální části.
Vynález se také týká kmene transformovaných kvasinek koexprimujících protein, mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, P450SCC, ADR a ADX a akumulující volný nebo esterifikovaný pregnenolon, obzvláště výše zmíněný kmen kvasinek, ve kterém protein mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy je protein A. thaliana delta-7Red a speciálně kmen kvasinek pojmenovaný EC01/pCD63 jehož detailní konstrukce je popsána dále v experimentální partii.
Vynález se také týká sekvence lidské DNA, získané klonováním způsobem popsaným výše, používané jako sonda pro diagnostikování vrozené deficience delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy. Deficience delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy zahrnuje například deficienci 7-dehydrocholesterol reduktasy, způsobující anormálně nízký podíl cholesterolu v plazmě.
Vynález se také týká metody detekce deficience delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, spočívající v inkubaci vzorku, obsahujícího lidskou genomickou DNA se sondou definovanou výše za standardních podmínek hybridizace a prokázání fixace nebo absence fixace sondy na genomickou DNA, přičemž absence fixace nebo její redukce indikuje vrozenou deficienci delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy.
Metoda podle vynálezu dovoluje například detekovat vrozenou deficienci delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy v prenatálním období nebo u novorozenců, stejně tak jako u pacientů s různými druhy poruch a jmenovitě u pacientů u nichž se klinicky projevuje syndrom RSH-SLO.
Připojené obrázky ilustrují některé aspekty vynálezu:
Obrázek 1 představuje celkový podíl sterolů extrahovaných z klonu F22 rezistentního na nystatin a získaný proséváním banky A. thaliana v kvasinkách FY 1679. Analýza je prováděna pomocí RP-HPLC při 205 nm nebo 285 nm (obrázek 1A) nebo pomocí plynové chromatografie ve srovnání s netransformovanými kvasinkami FY 1679 (obrázek 1B).
Obrázek 2 představuje restrikční mapu fragmentu Not I plasmidu pF22 a strategii sekvence.
Obrázek 3 představuje nukleotidickou sekvenci cDNA delta-7Red (SEQ ID No. 1) a odpovídající sekvenci aminokyselin (SEQ ID No. 2).
-18CZ 294860 B6
Obrázek 4 znázorňuje měření účinku in vitro delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy z mikrosomální frakce FY 1679 transformované vektorem indukovatelné exprese „delta-7/V8“. Analýza je prováděna plynovou chromatografií a ukazuje transformaci substrátu 7-dehydrocholesterolu (TR=16,528 min) na cholesterol (TR=15,887 min) v přítomnosti endogenních sterolů ergosterol (TR=15,887 min) v přítomnosti endogenních sterolů ergosta-5,22-dien-3-ol (TR=16,682 min), ergosterolu (TR= 17,249 min) a ergosta-5-en-3-olu (TR= 17,664 min).
Obrázek 5 ilustruje produkci pregnenolonu in vitro štěpením čistého ergosta-5-en-3-olu (obr. 5A), ergosta-5,24(28)-dien-3-olu (5B) nebo ergosta-5,22-dien-3-olu (5C) z transformovaných kvasinek exprimujících delta-7Red, poté inkubovaných s P450SCC, ADX a ADR. Analýza je prováděna plynovou chromatografií ve srovnání s kontrolním štěpením cholesterolu (plná čára).
Obrázek 6 ilustruje konstrukci integrovaného plasmidu pADA7, který dovoluje integraci cDNA kódující delta-7Red (sterol Δ7 reduktasa) v místě ADE2.
Obrázek 7 představuje výsledky plynové chromatografíe sterolů extrahovaných alkalickým zmýdelněním kmenu FY 1679 a integrovaného kmenu ELR01, kultivovaných v přítomnosti galaktosy.
Obrázek 8 podává schematicky konstrukci člunkového (shuttle) vektoru E. coli S. cerevisiae VI3, obsahujícího jediné místo Sáli (Sa) v místě vícenásobného klonování.
Obrázek 9 představuje etapy konstrukce integrovaných plasmidů pCD62-l a pCD62-2, která umožňuje inzerci genu exprese ADR do mezigenové oblasti genů leu2 a spllA.SCMl a SCM2: vícenásobně klonovatelná místa.
Obrázek 10 ukazuje strategii konstrukce kmene CDR01.
Obrázek 11 představuje etapy konstrukce plasmidu exprese pCD63, obsahujícího dva geny exprese ADX a P450SCC.
Obrázek 12 představuje analýzu plynovou chromatografií sterolů, extrahovaných z buněk (celulární lyzát) nebo z kultury (kultivační půda) a získaných z kmene EC01/pCD63 po indukci galaktosou po 9 hodin (obrázek 12a) nebo 24 hodin (obrázek 12b).
Obrázek 13 představuje strukturu plasmidu pTG 7457.
Obrázek 14 představuje strukturu plasmidu pTG 7453.
Obrázek 15 představuje strukturu plasmidu pTG 10014.
Obrázek 16 představuje strukturu plasmidu pTG 10004.
Obrázek 17 představuje strukturu plasmidu pTG 10031.
Obrázek 18 představuje strukturu plasmidu pTG 10033.
Následující příklady ilustrují vynález, aniž by jej omezovaly.
- 19CZ 294860 B6
Příklad 1: Klonování cDNA, kódující delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasu (delta-7Red) A. thaliana
A. Prosévání banky exprese A. thaliana v kvasinkách
Výchozí banka exprese DNA je banka popsaná M. Minetem a kol. (Plant. J., 2, 417-422, 1992), která byla připravena zRNAm A. thaliana ve stadiu od klíčení do stádia se dvěma listy a jejíž cDNA ohraničené místem Not I byly vloženy do místa Bst XI genu exprese člunkového vektoru E. coli/S. cerevisiae FL61. Tento gen obsahuje sekvence promotoru a terminátoru genu fosfoglycerátkinasy (PGK). Počátek replikace kvasinky odvozený ze sekvence 2μ a markér selekce URA3 zaručují propagaci vektoru do kvasinky. Propagace vektoru E. coli je odvozena od plasmidu pUC19.
Kmen kvasinek FY 1679 (Mata), který je izogenický kmenu S288C, který popsal A. Thierry a kol. (Yeast, 6, 521-534, 1990) byl transformován bankou cDNA za použití metody lithiumacetátu, kterou popsal D. Gietz a kol. (Nucleic, Acids Res., 20, 1425, 1992).
Buňky byly rozprostřeny na syntetické kultivační půdě SGI, obsahující 7g/l „yeast nitrogen base“ (Difco), 1 g/1 bactocasaminokyseliny (Difco), 20 g/1 glukózy, 20 mg/1 tryptophanu a zbavené uracilu. Bylo získáno 105 transformantů prototrofních na uráčil. Ty byly poté seskupeny a znovu umístěny na syntetickou kultivační půdu zbaveného uracilu a obsahujícího 2 nebo 5 pg/ml nystatinu po 5 x 104 buněk na misku. Takto bylo pro každou koncentraci nystatinu proséváno 106 buněk. Po 3 dnech inkubace při 28 °C bylo přibližně 100 klonů, které vyrostly při koncentraci 2pg/ml nystatinu, seskupeno do skupin po 5 klonech, u nichž bylo analyzováno složení sterolů vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií v inverzní fázi (označované dále RP-HPLC), zatímco jediný rezistentní klon, označený F22, byl získán při koncentraci 5pg/ml nystatinu.
B - Analýza akumulovaných sterolů v klonu F22.
Získané steroly jsou preparovány metodou alkalické saponifíkace, kterou popsal L. Parks a kol. (Methods in Enzymol., 111, 333-346, 1985) a potom analyzovány RP-HPLC a/nebo chromatografií v plynné fázi (GPC).
Reziduum získaných sterolů se rozpustí ve směsi ethanol-tetrahydrofuran-voda (65:10:25 objemově) a potom analyzovány RP-HPLC na koloně roubované silice C18 Applied Biosystems (100 x 2,1 mm) při průtoku 1 ml/mn a 55 °C při lineárním gradientu methanolu ve vodě(50
Směs sterolů je také analyzována plynovou chromatografií (GPC) na kapilární koloně SE-30 Alltech (30 m x 0,32 mm) s heliem jako plynným nosičem při teplotách od 280 °C do 310 °C pro injektor a detektor, s počátečním zvýšením teploty z 110 °C na 245 °C při rychlosti 45 °C/min, poté 3 °C/min až na 280 °C.
Analýza pomocí RP-HPLC (obrázek 1A) a analýza plynovou chromatografií (obrázek 1B) ukazují rozložení akumulovaných sterolů v klonu F22 získaného postupem popsaným výše, vyznačující se takřka úplným vymizením ergosterolu, který je přitom majoritním sterolem netransformovaného kmene FY 1679, a jeho nahrazením dvěma majoritními steroly v obdobných množstvích, které neabsorbují 285 nm a tudíž podle analýzy pomocí RP-HPLC neobsahují dvojitou konjugovanou nenasycenost.
Na obrázku 1A campesterol (Sigma) (24-R-ergosta-5-en-3-ol) obsahuje zhruba 35
C - Klonování cDNA delta-7Red.
Plasmidy pocházející z klonu F22 jsou amplifikovány v E. coli metodou popsanou J.N. Strathenem a kol. (Methods in Enzymol., 194, 319-329, 1991), potom natráveny pomocí
-20CZ 294860 B6
Not I. Byly získány fragment o zhruba 600 párech bází a fragment o 1600 párech bází. Kmen FY 1679 byl transformován každým ze zmíněných fragmentů. Složení sterolů v každém z klonů transformovaných kvasinek bylo analyzováno výše popsaným způsobem, což dovolilo rozlišit plasmidy nesoucí gen způsobující modifikovaný profil sterolů. Takto identifikovaný plasmid byl označen jako pF22.
D - Určení sekvence cDNA delta-7Red
Vložená cDNA plasmidu pFF22 byla klonována do místa Not I vektoru pUC9N odvozeného od pUC9 (Pharmacia), ve kterém bylo místo EcoRI vícenásobného klonovacího místa nahraženo vložením restrikčního místa Not I přičemž byla zachována čtecí fáze genu LacZ. Pak byla určena restrikční mapa (obrázek 2).
Restrikční fragmenty mající externí místo Not I a interní místa EcoRI, PvuII nebo HindlII byly klonovány v plasmidu pBluescript (Stratagen). Nukleotidická sekvence byla určena Sangerovou metodou pomocí DNA polymerázy Sequenase (kit Stratagen) na dvou vláknech užívajíce při tom přímé a inverzní primery pUC9, T3 a T7 plasmidu pBluescript nebo specifické primeiy odvozené z nukleotidické sekvence cDNA.
Kompilaci souboru získaných sekvencí podává nukleotidická sekvence cDNA delta-7Red organizmu A. thaliana (SEQ ID No. 1), znázorněná na obrázku 3. Tato sekvence zahrnuje 1496 nukleotidů a je ukončena sekvencí polyadenylace. Představuje otevřený čtecí segment začínající iniciačním methioninem v nukleotidu 76 a zakončený terminačním kodonem v nukleotidu 1366, což dává dohromady 1290 nukleotidů, kódujících protein obsahující 430 aminokyselin. Kódující oblast cDNA delta-7Red kóduje protein delta-7Red, jehož odvozená sekvence aminokyselin (SEQ ID No. 2) je ukázána na obrázku 3. Sekvence proteinu obsahuje 430 aminokyselin a má vypočtenou molekulovou hmotnost 49286 kDa.
Vzorek kmene E. coli DH5-1, obsahující cDNA delta-7Red ve vektoru pUC9N (označenou jako cDNA delta7red-pUC9N) byla deponována u CNCM 10. února 1995 pod číslem 1-1535.
E - Určení společné sekvence SEQ ID No. 3
Prohledáním buněk sekvencí (Genbank a EMBL) pomocí informatických metod bylo prokázáno, že sekvence proteinu delta-7Red A. thaliana vykazuje jistou podobnost se sekvencemi ostatních sterol reduktas, speciálně se sterol C-14 reduktasou S. cerevisiae, kterou popsal R. T. Lorentz a kol. (DNA Cell. Biol., 11, 685-692, 1992) a sterol C-24(28) reduktasou S. cerevisiae, popsanou W. Chenem a kol. (Yeast, 7, 305-308, 1991) stejně tak jako s produkty genu sts 1+ S. pombe, které popsal M. Shimanuki a kol. (Mol. Biol. Cell, 3, 263-273, 1992) a se sterol C-14 reduktasou Neurospora crassa (No. X77955 v bázi EMBL). Navíc protein delta-7Red vykazuje podobnost se 400 aminokyselinami C-terminálního konce receptoru kuřecího laminu Bas obdobnými aminokyselinami odpovídajícího lidského receptoru, které byly popsány H. J. Wormanem a kol. (J. Cell. Biol., 111, 1535-1542, 1990) a E. Schulerem a kol. (J. Biol. Chem., 269, 11312-11317, 1994).
Bylo provedeno porovnání shody sekvence aminokyselin SEQ ID No. 2 odvozené z cDNA delta-7Red získané výše uvedeným způsobem se třemi sterol reduktasami kvasinek a dvěma receptory laminu B a byla určená nová společná podsekvence aminokyselin (SEQ ID No. 3):
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr
10 15 ve které Xaa v pozici 7 je Trp nebo Tyr a Xaa v pozici 12 je His nebo Lys,
-21 CZ 294860 B6 pro přípravu oligonukleotidů použitelných jako primery pro amplifikaci pomocí PCR nových sekvencí genomické DNA nebo cDNA kódující protein mající účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy.
F - Exprese proteinu delta-7Red v kvasinkách.
a) konstrukce expresního vektoru delta-7/V8, indukovatelného v kvasinkách
Bylo provedeno vynechání nekódujících oblastí cDNA v pF22 technikou amplifikace PCR, používajíce následující specifické oligonukleotidy:
5’CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 3’ (SEQ ID No.4) a
5’CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3’ (SEQ ID No. 5) které byly definovány za cílem vložení restrikčního místa BamH I bezprostředně na počátku inicializačního kodonu a restrikčního místa Κρη I na samém konci stop kodonu.
cDNA byla amplifikována vycházejíce z 1 ng plasmidu „cDNA delta7red/pUC9N“ za přítomnosti 2 jednotek Pfu DNA polymerázy a 0,2 μΜ každého z výše zmíněných primerů, a to za následujících podmínek: 94 °C, 10 s; 52 °C, 50 s; 74 °C, 90 s; 33 cyklů se soupravou PCR Stratagenu.
Získaný fragment o velikosti zhruba 1300 párů bází byl natráven restrikčními enzymy BamHI a Κρη I a inzertován do míst BamH I a Κρη I člunkového vektoru E. coli/S. cerevisiae pYeDPl/8-2 (který je nazýván V8), popsaného C. Cullinem a kol. (Gene, 65, 203-217, 1988). V8 nese markér selekce URA3 a obsahuje gen exprese v kvasinkách, obsahující promotor GAL10-CYC1 a terminační sekvenci genu PGK. Takto získaný vektor, nazvaný delta-7/V8, dovoluje expresi proteinu delta-7Red indukovatelnou galaktosou.
b) Příprava proteinu delta-7Red
Kmen FY 1679 kvasinek (Mata) byl transformován plasmidem delta-7/V8 získaným výše, používajíce při tom metodu lithiumacetátu, kterou popsal D. Gietz a kol. (citováno výše).
Transformované kvasinky byly kultivovány při teplotě 27 °C na selektivní kultivační půdě SGI popsané výše, ale ve které koncentrace glukózy byla 5 g/1, a to až do dosažení nasycení buněčné hustoty (D06oonm = 12). Kultura se poté zředí přidáním úplné kultivační půdy YP (10 g/1 kvasinkového extraktu (Difco) a 10 g/1 bactopeptonu (Difco)), poté se přidá ethanol (1,5
Postup byl také realizován na minimální selektivní kultivační půdě SLI, které odpovídá kultivační půdě SGI, ve které je glukóza nahrazena galaktosou v koncentraci 20 g/1 a kde bylo dosaženo buněčné koncentrace 2 x 107 buněk/ml.
c) Enzymatický test in vitro účinku delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy.
Exprese proteinu delta-7Red byla prokázána pomocí enzymatického testu, který popsal M. Tatom a kol. (Biochem. Bioph. Res. Commun., 181, 465-473, 1991), ale bez systému regenerace NADPH, s mikrosomálními nebo cytosolickými částmi buněk kvasinek, připravených postupy uvedenými výše.
Buněčné frakce byly získány mechanickou destrukcí získaných buněk a izolací frakcí ultracentrifugací podle metody, kterou popsal P. Urban a kol. (Eur. J. Biochem., 222, 843-850, 1994). Buňky se dvakrát promyjí pufrem TE-KC1 (Tris-HCl 50mM, pH 7,4; EDTA 1 mM, KC1 0,1 M) a suspendují lyžujícím pufrem TE-sorbitol 0,6 M. Přidají se skleněné kuličky o průměru 0,45
-22CZ 294860 B6
0,5 mm do výše hladiny buněčné suspenze, která se míchá po 5 min při 4 °C. Buněčný lyzát na povrchu se sejme a skleněné kuličky se třikrát promývají lyzačním pufrem. Lyzát a promývací roztok se spojí a potom centrifugují při 20 000 g po 13 minut při 4 °C, aby se eliminovaly mitochondriální frakce. Část odebraná z povrchu se centrifuguje po 1 hodinu při 100.000 g a při 4 °C. Usazenina, který obsahuje mikrosomální frakci a povrchová složka, který představuje cytosolickou frakci se získají odděleně.
Jak mikrosomální, tak cytosolické frakce se separátně inkubují po 90 minut při 37 °C v pufru Tris/HCl 100 mM a pH 7,3, který obsahuje jako substrát 7-dehydrocholesterol 150 μΜ emulzifikovaný s tween 80 (1,5 g/1) a v přítomnosti NADPH 2 mM. Steroly se extrahují přidáním 3 objemových dílů směsi methanol-dichlormethan (50:50 objemově) a potom analyzovány plynovou chromatografíí a porovnány s kontrolním vzorkem.
Tvorbu cholesterolu (TR=15,887 min) z 7-dehydrocholesterolu (TR=16,528 min) ukazuje obrázek 4, kde je znázorněna frakce mikrosomální (3,5 mg/ml proteinu), získaná postupem popsaným výše z kvasinek FY 1679 transformovaných vektorem delta-7/V8 působícím po 3 hodiny, takže jeho endogenní steroly mají čas na vyšší retenci (TR= 16,682 min pro ergosta-522-dien-3-ol;
TR=17,249 min pro ergosterol a TR = 17,664 min pro ergosta-5-en-3-ol).
Tyto výsledky ukazují, že protein delta-7Red je předně exprimován v transformovaných kvasinkách a dále, že vykazuje účinek delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy.
Příklad 2: Redukce in vivo endogenních sterolů kvasinek nenasycených v poloze C-7.
Kmeny kvasinek, jejichž majoritní steroly mají dvojnou vazbu v poloze C-5,7 byly transformovány vektorem delta-7/V8 získaným v příkladě 1, potom kultivovány a indukovány tak, jak je popsáno v příkladě 1. Endogenní steroly, jejichž profil je analyzován plynovou chromatografíí, byly extrahovány a purifíkovány pomocí RP-HPLC tak, jak již bylo popsáno v příkladě 1, používajíce preparativní kolonu Cl8 (100 x 4,6 mm), a potom identifikovány pomocí IR, UV, hmotovým spektrografem a NMR. Byly použity následující tři kmeny:
- kmen FY 1679, popsaný v příkladě 1,
- kmen mutant erg5, nazvaný PLC 1051, vyznačený defícientní sterol C-22 denaturázy, který byl připraven křížením mezi kmeny FY 1679 a originálním kmenem pol5, který popsal S. W. Molzahn a kol. (J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972) a který akumuluje ergosta5,7-dien-3-ol,
- kmen dvojitý mutant erg4,5, pojmenovaný PLC 1451, vyznačený deficiencí sterol C-22 denaturázy (erg5) a sterol C-24(28) reduktasy (erg4), který byl připraven křížením mezi kmenem FY 1679 a kmenem pol5, popsaným S. W. Molzahnem (citováno výše), který získal spontánní rezistenci na nystatin během systematického hybridizačního prohledávání kvasinek při hledání mutantů sterolu, a který akumuluje ergosta-5,7,24(28)-trien-3-ol. Vzniklý haploidní kmen, který nese dvojí mutaci erg4, erg5, roste v přítomnosti galaktosy a nefermentovatelného substrátu a je auxotropní pro uráčil, tryptofan a histidin. Kmeny PLC 1051 a PLC 1451 byly deponovány na CNCM dne 10. února 1995 pod čísly 1-1536 a I1537.
Redukované majoritní steroly identifikované u výše uvedených tří transformovaných kmenů jsou uvedeny v následující tabulce:
-23 CZ 294860 B6
Výchozí kmen Iniciální majoritní endogenní sterol Majoritní endogenní sterol redukovaný v C-7
FY 1679 erg5 PLC 1051 erg4,5 PLC 1451 ergosta-5,7,22-trien-3-ol (ergosterol) ergosta-5,7-dien-3-ol ergosta-5,7,24(28)-trien-3-ol ergosta-5-en-3-ol /dihydrobrassicasterol) ergosta-5,22-dien-3-ol (brassicasterol) ergosta-5-en-3-ol ergosta-5,24(28)-dien-3-ol (ostreasterol)
Příklad 3: Příprava pregnenolonu in vitro štěpením endogenních sterolů kvasinek redukovaných vC-7
Příprava pregnenolonu se provádí pomocí enzymatického testu štěpení postranního řetězce cholesterolu in vitro, který popsal Wada a kol. Arch. Biochem. Biophys., 290, 376-380, 1991), ve kterém 260 μΜ sterolu redukovaného vC-7 a získaného v příkladě 2 se inkubuje v 150 μΐ fosfátového pufru 10 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, tween 20 0,3 Reakce se spustí přidáním 150 μΜ NADPH. Po inkubaci 80 minut při 37 °C se reakce zastaví přidáním jednoho objemového dílu směsi methanol-dichlormethan (50:50 objemově). Steroly se extrahují a analyzují plynovou chromatografií tak, jak je popsáno v příkladě 1.
Obrázek 5 ukazuje, že když ergosta-5-en-3-ol (obr. 5A), ergosta-5,24(28)-dien-3-ol (obr. 5B) a ergosta-5,22-dien-3-ol (obr. 5C) jsou substráty cytochromu P450SCC, vedou na produkt, mající TR identické hodnotě pregnenolonu, získaného za stejných podmínek štěpením cholesterolu.
Získané výsledky ukazují, že transformované kvasinky exprimující delta-7Red akumulují steroly přímo použitelné pro přípravu pregnenolonu biologickou oxidací in vitro.
Příklad 4: Konstrukce kmenů kvasinek, produkujících in vivo pregnenolon nebo jeho ester s kyselinou octovou
A - Konstrukce kmene ELR01, obsahujícího gen exprese pro delta-7Red A. thaliana, integrovaná do místa ADE2 haploidního kmene FY 1679 matingového typu a (FY 1679 Mata)
a) Konstrukce integrovaného plasmidu pADdelta-7 (pADA7):
Konstrukce plasmidu pADA7 byla vedena tak, jak je popsána na obrázku 6. Fragment BglII (2244pb) obsahující gen ADE2 S. cerevisiae byl izolován z plasmidu pASZ 11 (A. Stoltz a kol., Gene, 95, 91, 1990) a vložen do vektoru pBluescriptlI KS+ (Stratagen) od místa BamHI do vícenásobného klonovacího místa.
Získaný plasmid, označený pBS-ADE2, byl potom linearizován ve svém jediném místě Stu I a defosforylován.
Fragment o velikosti zhruba 2,44 kb, obsahující promotor GAL10/CYC1, kódující fázi delta-7Red (sterol Δ 7 reduktasu) a terminátor PGK (tPGK), byl získán z plasmidu delta-7/V8, získaného v příkladě 1F technikou PCR, užívajíce jako primery následující oligonukleotidy:
-24CZ 294860 B6
5’ GATTACGCCA AGCTTTTCGA CCA 3’ (SEQ ID No. 6) a
5’ AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 3’ (SEQ ID No. 7) které byly určeny k tomu, aby se připárovaly na koncích 3' u tPGK a 3' genu URA3. Jako matrice (80 ng) byl použit plasmid delta-7/V8, dále byly použity oligonukleotidy popsané výše (0,5 μΜ každý), Pfu DNA přírodní polymerázy (1 jednotka v pufru doporučeném Stratagenem), a to za těchto podmínek: 35 cyklů; 1 min při 95 °C; 5s při 95 °C; 30 s při 56 °C; 4 min 30 s při 70 °C. Fragment získaný amplifíkací byl potom klonován za volné konce v plasmidu pBS-ADE2 linearizovaném výše, čímž se získal plasmid pADA7 ve kterém fragment Notl-Pstl o velikosti zhruba 4720 pb nese gen ADE2, přerušený genem exprese delta-7Red.
b) Chromosomatická integrace ve kmeni kvasinek FY 1679 Mata:
Fragment Notl-PSTI (4720 bp), izolovaný z plasmidu pADA7 natráveného restrikčními enzymy Notl a Pstl, byl vložen do kvasinek FY 1679 Mata používajíce metodu lithiumacetátu, kterou popsal D. Gietz a kol. (citováno výše).
Transformanty, do nichž byl tento fragment vložen homologickou rekombinací, byly selektovány na základě jejich rezistence na nystatin, přičemž tento fenotyp vyšel z exprese delta-7Red, který konvertoval delta-5,7 steroly kvasinek na delta-5 steroly.
Transformované buňky byly inkubovány při 28 °C po 4 hodiny na úplné kultivační půdě YP, popsané v příkladě 1F a obsahující glukózu (20 g/1) a doplněné adeninem (20 mg/1). Ty potom byly koncentrovány a rozetřeny na minimální kultivační půdu SLI-agar (lg/1 bactocasaminokyseliny; 7 g/1 „yeast nitrogen base“; 20 g/1 galaktosy; 20 mg/1 adeninu; 20 g/1 agaru) a inkubovány po jednu noc při 28 °C, aby byla indukována exprese genu delta-7Red. Nepřítomnost uracilové komplementace dovoluje omezit přibývání buněk. Klony jsou shromážděny, naneseny do misek na úplnou kultivační půdu YL, obsahující galaktosu (20 g/1) doplněnou adeninem (20 mg/1) a v přítomnosti rostoucích koncentrací nystatinu (0 pg/ml, 1 pg/ml, 2 pg/ml, 5 pg/ml, 20 pg/ml). Čtvrtý den se v koncentraci 5 pg/ml nystadinu vytvořilo okolo dvaceti klonů. Dvanáct z těchto klonů bylo přesazeno minimální kultivační půdu W0 (7 g/1 „yeast nitrogen base“ bez aminokyselin, 20 g/1 glukózy), obohacenou uracilem, leucinem, tryptophanem, histidinem a adeninem (20 mg/1 od každého).
Autotrofie na adenin, způsobovaná přerušením genu ADE2 byla posléze potvrzena pozorováním nepřítomnosti růstu na kultivační půdě W0, obohacené uracilem, leucinem, tryptophanem, histidinem, ale postrádající adenin.
Přítomnost genu exprese v genomu kvasinek byla určována amplifíkací získaných klonů pomocí PCR vycházejíce zgenomické DNA a používajíce primery mající sekvence SEQ ID No. 6 a SEQ ID No. 7, popsané výše.
Funkčnost vloženého genu delta-7Red byla potvrzena analýzou složení sterolů akumulovaných v kvasinkách a extrahovaných alkalickým zmýdelněním způsobem popsaným v příkladu 1B pomocí plynové chromatografíe na kapilární koloně SE 30 délky pět metrů (ALLtech). Analýza ukazuje modifikovanou křivku udávající steroly nasycené v C-7, pakliže jsou klony kultivovány za přítomnosti galaktosy. Získaný kmen, označený ERL01, akumuluje ergosta-5-en-3-ol a ergosta-5,22-dien-3-ol namísto ergosta-5,7,22-trien-3-ol (ergosterol), což je majoritní sterol iniciálního kmene FY 1679, jak je ukázáno na obrázku 7.
Takto získaný kmen ERL01 exprimuje díky transkripční kontrole promotorem GAL10/CYC1 gen delta-7Red, je-li kultivován v přítomnosti galaktosy. I když má jednotka exprimující delta-7Red stejný směr transkripce jako gen ADE2, není žádná exprese delta-7Red
-25CZ 294860 B6 detekovatelná analýzou směsi sterolů plynovou chromatografíí, pakliže je kultura pěstována v přítomnosti glukózy, neboť tato působí represi promotoru GAL10/CYC1.
B - Konstrukce kmene CDR01, obsahujícího gen exprese pro zralou formu dobytčí adrenodoxin reduktasy (ADRm), vložené mezi místy LEU2 a SPL1 haploidního kmene FY 1679 mating typu alfa (mat alpha).
a) Konstrukce člunkového vektoru E. coli-S. cerevisiae V13
Vektor V13 odpovídá vektoru V8 (C. Cullin a kol., citováno výše), který nese markér selekce URA3 a gen exprese v kvasinkách obsahujících promotor GAL10-CYC1 (pG/C) a ve kterém bylo vloženo do vícenásobného klonovacího místa dodatečné místo Sáli (Sa) podle schématu na obrázku 8.
Vektor V8 byl natráven restrikčními enzymy Hind III a BamHI a získaný fragment BamHI-HindlII (1722 pb), obsahující gen URA3 a promotor GAL10/CYC1 (označovaný dále jako „ura-gal“), byl klonován mezi odpovídající místa vektoru pUC18 (Pharmacia), natráveného restrikčními vektory HindlII a BamHI.
Fragment „ura-gal“ byl potom amplifíkován pomocí PCR, vycházejíce z 30 ng získaného plasmidu pUC18-„ura-gal“, denaturovaného po 30 s při 95 °C za následujících podmínek“ 30 cyklů; 5s při 86 °C; lOs při 95 °C; 40s při 38 °C; 5s při 55 °C a 2 min při 74 °C, 2 jednotky Taq DNA polymerázy (Boehringer) v pufru výrobce a ΙμΜ od každého zprimerů, majících následující nukleotidickou sekvenci“
5’ GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 3’ (SEQ ID No. 8) a
5’ GTAAAACGAC GGCCAGT 3’ (SE2Q ID No. 9).
Primer SEQ ID No. 8 obsahuje místo BamHI GGATCC identické místu ve fragmentu „ura-gal“, 3 po sobě následující nukleotidy v místě BamHI, které se nehybridují na matrici, místo Sáli GTCGAC a sekvenci, která je homologická sekvenci GAL10-CYC1. Primer SEQ ID No. 9 se páruje na předcházející sekvenci od místa HindlII do místa vícenásobného klonování pUC18. Fragment HindlII-BamHI o 1722 pb získaný po amplifikaci byl natráven Xhol a BamHI, čímž se uvolnil fragment o 254 pb obsahující promotor GAL10/CYC1 (pG/C), který byl potom klonován do vektoru V8 natráveného restrikčními enzymy BamHI a Xhol.
Fragment „ura-gal“ byl poté amplifíkován pomocí PCR z 30 ng získaného plasmidu pUC 18/“ura-gal“ denaturovaného po 30 s při 95 °C za následujících podmínek: 30 cyklů; 5s při 86 °C; lOs při 95 °C; 40s při 38 °C; 5s při 55 °C a 2min při 74 °C, 2 jednotky Taq DNA polymerázy (Boehringer) v pufru výrobce a 1 μΜ každého z primerů s následujícími nukleotidickými sekvencemi:
5’ GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 3’ (SEQ ID No. 8) a
5’ GTAAAACGAC GGCCAGT 3’ (SEQ ID No. 9)
Primer SEQ ID No. 8 obsahuje místo BamHI GGATCC identické místu fragmentu „ura-gal“, přičemž 3 po sobě následující nukleotidy místa BamHI nehybriduje na matrici, místo Sáli GTCGAC a sekvenci homologickou sekvenci promotoru GAL10/CYC1. Primer
-26CZ 294860 B6
SEQ ID No. 9 se páruje k sekvenci předcházející místo Hind III vícenásobného klonovacího místa pUC18. Fragment HindlII-BamHI o 1722 pb, získaný po amplifikaci byl natráven pomocí Xhol a Bam HI, čímž se uvolnil fragment 254 pb obsahující promotor GAL10/CYC1 (pG/C), který byl potom klonován do vektoru V8 natráveného restrikčními BamHI a Xhol.
Vzniklý vektor V13 obsahuje restrikční místa dovolující snadno klonovat cDNA, kódující maturovanou dobytčí adrenodoxin reduktasu ADRm, maturovaný dobytčí adrenodoxin (ADXm) a dobytčí cytochrom P450SCC.
Z vektoru VI3 byly připraveny vektory V13-ADR, vektor V13-ADX a vektor V13-SCC10 následujícím způsobem:
a) Konstrukce vektoru VI3-ADR
Fragment Sall-KpnI o 1478 pb nesoucí cDNA kódující ADRm byl izolován zplasmidu pGBADR-2 popsaném v příkladě 25 přihlášky evropského patentu EP 340878 a klonován do odpovídajících míst vektoru V13, čímž se získá vektor VI3-ADR.
β) Konstrukce vektoru V13-ADX
Fragment Sáli BamHI o 390 pb nesoucí cADN kódující ADXm byl izolován zplasmidu PGBADX-1 popsaného v příkladě 23 přihlášky evropského patentu EP 340878 a klonován do odpovídajících míst vektoru V13, čímž se získá vektor VI3-ADX.
γ) Konstrukce vektoru V13-SCC10
Fragment Sáli EcoRI o 1554 pb nesoucí cADN kódující P450SCC byl izolován zplasmidu PGBSCC-10 popsaného v příkladě 6 přihlášky evropského patentu EP 340878 a klonován do odpovídajících míst vektoru V13, čímž se získá vektor VI3-SCC 10.
b) Konstrukce integrovaných plasmidů pCD62-l a pCS62-2:
Konstrukce plasmidů pCD62-l a pCS62-2byla prováděna podle obrázku 9.
a) Konstrukce plasmidů pFL26CD
Do plasmidů pFL26 bylo vloženo místo Notl (N. Bonneaud a kol., Yeast, 7, 609-615, 1991), a to v mezigenové oblasti separující gen leu2 od konce 5' genu spll (a označované spi 1Δ) (C. Kolman a kol., J. Bacteriol., 175, 1433, 1993), používajíce následující postup:
Dva fragmenty DNA o 704 pb a 347 pb nesoucí zakončení 5' leu2 a zakončení 3' splA byly syntetizovány pomocí PCR, užívající primery mající následující nukleotidické sekvence
5’ TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 3’ (SEQ ID No. 10) a
5’ GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 3’ (SEQ
ID No. 11) pro amplifikaci fragmentu 704 pb a nukleotidické sekvence
-27CZ 294860 B6
5’ CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 3’ (SEQ ID
No. 12) a
5’ TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 3’ (SEQ ID No. 13) pro amplifikaci fragmentu 347 pb.
Primery SEQ ID No. 11 a SEQ ID No. 12 obsahují sekvenci GGCGGCCG, která odpovídá místu Notl a ve kterém 3 báze se nepárují s matricí. Primer SEQ ID No. 10 se páruje k sekvenci situované 536 pb před kodonem stop leu2 a primer SEQ ID No. 13 k sekvenci situované 194 pb před kodonem stop spllA.
Fragmenty 704 pb a 347 pb jsou nejprve amplifikovány pomocí PCR, používajíce jako matrici plasmid pFL26 a jako enzym Pfu DNA polymerázu za standardních podmínek popsaných dodavatelem (Stratagen).
Dva získané amplifikované segmenty se párují na 20 pb na úrovni konců generovaných primerem SEQ ID No. 11 (fragment 704 pb) a primerem SEQ ID No. 12 (fragment 347 pb) počínaje od konce 5'; těchto odpovídajících 20 pb odpovídá 20 prvním nukleotidům každého z primerů.
Vzniklý produkt párování fragmentů DNA 704 pb (1 ng) a 347 pb (2 ng) byl amplifíkován používajíce primery SEQ ID No. 10 a SEQ ID No. 13 za následujících podmínek: 30 cyklů po 10 s při 95 °C; 5s při 60 °C; lmin při 45 °C; 5s při 65 °C a 2min při 72 °C, následováno 1 cyklem 7min při 72 °C; 50 pmol každého z primerů a 1 jednotka Pfu DNA polymerázy v 50 μΐ reakčního pufru (Stratagen). Byl získán amplifikovaný fragment 1031 pb obsahující štěpivé místo Notl. Tento fragment byl potom natráven enzymy BstXI a Nsil a získaný fragment 920 pb, obsahující místo Notl, byl vložen na místo fragmentu BstXI-Nsil původního pFL26, čímž byl získán plasmid pFL26CD, jehož mapa je znázorněna na obrázku 9a.
β Konstrukce plasmidu pCD60
Příprava plasmidu pDP10036:
Fragment Sall-BamHI o 390 pb nesoucí cDNA kódující maturovaný dobytčí adrenodoxin (ADXm) byl izolován z plasmidu V13-ADX a potom klonován do míst Sáli—BglII místa vícenásobného klonování plasmidu pTG10033, které je ohraničeno induktibilním promotorem GAL10/CYC1 a terminátorem ter PGK. Plasmid pTG10033, jehož mapa je znázorněna na obrázku 18 a který odpovídá vektoru exprese pTG10031 (obrázek 17), obsahující promotor CYC1 a terPGK, ve kterém byl promotor CYC1 nahražen promotorem GAL10/CYC1, byl připraven způsobem popsaným dále.
Takto získaný plasmid, označený pDP10034, nese gen exprese ADX, to jest gen kódující ADXm pod transkripční kontrolou GAL10/CYC1 a terPGK. V následujícím bude výraz „gen exprese“ používán pro všechny geny transkripčně závislé na GAL10/CYC1 a terPGK.
Fragment HindlII o 3593 pb, nesoucí markér selekce URA3 a gen exprese ADR byl izolován z plasmidu V13-ADR natráveného restrikčním enzymem HindlII a potom vložen do odpovídajícího místa plasmidu pDP10034, natráveného restrikčním enzymem HindlII. Získaný plasmid, označený pDP10036, obsahuje geny exprese ADX a ADR oddělené navzájem od sebe markérem URA3 (obrázek 9b).
- Příprava plasmidu pCD60
-28CZ 294860 B6
Fragment AflIII-AccI o 2770 pb, nesoucí gen ADR byl izolován částečným natrávením plasmidu pDP 10036 restrikčním enzymem AflIII a AccI, přičemž volné konce byly vytvořeny pomocí Klenowova fragmentu DNA polymerázy a klonovány ligací volných konců do místa Smál plasmidu pBlue-Script KS+ (Stratagen). V získaném plasmidu, nazvaném pCD60, je gen exprese ADR ohraničen z jedné i druhé strany místem Notl, přičemž jedno se nachází 209 pb před ligačním místem AfIIII/Smal a pochází z klonovaného fragmentu a druhé pochází z místa vícenásobného klonování (SCM1) pBlue-Script KS+ (obrázek 9).
γ) Konstrukce plasmidů pCD62-l a pCD62-2:
Fragment Notl o 2558 pb, izolovaný z plasmidu pCD60, natráveného restrikčním enzymem Notl, byl poté klonován do jediného místa Notl plasmidu pFL26CD.
Podle směru vložení fragmentu byly získány dva plasmidy, které byly označeny pCD62-l a pCD62-2 (obrázek 9c).
V plasmidu pCD62-l je gen exprese ADR orientován ve směru transkripce genu leu2, zatímco v plasmidu pCD62-2 je orientace opačná.
Plasmid pCD62-l byl ponechán pro konstrukce popsané dále.
c) Chromosomatická integrace v kmenu kvasinek FY 1679 (Matalpha):
Plasmid pCD62-l obsahuje oblasti homologické chromosomickému locusu kmene FY 1679. Tyto oblasti odpovídají po řadě fragmentům BglII-Clal o 1060 pb (A), EcoRI-Notl o 707 pb (B) a Notl-BglII o 602 pb (C), znázorněné na obrázku 10.
Odpovídající oblast na fragmentu Clal-EcoRI o 486 pb plasmidu pCD62-l byla vynechána v kmeni FY 1679, což vedlo k auxotrofíi tohoto kmenu vzhledem k leucinu (kmenLEU2 ) (R. S. Sikorski a kol., Genetics, 122, 19, 1989).
Plasmid pCD62-l byl linearizován natrávením restrikčním enzymem Xbal, jehož restrikční místo je situováno vně homologické oblasti, potom byl vložen do kmene FY 1679 (Matalpha) používajíce metodu lithiumacetátu (D. Gietz a kol., citováno výše).
Schopnost buněčné opravy DNA kvasinkami („gap repair“) a selekce rekombinantů majících fenotyp LEU2+ dovolila nejdříve selekci dvou typů rekombinantů: první typ se získá homologickou rekombinací na úrovni fragmentů A a B, druhý typ se získá homologickou rekombinací na úrovni fragmentů A a C. Pouze tento poslední typ rekombinace dovolil navíc k obnovení fenotypu LEU2+ integraci gen exprese ADR.
Pro selekci tohoto druhého typu klonu bylo provedeno hybridizačním prohledáváním pomocí PCR, užívajíce jako primeru SEQ ID No. 10 popsaným výše a primer mající následující nukleotidickou sekvenci:
5’ TACATTAGGT CCTTTGTAGC 3’ (SEQ ID No. 14) aby byla potvrzena jednak přítomnost a kromě toho i přesná lokalizace genu exprese ADR v genomu kmene FY 1679 (Matalpha).
V tomto prohledávání se primer SEQ ID No. 14 páruje výhradně na sekvenci kódující ADRm a primer SEQ ID No. 10 se páruje na chromosomální sekvenci (obrázek 10).
-29CZ 294860 B6
Reakce amplifikace byla realizována za použití matrice tvořené genomickou DNA (20 ng), izolovanou z kmene FY1679 (Matalpha) (C. Hoffman a kol., Gene, 57, 267, 1987), Taq DNA polymerázou (1U, Boehringer), 50 pmol každého z primerů a 30 cykly PCR (lOs při 95 °C, lmin při 55 °C a 3min při 72 °C) za standardních podmínek, popsaných dodavatelem.
Amplifikace vedla k izolaci odpovídajícího fragmentu 2,9 kb v případě, že gen exprese byl integrován. V opačném případě nebyl detekován žádný amplifikační produkt.
Takto získaný kmen FZ1679 (Matalpha), obsahující vložený gen exprese ADR byl pojmenován CDR01.
Exprese ADR tímto kmenem byla prokázána pomocí cytosolických buněčných frakcí připravených postupem popsaným v příkladě 1F imunodetekcí proteinu protilátkami anti-ADR.
Funkčnost ADR exprimovaného kmenem CDR01 byla potvrzena testem enzymatického štěpení postranního řetězce cholesterolu in vitro, tak jak byl popsán v příkladě 3 a ve kterém puntíkovaná ADR (0,28 pmol) byla nahrazena cytosolickou buněčnou frakcí kmene CDR01, obsahující celkově 100 pg proteinů. Byla pozorována biokonverse cholesterolu vpregnenolon s výtěžkem zhruba 25.
C - Konstrukce dipoidního kmene EC01 koexprimujícího delta-7Red A. Thaliana a ADRm.
Diploidní kmen EC01 byl získán křížením haploidních kmenů CDR01 a ELR01 postupem, popsaným G. Spraguem a kol. (Methods in Enzymology, 194, 77, 1991):
Pomocí první selekce na minimální kultivační půdě W0 popsané výše a obohacené uracilem, tryptophanem a histidinem (20 mg/1 od každého), ale neobsahující leucin byly získány diploidní klony LEU2+ (prototrofní typ, dokazující přítomnost genu exprese ADR). Tyto klony byly potom testovány na odolnost na nystatin při 5 pg/ml (rezistence, která prokazuje přítomnost genu exprese delta-7Red) na pevné syntetické kultivační půdě SLI-agar, popsané výše.
Jeden kmen, označený EC01, byl takto izolován náhodným způsobem z klonů rezistentním na nystatin.
D - Konstrukce kmene EC01-pCD63 produkujícího pregnenolon a pregnenolon 3-octan.
a) Konstrukce plasmidu exprese pCD63
Konstrukce plasmidu pCD63 byla prováděna způsobem popsaným na obrázku 11.
Fragment Notl o 4961 pb obsahující gen exprese ADX, markér selekce URA3 a gen exprese ADR byly izolovány z plasmidu pDP 10036 připraveného způsobem popsaným výše a natráveny restrikčním enzymem Notl, poté klonován do místa Notl v místě vícenásobného klonování plasmidu pFL45L (N. Boneaud a kol., Yeast 7, 609, 1991). Takto získaný vektor, označený pDPl0037 je znázorněn na obrázku 11.
Nejprve byl plasmid pDP10037 linearizován natrávením enzymem Tthllll, jehož restrikční místo se nachází v genu kódujícím ADRm. Kromě toho byl z plasmidu V13-SCC10 získaného způsobem popsaným výše purifikován fragment PvuII-EcoRV o 3476 pb obsahující gen exprese P450SCC a konec 5' markéru URA3 a natráven restrikčními enzymy PvuII a EcoRV.
Dvě lineární DNA získané těmito způsoby mají homologické oblasti odpovídající na jedné straně konci 5' genu URA3 a GAL10/CYC1, na druhé straně terPGK, tak, jak je to znázorněno na obrázku 11 a.
-30CZ 294860 B6
Tyto dva fragmenty byly potom vloženy do kmene kvasinek FY1679 (Mata) kotransformací pomocí metody lithiumacetátu (D. Gietz, citováno výše).
Následující selekce rekombinátů prototropních na uráčil a tryptophan (URA3+, TRP1+) dovolila izolovat klony ve kterých zlom dvojitého vlákna vyvolaný natrávením restrikčním enzymem Tthl 1II byl opraven integrací genu exprese P450SCC homologickou rekombinací.
Selekce rekombinantů (URA3+, TRP1+) byla provedena na minimální kultivační půdě WO obohacené leucinem, histidinem a leucinem (20 mg/1 každý), ale zbavené uracilu a tryptophanu. Z celkově 50 klonů byla DNA extrahována metodou, kterou popsal C. Hoffman a kol. (Gene 57, 267, 1987) a potom elektroporaci vložena do kmene E. coli XLl-Blue (Stratagen). Klony transformované plasmidem generovaným pomocí „gap repair“ byly selektovány na obohacené kultivační půdě LB (trypton 1
b) Transformace kmene EC01 plasmidem pCD63.
Do kmene EC01 získaného výše byl vložen plasmid pCD63 transformací pomocí metody lithiumacetátu (G. Dietz a kol., citováno výše). Transformované kvasinky byly potom kultivovány na minimální kultivační půdě WO popsané výše a zbavené uracilu, traptophamu, adeninu a leucinu, ale obohacené histidinem (20 mg/1).
Takto byl získán kmen, nazvaný EC01/pCD63. Vzorek tohoto kmene byl pod referencí EC01-pCD63 deponován 10. února 1995 na CNCM pod číslem 1-1538.
c) Produkce in vivo pregnenolonu a pregnenolon 3-octanu.
Kmen EC01/pCD63 byl kultivován při 28 °C v aerobiose (130 t/min) v Erlenmeyerově baňce o objemu 3 litry až do dosažení stacionární fáze růstu (D0600=12 až 13) na selektivní kultivační půdě SGI popsaném v příkladě 1A a ve kterém koncentrace glukózy je 5g/l. Kultura je potom zředěna adicí jednoho objemu úplné kultivační půdy YP popsané výše a potom adicí ethanolu (0,5
Koexprese těchto čtyř genů byla prokázána analýzou sterolů nashromážděných v buňkách a na povrchu kultury následujícím způsobem:
Dva vzorky po 50 ml kultury se seberou po 9 a 24 hodinách indukce. Každý vzorek se centrifuguje (4000 g, 10 min, 4 °C) aby se buňky separovaly od kultivační půdy.
Na jedné straně jsou buňky lyžovány mechanickým lámáním v přítomnosti skleněných kuliček podle metody popsané v příkladě 1F. Ze získaného lyzátu se potom extrahují mezibuněčné steroly přidáním hexanu.
Na druhé straně steroly obsažené v kultivační půdě se extrahují přímo přidáním hexanu.
Směs extrahovaných sterolů je analyzována plynovou chromatografií, tak, jak je popsáno v příkladě 1, a výsledky jsou porovnány vzhledem ke standardním vzorkům.
Výsledky získané po 9 hodinách a po 24 hodinách indukce jsou znázorněny na obrázcích 12a a 12b.
Obrázek 12a ukazuje, že po 9 hodinách:
- v buněčném lyzátu je majoritní sloučeninou látka, mající retenční čas stejný jako standardní octan pregnenolonu (TR = 11,8 min), zatímco retenčnímu času pregnenolonu (TR = 9,9 min) odpovídá jen velice slabé zvýšení. Slabá množství endogenních sterolů kvasinek, redukovaných v C-7 (ergosta-5-en-3-ol a ergosta-5,22-dien-3-ol) jsou identifikována při
-31 CZ 294860 B6
TR= 18 min aTR= 17 min. Alkalické zmýdelnění buněčného lyzátu před analýzou vede k přítomnosti majoritní sloučeniny komigrující s pregnenolonem. To umožňuje potvrdit, že akumulované sloučeniny, mající TR = 11,8 min odpovídají octanu pregnenolonu.
- v kultivační půdě je zjištěna prokazatelná absence pregnenolonu i jeho octanu.
Obrázek 12b ukazuje, že po 24 hodinách indukce:
- v buněčném lyzátu je zjištěna přítomnost slabého množství pregnenolonu (TR = 10,2 min) a octanu pregnenolonu (TR= 12 min) stejně tak jako redukovaných endogenních sterolů kvasinek (TR= 17 min a TR= 18 min). Cholesterol (TR = 16,2 min) je vnitřní standard přidaný před extrakcí.
- v kultivační půdě je prokázána majoritní přítomnost octanu pregnenolonu a minoritní množství pregnenolonu.
Pokusy prováděné simultánně s kmenem EC01 transformovaným referenčním plasmidem jako je např. pFL45L již citovaným výše nevykázaly žádný pík odpovídající volnému pregnenolonu nebojeho octanu.
Identifikace takto připravených sterolů ukazuje, že kmen kvasinek EC01-pCD63 akumuloval pregnenolon a octan pregnenolonu za absence jakéhokoliv zdroje exogenních sterolů, a to po indukci v přítomnosti galaktosy a s největší produkcí po inkubaci po dobu 9 hodin.
Tyto výsledky ukazují na jedné straně účinnou mobilizaci endogenních sterolů redukovaných v poloze C-7 kmene EC01 a na druhé straně velmi vysokou účinnost štěpení postranního řetězce endogenních sterolů.
Tabulka: rekapitulace integrovaných kmenů.
Rekapitulační tabulka integrovaných kmenů.
Kmen Integrační místo Integrovaný gen Transf. plasmid Plasmid. markér Gen na plasmidu Selekční markér
CDR01 (Mata) LEU-SPL1 ADRm - HIS3,URA3, TRPÍ
ERL01 (Mata) ADE2 delta- 7Red ADE2,URA3, LEU2,HIS3 TRPÍ
EC01 (diploidní) LEU2-SPL1 +ADE2 ADRm delta7Red - - - HIS3,URA3, TRPÍ
EC01/ pCD63 LEU2-SPL1 + ADE2 ADRm delta 7Red pCD63 URA3 TRPÍ ADXm P450SCC HIS3
Příprava příkladu 4: konstrukce plasmidu pTG10033
1. Derivát pUC 19, mající nové místo vícenásobného klonování:
Klonovací vektor M13mpl9 (C. Zanish-Peron a kol., Gene, 33, 103, 1985) byl mutagenizován za použití následujícího oligonukleotidu:
-32CZ 294860 B6
5’ GCGCTCAGGG GCCGCTTTCC AGTCG 3’ SEQ ID No.15 čímž se vloží místo Notl do sekvence zkráceného genu láci a tím vznikne plasmid M13TG724.
Poté se do místa EcoRI plasmidu M13TG724 vloží „polylinker“ obsahující místa EcoRI, SnaBI a Notl používajíce následující oligonukleotidické sekvence:
5’ AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 3’ SEQ ID No. 16 a
5’ AATTCATACG TACGCGGCCG C 3’ SEQ ID No. 17 čímž se dostane plasmid M13TG7244, ve kterém byla ve stádiu amplifikace pozorována modifikace inzertu. Inzert plasmidu M13TG7244 má následující nukleotidickou sekvenci“
GAATTCATAGGTACGCGGCCGCAATTGCGGCCGGTACGTATAATTCAGTGGGGGT ve které místa EcoRI, SnaBI a Notl jsou podtrženy a sekvence lacZ pUC19 je napsána kurzívou.
Po natrávení plasmidu M13TG7244 restrikčními enzymy EcoRI a Sstl byl vložen „polylinker“ obsahující místa Mlul a AvrlI za použití následujících oligonukleotidů
5’ CAACGCGTCC TAGG 3’ SEQ ID No. 18 a
5’ AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 3’ SEQ ID No. 19.
Po natrávení enzymem PvuII byl získaný fragment PvuII klonován do pUC19 (C. Yanish-Perron a kol., citováno výše), čímž se získal plasmid pTG7457 (obrázek 13).
2. Klonování terminátoru PGK:
pUC19 byl natráven restrikčními enzymy BamHI a EcoRI a byl vložen nový „polylinker“ BamHI Sstl byl vložen používajíce následující oligonukleotidy:
5’ GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 3’ SEQ ID No.
5’ AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 3’ SEQ
ID No. 21
5’ CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACAACCTA GGAG 3’ SEQ ID
No. 22 a
5’ AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 3’ SEQ ID No. 23.
Takto získaný plasmid pTG7453 (obrázek 14), který byl poté natráven restrikčním enzymem BamHI a Sstl. Místa „polylinkeru“ mezi BamHI a Sstl byly vloženy do derivátu plasmidu pTG7457 získaného výše a natrávena restrikčními enzymy BamHI a Sstl. Takto získaný nový plasmid obsahuje místa PvuII, HindlII, BamHI, EcoRI, Xbal, Smál, BglII, Sstl (=SacI), Mlul, AvrlI, EcoRI, SnaBI, Notl, SnaBI, Pvul.
-33 CZ 294860 B6
Tento nový plasmid byl natráven restrikčními enzymy BglII a HindlII a pak do něho byl vložen fragment BglII-HindlII, obsahující promotor PGK (R. A. Hitzeman a kol., Yeast, 5, 497, 1989), čímž se získá plasmid pTG10014 (obrázek 15).
3. Klonování promotorů:
a) promotor CYC1
Místa „polylinkeru“ plasmidu pTG7453 mezi BamHI a Sstl byla vložena do derivátu plasmidu pTG7457 způsobem popsaným výše. Nově získaný plasmid byl štěpen restrikčním enzymem SnaBI, potom do něho byl vložen fragment Rsal-Dral o 456 pb plasmidu pEMBL8 (L. Dente a kol., Nucleic Acid Res., 11, 1645, 1983) obsahující místo počátku replikace fágu fl a tím vznikl plasmid pTG7503.
Fragment BamHI HindlII o 0,78 kb plasmidu pGBSCC-9, získaný podle příkladu 6 v přihlášce evropského patentu EP 0340378 a obsahující promotor CYC1 S. cerevisiae, „polylinker“ a terminátor laktázy K. lactis byly potom klonovány do plasmidu pTG7503 natráveného restrikčním enzymem HindlII a BamHI a tím byl získán plasmid pTG 10004 (obrázek 16).
Místa Xhol a Mlul promotoru CYC1 byly potom eliminována řízenou mutagenezí dvojvláknové DNA plasmidu pTG10004 za použití následujícího oligonukleotidu
5’ GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 3’
SEQ ID No. 24.
Plasmid pTG 10005, který tím byl získán, byl potom natráven restrikčními enzymy Sáli a Xhol a potom bylo vloženo místo Mlul za použití následujících oligonukleotidů:
5’ TCGACGGACG CGTGG 3’ SEQ ID No. 25 a
5’ TCGACCACGC GTCC 3’ SEQ ID No. 26, čímž vznikl plasmid pTG 10006.
b) promotor GAL 10/CYC1
Plasmid pYeDPl/8-2 (C. Culin a kol., Gene, 203, 1988) byl otevřen restrikčním enzymem Xhol. Vytvořené kohezivní konce byly doplněny Klenowovým fragmentem DNA polymerázy a potom byl plasmid opětně spojen. Plasmid pTGlOOlO získaný tímto způsobem, ve kterém promotor GAL10/CYC1 již neobsahuje místo Xhol se používá jako matrice pro amplifikaci pomocí PCR.
4. Konstrukce vektoru exprese pTG 10031
Zbývající část sekvence kódující lacZ byla v plasmidu pTG7503 eliminována řízenou mutagenezí za použití následujícího oligonukleotidu:
5’ TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 3’ SEQ ID
No. 27 a tím vznikl plasmid pTG7549.
-34CZ 294860 B6
Promotor LacZ přítomný v plasmidu pTG7549 byl potom vypuštěn za použití následujícího oligonukleotidu
5’ GGCCGCAAAA CCAAA 3’ SEQ ID No. 28 a
5’ AGCTTTTGGT TTTGC 3’ SEQ ID No. 29, které byly vloženy do plasmidu natráveného předtím restrikčními enzymy Notl a HindlII a které obnovily tato dvě místa, čímž vznikl plasmid pTG7553.
Fragment BamHI Mlul, obsahující promotor CYC1 byl získán z plasmidu natráveného restrikčními enzymy BamHI a Mlul a fragment Mlul HindlII obsahující promotor PGK byl izolován z plasmidu pTG10015 natráveného restrikčními enzymy Mlul a HindlII. Tyto dva fragmenty byly spojeny a ligační produkt byl vložen do plasmidu pTG7553 natráveného předtím restrikčními enzymy Mlul a Hind III.
Následující oligonukleotid
5’ GATCTATCGA TGCGGCCGCG 3’ SEQ ID No. 30 hybridovaný s následujícím oligonukleotidem
5’ CGCGCGCGGC CGCATCGATA 3’ SEQ ID No. 31 který představuje „linker“ BamHI Mlul obsahující místa Clal a Notl byl přidán a ligován, čímž vznikl vektor exprese pTG 10031 (obrázek 17).
PCR amplifikovaný fragment získaný výše z plasmidu pYeDPl/8-2 byl natráven restrikčními enzymy Clal a Sáli a potom vložen do plasmidu pTG 10031 předtím natráveného těmito restrikčními enzymy, čímž vznikl plasmid pTG 10033 (obrázek 18).
SEZNAM SEKVENCÍ (1) Obecné informace:
(i) Překladatel:
(A) Jméno: Roussel Uclaf (B) Ulice: 102, Routě de Noisy (C) Město: Romainville (D) Země: Francie (F) PSČ: 93230 (G) Telefon: 49 91 49 91 (H) Fax: 49 91 46 10 (ii) Název vynálezu: Sekvence DNA kódující protein organizmu A. Thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol, delta-7-reduktasy, protein delta-7-Red, způsob jejich výroby, kmeny transformovaných kvasinek, aplikace.
(iii) Počet sekvencí: 31 (iv) Způsob počítačové prezentace:
(A) Typ média: pružný disk
-35CZ 294860 B6 (B) Počítač: IBM PC compatible (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1.0, verse # 1.30 (OEB) (vi) Popis předcházející přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: FR 9501723 (B) Datum podání: 15. února 1995 (vi) Popis předcházející přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: FR 9506517 (B) Datum podání: 1. června 1995 (2) Informace pro SEQ ID No. 1:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 1496 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (vi) Původ:
(A) Organizmus: Arabidopsis thaliana (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 76..1365 (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 1:
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC
111
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Vál Thr Tyr
GCA TCG ATG Ala Ser Met 15 TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159
Leu Ser Leu Leu Ala 20 Phe Cys Pro Pro Phe 25 Val Ile Leu
CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gin Asp Gly Ser Val Thr Gin Thr Phe
30 3S 40
-36CZ 294860 B6
GGC TTC Gly Phe 45 TTT TGG GAG AAT Phe Trp Glu Asn 50 GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255
Gly Val Gin Gly Leu 55 Ile Asn Ile Trp Pro 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303
Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe
65 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351
Glu Ala Ile Leu Gin Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro
80 85 90
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala
95 100 105
GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447
Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly
110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495
Ile Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser
125 130 135 140
GCA Ala CTA Leu ATA Ile TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543
Phe Gly 145 Ser Phe Ile Phe Cys 150 Val Leu Leu Tyr Ile 155 Lys
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591
Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu
160 165 170
ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys
175 180 185
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687
Ser Phe Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser
190 195 200
TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735
Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gin Tyr Glu Ile Asn
205 210 215 220
-37CZ 294860 B6
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val 783
225 230 235
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831
Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met
240 245 250
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879
Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu
255 260 265
GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927
Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn
270 275 280
CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975
His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gin Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala
285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023
Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys 1 Tyr Asp Cys . Asp Arg Gin Arg Gin
305 310 315
GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT Val TGG GGA AGA GCC Ala CCG Pro 1071
Glu Phe Arg Arg Thr 320 Asn Gly Lys Cys 325 Leu Trp Gly Arg 330
TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119
ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr
335 340 345
AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167
Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His
350 355 360
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu
365 370 375 380
-38CZ 294860 B6
TTC Phe GAT Asp AAC Asn TTC TTG GCA Phe Leu Ala 385 TAC Tyr TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263
Phe Tyr Val 390 Leu Thr Leu Leu Leu Phe 395
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
ASp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys.
400 405 410
TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359
Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
415 420 425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT ' TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415
Ile Tyr
430
GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA
TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A
1475
1496 (2) Informace pro SEQ ID No. 2:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 430 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 2:
-39CZ 294860 B6
Met : Ala Glu i Thr • Val . His i Ser Prc > Ile i Val . Thr • Tyr Ala ; Sex • Met Leu
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro ' Pro i Phe Val Ile Leu : Leu Trp i Tyr Thr
20 25 30
Met Val His Gin Aep Gly Ser Val Thr Gin Thr Phe Gly Phe Phe Trp
35 40 45
Clu Asn Gly Val Gin Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu
50 55 60
Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu
65 70 75 80
Gin Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala
85 90 95
Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val
100 105 110
Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro
115 120 125
Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe
130 135 140
Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser CyB Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe
165 170 175
Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp Ile
180 185 190
Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu
195 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gin Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser
210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys
225 230 235 240
-40CZ 294860 B6
Phe Phe Trp i Trp Glu Ala . Gly Tyr • Trp i Asn . Thr Met Asp » Ile Ala His
245 250 255
Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro
260 265 270
Ser Val Tyr Thr ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro Val Glu
275 280 285
Leu Gly Thr Gin Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cys
290 295 300
Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gin Arg Gin Glu Phe Arg Arg
305 310 315 320
Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val
325 330 335
Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu
340 345 350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu
355 360 365
Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Phe
370 375 380
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys
385 390 395 400
Arg Asp Aep Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu
405 410 415
Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr
420 425 430
-41 CZ 294860 B6 (2) Informace pro SEQ ID No. 3:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vláken: jednoduchá (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: peptid (B) Umístění 7 (D) Další informace: /notě = „residu 7=Trp nebo Tyr“ (ix) Charakteristika (A) Jméno/klíč: peptid (B) Umístění: 12 (D) Další informace: /notě = „residu 12=His nebo Lys“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 3:
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr
10 15 (2) Informace pro SEQ ID No. 4:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 29 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 10..29 (D) Další informace: /note= „SEQUENCE ID No 1 DE 76 A 95“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 4:
CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC (2) Informace pro SEQ ID No. 5:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární
-42CZ 294860 B6 (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: misc feature (B) Umístění: komplement (10..38) (D) Další informace: /note= „SEQUENCE ID NO 1 COMPLEMENTAIRE DE 1350 A 1368“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 5:
CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG (2) Informace pro SEQ ID No. 6:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 23 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: komplement (1..23) (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 6:
GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC (2) Informace pro SEQ ID No. 7:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 29 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 7:
AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC (2) Informace pro SEQ ID No. 8:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 46 párů bází (B) Typ: nukleotid
-43 CZ 294860 B6 (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 8:
GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG (2) Informace pro SEQ ID No. 9:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 17 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: komplement (1..17) (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 9:
GTAAAACGAC GGCCAGT (2) Informace pro SEQ ID No. 10:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 10:
TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG (2) Informace pro SEQ ID No. 11:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 38 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární
-44CZ 294860 B6 (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: miscfeature (B) Umístění: komplement (1..38) (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 11:
GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG (2) Informace pro SEQ ID No. 12:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 34 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 12:
CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT (2) Informace pro SEQ ID No. 13:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: misc feature (B) Umístění: komplement (1..25) (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 13:
TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG (2) Informace pro SEQ ID No. 14:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární
-45 CZ 294860 B6 (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: misc feature (B) Umístění: komplement (1..20) (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 14:
TACATTAGGT CCTTTGTAGC (2) Informace pro SEQ ID No. 15:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 15:
GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG (2) Informace pro SEQ ID No. 16:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 16:
AATTGCGGCC GCGTACGTAT G (2) Informace pro SEQ ID No. 17:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“
-46CZ 294860 B6 (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: komplement (1 ..21) (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 17:
AATTCATACG TACGCGGCCG C (2) Informace pro SEQ ID No. 18:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 14 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 18:
CAACGCGTCC TAGG (2) Informace pro SEQ ID No. 19:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 22 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: misc feature (B) Umístění: komplement (1 ..22) (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 19:
AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT (2) Informace pro SEQ ID No. 20:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 33 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina
-47CZ 294860 B6 (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 20:
GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT (2) Informace pro SEQ ID No. 21:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 34 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: miscfeature (B) Umístění: komplement (1..39) (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 21:
(A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: misc feature (B) Umístění: komplement (1..28) (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 23:
AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT (2) Informace pro SEQ ID No. 24:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 40 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 24:
GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC (2) Informace pro SEQ ID No. 25:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 15 párů bází (B) Typ: nukleotid
-48CZ 294860 B6 (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 25:
TCGACGGACG CGTGG (2) Informace pro SEQ ID No. 26:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 14 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: komplement (1..14) (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 26:
TCGACCACGC GTCC (2) Informace pro SEQ ID No. 27:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 35 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 27:
TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT (2) Informace pro SEQ ID No. 28:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 15 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární
-49CZ 294860 B6 (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 28:
GGCCGCAAAA CCAAA (2) Informace pro SEQ ID No. 29:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 15 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: komplement (1..15) (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 29:
AGCTTTTGGT TTTGC (2) Informace pro SEQ ID No. 30:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 30:
GATCTATCGA TGCGGCCGCG (2) Informace pro SEQ ID No. 31:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jednoduchá (D) Konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: Jiná nukleová kyselina (A) Popis: /DESC= „OLIGONUKLEOTIDE“ (ix) Charakteristika:
-50CZ 294860 B6 (A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: komplement (1..20) (xi) Popis sekvence: SEQ ID No. 31:
CGCGCGCGGC CGCATCGATA
Průmyslová využitelnost
Sekvence DNA kódující protein A. Thaliana s aktivitou delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, protein delta-7-Red jakož i její způsob přípravy a kmeny transformovaných kvasinek mají využití v molekulární genetice.

Claims (28)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Sekvence nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující protein A. thaliana mající aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy, kdy kyselina je buď DNA, nebo RNA, výhodně cDNA; kde kódující sekvence odpovídá nukleotidová sekvenci SEQ ID No. 1:
    GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60 AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111 Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr 15 10
    GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159 Ala Ser Met 15 Leu Ser Leu Leu Ala 20 Phe Cys Pro Pro Phe Val 25 Ile Leu CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207 Leu Trp Tyr Thť Met Val His Gin Asp Gly Ser Val Thr Gin Thr Phe 30 3S 40 GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255 Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gin Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro 45 50 55 60 AGA ccc ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303 Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe 65 70 75 GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351 Glu Ala ile Leu Gin Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val G1U Gly Pro 80 85 90 ATA ' rcr cca i GCC GGA AAC < CGA i CCA i GTT TAC . AAG > GCC . AAT ( GGT CTG i GCT 399
    Ile
    Ala
    Gly
    Val
    Ala
    Gly
    Ala
    Lyfl
    Ser
    Asn
    Arg
    Tyr
    Led
    Pro
    Pro
    100
    Asn
    105
    GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA447
    Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly
    110 115120
    ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG495
    Ile Phe Α·η Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser
    125 130 135140
    GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ΑΤΑ AAA543
    Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys
    145 150155
    GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA591
    Gly His Val Ala Pro ser Ser Ser Asp Ser Gly ser Cys Gly Asn Leu
    160 165170
    ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG639
    Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile GlyLys
    175 180185
    AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT687
    Ser Phe Asp Ile tys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Cly Met MetSer
    190 195200
    TGG GCA GTT CTT CCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT735
    Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile tys Gin Tyr Glu Ile Asn
    205 210 215220
    GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG783
    Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val
    225 230235
    TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG831
    Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met
    240 245250
    GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA879
    Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly CysLeu
    255 260265
    GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC927
    Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn
    -52CZ 294860 B6
    CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ΑΤΆ TAC ATT CTC GTT GCA975
    His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gin Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala
    255 290 295300
    GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA1023
    Gly Ile Leu Cya Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gin Arg Gin
    305 310315
    GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG1071
    Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro
    320 325330
    TCA AAG ATT GTC GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT1119
    Ser Lye Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr
    335 340345
    AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT1167
    Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His
    350 355360
    TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC1215
    Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu
    365 370 37S380
    TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT1263
    Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe
    385 390395
    GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA1311
    Asp Arg Ala Lya Arg Asp Asp Asp Arg Cya Arg Ser Lys Tyr GlyLys
    400 405410
    TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA1359
    Tyr Trp Lys Leu· Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile ProGly
    415 420425
    ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC1415
    Ile Tyr
    430
    GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475
    TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A1496 stejně tak jako alelické variace této sekvence, jakož i sekvence DNA kódující protein mající 5 aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy, která hybridizuje se sekvencí definovanou výše za podmínek střední nebo vysoké stringence a nebo se shoduje se sekvencí definovanou výše na alespoň 60 %.
    -53 CZ 294860 B6
  2. 2. Primer pro amplifikaci sekvence DNA kódující protein mající aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy technikou polymerázové řetězové reakce (PCR), kterým je oligonukleotid který má sekvenci, které odpovídá následující sekvence aminokyselin SEQ ID No.
  3. 3:
    5 Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr
    15 10 15 ve které Xaa v poloze 7 je Trp nebo Tyr a Xaa v poloze 12 je His nebo Lys.
    10 3. Protein A. thaliana, mající aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy a mající sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 2:
    Met Ala i Clu ; Thr Val His Sex Pro ' Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr 20 25 30 Met Val His Gin Asp Gly Ser Val Thr Gin Thr Phe Gly Phe Phe Trp 35 40 45 Glu Asn Gly val Gin Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu 50 55 60 Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu es 70 75 80 Gin Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala 85 90 95 Gly : ften Arg Pro Val Tyr : Lys Ala Asn Gly Leu Ala . Ala Tyr Phe Val 100 105 110
    -54CZ 294860 B6
    Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp
    Phe Gly
    Ile Phe Asn Pro
    115
    120
    125
    Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe 130 135 140 Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala 145 150 155 160 Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu ile Ile Asp Phe 165 170 175 Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys ser Phe Asp Ile 180 185 190 Lys Val Phe Thr Asn Cye Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu 195 200 205 Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gin Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser
    210 21S 220
    Asp Ser 225 Mat Leu Val Asn 230 Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr 235 Val Thr Lys 240 Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala His 245 250 255 Aep Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro 260 265 270 Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro val Glu 275 280 285 Leu Gly Thr Gin Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cys 290 295 300 Ile Tyr Xla Lys Tyr Asp cys Asp Arg Gin Arg Gin Glu Phe Arg Arg
    305 310 315 320 Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val 325 330 335 Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu 340 345 350 Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu 355 360 365
    -55 CZ 294860 B6
    Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp A on Phe 370 375 380 Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys 385 390 395 400 Arg Aep Aep Asp Arg Cys Arg Šer Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu 4OS 410 415 Tyr Cy· Glu Lys val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr 420 425 430
    stejně tak jako alelické varianty a analogy této sekvence, které mají aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy nebo protein mající aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy a mající sekvenci aminokyselin, která se shoduje se sekvencí SEQ ID No. 2 na alespoň 60 %.
  4. 4. Protein A. thaliana, mající aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy a mající sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 2 a označený delta-7Red.
  5. 5. Použití DNA sekvence podle nároku 1 pro expresi proteinu, majícího aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, v hostitelské buňce.
  6. 6. Použití podle nároku 5, kde sekvence DNA kóduje sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 2.
  7. 7. Použití podle nároků 5 nebo 6, kde hostitelskou buňkou je kvasinka.
  8. 8. Protilátky proti proteinu majícímu aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy podle nároků 3 a 4.
  9. 9. Vektor exprese obsahující sekvenci DNA podle nároku 1.
  10. 10. Hostitelská buňka transformovaná vektorem exprese obsahujícím DNA sekvenci, popsanou v nároku 1.
  11. 11. Hostitelská buňka podle nároku 10 transformovaná vektorem, kde hostitel je kvasinka nebo vláknitá houba.
  12. 12. Způsob klonování nukleové kyseliny kódující protein mající aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy podle nároku 1 v mikroorganizmu, vyznačující se tím, že zahrnuje metodu prohledávání pomocí hybridizace a odpovídající jedné z následujících možností:
    - rezistence mikroorganizmu na nystatin nebo na analogickou sloučeninu, jejíž toxicita závisí na přítomnosti sterolů nesoucích nenasycenost v poloze C-7,
    - hybridizace nukleové kyseliny s nukleotidovou sekvencí SEQ ID No. 1,
    - identifikace nukleové kyseliny informatickou metodou mezi náhodně izolovanými sekvencemi DNA,
    - přímá exprese proteinu následovaná imunodetekcí s pomocí protilátek proti proteinu, majícímu sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 2.
  13. 13. Způsob výroby proteinu majícího aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy podle nároku 1, vyznačující se tím, že je kultivována transformovaná hostitelská buňka podle kteréhokoliv z nároků 10 nebo 11 a je izolován exprimovaný protein.
    -56CZ 294860 B6
  14. 14. Způsob podle nároku 13, v y z n a č u j í c i se t í m , že hostitelská buňka je transformovaná kvasinka, ve které je kódující sekvenci DNA řízena promotorem kvasinky.
  15. 15. Způsob redukce in vitro sterolu nenasyceného v poloze C-7, v y z n a č u j í c í se tím, že se sterol inkubuje s proteinem získaným podle nároků 3 nebo 4 a popřípadě se izoluje získaný redukovaný sterol.
  16. 16. Způsob redukce in vivo exogenního sterolu nenasyceného v poloze C-7, podle nároku 15, vyznačující se tím, že se sterol inkubuje s transformovanou hostitelskou buňkou podle nároků 10 nebo 11 a popřípadě se izoluje získaný redukovaný sterol.
  17. 17. Způsob redukce in vivo endogenního sterolu nenasyceného v poloze C-7, podle nároku 15, vyznačující se tím, že se kultivuje transformovaná hostitelská buňka podle nároku 10 a popřípadě se izoluje akumulovaný redukovaný sterol.
  18. 18. Způsob redukce in vitro nebo in vivo podle kteréhokoliv nároku 15 až 17, vyznačující se tí m, že získaný sterol je substrát enzymu štěpení postranního řetězce cholesterolu (P450SCC).
  19. 19. Způsob redukce podle nároku 18, vyznačující se tím, že endogenní sterol určený k redukci je ergosta-5,7-dien-3-ol, ergosta-5,7,24(28)-trien-3-ol nebo ergosta-5,7,22trien-3-ol a nebo jejich směs.
  20. 20. Způsob výroby pregnenolonu, vyzn aču j í cí se t í m , že se kultivují transformované hostitelské buňky podle nároku 11, popřípadě se izoluje akumulovaný endogenní sterol nebo steroly redukované v poloze C-7, redukované steroly se inkubují v přítomnosti P450SCC a popřípadě i adrenodoxin reduktasy, ADR, a adrenodoxinu, ADX, a popřípadě se izoluje získaný pregnenolon.
  21. 21. Způsob podle nároku 20, v y z n a č u j í c í se t í m , že hostitelská buňka je kvasinka.
  22. 22. Způsob výroby pregnenolonu podle nároku 20, vyznačující se tím, že se kultivují kvasinky transformované jedním nebo více vektory dovolujícími koexpresi proteinu definovaného nárokem 3, majícího aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy a P450SCC a popřípadě i ADR a ADX a popřípadě se izoluje volný nebo esterifikovaný pregnenolon.
  23. 23. Způsob výroby pregnenolonu podle nároku 22, vyznač u j í cí se tí m , že se kultivují transformované kvasinky koexprimující protein mající aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, P450SCC, ADR a ADX.
  24. 24. Způsob podle nároků 22 až 23, vyznačující se tím, že protein mající aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy je protein A. thaliana delta-7Red.
  25. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že kmen kvasinek je kmen EC01/pCD63, uložený pod přístupovým číslem CNCM 1-1538.
  26. 26. Transformovaný kmen kvasinek, koexprimující protein definovaný nárokem 3, mající aktivitu delta-5,7 sterol,delta-7 reduktasy, P450SCC, ADR a ADX a akumulující volný nebo esterifikovaný pregnenolem.
  27. 27. Kmen kvasinek podle nároku 26, ve kterém protein mající aktivitu delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy je protein A. thaliana delta-7Red.
    -57CZ 294860 B6
  28. 28. Kmen kvasinek podle nároku 27 označený EC01/pCD63, uložený pod přístupovým číslem CNCM 1-1538.
CZ1996432A 1995-02-15 1996-02-14 Sekvence DNA kódující protein A. thaliana s aktivitou delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, protein delta-7 Red, primer, protein A. thaliana, způsob jejich výroby, kmenové struktury transformovaných kvasinek a použití CZ294860B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9501723A FR2730494B1 (fr) 1995-02-15 1995-02-15 Sequence d'adn codant pour une proteine d'a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta7-red, procede de production, souches de levures transformees, applications
FR9506517A FR2734839B1 (fr) 1995-06-01 1995-06-01 Sequence d'adn codant pour une proteine d'a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta-7red, procede de production, souches de levures transformees, applications.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ43296A3 CZ43296A3 (en) 1996-12-11
CZ294860B6 true CZ294860B6 (cs) 2005-04-13

Family

ID=26231759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1996432A CZ294860B6 (cs) 1995-02-15 1996-02-14 Sekvence DNA kódující protein A. thaliana s aktivitou delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, protein delta-7 Red, primer, protein A. thaliana, způsob jejich výroby, kmenové struktury transformovaných kvasinek a použití

Country Status (24)

Country Link
US (3) US5759801A (cs)
EP (1) EP0727489B1 (cs)
JP (1) JP4082469B2 (cs)
KR (1) KR100422293B1 (cs)
CN (2) CN1664107A (cs)
AR (2) AR003407A1 (cs)
AT (1) ATE457354T1 (cs)
BR (1) BRPI9600729B8 (cs)
CA (1) CA2169524C (cs)
CZ (1) CZ294860B6 (cs)
DE (1) DE69638123D1 (cs)
DK (1) DK0727489T3 (cs)
ES (1) ES2339833T3 (cs)
FI (1) FI120877B (cs)
HR (1) HRP960078B1 (cs)
HU (1) HU220587B1 (cs)
IL (4) IL116872A (cs)
PL (1) PL185569B1 (cs)
PT (1) PT727489E (cs)
RU (1) RU2242517C2 (cs)
SI (1) SI0727489T1 (cs)
SK (1) SK283656B6 (cs)
TR (1) TR199600116A2 (cs)
UA (1) UA72172C2 (cs)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997048793A1 (en) * 1996-06-21 1997-12-24 The General Hospital Corporation Plant sterol reductases and uses thereof
DE19739940A1 (de) * 1997-09-11 1999-03-18 Hartmut Prof Dr Med Glossmann Protein mit Aminosäuresequenz der DELTA7-Sterolreduktase, isoliertes cDNA-Molekül, das für das Protein kodiert, rekombinanter DNA-Vektor und biologisch aktive Zusammensetzungen, die das Protein oder das cDNA-Molekül enthalten
FR2774393B1 (fr) * 1998-02-05 2000-03-24 Hoechst Marion Roussel Inc Souches de levure ayant le gene atf2 interrompu et leurs applications
US6465717B1 (en) * 1998-11-20 2002-10-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sterol metabolism enzymes
FR2812884B1 (fr) * 2000-08-08 2002-11-08 Aventis Pharma Sa Levures modifiees et utilisations, notamment pour la production de derives steroidiens
FR2820145B1 (fr) * 2001-01-31 2004-01-23 Aventis Pharma Sa Souche de levure produisant des steroides de facon autonome
US7193169B2 (en) * 2003-10-29 2007-03-20 Alcon, Inc. Ergonomic footswitch
FR2869914B1 (fr) * 2004-05-06 2012-11-09 Aventis Pharma Sa Souches de levure produisant du cholesterol et leurs applications
US7732680B2 (en) * 2005-03-16 2010-06-08 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
KR100672006B1 (ko) * 2005-08-03 2007-01-19 길병옥 폐자재를 이용한 형강의 제조방법 및 그 제조방법에 의해생산된 형강
US20100330572A1 (en) * 2007-12-21 2010-12-30 Assaraf Yehuda G Organic compounds
DE102009022772A1 (de) 2009-05-21 2010-11-25 Organobalance Gmbh Mikroorganismus zur Expression eines humanen Membranproteins
FR2961218A1 (fr) * 2010-06-10 2011-12-16 Sanofi Aventis Methode de detection de composes modulateurs du metabolisme du cholesterol
CN102286053B (zh) * 2011-06-20 2012-09-05 河北联合大学 孕甾烯醇酮吡咯化合物及其制备方法
KR20160019451A (ko) 2013-06-17 2016-02-19 사노피 시토크롬 p450 모노옥시게나제 생체촉매작용을 위한 전세포 시스템
CN110903993A (zh) * 2019-12-20 2020-03-24 河北兰升生物科技有限公司 一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
CN112813129B (zh) * 2021-02-05 2023-09-08 江南大学 利用区室化提高酵母菌中7-脱氢胆固醇产量的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1042567A (zh) * 1988-09-23 1990-05-30 吉斯特-布罗卡迪斯公司 类固醇多步氧化方法和所用的遗传工程细胞
JP2645130B2 (ja) * 1989-03-31 1997-08-25 日清製粉株式会社 ステロイド誘導体
US5547868A (en) * 1993-06-09 1996-08-20 Regents Of The University Of California Cholesterol disposal fusion enzymes

Also Published As

Publication number Publication date
AR003407A1 (es) 1998-08-05
CA2169524A1 (fr) 1996-08-16
EP0727489A1 (fr) 1996-08-21
HUP9600325A3 (en) 1999-07-28
US5989881A (en) 1999-11-23
JPH08289793A (ja) 1996-11-05
PL312828A1 (en) 1996-08-19
IL162476A0 (en) 2005-11-20
TR199600116A2 (tr) 1996-08-21
FI120877B (fi) 2010-04-15
SI0727489T1 (sl) 2010-05-31
ES2339833T3 (es) 2010-05-25
US5965417A (en) 1999-10-12
PT727489E (pt) 2010-04-27
KR960031607A (ko) 1996-09-17
HUP9600325A1 (en) 1996-11-28
IL116872A (en) 2004-12-15
HU220587B1 (hu) 2002-03-28
CZ43296A3 (en) 1996-12-11
CA2169524C (fr) 2012-05-01
HRP960078B1 (en) 2011-11-30
IL162476A (en) 2005-12-18
CN1216995C (zh) 2005-08-31
DK0727489T3 (da) 2010-05-31
BRPI9600729A (pt) 1997-12-23
IL162477A0 (en) 2005-11-20
CN1664107A (zh) 2005-09-07
FI960663A (fi) 1996-08-16
JP4082469B2 (ja) 2008-04-30
IL116872A0 (en) 1996-07-23
CN1145953A (zh) 1997-03-26
BRPI9600729B1 (pt) 2017-06-20
SK18896A3 (en) 1996-10-02
DE69638123D1 (de) 2010-03-25
FI960663A0 (fi) 1996-02-14
UA72172C2 (uk) 2005-02-15
PL185569B1 (pl) 2003-06-30
ATE457354T1 (de) 2010-02-15
RU2242517C2 (ru) 2004-12-20
BRPI9600729B8 (pt) 2021-07-06
AR053931A2 (es) 2007-05-23
KR100422293B1 (ko) 2004-06-14
SK283656B6 (sk) 2003-11-04
HRP960078A2 (cs) 1998-02-28
EP0727489B1 (fr) 2010-02-10
US5759801A (en) 1998-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ294860B6 (cs) Sekvence DNA kódující protein A. thaliana s aktivitou delta-5,7 sterol, delta-7 reduktasy, protein delta-7 Red, primer, protein A. thaliana, způsob jejich výroby, kmenové struktury transformovaných kvasinek a použití
US7977065B2 (en) Yeast strains autonomously producing steroids
EP2386634A1 (en) Sterol side chain-cleaving enzyme protein and use thereof
KR100599346B1 (ko) 중단된 ａｔｆ2 유전자를 가진 효모 균주 및 그의 용도
US8173402B2 (en) Modified yeasts and uses thereof, in particular for producing steroid derivatives
AU707957B2 (en) DNA sequence coding for a protein of A. thaliana having a delta-5,7sterol,delta-7 reductase activity, delta7-red protein, production process, strains of transformed yeasts, uses
FR2734839A1 (fr) Sequence d&#39;adn codant pour une proteine d&#39;a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta-7red, procede de production, souches de levures transformees, applications.
AU780186B2 (en) Method for preparing steroids modified by yeast fermentation

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20160214