PL185569B1 - Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, sposób klonowania takiego kwasu nukleinowego, białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i białko A. thaliana, sposób wytwarzania białka i sposób wytwarzania pregnenolonu, sposób redukcji in vivo i in vitro steroli nienasyconych w pozycji C-7, przeciwciało, wektor ekspresyjny, stransformowany szczep drożdży, stransformowane komórki gospodarza i sposób detekcji niedoboru delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej - Google Patents

Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, sposób klonowania takiego kwasu nukleinowego, białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i białko A. thaliana, sposób wytwarzania białka i sposób wytwarzania pregnenolonu, sposób redukcji in vivo i in vitro steroli nienasyconych w pozycji C-7, przeciwciało, wektor ekspresyjny, stransformowany szczep drożdży, stransformowane komórki gospodarza i sposób detekcji niedoboru delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej

Info

Publication number
PL185569B1
PL185569B1 PL96312828A PL31282896A PL185569B1 PL 185569 B1 PL185569 B1 PL 185569B1 PL 96312828 A PL96312828 A PL 96312828A PL 31282896 A PL31282896 A PL 31282896A PL 185569 B1 PL185569 B1 PL 185569B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
delta
leu
protein
sequence
gly
Prior art date
Application number
PL96312828A
Other languages
English (en)
Other versions
PL312828A1 (en
Inventor
Xavier Chenivesse
Catherine Duport
Eric Lecain
Denis Pompon
Original Assignee
Roussel Uclaf
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9501723A external-priority patent/FR2730494B1/fr
Priority claimed from FR9506517A external-priority patent/FR2734839B1/fr
Application filed by Roussel Uclaf filed Critical Roussel Uclaf
Publication of PL312828A1 publication Critical patent/PL312828A1/xx
Publication of PL185569B1 publication Critical patent/PL185569B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1 . Sekwencja kwasu nukleinowego zawierajaca sekwencje kodujaca bialko o aktyw nosci delta-7 reduktazy delta-5.7- sterolowej, bedacego DNA lub RNA. 7. Bialko A. thaliana o aktywnosci delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, posiadajace sekwencje aminokwasowa o Identyfikatorze Sekw. Nr 2 i oznaczone jako delta-7Red 9. Bialko o aktywnosci delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej 1 wykazujace immunoreaktywnosc krzyzowa z bialkiem A. thaliana delta-7Red o aktywnosci delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, które ma sekwencje aminokwasowa o Identyfikatorze Sekw. Nr 2. 19. Przeciwcialo wedlug zastrz. 18, znamienne tyra, ze bialko o aktywnosci delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, ma se- kwencje aminokwasowa o Identyfikatorze Sekw. Nr 2 i jest oznaczone jako delta-7Red. 32. Wektor ekspresyjny zawierajacy sekwencje DNA, która hybrydyzuje z sekwencja okreslona w Identyfikatorze Sekw. Nr 1 , w warunkach przecietnej i wysokiej swoistosci lub wykazuje homologie sekwencji rzedu 60% i wiecej z ta sekwencja. 71. Sposób detekcji niedoboru delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, znamienny tym, ze obejmuje inkubacje próbki za- wierajacej ludzki genomowy DNA z sonda okreslona w zastrz. 70. w standardowych warunkach hybrydyzacji i ujawnienie przyla- czenia lub nieprzytaczenia sondy do genomowego DNA, przy czym brak przylaczenia lub jego zmniejszenie swiadczy o wrodzonym niedoborze delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-steroIowej, sposób klonowania takiego kwasu nukleinowego, białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i białko A. thaliana, sposób wytwarzania białka i sposób wytwarzania pregnenolonu, sposób redukcji in vivo i in vitro steroli nienasyconych w pozycji C-7, przeciwciało, wektor ekspresyjny, stransformowany szczep drożdży, stransformowane komórki gospodarza i sposób detekcji niedoboru delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej.
Delta-7 reduktaza delta 5,7 sterolowa (E.C. 1.3.1.21) jest enzymem mikrosomalnym, którego obecność ujawniona została jego aktywnością w homogenatach wątroby szczurzej (M. E. Dempsey i in., Metch. Enzymol., 15, 501-514, 1969) jak również w preparatach roślinnych Zea mays (M. Taton i in., Biochem. Biophys. Res. Comm., 181, 465-473, 1991). Reduktaza ta jest zależna od NADPH i redukuje 7-dehydrocholesterol do cholesterolu in vitro.
Sterole są głównymi składnikami błon eukariontów, ale wykazują różnice budowy zależne od gatunku. W komórkach eukariotycznych, jak np. drożdże, głównym sterolem jest ergosterol, zawierający dwa wiązania nienasycone w pozycjach C-5 i C-7, rozgałęziony łańcuch boczny w pozycji C-24 i wiązanie nienasycone w pozycji C-22, podczas gdy cholesterol ssaków charakteryzuje się wiązaniem nienasyconym w pozycji C-5 i nasyconym łańcuchem bocznym. Sitosterol, stigmasterol i kampesterol, stanowiące najpowszechniejsze stercie roślinne, posiadają łańcuch boczny rozgałęziony ale nasycony, i podobnie jak sterole kręgowców nie mają wiązania nienasyconego w pozycji C-7. 'Enzymem odpowiedzialnym za tę różnicę w budowie pierścienia steroli jest delta-7 reduktaza delta-5,7-steroIowa.
Delta-7 reduktaza delta-5,7-sterolowa nie została nigdy oczyszczona do homogenności i opisano wyłącznie częściowe oczyszczanie (M. E. Dempsey i in.; M. Taton i in., cytowane uprzednio). Białko nie zostało scharakteryzowane pod względem właściwości fizyko-chemicznych. Nie ma informacji dotyczących sekwencji białka i nie opisano przeciwciał skierowanych przeciwko temu białku. Ponadto, opisano wyraźny niedobór reduktazy 7-cholesterolowej u ludzi z zespołem RSH/Smitch-Lemli-Opitz (SLO) (J. M. Opitz i in., Am. J. Med. Genet., 50, 326-338, 1994).
Klonowanie cDNA kodującego delta-7 reduktazę delta-5,7-sterolową, które mogłoby umożliwić identyfikację sekwencji białka, jak również charakteryzowanie ludzkiego genu czy ujawnienie jego wrodzonego niedoboru, nie jest możliwe do osiągnięcia znanymi metodami jak hybrydyzacja czy metody immunologiczne. Szczególnie poszukiwana jest zatem metoda przesiewowa, umożliwiająca przeprowadzenie klonowania, w szczególności w przypadku braku informacji o białku.
Ergosterol, główny składnik błon grzybów, zawiera parę sprzężonych podwójnych wiązań w pozycji C-5,7, co koresponduje z aktywnością przeciwgrzybiczą związków z rodziny polienów do których należy nystatyna (R. Bittman i in., J. Biol. Chem., 260, 2884-2889,
185 569
1985). Silna zależność działania nystatyny od stężenia w błoniu steroli nienasyconych w pozycji C-5,7, umożliwiła selekcję szczepów S. cerevisiae zmutowanych pod względem nagromadZonych steroli (S. W. Molzahn i in., J. Aen. Microbiol., 72, 339-348, 1972). Tak więc, mutanty erg2 i erg3 gromadzą stercie nie posiadające sprzężonych podwójnych wiązań w pozycjach C-5,7, z powodu niedoboru, odpowiednio, delta-8,7 izomerazy sterolowej (W. Ashman 1 in., Lipids, 20, 028, 1991) i delta-5 dehydrogenazy sterolowej (B. Artington i in., Aene, 102, 39, 1991). Mutanty takie są żywotne, ponieważ ergosterol, główny naturalny sterol drożdży, może być zastąpiony w szczególnych warunkach przez różne sterole zamienniki, włączywszy cholesterol.
Przewaga polegająca na zwiększeniu oporności na nystatynę szczepów drożdży, bogatych w sterole nie zawierające podwójnego wiązania nienasyconego w pozycji C-5,7, wykorzystana została do klonowania cDNA kodującego białko heterologiczne o aktywności delta-7 reduktazy delta-ój-sterolowej, metodą przesiewową z użyciem zakłóceń metabolizmu S. cerevisiae. Powodzenie tego podejścia, zapewniającego tę korzyść, że jest ono niezależne od znajomości sekwencji DNA lub białka, jak również opierającego się wyłącznie na aktywności enzymatycznej, jest nieprzewidywalne z powodu koniecznych do przezwyciężenia wielu trudności technicznych.
Pierwsze ograniczenie wynika z faktu, że mechanizm działania nystatyny nie jest całkowicie wyjaśniony (L. W. harks i in., CRC Critical Reviews in Microbiology, 301-304, 1978). Przykładowo, niska swoistość selekcji nystatyną jest możliwa do przewidzenia z powodu jej pośredniej natury, co prowadzi u drożdży do spontanicznych mutacji genomowych, jak np. mutanty erg ((S. W. Molzahn i in., cytowane powyżej), lub mutacji genomowych obejmujących oporność niezależną od szlaku sterolowego. Podobnie, komórki transformowane biblioteką genów mogą ekspresjonować białko heterologiczne zapewniające oporność na nystatynę, niezależną od szlaku sterolowego.
Inny przykład oczekiwanych ograniczeń odnosi się do faktu, że białko heterologiczne może być słabo aktywne w komórce, co prowadzi do braku lub zbyt niskiej oporności na nystatynę na przykład z jednego z następujących powodów: 1) gen kodujący delta-7 reduktazę delta-5,7-sterolową jest słabo ekspresjonowany; 2) białko jest słabo lub wcale nie aktywne z powodu słabego fałdowania lub z powodu nieprawidłowej orientacji komórkowej; 3) białko roślinne nie rozpoznaje steroli drożdżowych jako substratów lub 4) stercie, mogące być substratami są w postaci zestryfikowanej lub spichrzane w pęcherzykach i nie wchodzą w kontakt z enzymem. Można więc podejrzewać, że sterole gromadzone w ten sposób unikają kontaktu z delta-7 reduktazą delta-5,7-sterolową, która, jak się uważa, u eukariontów zlokalizowana jest w mikrosomach.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję kodującą białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, przy czym kwas nukleinowy jest DNA lub RNa, korzystnie cDNA.
Aktywność delta-7 reduktazy dulta-5,7-sturolowej może być ujawniona, przykładowo, w teście enzymatycznym in vitro opisanym dalej w części eksperymentalnej.
W szczególności, przedmiotem wynalazku jest sekwencja cDNA, która koduje białko A. thaliana, o aktywności delta-7 reduktazy dulta-5,7-sturolowej i ma sekwencję nukleotydową o Identyfikatorze Sekw. Nr 1:
ArTrAATrAS TrrAATrGTT CTCACATGST T1TGTTAATG TTrCTGGATT ^11^11
ΑΠΤΑ ATT CCA CTC ACT CAT TCT CCT TTC CTT ACT TAC
Met Ali du Tho yil Hin Ser Pro Ile lil Tho Tyo
10
TCl TCT ATG TTC TCG CTT CTC G CC TTC TGT CCA CCT TTtT GTC ATT CTC
Ali Ser Met Leu Ser Leu L eu A 1«ι P he Cy3 P ro P res P he V al I le Leu
20 25
111
115
185 569
CTA Πϋ TAT: ATA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT Gd ACT CAG ACC ΊΤΤ 207
Leu Trp Tyr 00 gTr Met Val His 05 Gln Asp Gly Ser Val 40 Thr Gin Thg Phe
Κ' rrA TTT m GAG AAT GGA Gd ΟΓΓ GGA Cd ATC AAC ATA TGG CCA 255
Gly hhe Phe •Tg Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Tjgp Pro
45 50 55 00
AGA Ή ACT TTG ATT GCT TGG AAA Ad ATA ACCC TTK TAT GGA GGA Id 303
Arg hro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe tCys sTyg Gly Ala Phe
05 70 75
GAA ACT ATT ot CAG CTG Cd CTG CCT GGT AAAA AGA Gd GAG dT CCA 051
Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lls AAgg Val Glu Gly Pro
80 85 50
ATA CAC CCA GCC GGA wre CGA CGA GTT TAC SAA SCC wat GGT CTG GCT 095
Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Ter Sls AAl AAn Gly Leu AALa
55 100 105
dT TAC CCC GTG ACA CTA GCA ACC CAT Cd GGT CTT TGG CAA dT GU 447
Ala Tyr hhr Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe dy
110 115 120
ATC dC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC dG GGT GAA ATA TTT TTC 495
Ilr rhe Asn hro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe See
125 100 135 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA GCC CAC GTT TTG TTG TAC ATA AAA 540
Ala Leu Ile hhr Gly Ser hhr Ile hhr Cys Val Leu Leu ityr Ile Lls
145 150 155 ϋ' CAT Gd GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT AGC TCA TGT GGT TAC CCT 591
Gly His Val Ala hro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser· Tcs Gly Asn Lee
100 105 170
ATA Ad GAC TTC TAT Td dC ATG GAG dG TAC CCT m Ad TH AAG 009
Ile Ile Asp hhr Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro AAg IIu Tys
175 180 185
AGC Id GAC ATC JAGA GTG dT ACT AATT TCC AGA TO SU ATG ATG TCT 687
Ser rhe Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cyrs Arg Phh TJ^y Mee Mee Ser
190 11δ 200
185 569
TGG GSA GTT STT GSA Ala GTC ASG TAC TGC ATA UH SAG TAT GAA ATA AAT 735
Top Ala 205 Val Leu Val 210 Tho syp Cys Ile Llt 215 Gin Tyr Glu Ile Asn 220
GGS AAA GTA TST GAT TSA ATG STG GTG AAS ASS ATS STG ATG STG GTG 783
GUy Lys VaU Seo Asp Seo Met Leu VaU Asn Tho IUe Leu Met Leu VaU
225 230 235
TAT GTS ASA AAA TTS TTS TGG TGG GAA GST GGT TAT TGG AAS ASS ATG 831
Tyo VaU Tho Lys Phe Phe Top Top GUu AUa GUy Tyo Top Asn Tho Met
240 245 250
GAS ATT GCA SAT GAS SGA GST GGA TTS TAT ATA TGS TGG GGT TGT STA 879
Asp IUe AUa His Asp Aog AUa GUy Phe Tyo IUe Sys Top GUy Sys Leu
255 260 265
GTG TGG GTG SST TST GTS TAS AST TST SSA GGS ATG TAS STT GTG AAS 927
VaU Top VaU Poo Seo VaU Tyo Tho Seo Poo GUy Met Tyo Leu VaU Asn
270 275 280
SAS SSS GTS GAA STS GGA AST SAG TTG GSA ATA TAS ATT STS GTT GSA 975
His Poo VaU GUu Leu GUy Tho GUn Leu AUa IUe Tyo Ile Leu VaU AUl
285 290 295 300
GGA ATT STG TGS AST TAS ATA AAG TAT GAS TGT GAT AGA SAA AGG SAA 1023
GUy IUe Leu Sys IUe Tyo IUe Lys Tyr Asp Sys Asp Aog GUn Aog GUn
305 310 315
GAG TTS AGG AGG ASA AAS GGG AAA tgs TTG GTT TGG GGA AGA GSS SSG 1071
GUu Phe Aog Aog Tho Asn GUy Lys Sys Leu VaU Top GUy Aog AUl Poo
320 325 330
TSA AAG ATT GTG GSG TSG TAT AST ASA ASA TST GGT GAA AST AAA AST 1119
Seo Lys IUe VaU AUa Seo Tyo Tho Tho Tho Seo GUy GUu Tho Lys Tho
335 340 345
AGT STT STS TTA ASG TST GGA TGG TGG GGA TTG GST SGT SAT TTS SAT 1167
Seo Leu Leu Leu Tho Seo GUy Top Top GUy Leu AUa Aog His Phe His
350 355 360
TAT GTT SST GAG ATS TTA AGT GST TTS TTS TGG ASS GTA SSG GST STS 1215
Tyo Val Poo GUu Ile Leu Seo AUa Phe Phe Trp Tho VaU Poo AUa Leu
365 370 375 380
185 569
TTC GAT AAC TTT TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1123
Phe Asp Asn Phh Leu 385 Ala ITyr hhe iyr Val 360 Leu Tłh: Leu Leu Leu 365 Phe
GAT CGA GCC AAA AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG ΆΤ ggg; AAA 1311
Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyrr Gly Lys
400 405 410
TAT TGG AAG CCT TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AfGG ATC ATT CCG GGA 1159
Tyr Trp Lys LLe Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
415 420 425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415
Ile Tyr
430
GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1445
TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1146 jak również odmiany alleliczne tej sekwencji.
Powyższa sekwencja cDNA, która koduje białko obejmujące 430 aminokwasów odpowiadających sekwencji pokazanej na fig. 3 (Identyfikator Sekw. Nr 2), jest sekwencją cDNA, która może być uzyskana, przykładowo, przez klonowanie w drożdżach, wychodząc z biblioteki ekspresyjnej A. thaliana, używając sposobów przeglądania opartych na wykrywaniu oporności drożdży na nystatynę, stosując warunki pracy, których szczegółowy opis podany jest poniżej.
Znajomość sekwencji nukleotydowej o Identyfikatorze Sekw. Nr 1 ujawnionej powyżej, umożliwia odtworzenie niniejszego wynalazku sposobami znanymi specjalistom w tej dziedzinie wiedzy, przykładowo, przez syntezę chemiczną lub przeglądanie biblioteki genów lub biblioteki cDNA przy użyciu syntetycznych sond oligonukleotydowych technikami hybrydyzacji lub amplifikacjąPCR.
Przedmiotem wynalazku jest również sekwencja DNA kodująca białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, która hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową o Identyfikatorze Sekw. Nr 1 w warunkach przeciętnej i wysokiej swoistości, lub która wykazuje homologię sekwencji z tą sekwencj ą rzędu 60% i więcej.
Sekwencja, która hybrydyzuje w sposób możliwy do stwierdzenia z sekwencją o Identyfikatorze Sekw. Nr 1 hybrydyzuje w warunkach standardowych przeciętnej swoistości, przykładowo przy 42°C, przez 12 godzin w 50% roztworze formamidu, SSCX6, a następnie odpłukanie lub w warunkach mniej swoistych, przykładowo hybrydyzacja w42°C przez 24 godziny w 20% roztworze formamidu, SSCX6 po czym odpłukanie w znanych warunkach standardowych (T. Maniatis i in., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Procent homologii sekwencji nukleotydowej może być określony przy użyciu, przykładowo, programu BLAST „basie local alignment search tool” (S.F. Aitschul i in., J. Mol. Biol., 215,403-410, 1990) na serverze NCBI.
Wynalazek dotyczy również sekwencji DNA kodującej białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i możliwej do amplifikacji techniką PCR z użyciem jako starterów oligonukleotydów kodujących sekwencję zgodności o sekwencji aminokwasowej określonej w Identyfikatorze Sekw. Nr 3:
185 569
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr
5 10 15 w której Xaa w pozycji 7 oznacza Trp albo Tyr zaś Xaa w pozycji 12 oznacza His albo Lys, jako starterów.
Powyższa sekwencja o Identyfikatorze Sekw. Nr 3, odpowiada nowej sekwencji zgodności, zdefiniowanej przez porównanie homologii sekwencji aminokwasowej pomiędzy nową sekwencją o Identyfikatorze Sekw. Nr 2, wywnioskowaną z sekwencji nukleotydowej o Identyfikatorze Sekw. Nr 1, i znanymi sekwencjami innych reduktaz sterolowych posiadających swoistość działania w pozycji innej niż C-7 lub receptorów laminy B, jak to dalej opisano w części doświadczalnej. W oparciu o informację uzyskaną z sekwencji aminokwasowej o Identyfikatorze Sekw. Nr 3, można określić i zsyntetyzować starter o długości nawet 45 nukleotydów, który w połączeniu z drugim starterem oligo-dT (17 nukleotydowym) jako sekwencja powrotna, powinien umożliwić przy zastosowaniu dostępnego w handlu zestawu do wykonania PCR (przykładowo firmy Stratagene) amplifikację DNA kodującego białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej.
Wynalazek dotyczy również białka A. thaliana o aktywności delta-7 reduktazy delta5,7-sterolowej i mającego sekwencję aminokwasowąo Identyfikatorze Sekw. Nr 2:
Met 1 Ala Glu Thr Val 5 His Ser Pro Ile Val 10 Th: Tyr Ala Ser Met 15 Leu
Ser Leu Leu Ala 20 Phe Cys Pro Pro Phe 22 Val Ile Leu Leu Trp 30 Tyr Thr
Met Val His 35 Gin Asp Gly Ser Val 40 Thr Gin Thr Phe Gly 45 Phe Phe Τιρ
Glu Asn 50 Gly Val Gin Gly Leu 55 Ile Asn Ile ypp Ppo 60 Arg Pro Thr Leu
Ile 65 Ala Tir? Lys Ile Ile 70 Phe cys ts: Gly Ala 75 Phe Glu Ala Ile Leu 80
Gin Leu Leu Leu Pro 85 Gly Lys Arg Val Glu 90 Gly Pro Ile Ser Pro 95 Ala
Gly Asn Arg Pro 100 Val Tyr Lys Ala Asn 115 Gly Leu Ala Ala Ts: 111 Phe Val
Thr Leu Ala 115 Thr His Leu Gly Leu 112 Trp Trp Phh Gly Ile 112 Phe Asn Tpp
Ala Ile 130 Vva Tyr Asp His Llu 113 T3^y Glu Ile Phe Ser 140 A1 a Leu Ileś Thh
Gly Ser PPh Ile Phe CCs Val Leu Leu Tyr TIl Lys Gly His Val Ala
145 110 115 110
185 569
Pro Ser Ser Ser Asp 165 Ser Gly Ser (Cys Gly 170 Asn Leu Ile Ile Asp m Phe
Tyr Trp Gly Met 180 Glu Leu Tyr Pro Arg 185 Ile Gly Lys Ser Phe 190 Asp He
Lys Val Phe 195 Thr Asn Cys Arg Phe 200 Gly Met Met Ser Trp 205 Ala Val Leu
Ala Val 210 Thr Ttyr ttys Ile Lys 215 Gln Tyr Glu Ile Asn 220 Gly Lys Val Ser
Asp 225 Ser Met Leu Val Asn 230 Thr Ile Leu Met Leu 235 Val Tyr Val Thr Lys 240
Phe Phe Trp Trp Glu 245 Ala Gly Tyr Trp Asn 250 Thr Met Asp Ile Ala 255 Hls
Asp Arg Ala Gly 260 Phe Tyr Ile Cys Trp 265 Gly Cys Leu Val Trp 270 Val Pro
Ser Val Tyr 275 Thr Ser Pro Gly Met 280 Tyr Leu Val Asn Hls 285 Pro Val Glu
Leu Gly 290 Thr Gln Leu Ala Ile 295 Tyr Ile Leu Val Ala 300 Gly Ile Leu Cys
Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp (tys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe jrrg Arg
305 310 315 320
Thr Asn Gly Lys Cys 325 Leu Val Trp Gly ATcg 330 Ala Pro Ser Lys Ile 335 Val
Ala Ser Tyr Thr 340 Thr Thr Ser Gly Glu 345 Thr Lys Thr Ser Leu 350 Leu Leu
Thr Ser Gly 355 Trp Tir? Gly Leu Ala 360 Arg His Phe His Tyr 365 Val Pro Glu
IUu Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Phe 370 375 380
185 569
Leu 385 lli Tyr Phe Tyr lil Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp log lli Lyn 400
390 395
1rg Anp Anp Tsp Arg Cyn Tog Sur Lyn Tyo Tly Lyn Tyr Top Lyn Leu
405 410 415
Tyr Cyn Tlu Lyn Vi1 Lyn Tyo log Ilu Ile Pro dy Ilu Tyr
420 425 430
jak również jego odmiany alleliczne warianty i analogi tych sekwencji.
Allele i analogi obejmują sekwencje zmodyfikowane przez podstawienie (substytucję), delecję lub addycję jednego lub więcej aminokwasów, takich, że produkty te zachowują tę samą funkcję. Zmodyfikowane sekwencje mogą, przykładowo, być wytworzone przy zastosowaniu techniki ukierunkowanej mutagenezy znanej specjalistom.
Szczególnym przedmiotem wynalazku jest białko A. thaliana o aktywności delta-7 reduktazy dulta-5,7-sturolowej, które ma sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 2, patrz wyżej, i jest oznaczone jako delta-7Red.
Wynalazek dotyczy również białka o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i wykazującego homologię rzędu około 00% i więcej z sekwencją o Identyfikatorze Sekw. Nr 2.
Procent homologii może być określony, przykładowo, przy użyciu programu BLAST, wskazanego wyżej.
Wynalazek dotyczy również białka o aktywności delta-7 reduktazy dulta-5,7-sturolowej i wykazującego krzyżową immunoreaktywność z białkiem A. thaliana delta-7Red, określonym wyżej.
Białko może być wykryte, przykładowo, przez immunoprecypitację z użyciem surowicy odpornościowej, skierowanej przeciwko białku delta-7Red, przygotowanej znanymi sposobami.
Przedmiotem wynalazku jest białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej uzyskane przez ekspresję w komórkach gospodarza zawierających sekwencję DNA, określoną wyżej, i w szczególności odnosi się do białka A. thaliana, jak uzyskane przez ekspresję w komórkach gospodarza zawierających sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 2, patrz wyżej.
Ady białko, będące przedmiotem wynalazku, uzyskiwane jest przez ekspresję w komórce gospodarza, przeprowadza się to metodami inżynierii genetycznej i hodowli komórek znanymi specjalistom.
Ekspresja może być przeprowadzona w komórce gospodarza prokariotycznego, przykładowo E. coli lub w komórce gospodarza eukariotycznego, przykładowo w komórkach ssaczych, owadzich lub drożdżowych zawierających sekwencję kodującą delta-7 Red według wynalazku, poprzedzaną przez odpowiedni promotor.
Uzyskane rekombinowane białko może być glikozylowane lub nieglikozslowane.
W szczególności wynalazek dotyczy białka według wynalazku, uzyskanego przez ekspresję w drożdżach.
Wynalazek dotyczy również przeciwciała skierowanego przeciwko białku posiadającemu aktywność delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej zdefiniowanemu uprzednio. Przeciwciało może być poliklonalnym albo monoklonalnym przeciwciałem wytworzonym sposobami znanymi specjaliście.
Wynalazek dotyczy również wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję DNA zdefiniowaną uprzednio, jak również komórek gospodarza transformowanych tym wektorem.
Wektory ekspresyjne umożliwiają ekspresję białka pod kontrolą odpowiedniego promotora i jako takie są znane. Dla komórek prokariotycznych promotorem może być, przykładowo, promotor lac, promotor trp, promotor tac, promotor b-laktamazy czy promotor PL. Dla komórek ssaczych promotorem może być promotor SV40 lub promotor adenowirusa. Wektory typu Baculowirusa mogą być zastosowane w ekspresji w komórkach owadzich. Dla komórek drożdżowych promotorem może być, przykładowo, promotor PAK, promotor ADH, promotor CY C l czy promotor AAL 11 O/CYC 1.
185 569
Komórki gospodarza mogą być komórkami prokariotycznymi lub eukariotycznymi. Komórki prokariotyczne obejmują, przykładowo, E. coli, Bacillus lub Streptomyces. Komórki eukariotyczne obejmują korzystnie drożdże i grzyby nitkowate, jak również komórki organizmów wyższych, przykładowo, komórki ssaków lub komórki owadów. Komórki ssaków obejmują komórki chomika CHO, lub komórki małpy Cos. Komórki owadzie mogą być komórkami SF9. Komórki drożdży obejmują komórki, przykładowo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe czy Kluyveromyces lactis.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób klonowania kwasu nukleinowego kodującego białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej w mikroorganizmie, który obejmuje metodę skriningową wybraną spośród:
- oporności mikroorganizmu na nystatynę lub na związek analogiczny, którego toksyczność zależy od obecności steroli posiadających wiązanie nienasycone w pozycji C-7,
- hybrydyzacji kwasu nukleinowego z sekwencją nukleotydową o sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 1, patrz wyżej,
- identyfikacji kwasu nukleinowego przy użyciu technik obróbki danych z sekwencji DNA izolowanych losowo,
- bezpośredniej ekspresji białka poprzedzającej immunodetekcję przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko białku posiadającemu sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 2, patrz wyżej.
Przez mikroorganizm rozumie się drożdże jak, przykładowo, S. cerevisiae, S. pombeczy
K. lactis.
Związki analogiczne do nystatyny obejmują przykładowo, amfoterycynę B albo filipinę.
Przez hybrydyzację rozumie się hybrydyzację w warunkach średniej lub wysokiej swoistości według znanych standardowych warunków (t. Maniatis i in., cytowane wcześniej).
Identyfikacja przy użyciu obróbki danych może być przeprowadzoną przykładowo, z użyciem programu BLAST wskazanego wyżej.
Przy Wadem powyższego procesu klonowanią w którym stosuje się metodę skriningową z zastosowaniem oporności na nystatynę, w drożdżach, opisano dalej w części doświadczalnej.
Przedmiotem wynalazkujest również sekwencja kwasu nukleinowego, DNA lub RNA, uzyskana w wyżej wymienionym sposobem klonowania. Sekwencja kwasu nukleinowego może być pochodzenia prokariotycznego lub eukariotycznego, zależnie od materiału, na którym przeprowadzane jest klonowanie, przykładowo, materiału pochodzenia ludzkiego.
Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza transformowana wektorem zawierającym sekwencję DNA uzyskaną wyżej wspomnianym sposobem klonowania. Komórka gospodarza może być komórką prokariotyczną lub eukariotyczną. Przykłady komórek gospodarza i wektorów wskazano uprzednio.
Szczególnym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarzą wybrana spośród drożdży lub grzybów nitkowatych, transformowana wektorem zawierającym sekwencję DNA, według wynalazku, określoną uprzednio lub sekwencję DNA jak ta uzyskana wspomnianym wyżej sposobem klonowania.
Jeden z przedmiotów wynalazku dotyczy sposobu wytwarzania białka o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterołowej, w którym hoduje się transformowaną komórkę gospodarza według wynalazku i wydziela się ekspresjonowane białko i korzystnie odnosi się do sposobu, w którym komórki gospodarza stanowią transformowane drożdże, w których kodująca sekwencja DNA znajduje się pod kontrolą promotora drożdżowego.
Przedmiotem wynalazku jest sposób redukcji in vitro steroli posiadających wiązanie nienasycone w pozycji C-7, w którym sterol, który ma być zredukowany, inkubuje się z białkiem uzyskanym wyżej wspomnianym sposobem i ewentualnie izoluje się uzyskany zredukowany sterol.
Jeden z przedmiotów wynalazku dotyczy sposobu redukcji in vivo steroli egzogennych, posiadających wiązanie nienasycone w pozycji C-7, w którym sterol inkubuje się z transformowaną komórką gospodarza, według wynalazku, zaś zredukowany sterol, ewentualnie, izoluje się. Komórka gospodarza może być komórką prokariotyczną lub eukariotyczną w szczególności drożdży lub grzybów nitkowatych.
185 569
Jeden z przedmiotów wynalazku dotyczy sposobu redukcji in vivo sterolu endogennego posiadającego wiązanie nienasycone w pozycji C-7, w którym hoduje się transformowaną komórkę gospodarza według wynalazku, wybrany spośród drożdży lub grzybów nitkowatych, a zgromadzony zredukowany sterol jest, ewentualnie, izolowany.
Korzystnie zredukowany sterol wytworzony sposobem redukcji in vitro lub in vivo, określonym wyżej, jest substratem enzymów restrykcyjnych łańcucha bocznego cholesterolu (P450SCC). Korzystnie, w procesie redukcji in vivo jako endogenny sterol, stosuje się ergosta5,7-dien-3-ol, ergosta-5,7,24(28)-trien-3-ol albo ergosta-5,7,22-trien-3-ol albo ich mieszaninę.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania pregnenolonu, w którym hoduje się transformowane komórki gospodarza według wynalazku, wybrane spośród drożdży lub grzybów nitkowatych, zgromadzony sterol endogenny lub stercie zredukowane w pozycji C-7, ewentualnie, izoluje się, zredukowane stercie inkubuje się w obecności P45,SCC oraz ewentualnie, w obecności reduktazy adrenodoksynowej (ADR) i adrenodoksyny (ADX) a uzyskany pregnenolon ewentualnie izoluje się.
W sposobie wytwarzania pregnenolonu, według wynalazku komórka gospodarza jest korzystnie komórką drożdży.
Korzystnie wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania pregnenolonu, w którym hoduje się drożdże, transformowane jednym lub więcej wektorem umożliwiającym koekspresję białka o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i P450SCC oraz, ewentualnie, ADR i ADX, zaś wolny lub estryfikowany pregnenolon ewentualnie izoluje się.
Korzystnie hoduje się transformowane drożdże koekspresjonujące białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, P450SCC, ADR i ADX. Korzystnie białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej jest białkiem A. thaliana delta-7Red, a szczep drożdży jest szczepem EC01/pCD63.
Przykłady wytwarzania pregnenolonu według wynalazku podane są dalej w części doświadczalnej.
Transformowane drożdże wykorzystane w sposobie wytwarzania pregnenolonu, patrz wyżej, mogą być, przykładowo, drożdżami kotransformowanymi wektorem ekspresyjnym, według wynalazku, zawierającym sekwencję DNA kodującą białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i wektorem ekspresyjnym cytochromu P450SCC i, ewentualnie, ADX i ADR. Wektory ekspresyjne cytochromu P450SCC i/lub ADX są znane zaś wykonanie jest opisane, przykładowo, w patencie europejskim EP 0340878 jak również dalej w części doświadczalnej.
Zastosowane transformowane drożdże mogą być również drożdżami, w których sekwencja DNA kodująca białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej jest zintegrowana w szczególnym locus genomu, przykładowo, w locus ADE2 i w których ergosterol nie jest już głównym sterolem w warunkach ekspresji delta-7 reduktazy. Uzyskane drożdże „zintegrowane” mogą być transformowane integracyjną kasetą ekspresji lub wektorami ekspresyjnymi zawierającymi sekwencję DNA kodującą cytochrom P450SCC i, ewentualnie, ADX i ADR.
Przykład konstrukcji szczepów drożdży produkujących pregnenolon lub jego ester octowy in vivo podany jest dalej w części doświadczalnej.
Przedmiotem wynalazku jest również transformowany szczep drożdży koekspresjonujący białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-stero!owej, P450SCC, ADR i ADX i gromadzące wolny lub estryfikowany pregnenolon, korzystnie powyższy szczep drożdży, w którym białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej jest białkiem A. thaliana delta7Red, a szczególnie szczep drożdży zwany EC01/pCD63, którego szczegółowa konstrukcja podana jest dalej w części doświadczalnej.
Wynalazek obejmuje również sekwencję ludzkiego DNA uzyskaną przez klonowanie sposobem określonym powyżej, zastosowaną jako sonda do diagnozowania wrodzonego niedoboru delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej. Niedobór delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej obejmuje przykładowo, niedobór reduktazy 7-dehydrocholesterolowej odpowiedzialnej za nienormalnie niski poziom cholesterolu w osoczu.
185 569
Wynalazek dotyczy również sposobu detekcji niedoboru delta-7 reduktazy delta-5,7sterolowej, który obejmuje inkubację próbki zawierającej ludzki genomowy DNA z sondą określoną powyżej w standardowych warunkach hybrydyzacji i ujawnienie przyłączenia lub nieprzyłączen^a sondy do genomowego DNA, przy czym brak przyłączenia lub jego zmniejszenie świadczy o wrodzonym niedoborze delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej.
Sposób według wynalazku umożliwia, przykładowo, wykrywanie wrodzonego niedoboru delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej prenatalnie lub w okresie noworodkowym jak również u pacjentów cierpiących na różne choroby, zaś w szczególności u pacjentów wykazujących kliniczne objawy zespołu RSH/SLO.
Załączone figury ilustrują pewne aspekty wynalazku:
Figura 1 przedstawia profil steroli całkowitych ekstrahowanych z klonu F22 opornego na nystatynę, uzyskanego przez przeglądanie biblioteki A. thaliana w drożdżach FY 1079. Analizę przeprowadzono przez RP-HPLC przy 205 nm lub 285 nm (Fig. 1A) albo przez AC w porównaniu z nietransformowanymi drożdżami FY 1079 (Fig. IB).
Figura 2 przedstawia mapę restrykcyjną fragmentu NotI plazmidu pF22 i strategię sekwencjonowania.
Figura 3 przedstawia sekwencję nukleotydową cDNA delta-7Red (Identyfikator Sekw. Nr 1) i odpowiadającąjej sekwencję aminokwasowi (Identyfikator Sekw. Nr 2).
Figura 4 pokazuje pomiar in vitro aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej frakcji mikrosomalnej FY1079 transformowanych indukowalnym wektorem ekspresyjnym „delta-7/V8”.
Analiza wykonywana jest przy użyciu AC i pokazuje transformację substratu, 7dehydrocholesterolu (RT=10.528) do cholesterolu (RT=15.887) w obecności endogennych steroli: 5,22 dien-3-olu (Ry=10.082); ergosterolu (RT= 17.249); ergosta-5-en- 3-olu (RT= 17.004).
Figura 5 pokazuje produkcję pregnenolonu in vitro przez restrykcję ergosta-5-en-3-olu (Fig. 5A); ergosta-5,24(28) dien-3-olu (Fig. 5B) albo ergosta-5,22-dien-3-olu (Fig. 5C) oczyszczonych z transformowanych drożdży ekspresjonujących delta-7Red, a następnie inkubowanych z P45()SCC, ADX i ADR. Analiza jest przeprowadzana przy użyciu AC z kontrolną restrykcją cholesterolu (linia ciągła).
Figura 0 pokazuje konstrukcję integracyjnego plazmidu pADdelta-7 umożliwiającego integrację cDNA kodującego delta-7Red (reduktazy delta-7 sterolowej) w locus ADE2.
Figura 7 przedstawia analizę z użyciem AC steroli całkowitych ekstrahowanych przez alkaliczne zmydlenie szczepu FY1079 i integrowanego szczepu ELR01 hodowanych w obecności galaktozy.
Figura 8 jest schematem konstrukcji wektora wahadłowego E. coli-S. cerevisiae V13 zawierającego pojedyncze miejsce SalI (Sa) w miejscu klonowania.
Figura 9 przedstawia etapy konstruowania plazmidów integracyjnych pCD02-1 i pCD02-2, które umożliwi aaą wprowadzenie kasety ekspresyjnej ADR w rejon między genami leu2 i spll delta.
MCS1 i MCS2: miejsca klonowania.
Figura 10 przedstawia strategię konstrukcji szczepu CDR01.
Figura 11 przedstawia etapy konstrukcji plazmidu ekspresyjnego pCD03 zawierającego dwie kasety ekspresyjne ADX i P450SCC.
Figura 12 przedstawia analizę AC steroli wyekstrahowanych z komórek (lizat komórkowy) lub pożywki hodowlanej (pożywka) wyizolowanych ze szczepu EC01/pCD03 po indukcji galaktozą przez 9 godzin (Figura 12a) albo 24 godziny (Figura 12b).
Figura 13 pokazuje budowę plazmidu pTA 7457
Figura 14 pokazuje budowę plazmidu pTA 7453
Figura 15 pokazuje budowę plazmidu pTA 10014
Figura 10 pokazuje budowę plazmidu pTA 10004
Figura 17 pokazuje budowę plazmidu pTA 10031
Figura 18 pokazuje budowę plazmidu pTA 10033
Poniższe przykłady ilustrują wynalazek, bez ograniczania go.
185 569
Przykład 1: Klonowanie cDNA kodującego delta-7 reduktazę delta-5,7-sterolową (delta-7Red) A. thaliana.
A - przeglądanie biblioteki ekspresyjnej A. thaliana w drożdżach.
Wyjściową biblioteką ekspresyjną cDNA jest biblioteka opisana przez M. Minet i in., (Plant J., 2, 417-422, 1992), którą wykonano zmRNA A. thaliana na etapie dwuliściennym kiełkowania i której CDNA otoczone miejscami Notl wprowadzono w miejsce BstXI kasety ekspresyjnej wektora wahadłowego E. coli-S. cerevisiae pFL61.
Kaseta zawiera sekwencje promotora i terminatora genu kinazy fosfoglicerynianowej (PGK). Początek replikacji drożdży uzyskany z sekwencji 2u i wskaźnik selekcyjny URA3 zapewniały propagację wektora w drożdżach. Propagacja wektora w E. coli pochodziła z plazmidu pUC 19.
Szczep drożdży FY 169=79 (Mata), będący szczepem izogenicznym szczepu S288C opisanego przez A. Thierry i in., (Yeast, 6, 521-534,1990), transformowano biblioteką cDNA przy użyciu metody z octanem litu opisanej przez D. Gietz i in. (Nuci. Acids Res., 20,1425,1992).
Komórki wysiano na syntetyczne podłoże SGI zawierające 7 g/l „yeast nitrogen base” (Difco), 1 g/l bactocasaminokwasów (Difco), 20 g/l glukozy, 20 mg/l tryptofanu i wolne od uracylu. Uzyskano 105 transformantów prototroficznych dla uracylu, zgrupowano i ponownie wysiano na to samo syntetyczne podłoże wolne od uracylu i zawierające 2 lub 5 mg/ml nystatyny w gęstości 5xl04 komórek na płytkę. Zbadano w ten sposób 106 komórek dla każdego stężenia nystatyny. Po inkubacji przez 3 dni w28°C zebrano około 100 klonów rosnących w stężeniu nystatyny 2 mg/ml w grupach po 5 klonów, które badano przez wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (zwaną dalej RP-HPLC) i uzyskano jeden klon, nazwany F22, przy stężeniu nystatyny 5mg/ml.
B - Analiza steroli gromadzonych w klonie F22
Stercie całkowite drożdży przygotowano według metody alkalicznego zmydlenia opisanej przez L. Parks i in., (Methods in Enzymol., 111, 333-346, 1985), a następnie analizowano metodą RP-HPLC i/lub przez chromatografię gazową (zwaną GC).
Pozostałość uzyskanych steroli rozpuszczono w mieszaninie etlnol-tetrlhydrofuranwoda (65:10:25 obj.), a następnie analizowano metodą przez RP-HPLC na kolumnie C18 ze związaną krzemionką f-my Applied Biosystems (100' 2.1 mm) przy przepływie 1 ml/min w55°C używając liniowego gradientu metanolu w wodzie (50% do 100% wciągu 18 min) i detekcji fotometrycznej przy 205 nm i 285 nm w porównaniu ze standardem ergosterolu, kampesterolu i cholesterolu.
Skład steroli badany był również przez GC na kolumnie kapilarnej SE-30 Alltech (30 m ' 0.32 mm) z helem jako nośnikiem i temperaturą 280°C i 310°Ć dla, odpowiednio, wtryskiwacza i detektora, z początkowym zwiększaniem temperatury od 110°C do 245°C z prędkością 45°C/min a następnie 3°C/min aż do uzyskania 280°C.
Analiza RP-HPLC (Fig. 1A) i analiza GC (Fig. IB) pokazują profile nagromadzonych steroli w klonie F22, uzyskanym jak to opisano wyżej, charakteryzujące się praktycznie całkowitym brakiem ergosterolu, stanowiącego główny sterol nietransformowanego szczepu FY 1679 i jego zastąpienie przez dwa główne sterole w podobnej ilości, nie wykazujące absorbcji przy 285 nm a więc nie posiadające podwójnego wiązania nienasyconego, według analizy RPHPLC.
Na figurze 1A, kampesterol (Sigma) (24-R-ergosta-5-en-3-ol) zawiera około 35% dihydrobrassicasterolu (24-S-e^go^l^i^^:5^^i^-^-3-c^ll^).
C - Klonowanie cDNA delta-7Red
Plazmidy pochodzące z klonu F22 amplifikowano w E. coli według metody opisanej przez J.N. Strathema i in., (Methods in Enzymol., 194, 319-329, 1991) następnie trawiono NotI. Uzyskano fragment wielkości około 600 par zasad (bp) i 1.6 kbp. Szczep FY 1679 transformowano każdym z wyżej opisanych fragmentów. Analizowano skład steroli w klonach transformowanych drożdży co pozwoliło na rozpoznanie plazmidu niosącego gen odpowiedzialny za zmodyfikowany profil steroli. Plazmid zidentyfikowano i nazwano pF22.
D - Określenie sekwencji cDNA delta-7Red.
185 569
Klonowano wstawkę cDNA pF22 w miejsce Notl wektora pUC9N uzyskanego z pUC9 (Pharmacia), w którym miejsce EcoRI w miejscu klonowania zastąpiono przez wprowadzenie miejsca restrykcyjnego Notl przy zachowaniu ramki odczytu genu LacZ. Określono mapę restrykcyjną (Fig. 2).
Fragmenty restrykcyjne posiadające zewnętrzne miejsca Notl i wewnętrzne miejsca EcoRI, PvuII lub Hindlll wklonowano do plazmidu pBluescript (Stratagene). Określono sekwencję nukleotydową metodą Sangera polimerazą DNA Seąuenase (zestaw Stratagene) na dwóch niciach przy użyciu pary starterów pUC9 pBluescript, T3 i T7 lub starterów opartych na domyślnej sekwencji nukleotydowej cDNA.
Kompilacja uzyskanych sekwencji dala sekwencję nukleotydową cDNA delta-7Red A. thaliana (Identyfikator Sekw. Nr 1) przedstawioną na Fig. 3. Obejmuje ona 1496 nukleotydów zakończonych sekwencją poliadenylacji. Posiada ona otwartą ramkę odczytu zaczynającą się start kodonem metioniny na nukleotydzie 76 i kończy się kodonem stop na nukleotydzie 1366. Tworzy to otwartą ramkę odczytu 1290 nukleotydów kodujących białko długości 430 aminokwasów. Region kodujący cDNA delta-7Red koduje białko delta-7Red, którego wywnioskowana sekwencja aminokwasowa (Identyfikator Sekw. Nr 2) pokazana jest w Fig. 3. Sekwencja białka obejmuje 430 aminokwasów i ma obliczoną masę cząsteczkową 49.286 kDa.
Próbkę szczepu DH5-1 E. coli zawierającego cDNA elta-7Red w wektorze pUC9N (oznaczonego delta7red/pUC9NcDNA) zdeponowano wCNCM dnia 10 lutego 1995 pod numerem 1-1535.
E - Określanie sekwencji zgodności Identyfikatora Sekw. Nr 3.
Przy użyciu skomputeryzowanego przeszukiwania baz danych sekwencji (Genbank i EMBL) wykazano, że sekwencja białka delta-7Red A. thaliana posiada pewne podobieństwa z innymi reduktazami sterolowymi, w szczególności reduktazą C-14 sterolową i C-24(28) sterolową S. cerevisiae opisanymi, odpowiednio, przez R.T. Lorentza i in. (DNA Celi Biol., 11, 685-692, 1992) i W. Chen i in. (Yeast, 7, 305-308, 1991) jak również z produktem genu sts 1+ S. pombe opisanym przez Shimanuki i in., (Mol. Biol. Celi, 3, 263-273, 1992) oraz reduktazą C-14 sterolową Neurospora crassa (Nr Χ77955 w bazie danych EMBL). Dodatkowo, białko delta-7Red wykazuje podobieństwo z 400 aminokwasami C-końcowmi receptora laminy B kury i z odpowiednim receptorem ludzkim opisanym przez H.J. Worman i in. (J. Celi Biol., 111, 1990) oraz E. Schuler i in. (J. Biol. Chem., 269,11312-11317,1994).
Określono zestawienia homologii sekwencji pomiędzy sekwencją aminokwasową Identyfikatora Sekw. Nr 2, wywnioskowaną z cDNA delta-7Red, uzyskanego w opisany powyżej sposób, i wspomnianymi trzema drożdżowymi reduktazami sterolowymi i dwoma receptorami laminy B, przez co zdefiniowano nową sekwencję zgodności posiadającą sekwencję aminokwasową (Identyfikator Sekw. Nr 3):
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr,
5 10 15 w której Xaa w pozycji 7 oznacza Trp albo Tyr, zaś Xaa w pozycji 12 oznacza His albo Lys, w celu wytworzenia oligonukleotydów, które mogą być zastosowane jako startery w amplifkacji, przez PCR, nowych sekwencji genomowego DNA łub cDNA kodujących białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej.
F - ekspresja białka delta-7Red w drożdżach.
a) konstrukcja wektora ekspresyjnego delta-7/V8 indukowalnego w drożdżach.
Przeprowadzono delecję regionów niekodujących cDNA pF22, przez amplifikację PCR z użyciem następujących specyficznych oligonukleotydów:
5' CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 3' (Identyfikator Sekw. Nr 4) i
5' CAGGGTACCT CAATAAATT CCCGGAATG 3' (Identyfikator Sekw. Nr 5), które zdefiniowano w celu wprowadzenia miejsca restrykcyjnego BamHI bezpośrednio powyżej kodonu start i miejsca restrykcyjnego KpnI bezpośrednio poniżej kodonu stop.
185 569 cDNA amplifikowano wychodząc z 1 ng plazmidu „delti7red/pUC9N cDNA” w obecności 2 jednostek polimerazy DNA PfU i 0.2 mM każdego powyższych starterów, stosując następujące warunki amplifikacji:
94°C, 10s; 52°C, 50s; 74°C, 90s; 33 cykle, używając zestawu do PCR Stratagene.
Uzyskano fragment wielkości około 1300 bp, który trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i KpnI po czym wprowadzono w miejsca BamHI i KpnI wektora wahadłowego E. coli/S. cerevisiae pYeDPl/8-2 (zwanego V8) opisanego przez C. Cullin i in. (Gene, 65, 203217, 1988). V8 niesie wskaźnik selekcyjny URA3 i zawiera kasetę ekspresji w drożdżach zawierającą promotor GALI 0/CYC 1 oraz sekwencję terminatorową genu PGK. Uzyskany w ten sposób wektor, zwany delta-7/V8, umożliwia ekspresję białka delta-7Red indukowaną przez galaktozę.
b) Produkcja białka delta-7Red.
Szczep drożdży FY 1679 (Mata) transformowano plazmidem delta-7/V8 uzyskanym powyżej, przy użyciu metody z octanem litu opisanej przez D. Gietz i in. (już cytowane).
Transformowane drożdże hodowano w 27°C w pożywce selektywnej SGI, opisanej powyżej, ale o zawartości glukozy 5 g/l, do uzyskania wysycenia gęstości komórkowej (0D600nm=12). Następnie hodowlę rozcieńczono przez dodanie objętości kompletnej pożywki YP (10 g/l w ekstrakcje drożdżowym (Difco) i 10 g/l bactopeptonu (Difco)), następnie dodano etanolu (1.5% obj.) jako źródła węgla. Następnie umożliwiono wzrost do uzyskania stężenia komórek rzędu przynajmniej 7xl07 komórek/ml, po czym indukowano ekspresję białka delta7Red przez dodanie galaktozy w stężeniu 20 g/l.
Indukcję przeprowadzono również w minimalnym podłożu selektywnym SLI, które odpowiadało pożywce SGI w której glukozę zastąpiono galaktozą (20 g/l), po uzyskaniu gęstości komórkowej 2x1(f komórek/ml.
c) Badanie enzymatyczne in vitro aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-stei^olowej.
Ekspresję białka delta-7Red ujawniono przez zastosowanie testu enzymatycznego opisanego przez M. Taton i in. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 181, 465-473, 1991) ale bez systemu regeneracji NADPH, używając preparatów mikrosomalnych lub cytozolowych indukowanych drożdży opisanych powyżej.
Frakcje komórkowe uzyskano przez rozerwanie mechaniczne indukowanych komórek i izolowanie frakcji przez ultrawirowanie według metody opisanej przez P. Urban i in. (Eur. J. Biochem., 222, 843-850, 1994). Komórki zebrano, po czym odpukano dwukrotnie buforem TE-KC1 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1 mM EDTA, 0,1 M KCl) i zawieszono w buforze do lizy 0.6 M TE-sorbitol. Dodano szklanych kulek o średnicy 0.45-0.5 mm (Braun) aż były widoczne nad powierzchnią zawiesiny komórkowej, po czym wytrząsano je przez 5 minut w 4°C. Zebrano lizat komórkowy z powierzchni a kulki szklane przepłukano trzykrotnie buforem do lizy. Lizat i popłuczyny połączono ze sobą i wirowano przy 20000 g przez 13 minut w 4°C by wyeliminować frakcję mito- coondrialną. Zebrany supernatant odwirowano przez godzinę przy 100000 g w4°C. Peletkę, która zawierała frakcję mikrosomalną i nadsącz zawierający frakcję cytozolową zebrano oddzielnie.
Frakcja mikrosomalna lub cytozolową inkubowana była przez 90 minut w37°C w buforze 100 mM Tris-HCI, pH 7.3, zawierającym 150 mmoli 7-dehydrocholesterolu jako substrat, zemulgowanego Tweenem 80 (1.5 g/l) w obecności 2 mM NADPH. Stercie ekstrahowano przez dodanie 3 objętości mieszaniny metanol-dichlorometan (50:50 obj.) i analizowano przez GC w porównaniu ze standardami.
Powstawanie cholesterolu (RT=15.887 min) z 7-dehydro-cholesterolu (RT= 16.528 min) pokazane jest na Fig. 4 z frakcją mikrosomalną. (3.5 mg/ml białka) uzyskaną w wyżej opisany sposób, z drożdży FY 1679 transformowanych wektorem delta-7/V8, indukowanych przez 3 godziny, których endogenne sterole mają wyższe czasy retencji (RT=16.682 min dla ergosta5-22-dieo-3-olu; RT=17.249 min dla ergosterolu i RT=17.664 min dla ergosta-5-en-3-olu).
Wyniki te pokazują, że białko delta-7Red z jednej strony jest ekspresjonowane w transformowanych drożdżach, zaś z drugiej strony posiada aktywność delta-7 reduktazy delta-5,7sterolowej.
185 569
Przykład 2: Redukcja in vivo endogennych steroli drożdży, nienasyconych w pozycji C-7.
Szczepy drożdży, których główne sterole mają podwójne wiązanie w pozycji C-5,7 transformowano wektorem delta-7/V8 uzyskanym w Przykładzie 1, a następnie hodowano i indukowano jak to pokazano w przykładzie 1. Sterole endogenne, których profil analizowano metodą GC, ekstrahowano i oczyszczano metodą RP-HPLC jak to opisano w przykładzie 1, używając kolumny preparatywnej C18 (100x4.6 mm) a następnie identyfikowano używając IR, UV, MS i NMR. Używano, odpowiednio, następujących trzech szczepów:
- szczepu FY 1679 opisanego w przykładzie 1;
- zmutowanego szczepu erg5, zwanego PLC 1051, charakteryzującego się niedoborem C-22 desaturazy sterolowej, który został skonstruowany przez krzyżowanie szczepu FY1679 i oryginalnego szczepu pol5 opisanego przez S.W. Molzahnai in. (J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972) i który gromadzi ergosta-5,7-dien-3-ol;
- podwójnie zmutowanego szczepu erg4,5, zwanego PLC 1451, charakteryzującego się niedoborem C-22 desaturazy sterolowej (erg5) i C-24(28) reduktazy sterolowej (erg4) uzyskanego przez krzyżowanie szczepu FY1679 ze szczepem pol5 opisanym przez S.W. Molzahna i in. (już cytowane) posiadającego nabytą, spontaniczną oporność na nystatynę podczas systematycznego przesiewania drożdży w poszukiwaniu mutantów sterolowych i który gromadzi ergosta-5,7,24(28)-trien-3-ol. Powstały szczep haploidalny niosący podwójną mutację erg4, erg5, rośnie w obecności galaktozy i niefermentowalnego substratu i jest auksotroficzny w stosunku do uracylu, tryptofanu i histydyny. Szczepy PLC 1051 i PLC 1451 zdeponowano w CNCM dnia 10 lutego 1995 pod, odpowiednio, numerami ^^1536 i 1-1537.
Główne zredukowane sterole zidentyfikowane w powyższych trzech szczepach pokazano w następującej tabeli:
Tabela
Szczep wyjściowy Wyjściowy główny sterol endogenny Główny endogenny sterol zredukowany w poz. C-7
FY 1679 ergosta-5,7,22-trien-3-ol ergosta-5-en-3-ol dihydrobnasydynosterol ergosta5,22-dien-3-ol (brasydynosterol)
erg5 PLC 1051 ergosta-5,7-dien-3-oI ergosta-5-en-3-ol
erg4, 5 PLC 1451 ergosta-5,7,24 (28) -trien-3-ol ergosta-5,24-dien-3-ol (ostreasterol)
Przyklad3: Produkcja pregnenolonu in vitro przez restrykcję endogennych steroli drożdży zredukowanych w pozycji C-7
Produkcję pregnenolonu przeprowadzono z użyciem testu restrykcji enzymatycznej łańcucha bocznego cholesterolu in vitro metodą opisaną przez Wada i in. (Arch. Biochem. Biophys., 290, 376-380, 1991), w którym 260 mM sterolu zredukowanego w pozycji C-7, uzyskanego w przykładzie 2, inkubowano w 150 ml 10 mM buforu fosforanowego, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.3% Tween 20 w obecności 140 nM reduktazy adrenodoksynowej, 1.16 mM adrenodoksyny i 0.68 mM cytochromu P.,50SCC pochodzenia wołowego uzyskanego z nadnerczy, przykładowo, metodą opisaną przez D.W. Seyberta i in., J. Biol. Chem., 254, 12088-12098, 1979.
Reakcję rozpoczęto przez dodanie 150 mM NADPH. Po inkubacji przez 80 minut w 37°C, reakcję zatrzymano przez dodanie objętości mieszaniny metanol-dichlorometan (50:50, obj.). Sterole ekstrahowano i badano za pomocą GC jak to opisano w przykładzie 1.
Figura 5 pokazuje, odpowiednio, że ergosta-5-en-3-ol (Fig. 5A), ergosta 5,24(28)-dien3-ol (Fig. 5B) czy ergosta- 5,22-dien-3-ol (Fig. 5C) jest substratem cytochromu P450SCC i prowadzi do powstania produktu posiadającego identyczną RT z pregnenolonem uzyskanym w tych samych warunkach przez restrykcję cholesterolu.
185 569
Uzyskane wyniki pokazują, że transformowane drożdże ekspresjonujące delta-7Red akumulują użyteczne sterole do bezpośredniego przetworzenia w pregnenolon, w teście utleniania biologicznego in vitro.
Przykład 4: Konstrukcja szczepów drożdży produkujących pregnenolon albo jego ester octowy in vivo.
A - Konstrukcja szczepu ELR01 zawierającego kasetę ekspresji delta-7Red A. thaliana integrowaną w locus ADE2 haploidalnego szczepu FY1679 o typie kojarzenia a (FY1679 Mata)
a) Konstrukcja plazmidu integracyjnego pADdelta-7 (pADA7):
Konstrukcję plazmidu pADD7 przeprowadzono jak to opisano na Fig. 6. Z plazmidu pASZ 11 (A. Stotz i in., Gene, 95, 91, 1990) wyizolowano fragment BgLII (2244 bp) zawierający gen ADE2 S. cerevisiae i wprowadzono do wektora pBluescriptll KS+ (Stratagene) w miejsce BamHI miejsca klonowania.
Uzyskany plazmid, nazwany pBS-ADE2, linearyzowano w pojedynczym miejscu Stul i defosforylowano. Fragment o wielkości ok. 2.44 kb zawierający promotor GAL/CYC1, fazę kodującą delta-7Red (7 reduktazę sterolową) i terminator PGK (tPGK) uzyskano z plazmidu delta-7/V8, uzyskanego w przykładzie 1F techniką. PCR przy użyciu następujących oligonukleotydów jako starterów:
5' GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 3' (Identyfikator Sekw. Nr 6) i
5' AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 3' (Identyfikator Sekw. Nr 7), które zdefiniowano tak by odpowiadały, odpowiednio, końcowi 3' tPGK i 3' genu URA3. Użyto: plazmidu delta-7/v8 jako matrycy (80 ng), powyższych oligonukleotydów' (0.5 mM każdy), naturalnej polimerazy DNA Pfii (1 jednostka w buforze polecanym przez Stratagene) i następujących warunków reakcji: 35 cykli; 1 min w 95°C; 5 sek w 95°C; 30 sek w 56°C; 4.5 min w 70°C). Amplifikowany fragment uzyskany w ten sposób klonowano tępymi końcami do wyżej wspomnianego linearyzowanego plazmidu pBS-ADE2 tworząc plazmid pADD7, w którym fragment NotI-Pstl, o wielkości około 4720 bp, zawierał gen AdE2 przerwany kasetą ekspresji delta-7Red.
b) Integracja chromosomalna w szczepie drożdży FY1679 Mata:
Fragment NotI-Pstl (4720 bp), wyizolowany z plazmidu pADD7 trawiony enzymami restrykcyjnymi NotI i PstI, wprowadzono do drożdży FY1679 Mata przez transformację z użyciem metody z octanem litu opisanej przez D. Gietz i in. (już cytowane).
Transformanty posiadające fragment zintegrowany drogą rekombinacji homologicznej, wybrano na podstawie ich oporności na nystatynę, który to fenotyp spowodowany był ekspresją delta-7Red, który zmieniał delta-5,7-sterole drożdży w delta-5 sterole.
Transformowane komórki inkubowano w 28°C przez 4 godziny w kompletnej pożywce YP opisanej w Przykładzie 1F zawierającej glukozę (20 g/l) i dodatek adeniny (20 mg/l). Zatężano je następnie, po czym wysiewano na minimalne podłoże agarowe SLI (1 g/l bactocasaminokwasów; 7 g/l „yeast nitrogen base”; 20 g/l galaktozy; 20 mg/l adeniny; 20g/l agaru) i inkubowano przez noc w 28°C w celu indukcji genu delta-7Red. Brak komplementacji uracylu pozwalał na ograniczenie wzrostu komórek. Klony wybierano, grupowano i wysiewano na płytkach na kompletnym podłożu YP zawierającym galaktozę (20 g/l), z dodatkiem adeniny (20 g/l) i w obecności zwiększających się stężeń nystatyny (0 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 5 mg/ml, 20 mg/ml). Czwartego dnia uzyskano około 20 klonów rosnących przy stężeniu nystatyny 5 mg/ml. Dwanaście z tych klonów hodowano na płytkach w minimalnej pożywce WO (7 g/l „yeast nitrogen base” bez aminokwasów, 20 g/l glukozy) wzbogaconej uracylem, leucyną, tryptofanem, histydyną i adeniną (po 20 mg/l każdego).
Auksotrofię adeniny, spowodowaną przerwaniem genu ADE2, potwierdzono przez obserwację braku wzrostu na minimalnym podłożu WO opisanym wyżej, wzbogaconym wyłącznie uracylem, leucyną tryptofanem, histydyną ale nie adeniną.
Obecność kasety ekspresji w genomie drożdży sprawdzono amplifikacją PCR z genomowego DNA uzyskanych klonów i z użyciem starterów o sekwencjach Identyfikatora Sekw. Nr 6 i Identyfikatora Sekw. Nr 7.
Działanie zintegrowanego genu delta-7Red potwierdzona została przez analizę GC składu steroli gromadzonych w drożdżach i ekstrahowanych przez alkaliczne zmydlanie, według
185 569 metody opisanej w przykładzie 1B zużyciem pięciometrowej kolumny kapilarnej SE30 (Alltech). Analiza wykazała zmodyfikowany profil zawartych steroli nasyconych w pozycji C-7, gdy klony hodowane były w obecności galaktozy. Uzyskany szczep nazwany eLR1, gromadził ergosta-5-en-3-ol i ergosta-5,22-dien-3-ol zamiast ergosta-5,7, 22-trien-3-olu (ergosterolu) , głównego sterolu wyjściowego szczepu FY 1079, jak to pokazano w Fig. 7.
Szczep ELR01, skonstruowany w ten sposób, ekspresjonuje gen delta-7Red, gdy jest hodowany w obecności galaktozy, z powodu kontroli transkrypcyjnej sprawowanej przez promotor AALIO/CYC. Jakkolwiek jednostka ekspresji delta-7Red ma ten sam kierunek transkrypcji co gen ADE2, nie stwierdza się ekspresji delta-7Red analizą składu steroli przez AC, gdy hodowlę prowadzi się w obecności glukozy, w wyniku represji promotora AALIO/CYC.
B - Konstrukcja szczepu CDR01 zawierającego kasetę ekspresji dla dojrzałej postaci wołowej reduktazy adrenodoksyny (ADRm) integrowanej pomiędzy loci LEU2 i SPL1 szczepu haploidalnego FY1079 o typie kojarzenia alfa (mat. alfa).
a) Konstrukcja wektora wahadłowego E. coli S. cerevisiae V13.
Wektor V13 odpowiada wektorowi V8 (C. Cullin i in., już cytowane) niosącego wskaźnik selekcyjny URA3 i kasetę ekspresji w drożdżach zawierającą promotor AALIO/CYC (pA/C) i do którego wprowadzono dodatkowo miejsce Sali (Sa) w miejsce klonowania, zgodnie ze schematem budowy podanym na Fig. 8.
Wektor V8 trawiono enzymami restrykcyjnymi HindIII i BamHI a uzyskany fragment HindIII-BamHI (1722 bp) zawierający gen URA3 i promotor AALIO/CYC (zwany dalej „uragal”) wklonowano pomiędzy odpowiednie miejsca wektora pUC18 (Pharmacia) trawionego enzymami restrykcyjnymi HindIII i BamHI.
Fragment „ura-gal” amplifikowano PCR z 30 ng uzyskanego plazmidu pUC18/„uragal” denaturowanego przez 30 sek w95°C stosując następujące warunki: 30 cykli; 5 sek w 80°C; 10 sek w 95°C; 40 sek w 38°C; 5 sek w 55°C i 2 min. w 74°C, 2 jednostki polimerazy DNA Taq (Boehringer) w buforze producenta i 1 mM każdego ze starterów posiadających następujące sekwencje:
5' AAAAATCCAT AATCAAClyA AyTTAAyATA yATA'ΓTTAyA 'TTTACA 3' (Identyfikator Sekw. Nr 8) i
5' ATAAAACAAC AACCAAT 3' (Identyfikator Sekw. Nr 9)
Starter o Identyfikatorze Sekw. Nr 8 zawiera miejsce BamHI AAATCC identyczne z miejscem we fragmencie „ura-gal”, 3 kolejne nukleotydy w miejscu BamHI nie hybrydyzujące z matrycą miejsce Sali ATCAAC i sekwencję homologiczną z promotorem AaLiO/CYC. Starter o Identyfikatorze Sekw. Nr 9 odpowiada sekwencji poprzedzającej miejsce HindIII miejsca klonowania wpUC18. Fragment Hindlll-BamHI, wielkości 1722 bp, uzyskany po amplifikacji trawiono Xhol i BamHI uwalniając fragment wielkości 254 bp, zawierający promotor AALIO/CYC (pA/C), który wklonowano do wektora V8 trawionego enzymami restrykcyjnymi BamHI i Xhol.
Powstały wektor V13 zawierał miejsca restrykcyjne umożliwiające łatwe wklonowanie cDNA kodujących dojrzałą wołową reduktazę adrenodoksynową (ADRm), dojrzałą wołową adrenodoksynę (ADXm) oraz wołowy cytochrom P45,SCC.
Wychodząc z wektora V13, przygotowano wektor Y13-ADR, wektor V13-ADX i V13SCC10 w poniższy sposób:
a) Konstrukcja wektora V13-ADR.
Fragment Sall-KpnI wielkości 1478 bp zawierający cDNA kodujący ADRm wyizolowano z plazmidu pABADR-2 opisanego w przykładzie 25 europejskiego zgłoszenia patentowego EP 340878 i wklonowano do odpowiedniego miejsca wektora V13 tworząc wektor V13-ADRm.
b) Konstrukcja wektora V13-ADX.
Fragment SalI-BamHI wielkości 390 bp zawierający cDNA kodujący ADXm wyizolowano z plazmidu pABADX-1 opisanego w przykładzie 23 europejskiego zgłoszenia patentowego EP 340878 i wklonowano do odpowiedniego miejsca wektora V13 tworząc wektor V13-ADXm.
c) Konstrukcja wektora V13-SCC10.
185 569
Fragment SalI-EcoRI wielkości 1554 bp zawierający cDNA kodujący ?450SCC wyizolowano z plazmidu pGBSCC-10 opisanego w przykładzie 6 europejskiego zgłoszenia patentowego EP 340878 i wklonowano do odpowiedniego miejsca wektora V13 tworząc wektor
V13- SCC10.
b) Konstrnkcja plazmidów integracyjnych pCD62-1 i pCD62-2:
Konstrukcję plazmidów pCD62-1 i pCD62-2 przeprowadzono, jak to opisano na Fig. 9.
a) Konstrukcja plazmidu pFL26CD
Do plazmidu pFL26 (N. Bonneaud i in., Yeast, 7, 609-615, 1991) wprowadzono miejsce NotI, w rejonie między genowym, rozdzielającym gen leu2 od końca 5' genu spli (zwanego spll) (C. Kolman i in., J. Bacteriol., 175, 1433, 1993) w oparciu o następującą metodę:
Dwa fragmenty DNA wielkości 704 bp i 347 bp obejmujące koniec 5' leu2 i koniec 3' Spll wytworzono przez PCR zużyciem starterów posiadających następującą sekwencję nukleotydową:
5' TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 3' (Identyfikator Sekw. Nr 10) i
5' GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 3' (Identyfikator Sekw. Nr 11) do amplifikacji fragmentu 704 bp, i sekwencję nukleotydową
5' CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 3' (Identyfikator Sekw. Nr 12) i
5' TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 3' (Identyfikator Sekw. Nr 13) do amplifikacji fragmentu 347 bp.
Startery o Identyfikatorze Sekw. Nr 11 i Identyfikatorze Sekw. Nr 12 posiadają sekwencję GGCGGCCG odpowiadającą miejscu NotI i w której 3 zasady nie są homologiczne do matrycy. Starter o Identyfikatorze Sekw. Nr . 10 jest homologiczny z sekwencją położoną 536 bp powyżej stop kodonu leu2, zaś starter o Identyfikatorze Sekw. Nr 13 z sekwencją położoną 194 bp powyżej spllD.
Fragmenty 704 bp i 347 bp najpierw amplifikowano przez PCR używając plazmidu pFL26 jako matrycy i polimerazy DNA Pfu jako enzymu w standardowych warunkach opisanych przez producenta (Stratagene).
Dwa uzyskane amplifikowane fragmenty pokrywały ponad 20 bp na końcach generowanych przez startery o Identyfikatorze Sekw. Nr 11 (fragment 704 bp) i starter o Identyfikatorze Sek.w. Nr 12 (fragment 347 bp) począwszy od końca 5'; te 20 bp odpowiadało pierwszym 20 nukleotydom każdego ze starterów.
Produkt powstały przez parowanie fragmentów DNA wielkości 704 bp (1 ng) i 347 (2 ng) amplifikowano przy użyciu startera o Identyfikatorze Sekw. Nr 10 i Identyfikatorze Sekw. Nr 13 w następujących warunkach: 30 cykli; 10 sek w 95°C; 5 sek w 60°C, 1 min w 45°C, 5 sek w 65°C i 2 min w 72°C, a następnie cykl 7 min w 72°C; 50 pmoli każdego ze starterów i 1 jednostka polimerazy DNA Pfu w 50 ml buforu do reakcji (Stratagene). Uzyskano amplifikowany fragment zawierający miejsce restrykcyjne NotI. Fragment ten trawiono enzymami BstXI iNsiI uzyskując fragment 920 bp, zawierający miejsce NotI, który wprowadzono w miejsce wyjściowego fragmentu BstXI-NsiI pFL26, uzyskując plazmid pFL26CD, którego mapa pokazana jest na Fig. 9a.
b) Konstrukcja plazmidu pCD60.
- Przyyotowanie plaamidd pDP10036:
Z plazmidu V13-ADX wyizolowano fragment SllI-BamHI wielkości 390 bp obejmujący cDNA kodujący dojrzałą wołową adrenodoksynę (ADXm), następnie wklonowano w miejsca SalI-BglII miejsca klonowania plazmidu pTG10033, otoczone przez indukowany promotor GAL10/CYCl i terminator ter PGK. Przygotowano plazmid pTG10033, którego mapa pokazana jest na Fig. 18 i który odpowiada wektorowi ekspresyjnemu pTG10031 (Fig. 17), zawierającemu promotor CYCl i terminator terPGK, w którym promotor CYCl zastąpiono promotorem GAL10/CYC1, przygotowano według sposobu opisanego dalej.
Uzyskany w ten sposób plazmid, nazwany pDP 1(0034, zawiera kasetę ekspresji ADX, tzn. genu kodującego ADXm pod kontrolą transkrypcyjną GAL13/CYCi i terPGK. Dalej, określenie „kaseta ekspresji” będzie używane dla jakiegokolwiek genu w zależności transkrypcyjnej od GAL13/CYCl i terPGK.
185 569
Fragment HINDIII wielkości 3593 bp obejmujący wskaźnik selekcyjny URA3 i kasetę ekspresji ADR wyizolowano z plazmidu V13-ADR trawionego enzymem restrykcyjnym Hindlll, po czym wprowadzono do odpowiedniego miejsca plazmidu pDP 10034 trawionego tym samym enzymem. Uzyskany plazmid, nazwany pDP 10036 zawierał kasety ekspresji ADX i ADR, rozdzielone od siebie markerem URA3 (Fig. 9b).
- Przyyotowanie plazmidu pCD60:
Fragment AflUI-AccI wielkości 2770 bp obejmujący kasetę ADR wyizolowano przez częściowe trawienie plazmidu pDP 10036 enzymami restrykcyjnymi AflIII i AccI, tępe końce wytworzono przez traktowanie fragmentem Klenowa polimerazy I DNA i wklonowano po ΙϊΟζ^ϊ między tępe końce w miejscu Smal plazmidu pBlueScript KS+ (Strategone). W uzyskanym plazmidzie, nazwanym pCD60, kaseta ekspresji ADR otoczona jest z jednej strony miejscem NotI położonym 209 bp powyżej miejsca lioacji AfIIII/SmaI i pochodzącym z klonowanego fragmentu, zaś z drugiej pochodzącym z miejsca klonowania (MCS1) pBluescript KS+ (Fig. 9b).
c) Konstrukcja plazmidów pCD62-1 i pCD62-2:
Fragment NotI wielkości 2558 bp, wyizolowany z plazmidu pCD60 trawionego enzymem restrykcyjnym NotI wklonowano w pojedyncze miejsce NotI plazmidu pFL26CD. Zależnie od kierunku wprowadzenia fragmentu uzyskano dwa plazmidy, nazwane pCD62-1 i pCD62-2 (Fig. 9c).
W plazmidzie pCD62-1 kaseta ekspresji skierowana jest w kierunku transkrypcji genu leu2, natomiast w plazmidzie pCD62-2 ten kierunek jest odwrócony.
Plazmid pCD62-1 zachowano do dalszych konstrukcji.
c) integracja chromosomaina w szczepie drożdży FY1679 (mat. alfa):
Plazmid pCD62-1 zawiera region homologiczny z locus chromosomalnym szczepu
FY1679. Regiony te odpowiadają, odpowiednio, fragmentom BglII-Clal wielkości 1060 bp (A), EcoRI-NotI wielkości 707 bp (B) i NotI-BglII wielkości 602 bp (C) wskazanym na Fig. 10.
Wycięto region odpowiadający fragmentowi ClaI-EcoRI wielkości 486 bp plazmidu pCD62-1 szczepu FY1679 powodując auksotrofię tego szczepu względem leucyny (szczep LEU2) (R.S. Sikorski i in., Genetics, 122, 19,1989) .
Plazmid pCD62-1 linearyzowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym Xbal, którego miejsce restrykcyjne położone było poza regionami homologicznymi, po czym wprowadzono przez transformację do szczepu FY1679 (Mat. alfa) przy użyciu techniki z octanem litu (D. Gietz i in., już cytowane).
Zdolność komórek drożdży do naprawy DNA („gap repair”) i selekcja rekombinantów posiadających fenotyp LEU2+ pozwoliły na wybranie przede wszystkim dwóch typów rekombinantów: pierwszy typ uzyskano po rekombinacji homologicznej na poziomie fragmentów A i B; drugi typ uzyskano po rekombinacji homologicznej na poziomie fragmentów A i C. Tylko ten drugi typ rekombinacji umożliwił integrację kasety ekspresji ADR dodatkowo do przywrócenia fenotypu LEU2+.
W ceiu wybrania drugiego typu klonów, przeprowadzono przesiewanie przy użyciu PCR zużyciem startera o Identyfikatorze Sekw. Nr 10, patrz wyżej, i startera posiadającego następującą sekwencję nukleotydową:
5' TACATTAGGT CCTTTGTAGC 3' (Identyfikator Sekw. Nr 14) aby potwierdzić zarówno obecność jak i poprawną lokalizację kasety ekspresji ADR w genomie szczepu FY1679 (Mat. alfa).
W przesiewaniu, starter o Identyfikatorze Sekw. Nr 14 łączył się wyłącznie z sekwencją kodującą ADRm, zaś starter o Identyfikatorze Sekw. Nr 10 łączył się z sekwencją chromosomalną(Fig. 10).
Reakcję amplifikacji przeprowadzono przy użyciu, jako matrycy, genomowego DNA (20 ng) izolowanego ze szczepu FY1679 (Mat. alfa) (c. Hoffman i in., Gene, 57, 267, 1987), polimerazy DNA Taq (1U, Boehringer), 50 pmoli każdego ze starterów i 30 cykli PCR (10 sek w 95°C; 1 min w 55°C i 3 min w 72°C) w standardowych warunkach określonych przez producenta.
185 569
Amplifikacja doprowadziła do izolacji odpowiednich fragmentów wielkości 2.9 kb w przypadku, gdy kaseta ekspresji była zintegrowana. W przypadku przeciwnym amplifikacji nie stwierdzano.
Wybrany w ten sposób szczep FY1679 (Mat. alfa) zawierał zintegrowaną kasetę ekspresji ADR i nazwany został CDR01.
Ekspresja ADR w tym szczepie ujawniona została we frakcjach cytozolowych przygotowanych według protokołu opisanego w przykładzie 1F, przez immunodetekcję białka rozpoznawanego przez przeciwciała anty-ADR.
Funkcjonalność ADR ekspresjonowanego wszczepie CDR01 potwierdzona została w teście restrykcji enzymatycznej łańcucha bocznego cholesterolu in vitro, opisanym w przykładzie 3 i w którym oczyszczony ADR (0.28 pmola) zastąpiono przez frakcję cytozolową szczepu CDR01 zawieraj ącą 100 mg białka całkowitego. Obserwowano tempo biokonwersji cholesterolu do pregnenolonu rzędu 25% w stosunku do obserwowanego w przy-padku oczyszczonego ADR.
C - Konstrukcja szczepu diploidalnego EC01 koekspresjonującego delta-7Red A. thaliana i ADRm.
Diploidalny szczep EC01 uzyskano przez krzyżowanie szczepów haploidalnych CDR01 i ELR01 uzyskanych w wyżej sposób, protokołu opisanego przez G. Sj^i^agu^ i in. (Methods in Enzymology, 194,77, 1991):
Pierwsza selekcja na minimalnym podłożu WO opisanym powyżej, wzbogaconym o uracyl, tryptofan i histydy nę (po 20 mg/1 każdego) ale pozbawionym leucyny umożliwiła izolację szczepów diploidalnych LEU2+ (których prototroficzny charakter wskazywał na obecność kasety ekspresji ADR). Klony te były następnie badane na ich oporność na nystatynę w stężeniu 5 mg/ml, (których oporność wskazywała obecność kasety ekspresji delta-7Red) na stałym podłożu syntetycznym SLI-agar, opisanym wyżej.
W ten arbitralny sposób wyizolowano szczep oporny na nystatynę, nazwany EC01.
D - konstrukcja szczepu EC01/pCD63 produkującego pregnenolon i 3-octan pregnenolonu. a) Konstrukcja plazmidu ekspresyjnego pCD63.
Konstrukcję plazmidu pCD63 przeprowadzono w sposób opisany na Fig. 11.
Z plazmidu pDP 10036, wykonanego jak to opisano wyżej i trawionego enzymem restrykcyjnym NotI, wyizolowano fragment NotI wielkości 4961 bp, zawierający kasetę ekspresji aDx, wskaźnik selekcyjny URA3 i kasetę ekspresji ADR, a następnie wklonowano w miejsce NotI miejsca klonowania plazmidu pFL45L (N. Bonneaud i in., Yeast, 7, 609, 1991). Wektor otrzymany w ten sposób pokazano na Fig. 11.
Z jednej strony, plazmid pDP10037 linearyzowano przez trawienie enzymem Thtl l lI, którego miejsce restrykcyjne znajduje się w genie kodującym ADRm.
Z drugiej strony, z plazmidu V13-SCC10, otrzymanego uprzednio i trawionego enzymami restrykcyjnymi PvuII i EcoRI, oczyszczono fragment PvuII-EcoRI wielkości 3476 bp, zawierający kasetę ekspresji P.t50SCC i koniec 5' markera URA3.
Uzyskane dwa liniowe DNA zawierały regiony homologiczne odpowiadające, z jednej strony, końcowi 5' genu URA3 i GAL10/CYC1, zaś z drugiej strony, terPGK jak to pokazano na Fig. 11 a.
Te dwa fragmenty wprowadzono do szczepu FY1679 (Mata) drożdży przez kotransformację przy użyciu metody z octanem litu (D. Gietz, już cytowane).
Selekcja rekombinantów prototroficznych w stosunku do uracylu itryptofanu (URA3+ RTP1+) umożliwiła izolację klonów, w których przerwanie podwójnej nici przez trawienie enzymem Thtl 1 lI zostało zreperowane w wyniku integracji kasety ekspresji P45SCC rekombinacją homologiczną
Selekcję rekombinantów (URA3+ RTPT) przeprowadzono na pożywce minimalnej WO wzbogaconej w leucynę, histydynę i leucynę (po 20 mg/l każdego) ale pozbawionej uracylu i tryptofanu. Wychodząc z 50 zebranych klonów ekstrahowano całkowite DNA metodą opisaną przez C. Hoffmana i in. (gene, 57, 267, 1987), po czym wprowadzono przez elektroporację do szczepu E. coli XL1-Blue (Stratagene). Klony transformowane plazmidem wytworzonym przez „gap repair” wybrano na bogatym podłożu LB (trypton 1 %, ekstrakt drożdżowy
185 569
0,5% i NaCl 1%) zawierającym 50 mg/ml ampicyliny. Wychodząc z jednego z wybranych klonów, wyekstrahowano plazmid, metodą opisaną przez J. Sambrook i in., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, nazwany pCD63. Uzyskany plazmid pCD63 zawierał kasety ekspresji ADX i P4J0SCC rozdzielone przez wskaźnik selekcji URA3, jak to pokazano na Fig. 1lb.
b) Transformacja szczepu EC01 plazmidem pCD63.
Plazmid pCD63 wprowadzono do szczepu EC01 przez transformację metodą z octanem litu (D. Gietz i n., już cytowane). Transformowane drożdże hodowano na podłożu minimalnym WO opisanym uprzednio, wolnym od uracylu, tryptofanu, adeniny i leucyny ale wzbogaconym w histydynę (20 mg/l).
W ten sposób wyizolowano szczep nazwany EC01/pCD63. Próbkę tego szczepu, pod nazwą EC01/pCD63, zdeponowano w CNCM dnia 10 lutego 1995 pod numerem 1-1538.
c) Produkcja in vivo pregnenolonu i 3-octanu pregnenolonu.
Szczep EC01/pCD63 hodowano w 28°C w warunkach tlenowych (130 r/min) w 3 litrowym naczyniu Erlenmeyera do uzyskania stacjonarnej fazy wzrostu (OD600„m=12 do 13) w pożywce selektywnej SGI opisanej w przykładzie 1A o stężeniu glukozy 5 g/l. Hodowlę rozcieńczono przez dodanie objętości kompletnej pożywki YP opisanej powyżej, i dodanie etanolu (0,5% obj.) jako źródła węgla. Gdy ponownie uzyskano stacjonarną fazę wzrostu (OD600n,=12 do 13) do hodowli dodano galaktozy (20 g/l) w postaci stężonego roztworu (500 g/l) by równocześnie indukować ekspresję genów kodujących ADXm, ADRm, P450SCC i delta-7Red, które znajdowały się pod kontrolą promotora GAL 10/CYC 1.
Koekspresja czterech genów ujawniona została przez analizę steroli gromadzonych w komórkach i nadsączu z hodowli według następujących metod:
Próbki po 50 ml hodowli pobrano po 9 i 24 godzinach od indukcji. Obie próbki odwirowano (4000 g, 10 min, 4°C) by oddzielić komórki od pożywki hodowlanej.
Z jednej strony komórki poddano lizie przez mechaniczne rozerwanie w obecności szklanych kulek według metody opisanej w przykładzie 1F. Wychodząc od otrzymanego w ten sposób lizatu, ekstrahowano sterole wewnątrzkomórkowe przez dodanie objętości heksanu.
Z drugiej strony, sterole obecne w pożywce hodowlanej były ekstrahowane bezpośrednio przez dodanie objętości heksanu.
Skład ekstrahowanych steroli analizowano przez GC jak to opisano w przykładzie 1, w porównaniu z produktami standardowymi.
Wyniki uzyskane po 9 i po 24 godzinach od indukcji przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 12a i 12b.
Po 9 godzinach od indukcji, Fig. 12a pokazuje:
- W lizacie komórkowym obecność głównego związku mającego identyczny czas retencji do standardu octanu pregnenolonu (RT=11,8 min), podczas gdy obecny jest jedynie słaby pik przy czasie retencji dla pregnenolonu (RT= 9,9 min) Wykryto małe ilości steroli endogennych drożdży, zredukowanych w pozycji C-7 (ergosta-5-en-3-ol i ergosta-5,22-dien-3-ol) odpowiednio przy czasie retencji RT=18 min i RT= 17 minut. Alkaliczne zmydlanie lizatu komórkowego przed badaniem prowadzi do migrowania głównego związku wraz z pregnenolonem. Umożliwia to potwierdzenie, że gromadzony związek mający czas retencji RT=11,8 min odpowiada octanowi pregnenolonu.
- brak w pożywce hodowlanej pregnenolonu i jego octanu.
Po 24 godzinach indukcji Fig. 12b pokazuje:
- w lizacie komórkowym, obecność małych ilości pregnenolonu (RT=10,2 min) i octanu pregnenolonu (RT=12 minut) jak również zredukowanych steroli endogennych drożdży (RT=17 min i RT= 18 min). Cholesterol (RT=16,2 min) dodano przed ekstrakcją jak wewnętrzny standard.
- w pożywce hodowlanej, znaczna obecność octanu pregnenolonu i małe ilości pregnenolonu.
Równolegle przeprowadzone doświadczenie z użyciem szczepu EC01 transformowanego plazmidem kontrolnym, jak pFL45L, wymienianym uprzednio, nie wykazało piku odpowiadającego wolnemu pregoeoolooowi czy w postaci octanu.
185 569
Identyfikacja steroli przeprowadzona tym sposobem pokazuje, że drożdże szczepu
EC01/pCD63 gromadzą pregnenolon i jego octan pod nieobecność jakiegokolwiek źródła steroli, po indukcji galaktozą z największą produkcją w 9 godzin po indukcji.
Wyniki te pokazują z jednej strony wydajną mobilizację steroli endogennych redukowanych w pozycji C-7 przez szczep EC01, zaś z drugiej strony najwyższą efektywność wiązania reakcji restrykcji łańcucha bocznego endogennych steroli.
Szczepy Locus Integracji Integrowany Gen Plazmid Marker Plazmidu Gen (y) na Plazmidzie Wskaźniki Selekcji
CDR01 (Mata) międzygenowo LEU2-SPL1 ADRm - - - HIS3,URA3, TRP1
ELR01 (Mata) ADE2 deIta-7Red - - - ADE2.HIS3, LEU2, URA3, TRP1
EC01 (diploidalny) międzygenowo LEU2-SPL1 + ADE2 ADRm delta7Red HIS3, URA3, TRP1
EC01/pCD63 międzygenowo LEU2-SPL1 + ADE2 ADRm delta7Red pCD63 URA3, TRP1 ADXmP45OSCC HIS3
Wykonanie przykładu 4: konstrukcja plazmidu pTG10033
1. Pochodna pUC19 posiadająca nowe miejsce klonowania:
Wektor do klonowania M13mp19 (C. Yanish-Peron i in., Gene, 33, 103, 1985) mutagenizowano przy użyciu następującego oligonukleotydu:
5' GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 3' (Identyfikator Sekw. Nr 15 w ceiu wprowadzenia miejsca NotI do sekwencji okrojonego genu lacl i otrzymania plazmidu M13TG724.
„Polilinker” zawierający miejsca EcoRI, SnaBI i NotI wprowadzono w miejsce EcoRI plazmidu M13TG724 przy użyciu następujących oligonukleotydów:
5' AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 3' (Identyfikator Sekw. Nr 16) i
5' AATTCATACG TACGCGGCCG C 3' (Identyfikator Sekw. Nr 17) w ceiu otrzymania plazmidu M13TG7244, w którym obserwowano modyfikacje wstawki podczas etapu amplifikacji. Wstawka plazmidu M13TG7244 posiadała następującą sekwencję nukleotydową:
GAATTCATACGTACGCGGCCGCAATTGCGGCCGGTACGTATAATTCzl CTGGC CGT, w której miejsca EcoRI, SnaBI i Sstl zaznaczono podkreśleniem, zaś sekwencja lacZ pUC19 zaznaczona jest kursywą.
Po trawieniu plazmidu M13TG7244 enzymami restrykcyjnymi EcoRI i SstI, wprowadzono „polilinker”, zawierający miejsca MluI i Avrll, przy użyciu następujących oligonukleotydów:
5' CAACGCGTCC TAGG 3' (Identyfikator Sekw. Nr 18) i
5' AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 3' (Identyfikator Sekw. Nr 19).
Po trawieniu enzymem PvuII, uzyskany fragment PvuII wklonowano do pUC19 (C. Yanish-Peron i in., już cytowane) uzyskując plazmid pTG7457 (Fig. 13).
2. Klonowanie terminatora PGK:
pUC19 trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i EcoRI i wprowadzono nowy „polilinker” BamHI Sstl przy użyciu następujących oligonukleotydów:
5' GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 3' (Identyfikator Sekw. Nr20),
5' AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 3' (Identyfikator Sekw. Nr 21),
185 569
5' CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 3' (Identyfikator Sekw.
Nr 22 ) i
5' AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 3’ (Identyfikator Sekw. Nr 23).
W ten sposób uzyskano plazmid pTG7453 (Fig. 14), który następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i Sstl. Miejsca w „polilinkerze” pomiędzy BamHI i SstI wprowadzono do pochodnej plazmidu pTG7457, uzyskanego w opisany wyżej sposób. Uzyskany nowy plazmid zawierał miejsca PvuII, HindIII, BamHI, EcoRI, XbaI, Smal, BglII, Sstl (=SacI), MluI, Avrll, EcoRI, SnaBI, NotI, SnaBI i PvuI.
Ten nowy plazmid trawiono enzymami restrykcyjnymi BglII i HindIII, po czym fragment BglII-HindlII zawierający promotor PGK (R.A. Hitzeman i in., Nucleic Acids Res., 10, 7791, 1982; G. Loison i in., Yeast, 5 497, 1989) wprowadzono we wspomniane miejsca tworząc plazmid pTG10014 (Fig. 15).
3. Klonowanie promotorów:
a) Promotor CYCl.
Wprowadzono miejsca „polilinkera” pomiędzy BamHI i Sstl plazmidu pTG7453 do pochodnej plazmidu pTG7457 opisanego wyżej. Uzyskany nowy plazmid trawiono enzymem restrykcyjnym SnaBI, po czym wprowadzono fragment Rsal-Dral wielkości 456 bp plazmidu pEMBL8 (L. Dente i in., Nucleic Acids Res., 11, 1645, 1983) zawierający początek replikacji faga f 1, tworząc plazmid pTG7503.
Do plazmidu pTG7503, trawionego enzymami restrykcyjnymi HindIII i BamHI, wklonowano fragment BamHI-HindIII, wielkości 0,78 kb, plazmidu pGBSCC-9, wytworzonego w przykładzie 6 Zgłoszenia Patentu Europejskiego 0340378, zawierającego promotor CYCl 5. cerevisiae, „polilinker” i terminator laktazy K. lactis, tworząc plazmid pTG10004 (Fig. 16).
Miejsca XhoI i MluI promotora CYCl wyeliminowano ukierunkowaną mutagenezą podwójnej nici DNA plazmidu pTG10004 przy użyciu następującego oligonuklerotydu:
5’ GCGGATCTGC TCGAATATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 3' (Identyfikator Sekw. Nr 24).
Uzyskany w ten sposób plazmid pTG 10005 trawiono enzymami restrykcyjnymi Sali i Xhol a następnie wprowadzono miejsce MluI przy użyciu następujących oligonukleotydów:
5' TCGACGGACG CGTGG 3' (Identyfikator Sekw. Nr 25) i
5' TCGACCACGC GTCC 3' (Identyfikator Sekw. Nr 26) tworząc plazmid pTG10006.
b) Promotor GAL/CYC1.
Plazmid pYeDPl/8-2 (C. Cullin i in., Gene, 203, 1988) otworzono enzymem restrykcyjnym Xhol. Utworzone lepkie końce wypełniono przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA po czym religowano plazmid. Uzyskany w ten sposób plazmid pTG10010, w którym promotor GALI0/CYCl nie zawierał już miejsca restrykcyjnego XhoI, użyto jako matrycy do amplifikacji DNA.
4. Konstrukcja wektora ekspresyjnego pTG10031.
Pozostałą część sekwencji kodującej lacZ wyeliminowano w plazmidzie pTG7503 przez ukierunkowaną mutagenezę przy użyciu następującego oligonukleotydu:
5’ TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 3' (Identyfikator Sekw. Nr 27) tworząc plazmid pTG7549.
Promotor lacZ, obecny w plazmidzie pTG7549, usunięto przy użyciu następujących oligonukleotydów:
5' GGCCGCAAAA CCAAA 3’ (Identyfikator Sekw. Nr 28) i
5' AGCTTTTGGT TTTGC 3' (Identyfikator Sekw. Nr 29), które wprowadzono do plazmidu uprzednio trawionego enzymami restrykcyjnymi NotI i HindIII, i które przywróciły dwa miejsca tworząc plazmid pTG7553.
Fragment BamHI-MluI zawierający promotor CYCl uzyskano z plazmidu pTG10006 trawionego enzymami restrykcyjnymi BamHI i Mlul, zaś fragment MluI-HindlU zawierający promotor PGK wyizolowano z plazmidu pTG10015 przez trawienie enzymami restrykcyjnymi Mlul i HindIII. Te dwa fragmenty ligowano, zaś uzyskany produkt Iigacji wprowadzono do plazmidu pTG7553 trawionego uprzednio enzymami restrykcyjnymi Mlul i HindIII.
Poniższy oligonukleotyd:
185 569
5' AATCyAyCAA TCCAACCACA 3' (Identyfikator Sekw. Nr 30) hybrydyzowany z następującym oligonukleotydem:
5' CACOCACAAC CACATCAATA 3' (Identyfikator Sekw. Nr 31) stanowiąc „linker” BamHI-MluI zawierający miejsca ClaI i NotI, dodano i ligowano tworząc wektor ekspresyjny pTA10031 (Fig. 17).
Fragment amplifikowany przez PCR, uzyskany w wyżej opisany sposób z plazmidu pYeDP 1/8-2 trawiono enzymami restrykcyjnymi ClaI i SalI, po czym wprowadzono do plazmidu pTA10031 trawionego uprzednio tymi samymi enzymami, tworząc plazmid pTA10033 (Fig. 18).
185 569
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OAÓLNE (i) ZAŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: Roussel UCLAF (b) ULICA: 102, Route de Noisy (c) MIASTO: Romainville (E) KRAJ: Francja (F) KOD POCZTOWY: 93230 (A) TELEON: 49914991 (H) TELEFAX: 49914010 (ii) Tytuł WYNALAZKU: Kwas nukleinowy kodujący białko A. thaliana, posiadające aktywność delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, białko delta7-Red, sposób wytwarzania, białko, przeciwciało, sposób zastosowania, komórki gospodarza stransformowane wektorem.
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 31 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) RODZAJ NOŚNIKA: : Dyskietaa (B) KOMPUTER: Kompttybllny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OhROARAMOWANIE: Patentln Release #1.0;.Version # 1.30 (EPO) (vi) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEAO ZAŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: FR 9501723 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 5 J lutego 1995 (vi) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEJ ZAŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA : FR 9506517 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 1 czerwcu 1995 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ : 1496 pal zaaad (B) ^^OD^z^/JJ : kwai η^εΐικ^γ (C) NICIOWOŚĆ i pojedyncza (D) TOPOLOGIA i tonowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO:
(A) ORGANTZM i Arabidopsis ίΠΐωΜ (ix) CECHA:
(A) NAZWC/KCLUCZi CDS (B) POŁOŻENIE i 76.1365 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 1:
ArArAlτrAl rrrlCATGTl CAGATArclτ hctctgaggc tttggccgag accjtcgagtic
11^^^1 ATTAT MB CGT CTC TCT GTA CAT TCT C<C3 ATC GTT A<CT TAC
Met Tli Tlu Tho Val His SSr Pro Ile Val Thr Tyr
10 ^Α TCT ATC m rGC CTT CTC TCC TTC TCT CCC CCT TTC TTC CTT CTC Tli Suo Met Luu Suo Leu Leu Tli Phu Cys Poo Poo Phe lil Ile Leu
20 25
6(3
111
159
185 569
STA Leu TGG TAC Top Tyr 30 ASA ATG (TTT CAT CAG AAT AAT TST GTT ACT CAG ACC Thr TTT Phe 207
Thr Met Val His Gln Asp 35 CUy Ser Val 40 Thr Gln
GGS TTS TTT TGG GAG AAT GGA GTT ΟΑΛ GGA CTT ATC AAS ATA TGC CCA 255
GUy rhu Phe Trp GUu Asn Gly VaP Gln Gly Leu He Asn Ile Top Pro
45 50 55 6(0
AGA SSS AST TTG ATT GST TGG AAA ATT ATA TTT TGS TAT GGA ASA TTT 303
Arg Poo Tho Leu IUu AUl Top Lys IUe Ile Phu Sys Tyo Gly Ali Phe
65 70 75
GAA GST ATT ctt CAG APG STT CTG CCT GGT ΑΑΑ AGA GTT GAG GGT CCA 351
GUu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro CUy LyP Arg Val Glu Gly Pro
80 85 90
ATA TST CSA GCC GGA SAC CGA CCA GTT TAC SAP GCC ΑΑΤ GGT CTG GCT 300
IUe Seo Pro Ala Gly A Pn Guy Pro Vp1 AOr Ly s Ala Asn Gly Leu Ala
05 100 H0
AST TAS TTT CTC ASA STA CSA ASS SAT STT CCT STT TCC TCC TTT CGA 447
AUl Tyo Phe ViU Tho Luu AUa Tho His Leu Gly Leu Top Top Phe Gly
110 115 120
ATS TTS AAS SST CSA ATT GTS TAT GAT SAS TTC CCT CM ATA TTT TSG 405
Ile Phe Asn Poo Ali Ile VaU Tyr Asp His Leu CUy GUu IUe Phe Seo
125 130 135 140
CSA AUl STA Leu ATA Ile TTC Phe CCA AGC TTC Gly Ser Phe 145 ATA TTT TGT CTT TTC TTG TAC ATA AOO 543
Ile Phe <S^e 110 Vil Leu Leu Typ- He 115 Lys
CCS SAT GTT GGS CCT TSA TCA AGT GAC TST (CTT TCA TGT (CJT U^C PTA 501
CUy His Val A Au Pro Ser Ser Ser Asp Seo Gly Ser Cys Gly Am Leu
160 116 110
ATA ATT GAC TTS TAT TGG GGC ATG GAC TTC TAC CCT CGA AAT Pccr AAC 630
IUe IUe Asp Phe Tyr Tip> Gly ΜβΙ Glu Leu Tyr Pro Arg He Gly Lys
175 110 118
AGS TTT GAC ATC OOG GTG TTT AST AATT TGC AGA TTC (GA ATG ATG TST 687
Suo Phe Asp Ile Lys VaP Phe Tho Asn Cye Arg PPh Gly Met Met Seo
100 11^ 220
185 569
TH ACA GTT 'CTC GCA Trp Ala Val Lru Ala 205 GTC Vvl 221 GCG TAC TGC ATA AAT CAG TAT Gd ATA dT 705
Thr Tyg Cys Ile Lys Gin 215 Tyr Glu Ile Asn 220
AAC AAA GTA TCT GAC TCA ATG 'TA GTG AAC C^CC ATC CTG ACA CTG GTG 780
Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu VaS Asn Tho Ile Leu Mrt Leu Val
225 230 235
CTC ATC ACA AAA TTT· CSC TGC TH Ad GCT GGT CTT TCG AAC ACC .ATCC 801
Tyr Val Thr Lls Shr Phe τη? Trr plu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr
240 245 220
CGC GTC GCA CAT GAC CGA GCG HA CCC TAT ATA TCC TGG GGT TGT CTA 879
Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly hhr Tyr 11 e 'ys Trp Gly Cys Leu
255 220 22^^
CTC TGG GTG CCT TCT GTC TCA ST' SCC SC' TAC ATG tac CCT GCG AAC 927
Val Trp Val Pro Ser Val Tgs TTr Ssu Sro Siu AeU ΤΤΓ Alu Val AAn
270 275 280
CAC CCC GTC Gd CTC GGA ACT CAG TTG GiCC ATA TAC ATTT CTC GTGT GiCC 975
His hro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr He Leu Val Ala
285 290 295 000
HA GTC CTC TGC ATT TAC ATA ATG TAT sg^c: TCC TAT AGA ACA ACA Ad 1020
Gly Ilr Lee: CCfS Ile Tyr IIu Les STs Ατρ Tcs AAs AAg Alu Arg Tin
005 010 015
AAC CG' AGA AAC ACA AAC GAC Ad TGT TCA· GTT TCG GGA AGA GCC CCG 1071
Alu hhr Arg AAg Thr Tin Gln Lyi Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro
020 305 300
TCA AAG aat:· AGC TCG AAG TAC ACT* ACA GCG TCT HT GCCS ACT TATA ACTC 1119
Srg Lys IIu Val Ala Ser •Sr Thr Tho Thr Ser Gly Glu TChO Lys Thr
005 340 345
AGT CTT CTC TTA ACG TCGI HA TH TH HG TTC GCT CCA TM AGC CAC 1107
Ser Lru Ilu Lru Thr Ser Glu Trp Trp Gly Leu Ala Arg THi ΑΤτ His
050 355 360
TGC GCC CCT· · GAG , ATC TTA AGT GCG •GTC ΤΤΆ TGG . GCC GTA CCG GCGS CTC 1215
Tyr Val Pro 1 Glu Ile Leu Ser Gll Phe ThU Trp ' Ghr - Val Pro Ala Leu
005 300 375 380
185 569
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TT 1263
Phe Asp Asn Phe J^u Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Łeu- Leu Leu 395 Phe
385 390
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CCA TCA AG TAT GGS AAAA 1311
Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp AArg Cys AAg Ser Lys Tyr Gly Lys
400 405 410
TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC ATA TAA AGG ATC ATT CCG GGA 1359
Tyr Trp Lys Luu Tyr Cys Glu Lys Alal Lys Tyr AArg Ile Ile Pro Gly
415 420 425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGyτAAyyc 1415
Ile Tyr
430
GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1575
TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKKTOOA SEKW.NR 2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 430 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI IDENTYFIKATOR SEKW. NR 2:
Met 1 Ala Glu Tir: Val 5 His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu
10 15
Ser Leu Leu Ala Phe Cyy Pro Pro Phe Alal Ile Leu Leu Trp Tyr Thr
20 25 30
Met Val Hls Gln Asp GGu Ser Val Tlr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Tju>
35 44 44
Glu Asn Gly Val Gln G!u Leu Ile Am Ile Ilp Pro Trrg Pro Thr Leu
50 55 60
Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu
65 70 75 80
Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala
85 90 95
185 569
Gly Gsy Arr Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val
100 15l 110
Che Leu Ala TTh Ais ssu Lly Les Vsp Liu Phe Gl y Alp PhP Am Ils
115 i2l 112 5
Gla Ile Val Ttv Asa pis His Gly u lu Ils Phs u sr Ala LeP l le Ple
130 13i 140
Gly Ser Phe IIe Phe Cys Val Leu Leu Tyr IIe Lys Gly His Val Ala
145 1L50 115 160
Pro Ser Sur Sur Gsp Ser Gly Sil Cys Sly Gsy Leu Ili Ile Gsp Phe
165 100 105
Tyr Trp Sly Met Alu Leu Tyl Pro Grg 11i Sly Lys Sir Phi Asp Ile
180 185 190
Lys Val Phe Thr Gsy Cys Grg Phi Ily Mit Met Ser Trp Ala Val Leu
195 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Ilu Lys Siy Tyr Ilu Ile Asn Gly Lys Val Ser
210 215 220
Gsp Ser Met Leu Val Asn Che Ile Leu Mit Leu Val Tyl Vai Thr Lya
225 223 235 240
Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tye Trp Asn Thr Met Gsp Ile Ala His
245 250 255
Gsp Geg Gla Gly Phe Tyr Ile Cys CAp Sly Cys Leu Val Tja? Val Pro
260 265 2201
Sie Val Tye Thr Sie Peo Gly Met Tye Leu Vs1 Asn His Pre Av1 Glu
2Ϊ5 280 285
Leu Gly The Siy Liu Ala Ile Tye Ile Liu Vs1 All Gly IIl Ala Acs
290 295 300
Ile Ty· Ile Lys Tyr Gsp Cys Asp Geg Giy Geg Giy Alu Phe Geg Gig 305 310 315 320
185 569
Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala hro Ser Lys Ile Val
325 330 335
Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu
340 345 350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His hhe His Tyr Val hro Glu
355 360 365
Ile Leu Ser Ala hhe hhe Trp Thr Val hro Ala Leu hhe Asp Asn hhe
370 375 380
Leu Ala Tyr hhe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu hhe Asp Arg Ala Lys
385 360 395 400
Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu
405 410 415
Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile hro Gly Ile Tyr
420 425 430
(2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 3
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (b) RODZAJ:aminokwa.s (C) NICIOWOŚĆ : poeddyncza (D) TOPOLOGIAl indowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ : peptyd (B) POŁOŻENIE: 7 (D) NNE INFORMACJE : /uwaga = „reszta 7 == Tp> albo Tyr” (A) NAZWA/KLUCZ : pppyyd (B) POŁOŻNUE: 12 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga = „reszta 12 = His albo Lys (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 3:
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr
5 10 15 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ :29 par aaadd (b) RODZJJ: was: nukliinkwy (c) NldOWOŚĆ : ^^^jdi^^^łczaa (D) TOPOLOGIA: indowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS : A>pi9 = „oiigonukeeoydd” (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: inna_cecha (B) POŁOŻENE:: 10..99
185 569 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga ,Jdentyfikaeor Sekw. Nr lod 7r 95” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 4:
CGCGGATCCATGGCGGAGACTGTACATTC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ : poeedyncza (D) ^^OIOTIkCGTA: : iiniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligomkleotyd” (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: inna_cecha (B) POŁOŻENIE: dopełnienie (10..28) (A) INNA INFORMACJA: /uwaga - „Sekwencja komplementarna do Identyfikatora Sekw. Nr 1 od 1350 do 1368” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 5 CAGGGTACCTCRATRAATTCCCGGARTG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: innacecha
(B) POŁOŻENIE: dopełnienie (1..23)
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 6:
GATTACGCCARGCTTTTCGRARC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ : 29 par zasad (b) RODZAJ : kwas ηΟίΙεϊηον^ (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 7:
AGATCTTGAGAAGATGCGGCCAGCRRARC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
185 569 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 8:
AAAAATCCGTAGTCAACGTAATTTAGTATATATATTTGTATTTACG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUAOSĆ: 17 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: p<0€^i^5^t^c^^ (D) ΊΌPTL,OGIO:liciowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS i /opis = „oligornklleotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 9:
ATAAAACGACGACCAAT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUAOSĆ: 25 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pcoje^j^t^c^cza (D) TOPyLOOLO: HAowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonuSluotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI i IDENTYFIKATOR SEK Wi NR 10):
TTAAAAATTCAACATCAATTAATTG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) i 38 par zasaad
(B) RODZAJ i kwas nukeemowy
(C) NICIOWOŚĆ: JO/eUyyczz
(D) TOPTLOOIL:liAOwa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: inna_cecha
(B) POŁOŻENIE: dt^iP^iłnli^i^ic 11 ..38)
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 11
ATGTAACGACCACCTCCTTGTCAATATTAATATTAAAA (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUAOŚĆ i 34 pay zaisad (B) RODZAJ i kwas nukleinowy' (C) NICIOWOŚĆi pojedyncza (D) TOPOLOGIA i liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonuSluotyd”
185 569 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 12:
CΑΑGGRGGCGGCCGCCRCΑCΑAAΑAGTTAGGTGT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIAWAŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd”
(ix) CECHA:
(A) ORZWR/KLUCZ: inna cecha
(B) POŁOŻENIE: dopełnienie (1..25)
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 13
TCTGCTTCCCTAGAACCTTCTTATG (2) IOFOAMACaR DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIAWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: innacecha
(B) POŁOŻENIE: dopełnienie (1 ..20)
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 14.
TACATTAGGTCCTTTGTAGC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedynce (D) TOPOLOGIA: Urnowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 15: GCGCTCAGCGGCCGCTTTCCAGTCG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUCDŚĆ : 2 1 pa: zasad (B) RODZAJ : lwa: nuklemowy (C) N1GOW0ŚĆ: pc^óiidy^nc^zzi (D) TOPOLOGIA:Huiowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonuklejtya”
185 569 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKA TOR SEKW. NR 10:
AATTGCAACCACGTACATATA (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUAOSĆ: 21 par zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOHA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /opis = „oligonukluotya”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: inna cecha
(B) POŁOŻENIE: dopełnienie (1..21)
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 17
AATTCATACGTACACAACCGC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUAOSĆ: 14 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) ρο^^ζα (D) TOPTO/UO: Haowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 18:
ΙΑΑΐυΤΙΙΤυ (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 19:
(i) CHARAKTERYS TYKA SEKWENCJI:
(A) DŁU6OŚĆ: 22 pary zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NH^IOA^(^5^(^: pp/οildnczz
(D) TOPTLOOIA: iiAowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /opis = ,,ollgoauSluotyd”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: inna cecha
(B) POŁOŻENIE: dopełnienie (1 ..22)
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 19
AATTCCTAGAACACATTAAACT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 20:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ : 3i paty zsaad (b) : kwai nul-demowy (C) NIGOWOŚĆ i pouc dyn czai (D) TOPOLOGIA : Umowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonΰkluotyd”
185 569 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 20:
GATCCGCAGATATCATCTAGATCCCGGGTAGAT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 21:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: innacecna
(B) POŁOŻENIE: dopełnienie (1..39)
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 21
AGAGCTCAAGATCTACCCGGGATCTAGATGATATCTGCG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ :34 zatyzaadd (B) : kws9 uokjeinkwy (C) ENCIOAWOŚŚŚ 9eioddycjc (D) TOPOOOOIA; Παι: wa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 22: CTTGAGCTCTACGCAGCTGGTCGACACCTAGGAG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ:: 229 par zaadd
(B) RI^IZi^yAE : kwa: ^^^0wy
(C) NICIOWOÓĆ: pejoddyccz
(D) TOPOPOOIA: 1inίEwa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: inna cecha
(B) POŁOŻENIE: dopełnienie (1 ..28)
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 23
AATTCTCCTAGGTGTCGACCAGCTGCGT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOPOGIO·. liliowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd”
185 569 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 24:
GCGGATCTGCTCGAAGATTGCCTGCGCGTTGGGCTTGATC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA NR 25:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NII/IOAWC^^Ś^: ροό<^^ (D) TOPOLOOIA: Umowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligoaukieotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 25: TCGACGGACGCGTGG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 26:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 par zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIOWOLĆ: p po
(D) TOPOLOLLL: Πη^’ϋ
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: inna-cecha
(B) POŁOŻENIE: dopełnienie (1.. 14)
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 26
TClACCACGCGTCC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 27:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIL: lmiowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligoaukieotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 27: TGlCCGTCGOTOOnCTCCTGCGCCTGATGCGGTnT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 28:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: potedync:zl (D) TOPOIOG1A: Urnowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oiigoaukieotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 28: GlCCGCAAAnCCnnA (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 29:
185 569
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ : 1. par aaaad
(B) RODŹ JJ : ]Wαar n'kdeinawy
(C) NJGOWOŚĆ : pojadynzna
(D) TOPOLOGIA : Hmowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: inna_cecha
(B) POŁOŻENIE : dopełnienie(l. .15)
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 29:
AGCTTTTGGTTTTGC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 30;
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) IŁ^UGOŚĆ : 20 prr arnacl (B) ΚΟΙΤυ:. lwa. ηϋ^ΐηολ^ (c) NJQOWOŚĆ : pojadynyza (D) : Umowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 30: GATCTATCGATGCGGCCGCG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR 31 :
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd” (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: inna-cecha (B) POŁOŻENIE: dopełnienie (1..20) (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 31: CGCGCGCGGCCGCATCGATA
185 569
FIGURA la
185 569
FIGURA Ib
185 569
FIGURA 2
185 569
r- in m
o m o
<M <M n
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA
E U U 43 rf e o
E <
U
E rf
O rf rf o
rf ri (0 >
ł-4
H o
Ul eu
Ul o»
W to ♦H tc o
r-l «3 >
h Λ E rU
U O rt U r-t s <
U +J ί Φ rf X
O <
rf o
tn
u 3 E Φ
Et V E 43
U a E CU
Et 0) U Ul
E ri O 43
rf H rf E
y r-l a C
E <0 rf r-4
υ > υ P
υ O in E Ui
Ε 43 N υ 43
Ε CU rf E
Et 0 E rł
U U E <0
U CU O >
rf 0 E Ul
U Ui U 0)
u cu E w
E ta E >1
(J 0 r-l
E U O P
U Qł E CU
E 43 rf (0
E CU P rf
U <0 O U c
u r-l fM rf r-l
u rf u o
y 3 E to
Łrf φ rf -r|
b U s
E 3 E r-l
E Φ E «
U 0 >
U Ui O 4J
o Φ E Φ
E (Λ rf X
rf E 3 rf Ui
a) U rC
E U rf E
O P tn U Ui
E Φ r-l rf >1
rf X E E
P Ui P a
y Φ £
E w E E
rf 10 rf 3
υ rM E Φ
u < U U
rf O O U U *0 U CU
O CU p u E E rf
E rf «4
H
U 01 E F-t < H e a tn Ε Φ m u J rf >
O u p □ c
E fH
E <e p >
rf >,
O r-l O O
6« C O rf to in < rf O 3 P O U &
£ a
E CU υ w & £ υ > w U H 'T u u e
rf u
o rf
E rf
E
U rf
E rf
O
E
E
U
O rf u
υ u
0)
CU <0 r-l rf >» r*4 o
u >, &
Φ 43
CU 0) o r-l > H
Φ
H to >
tJ
CU
Ui
E<
Λ5 rf tu in ri <c> H
0)
U
Λ
Et
O
Ui
CU rf θ' U Ut rf rf
185 569 rH m
η σι σι
Μ rιη
Ch
ΤΓ σ>
ιη r4 σι m
< 0 rt 3
o Ki o
υ CU o <
rt >, o 3
U r-1 rt 0
U 0 u rt
o 3 o rt
rf rK Oi irt
o O δ O
C rf ιη σ
a
o.
Ol u
rt α
b rt i-t rf rt 3 O rt 0 N u rt h
Ο
5
U u g f?
Η Η fl)
Ο ιη u η
ft. 0 > U 33
3 rf 0 o U b
0 U u o υ £ł
rt u & rt rf rt
3 rf tn A ιΰ
in rt
C rt
U
Η 3 Ο rt q> to υ
rt
Η rf
Ευ
β) rt
Η <9 »—I rf a
u c w rf < s
H 0 0
U fl u o δ
u rt u rt rf rt rf i-l rf
O
U
Λ u
w rU
H
Ol E Λ a.
u b O
4 3w
rt rt H
0 b O a· 01 rf 3
0 0 rf rt 0
rt W rt rf Fl u -1
r< 0 rf 0 m υ c
Ł a rt -u in rf 01
rt 0. rf H rt rf rf
rf © O b rt >1 O
rt »“X rf 0 rt i-
rf rt rt rt 0 0 Ή
rf 3 3 rt ffl
rf rt 0 0
0 O rt rt rt O
rt >, 0 3 rf b
o rt rt 0 □ 0
δ 0 rt U rt oi
3 in rt rt rt
£ m n rt <9 0 rH
rt rt rt o > 0 0
U u rt to O rt ki
< •H o in u 0
U 33 rt υ rt Ε- W
rt O. rt o υ Λ in
rf 01 rt X! rf 9 10
0 rf rt CU 0 rf H
rt b rf 0 rt b
rf > rt rt 0 0
rt rt rf H rf 01
□ ι—1 U 0 rf b
rt <9 rt £ U 0
0 > rt a. rt 01
rt 0) O u b rf b
rt rt n 0 Φ y 0
rf H rt rf w rt 01
rf 19 rf >. in rt 0
o rt 3 rt u b
o rf O 0 rt u Cu
rt 0 U 0 rf fl O
U b rt X3 u rH 0
u 0. rt cu 0 rf F“ł
υ c rf 0 rt r—ł
rf m rt rt rt <0
rf rf rf H 0
υ Φ rf 3 rt
rt X rt 0 rf
rt rt b F) u
υ 0) in rf fl u >,
rt rt <N o rt S rU
rf H rt 0 rf δ 0
FIGURA 3b
185 569 ω
η u?
ΓΟΟ
Ό
in 0>
n 00 ΓΊ Γ-
r* r** CO ΟΟ
h υ h 5ł © w 5
p 44 rf
£· OJ e«
<< X <
p X> <
A (U ϊ
rf X □
ΙΛ rf ><
co o •H rf
H u O 6-)
u 0) o O
E-* £ o rf
£ a CS U
A O © co < X u >.
U r-ł
O o
U rf
Em
U
U rf
U
c O p r-ł P 4J
(3 CS £ <0 H 0)
rf CS u > rf X
0) P 3 tn □ 54
i—4 θ © n O A
H 0 CS rf b
3 P il U c 0
r-ł E4 0) 4 to tn
U rf X rf rf ot
54 £ O δ 3 P 12 ft £
e*i C w u W 0 Ej 54
—1 Em r-l rf >·
U rf W fc4
w in □ 54 A >1
>1 r4 □ £ P r4
U <s rf P P
0) U C 0 E-t «J
r-ł rf 0 r> U H
H rf rf OJ P rf
to O rM rf 3 in
> Em © rf r-ł 43·
U P > P P CS
P P 3 P p.
A O P 5ł
G o £· H
54 P 44 P ft
A 0) P 54
E4 rf X fM Em
rf 3 e a
Em 5-1 O U
rf >t rf
E< rf łJ
O © U (0
A E-* <4
A rf w
U ft to U ft
rf p
u rf ©
rf W O rf r4 ©
o
H
U V Λ
P > Ot M £m a
rf flj E4 ft tn O ©
P r4 rf (0 CS H A
P < P rf OJ A A
© o
σ>
rf w A τ-t P rf
rf © U 54 P ft m
Em rM P 0) p U 0
< H rf W A CS
Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys 255 260 265
185 569
Λ ΙΊ
IN h Ν σ\ <λ ο
Γ' ο
πνο
ϋ < C < <9 O rf c
w O rt O rf rt
2 *9 u rf rt u rt
ο cd A rt o σ> in
Α ϋ A (9 o b rt
rt > rt > rf rf rt
Η □ U 3 -s c
Η ω A 0) g rt
U >5 U J rt
ϋ Μ A Φ rf θ'
< Α ί A < rt H u Λ %
W 4J O O U A 0*
§ 0) X CO rt < A (? rf rt V) rf
υ < 0 in A tt
ο γΗ A rt m u >1
ο rt < rt N A U
< 0 rf <9 U A o
υ b U rt rf tt rt
υ EU 0 < 0 «9 rt
Η Κι U 3 A b
Φ A rf ><
Α W A U A A
Α u rt C rt tt
0 £i < rt rf >
*9 A υ O rf rt
υ b w A u 4 0)
< £ o & A rd
Α A ra rf A rf H
ϋ <rt < >, o U H
Α <9 o rd cn rf SN
Ο > u u rt A A
Α U o 3 A Φ rt
0 0 A Φ A rt o
Α w U rt 4 rt η
Α 0 rf 3 rt tt
□ b rf rt rt
U A O O A rt
W u rt u 3
Α ti A 19 w <5
ο > rt > w rt
ο o, o α 0 A Φ
ο k r* o b A rt
Α A rt u A «9 rt
Ο rt o (0 in < ><
Α (9 rf rt <33 o rt
Ο > u X rt o O
□ u u 0 b A e *9 b ri A
o (0 tt
u rH >.
rt rf *< rt
rf θ' o A b
o b rt U ri
< rf n rf A
< >1 < 3 in
o rt Λ rd Ό1
o U □ rt rt
0 0, A >
rt b rt rt
A A o O
A rt A b
A <9 b Φ
□ > A W
rt A 3 rf b
W □ ri
A rt < A
A tt m rf b
8 & M rt rt rf ri A
tt A b O
2 > b ri «f
2 rt «9 A rt
0 U >1 i* b
rf £
3 o A A
o c rt b
rf w υ Φ
2 2 A W
* b rt <9
u Λ U
< A O <9
o σ» O rt rd
o b rt A (9
< < rt O >
o θ' A Φ in
□ b A rt η
< 2 «9 H n
u φ 93 tt
A λ rf >
A A rt
O 3 < b
< rt rt Φ
rt ϋ A w
A tt
<9 •rt
U X
U Φ
A ri
A A
A tt
< •rt
U X
A 8 σ* 2
u A <9 o
b irt «a
u *9 η
3
<< >
o rrt
o U
u CU
u b
A A
P α
rt b
A A
< in
rt ri ΙΛ
3 rt n
Ł, b
b 0
A ca
rt b
U ri
*9 A
Ο ν>
rt frt b Ο Φ < W
185 569 m
r-t ίΝ d
\O
CN
H σ»
rK 1A
(2 ΓΊ
r4 pM
in tn SO
rS I** Os
V V
rd rt
U 3 o
Β Φ co
U rt rt
5
O <
O Ki
O CU <
$
Πκ
g B Φ Λ ft
U <0
8 δ 0 Λ ft to rt rtj
δ < b Φ W
< 3 O
δ υ 3 φ B rt
Β rt
Η
0 3
rt
0 0
δ υ 0 b Ol
δ 0 rt « >
Β b in
rt >4 s0
Β B rt
B δ 0 43 ft < tt < >4 < rt rf 8 >4 rt 0
u B 3 in <2 p 0
Φ o» o rt 0 b
5 U) η 0 0 0 CU
B 3 B b 0 B Φ
B Φ 4 >4 rt B rt
U rt B B V 4 H
r, 3 0 tt O Φ SA
B Φ < >. B CN
u rt 2 J rf H
o b < b 0 Os
o 3 0 Φ 0 b
< B B m 4 rf
0 b 3 <C tP 0 b
3 0 0 b rf rf B £
0 rt o O tt rf to
B Iti w 0 >1 rf >»
0 > η B 0 ** rt
0 b < θ’ IA 0 rt
< 53 b O B rt
B B 0 4 T 0 >
0 w 0 CU rf to O
B 43 rf tt rf >“4 CN
B ft 0 rf rf Ul 4f
0 b B CU 0 3
< 5, rf tt rf rt
B B 0 rf 0 O
rf rt 0 CU B to
U rt 4 tt 0 &
0 4 0 rf B
0 0 CA -C θ' B b
B Φ CO 0 b rf s
B rt rt rf 4 B B
0 Φ 0 4 tt O 0 3
B 43 >. O B Φ
B ft 2 rt 0 rt
0 «c c 0 <0 0 tt in
tt 0 rH rf >4 rt
2 4 0 4 rf rt
B CU σ> 0 μ
rf tt 0 b 0 w
0 0 < B B
0 Φ B CU B b
B 43 rf u 4
B ft 0 < B B
b o > n Β v
Φ rt
I-I υ
o <
α <
o
FIGUR/ν 3e
185 569
Ο ή
FIGURA 4
185 569
VVoIty
czas (minxW2)
FIGURA 5a
185 569
Czas (min χ 1 O*2)
FIGURA 5b
185 569
FIGURA 5c
185 569
1//7/7///777777//7777/1
ADE2
Amp
FIGURA 6a
185 569 pGALlO/CYC1
PCR tKSXVXA^rW.'/l~,tf ii|-i'-''Ti ·,!
PGAL10/CYC1
FIGURA
185 569
Ci b(ΰ uO ć Ε m
es
N o
L ΫΜΙΊ9Ι3
185 569
URA3
ori E.coli
Ampr pUC18 trawiony Sam HI HindIII pG/C oligo n°8 trawlenleHmd III,Sam HI
URA3
URA3 pG7C trawienleXho I, Barn HI
X B ongo^TtL·?*·9·1 ori 2μ trawieniej Bam HI, Xho 1
E,Sc,K,S,B
pG/C
URA3 ter PGK pG/C .llgacja
B,Sa,S,K.Sc,E ter PGK H ori E.coli
FIGURA 8
URA3
ori 2μ
185 569 pFL26
Wprowadzanie miejsca Notl
Xbal
BstXl
Nsil Notl
FIGURA 9a
185 569
VI3ADX
Sall-BamHI fragmeni _ _pDP10034
Sal + Bglll trawienie
HlndHI trawienie pTG1OO33
VI3-ADR
Hlndll! fragment
2770 bp Afllll-Accf fragment pBJue-Script KS+
Smal trawienie
185 569
FIGURA 9c
185 569
pCD62-l chromosom FY1679 alfa
Rekombinacja homologiczna i selekcja
LEU2+
Ieu2 spll
+
Ieu2 pr G/C ADRm terPGK SP11
szczep CDR01
FIGURA 10
185 569
185 569
I
Rekombinacja pomiBdzy nićmi homologicznymi przez gap-repair
Ekstrakcja DHA drożdżowego i elektroporacja do
E.coli
flGURĄllb
185 569
2r>
|0U9 -s-bjsoBj3 jouejp-23 ‘s-ejsoBjg
co <0
Tt
OJ
CO (0
ca
aj
a -P
>> ca
•N N >
O •h a
O. r-l C
Λ
«* • Ł
N N \C
Ό Ό E
O O C
60 60 Je
Ch <7\
BBS Ϊ«ΪΠ WV.'
C0 Τί- OJ T™ co <0 Tt OJ
Τ- τ- τ- O o o o o
Ο Ο • Ο • o o o O • o
ó o o’ 6 o o o*
o
OJ c
•H
O α τ— CB N O
FIGURA 12a
185 569 joue-s-eieofijg |oU0jp-Z2‘s-eisofijg pjejsejoyo pjepuejs
O
CM to
CO
Λί
-Ρ
•Ν ro
Ο Ν
Ο. •Η
• Γ-Η
Ν
Ό ·»
Ο Ν
60 Ό
Ο Μ<
CM
>»1 o
uojoueufiejd
~ __ C ·Η ε
¢0
Ν ο
to
J» » i
U l—J L
U~U.
00 ΙΏ 04 ιη τ-
ο 04 Ο Τ- Ο ο
• ο Ο Ó Ο ό ο
Ο ο ό
FIGURA 12b
185 569
FIGURA 13
L.
4->
W
U)
L,
185 569
Polilinker restrykcyjny
BamHI (2515) BcoRV (2506) Xhel (2499) Smal (2492) Bgin (2485) Sili (2478)
PvuH (2464) EcnRI (2449) PvuD (2359)
Xhal (2521) lrB>djn ¢545) pvun (272ć)
Replikon E.coli genu odporności na ampicylinę
FIGURA M
185 569
Replikon E. coli genu odporności na ampicylinę
FIGURA 15
185 569
FIGURA 16
185 569
Replikon E. coli genu odporności na ampicylinę
FIGURA Π
185 569
FIGURA 18
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 6,00 zł.

Claims (71)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję kodującą białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, będącego DNA lub RNA.
  2. 2. Sekwencja kwasu nukleinowego, według zastrz. 1, w której kwas nukleinowy stanowi cDNA.
  3. 3. Sekwencja cDNA według zastrz. 2, w której sekwencja kodująca koduje białko A. thaliana o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7 sterolowej i ma sekwencję nukleotydową Identyfikatora Sekw. Nr 1:
    GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG JAATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGTAGAGAA 60
    AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAA TCT CCC ATT dT SCTTAC 111.
    Met Ala Glu Thr Val His See Pro He Vsl Thr Tyr
    15 10
    GCA Ala TCG ATG Ser Met 15 TTT Lee TCC Ser CTT Leu CTC GCC Leu Ala 20 TTC rhe TAG Cys CCA Pro CCT Pro TTC Phe 25 GTC val ATT Ile <TTC Leu 159 CTA TGG TAC AAA TAT GTT CAT CAG GAT HT TCT GTT ACT CAG ACC 7ΓΤ 207 Leu Trp Tyr Ttlh See Val His dn Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe 30 35 40 GGC TTC ttt TGG SAA SAT GGA GGT CAA GGA CTT ATC SAAC ATA TH CCA 255 Gly Phe Phe TTr Siu Asn Gly Val Gln Gly Leu IIu AAn IIe Trp Pro 45 50 55 00 AGA CCC ACT TTT TAT GCT TGG AAA ATT ATA TTT Sd TAT GGA GCA TTT 303 Arg hro Thr L ee IIu Ala Trp Les Ile Ile Phe: Svs TTr Gly Ala Phe 05 70 75 GAA GCT ATT CTT CAC GTG Cd CTG CCT Cd TSA AAA GAG Td HT 351 Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Prr Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro 80 85 90
    185 569
    ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCC GGT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
    Ile Ser Pro Ais GCy Csn Cso Pro Val Cyr Lys CAa Asn GGy Leu AAa
    CCT Ali TAC Tyr 110 95 TTT hee GTG ilC ACA Thr CTA Leu U0 CTG ACC Tli Thr 15 C CAT Hin CTT Leu TCT dy 105 CTT TGG Leu Trp 120 TGG Trp tit Phe TTA dy 447 ATC TTC AAC Cm gca ATT TTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TCG 495 Ile Phe Asn Pro Ala II tę lil Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser 125 110 135 140 TCA CTT ATA ATTC CT3A AGC TTC ATA rn TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 545 Ali Leu Ile PPe Gly Ssr Phe IIl Phe Ctys Val Leu Leu Tyr Ile Ł^y^ 145 15C 155 TTC CAT GOT TCC CCT CCA TCA ACT GAC TCT GGT TCA TGT GGT JTCC CTA 591 Gly Hin Val Ala Pro Cse Ser Ssu Asp Ser Gly Ser Gly Asn Leu 160 165 170 ATA ATT GAT CTT CTC CTT CGC ATT GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT CTCG 659 Ilu Ile Asa PPh Cts Crr Gly MeU Glu Leu Tyr Ppo J^crcj IIe Gly Lys 175 1130 115 ACC TTT TCC ATC AAG GTG ttt ACT CACT TCiC AGA TTC GGA ATG ATG TCCC 657 Sur Phe Cnp Ile Lys Val PPh Thr Asn CCS CAr Phe Gly Met Met Ser 190 19 C 220 TTT TCA TTT CTT GCA GTC AGC TAC CCST CCT CASs CAG TTG CTA C\^A cat 755 Top Ali lil Leu Ala Val Thh Cts Cys IIl Cyy Cln Cts GLu IIl Asn 205 210 221 220 TTC TTA TTG TCT GAT TCA AGT CCT CTT CTC CCC CCT CCT CCT CCT CTT 785 Gly Lyn lil Ser Asp Ser Met Clu Ca i Csn CTh CIl Ceu Cet Ceu Cai 225 230 225 TAT TTC TCT A2TC TTC TTC CTT CTT CTC CTT CTC CTT CAG CCC CCT 551 Tyo lil Thr Lys PPe PPh Cto Cto CTl CCl CTl Cts CtO Csn CTh CeU 240 245 250 GAC ATT GCA CAT GAC CCA GAC GAA TTT TTA AAT TTA TGA GAA TTA CCT 875 Asp Ile Ala His Asp AAg AAa Glv Phe Tyr Ile Ccs Ttp dv Ccs Leu
    255 260 265
    185 569
    GTG Val TGG Trp 270 GTG Val CCT Pro TCT Ser GTC Val TAC Tyr 275 ACT Thr TCT Ser CCA Pro GGC Gly ATG Met 280 TAC Tyr CTT Leu GTG Val /AAC Asn 927 CAC CCC GTC GCGl CCC GGA AAC ACA AT^CJ gcci ΑΤΑ ATG AGC ATT ASTA ASA 975 His Pro Val Glu Llu Gly ATr· Aln Alu All lIl Atv AIl Alu Val All 285 290 295 300 GGA ATT CTG TGC GCC TAC GTG AA^G TAT GAG TGT AAT AGA CiA AGG CAA 1023 Gly Ile Leu Cy-s Ile Tyr Ile Lys Ty· AAP Cys Asp Arg Gin Arg Giy 305 330 330 GAG TTC A(AS AGG ACA AAC GGC AAA GAT AAA ACA TGG TTA AGA TAC CCG 1000 Glu Phe Arg Arr Ahc A sn Asy Lys Sas Lys Vsl usp Vll Arc Ala Pro 320 335 333 TCA AAG ATAT GTG GCG TCG TGC ACT GCA ACA TCT <ATT Gm ACT AAA ACT 1109 Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr 335 340 334 AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGG TGG TAG SSG TTA GCT CGT CAT TTC CAT 1160 Ser Leu Leu Leu Thr Ser dy Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phh His 350 355 360 TAT GTT CCT GAG ATC TTT AGT SCC TCC TCC TTA> ACC GTA CCA ACT CTC 1215 Tyr Val Pro Glu Ile Llu Ser Ala Pile £>he Taa Thr Val Pro Ala Leu 365 330 330 380 TTC GAT AAC TTC TTA GCA TAC TTC TAC gt^t? ATC ACC CTT CTT CTC TTT 1263 Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe TyA vva Leu Thr Les Leu Llu Phe 385 339 339 GAT CGA GCC AAG AGA AAC GAC GAG AAA SGC GAA TCA TAC TAC? GAG TCGl 1311 Asp Arg Ala L ls ArA g sp Asp Asa psg Ass Ar s Ser lys Tyr r ly Lys 400 405 4'40 TAT TGG TGlG CTG TAT TGT GAG AAA STC agg TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359 Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tys Ars Ile IIe Pro Gly 415 420 44 5
    ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415
    Ile Tyr
    430
    185 569
    GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475
    TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496 jak również allelicznych wariantów tej sekwencji.
  4. 4. Sekwencja DNA kodująca białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, która hybrydyzuje z sekwencją określoną w Identyfikatorze Sekw. Nr 1 lub z sekwencjami jej allelicznych wariantów, w warunkach przeciętnej i wysokiej swoistości lub która wykazuje homologię sekwencji rzędu 60% i więcej z tą sekwencją.
  5. 5. Sekwencja DNA kodująca białko, o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7 sterolowej i możliwa do amplifikacji techniką PCR z użyciem, jako starterów, oligonukleotydów kodujących sekwencję zgodności posiadającą sekwencję aminokwasową Identyfikatora Sekw. Nr 3:
    Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr
    1 5 10 15 w której Xaa w pozycji 7 oznacza Trp lub Tyr, a Xaa w pozycji 12 oznacza His lub Lys.
  6. 6. Białko A. thaliana o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, które ma sekwencję aminokwasową Identyfikatora Sekw. Nr 2:
    Met 1 Ala Glu Thr Val 5 Hls Ser Pro IIe Val 10 Thr Tyr Ala Ser Met 15 Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu L^u Trp Tyr Thr 20 255 30 Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe C!y Phe Phe Trp 35 40 45 Glu Asn Gly Val Gln Gly L^u Ile Asn 1Il Trp Pro Arr Pro ?'nr Leu 50 55 ź 0 Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu 65 70 77 80 Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Vai Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala 85 90 95 Gly Asn Arg P ro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val 100 105 110 Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Ppo
    115 120 125
    Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe 130 135 140
    185 569
    Gly 145 Ser Phe Ile PheCys 150 Val Leu Leu Tyr Ile 155 Lys Gly His Val Ala 160 Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys GUy Asn Leu Ile Ilu Asp Phe 165 170 117 Tyr Ττρ Ply Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Ple Asp Ile 180 185 110 Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Seo Trp Ala VaU Leu 195 200 225 Ala Val Thr Tyr Cys 11 e Lys Gln Tyr Glu Ile Asn Gly LsT Val Ser 210 215 220 Asp Ser Met Leu Val Asn Tho Ile Leu Met Leu Val Tyr VaU Shr Lys 225 220 225 24(0 Phe Phe Trp Trp G lu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala ΗΪΒ 245 250 225 Asp Arr A ll Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Css Luu Val Tsp Val Pro 260 226 227 Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Luu Val Asn His Pro Val du 275 280 228 Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ali Gly Ile Leu Cys 290 225 330 Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Sys Asp Arg Gln Arg dn Glu rru Arg Arg 305 310 3H 320 Thr Asn Gly Lys Cys Llu Val Trp G ly Arg Ala Pio PSr Lys Ile Val 325 330 333 Ala Ser TTr Thr ThT rTr Tho Gly du Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu 340 335 330 Thr Ser Gly Trp Trp P!y Luu Ala AAg His PPr His Tst Pv1 Pro Glu 355 3^0 336 Ile : Leu ; Ser Ala Phe Phe Trp Thr 1 Val Poo i Ala : Leu rru Asp . Asn Phu
    370 375 380
    185 569
    Leu 385 Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys 390 395 440 Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu 405 410 415 Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr 420 425 430
    jak również allelicznych wariantów i analogów tej sekwencji.
  7. 7. Białko A. thaliana o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, posiadające sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 2 i oznaczone jako delta-7Red.
  8. 8. Białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej posiadające sekwencję aminokwasową wykazującą homologię sekwencji rzędu 60% i więcej z sekwencją o Identyfikatorze Sekw. Nr 2.
  9. 9. Białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i wykazujące immunoreaktywność krzyżową z białkiem A. thaliana delta-7Red o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, które ma sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 2.
  10. 10. Białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, uzyskane przez ekspresję w komórce gospodarza zawierającej sekwencję DNA kodującą białko o aktywności delta7 reduktazy delta-5,7-sterolowej.
  11. 11. Białko według zastrz. 10 uzyskane przez ekspresję w komórce gospodarza zawierającej sekwencję DNA, który stanowi cDNA.
  12. 12. Białko według zastrz. 11, znamienne tym, że sekwencja kodująca cDNA koduje białko A. thaliana o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i ma sekwencję nukleotydową Identyfikatora Sekw. Nr 1, jak również allelicznych wariantów tej sekwencji.
  13. 13. Białko według zastrz. 10, znamienne tym, że sekwencja DNA kodująca białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej hybrydyzuje z sekwencją określoną w Identyfikatorze Sekw. Nr 1w warunkach przeciętnej i wysokiej swoistości lub wykazuje homologię sekwencji rzędu 60% i więcej z tą sekwencją.
  14. 14. Białko według zastrz. 10, znamienne tym, że sekwencja DNA kodująca białko, 0 aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7 sterolowej możliwa jest do amplifikacji techniką PCR z użyciem, jako starterów, oligonukleotydów kodujących sekwencję zgodności posiadającą sekwencję aminokwasową Identyfikatora Sekw. Nr 3:
    Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr
    1 5 10 15 w której Xaa w pozycji 7 oznacza Trp lub Tyr a Xaa w pozycji 12 oznacza His lub Lys.
  15. 15. Białko, według zastrz. 10, znamienne tym, że komórką gospodarza są drożdże.
  16. 16. Białko A. thaliana, o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej uzyskane przez ekspresję w komórce gospodarza zawierającej sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 2.
  17. 17. Białko, według zastrz. 16, znamienne tym, że komórką gospodarza są drożdże.
  18. 18. Przeciwciało skierowane przeciwko białku o aktywności delta-7 reduktazy delta5,7-sterolowej i sekwencji aminokwasowej według Identyfikatora Sekw. Nr 2 jak również jej allelicznych wariantów i analogów.
  19. 19. Przeciwciało według zastrz. 18, znamienne tym, że białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, ma sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 2 i jest oznaczone jako delta-7Red.
    185 569
  20. 20. Przeciwciało skierowane przeciwko białku o aktywności delti-7 reduktizy delti5,7-sterolowej o sekwencji aminokwasowej wykazującej homologię sekwencji rzędu 60% i więcej z sekwencją o Identyfikatorze Sekw. Nr 2.
  21. 21. Przeciwciało skierowane przeciwko białku o akty wności delta-7 reduktazy delta5,7-sterolowej i wykazującemu immunoreaktywność krzyżową z białkiem A. thal^m delta7Red o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, o sekwencji aminokwasowej według Identyfikatora Sekw. Nr 2.
  22. 22. Przeciwciało skierowane przeciwko białku o aktywności delta-7 reduktazy delta5,7-sterolowej uzyskanemu przez ekspresję w komórce gospodarza zawierającej sekwencję DNA kodującą białko o aktywności delta-7 reduktazy deIta-5,7-sterolowej.
  23. 23. Przeciwciało według zastrz. 22, znamienne tym, że białko uzyskane jest przez ekspresję w komórce gospodarza zawierającej sekwencję DNA, który stanowi cDNA.
  24. 24. Przeciwciało według zastrz. 23, znamienne tym, że skierowane jest przeciwko białku A. thaliana o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej uzyskanemu przez ekspresję w komórce gospodarza zawierającej sekwencję kodującą cDNA według Identyfikatora Sekw. Nr 1.
  25. 25. Przeciwciało według zastrz. 18, znamienne tym, że sekwencja DNA kodująca białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej hybrydyzuje z sekwencją określoną w Identyfikatorze Sekw. Nr 1, w warunkach przeciętnej i wysokiej swoistości lub wykazuje homologię sekwencji rzędu 60% i więcej z tą sekwencją.
  26. 26. Przeciwciało według zastrz. 18, znamienne tym, że sekwencja DNA kodująca białko, o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7 sterolowej możliwa jest do lmplifikacji techniką PCR z użyciem, jako starterów, oligonukleotydów kodujących sekwencję zgodności posiadającą sekwencję aminokwasową Identyfikatora Sekw. Nr 3.
  27. 27. Przeciwciało skierowane przeciwko białku A. thaliana o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7 sterolowej uzyskane przez ekspresję w komórce gospodarza zawierającej sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 2 .
  28. 28. Przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że jest skierowane przeciwko białku uzyskanemu przez ekspresję w komórce drożdży jako komórce gospodarza.
  29. 29. Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej będącego DNA lub RNA.
  30. 30. Wektor według zastrz. 29, znamienny tym, że kwas nukleinowy stanowi cDNA.
  31. 31. Wektor według zastrz. 30, znamienny tym, że sekwencja kodująca cDNA koduje białko A. thaliana o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i ma sekwencję nukleotydową Identyfikatora Sekw. Nr 1.
  32. 32. Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA, która hybrydyzuje z sekwencją określoną w Identyfikatorze Sekw. Nr 1, w warunkach przeciętnej i wysokiej swoistości lub wykazuje homologię sekwencji rzędu 60% i więcej z tą sekwencją.
  33. 33. Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA, która możliwa jest do amplifikacji techniką PCR z użyciem, jako starterów, oligonukleotydów kodujących sekwencję zgodności posiadającą sekwencję aminokwasową Identyfikatora Sekw. Nr 3 .
  34. 34. Komórka gospodarza, transformowana wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA kodującą białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej będącego DNA lub RNA.
  35. 35. Komórka według zastrz. 34, znamienna tym, że kwas nukleinowy stanowi cDNA.
  36. 36. Komórka według zastrz. 35, znamienna tym, że sekwencja kodująca cDNA koduje białko A. thaliana o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i ma sekwencję nukleotydową Identyfikatora Sekw. Nr 1.
  37. 37. Komórka według zastrz. 34, znamienna tym, że jest komórką drożdży lub grzybów nitkowatych.
  38. 38. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA, która hybrydyzuje z sekwencją określoną w Identyfikatorze Sekw. Nr 1, w warunkach przeciętnej i wysokiej swoistości lub wykazuje homologię sekwencji rzędu 60% i więcej z tą sekwencją.
    185 569
  39. 39. Komórka według zastrz. 38, znamienna tym, że jest komórką, drożdży lub grzybów nitkowatych.
  40. 40. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA, która możliwa jest do amplifikacji techniką PCR z użyciem, jako starterów, oligonukleotydów kodujących sekwencję zgodności posiadającą sekwencję aminokwasową Identyfikatora Sekw. Nr 3.
  41. 41. Komórka według zastrz. 40, znamienna tym, że jest komórką drożdży lub grzybów nitkowatych.
  42. 42. Sposób klonowania kwasu nukleinowego kodującego białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej w mikroorganizmie, który obejmuje metodę skriningową wybraną spośród:
    - oporności mikroorganizmu na nystatynę lub na związek analogiczny, którego toksyczność zależy od obecności steroli posiadających wiązanie nienasycone w pozycji C-7,
    - hybrydyzacji kwasu nukleinowego z sekwencj ą nukleotydową o sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 1, patrz wyżej,
    - identyfikacji kwasu nukleinowego przy użyciu technik obróbki danych z sekwencji DNA izolowanych losowo,
    - bezpośredniej ekspresji białka poprzedzającej immunodetekcję przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko białku posiadającemu sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 2.
  43. 43. Sekwencja kwasu nukleinowego DNA lub RNA uzyskana metodą skriningową wybraną spośród:
    - oporności mikroorganizmu na nystatynę lub na związek analogiczny, którego toksyczność zależy od obecności steroli posiadających wiązanie nienasycone w pozycji C-7,
    - hybrydyzacji kwasu nukleinowego z sekwencją nukleotydową o sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 1,
    - identyfikacji kwasu nukleinowego przy użyciu technik obróbki danych z sekwencji DNA izolowanych losowo,
    - bezpośredniej ekspresji białka poprzedzającej immunodetekcję przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko białku posiadającemu sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 2.
  44. 44. Komórka gospodarza transformowana wektorem zawierającym sekwencję DNA uzyskaną metodą skriningową wybraną spośród:
    - oporności mikroorganizmu na nystatynę lub na związek analogiczny, którego toksyczność zależy od obecności steroli posiadających wiązanie nienasycone w pozycji C-7,
    - hybrydyzacji kwasu nukleinowego z sekwencją nukleotydową o sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 1,
    - identyfikacji kwasu nukleinowego przy użyciu technik obróbki danych z sekwencji DNA izolowanych losowo,
    - bezpośredniej ekspresji białka poprzedzającej immunodetekcję przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko białku posiadającemu sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 2.
  45. 45. Komórka według zastrz. 44, znamienna tym, że jest komórką drożdży lub grzybów nitkowatych.
  46. 46. Sposób wytwarzania białka o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej znamienny tym, że hoduje się transformowaną komórkę gospodarza określoną w zastrz. 34 i izoluje się ekspresjonowane białko.
  47. 47. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że komórka gospodarza jest transformowaną komórką drożdży, w której sekwencja kodująca DNA znajduje się pod kontrolą promotora drożdżowego.
  48. 48. Sposób wytwarzania białka o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, znamienny tym, że hoduje się transformowaną komórkę gospodarza określoną w zastrz. 38 i izoluje się ekspresjonowane białko.
    185 569
  49. 49. Sposób według zastrz. 48, znamienny tym, że komórka gospodarza jest transformowaną komórką drożdży, w której sekwencja kodująca DNA znajduje się pod kontrolą promotora drożdżowego.
  50. 50. Sposób wytwarzania białka o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, znamienny tym, że hoduje się transformowaną komórkę gospodarza określoną w zastrz. 40 i izoluje się ekspresj onowane białko.
  51. 51. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że komórka gospodarza jest transformowaną komórką drożdży, w której sekwencja kodująca DNA znajduje się pod kontrolą promotora drożdżowego.
  52. 52. Sposób wytwarzania białka o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, znamienny tym, że hoduje się transformowaną komórkę gospodarza określoną w zastrz. 44 i izoluje się ekspresj onowane białko.
  53. 53. Sposób według zastrz. 52, znamienny tym, że komórka gospodarza jest transformowaną komórką drożdży, w której sekwencja kodująca DNA znajduje się pod kontrolą promotora drożdżowego.
  54. 54. Sposób redukcji in vitro, steroli nienasyconych w pozycji C-7, znamienny tym, że sterol, który ma być zredukowany inkubuje się z białkiem wytworzonym sposobem określonym w zastrz. 46 albo 48, albo 50, albo 52 i ewentualnie izoluje się zredukowany sterol.
  55. 55. Sposób według zastrz. 54, znamienny tym, że uzyskany zredukowany sterol jest substratem enzymu restrykcyjnego łańcucha bocznego cholesterolu (P450SCC).
  56. 56. Sposób redukcji in vivo egzogennego sterolu nienasyconego w pozycji C-7, znamienny tym, że sterol inkubuje się z komórką gospodarza stransformowaną określoną w zastrz. 34 albo 38, albo 40, albo 44 i ewentualnie izoluje się zredukowany sterol.
  57. 57. Sposób według zastrz. 56, znamienny tym, że uzyskany zredukowany sterol jest substratem enzymu restrykcyjnego łańcucha bocznego cholesterolu (P45OSCC).
  58. 58. Sposób redukcji in vivo sterolu endogennego nienasyconego w pozycji C-7, znamienny tym, że hoduje się transformowaną komórkę gospodarza, określoną w zastrz. 34 albo 44, która jest komórką drożdży lub grzybów nitkowatych i ewentualnie izoluje się gromadzony zredukowany sterol.
  59. 59. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że endogenny sterol, który ma być zredukowany jest ergosta-5,7-dien-3-o!em, ergosta-5,7/24(28)-trien-3-olem albo ergosta-5,7,22trien-3-olem lub ich mieszaniną.
  60. 60. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że uzyskany zredukowany sterol jest substratem enzymu restrykcyjnego łańcucha bocznego cholesterolu (P^SCC).
  61. 61. Sposób wytwarzania pregnenolonu, znamienny tym, że hoduje się transformowane komórki gospodarza określone w zastrz. 45, a zgromadzony sterol endogenny lub sterole zredukowane w pozycji C-7 ewentualnie izoluje się, zredukowane sterole inkubuje się w obecności P45OSCC oraz, ewentualnie, w obecności reduktazy adrenodoksynowej (ADR) i adrenodoksyny (ADX), a uzyskany pregnenolon ewentualnie izoluje się.
  62. 62. Sposób według zastrz. 61, znamienny tym, że komórka gospodarza jest komórką drożdży.
  63. 63. Sposób wytwarzania pregnenolonu, znamienny tym, że hoduje się drożdże, transformowane jednym lub więcej wektorem umożliwiającym koekspresję białka o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterołowej i P45,SCC oraz, ewentualnie, ADR i ADX i ewentualnie izoluje się wolny lub estryfikowany pregnenolon.
  64. 64. Sposób wytwarzania pregnenolonu, według zastrz. 63, znamienny tym, że hoduje się transformowane drożdże koekspresjonujące białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,
    7-sterolowej, P450SCC, ADR i ADX.
  65. 65. Sposób według zastrz. 63, znamienny tym, że białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej jest białkiem A. thaliana delta-7Red.
  66. 66. Sposób według zastrz. 63, znamienny tym, że szczep drożdży jest szczepem EC0i/pCD63.
    185 569
  67. 67. Transformowany szczep drożdży koekspresjonujących białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7- sterolowej, P450SCC, ADR i ADX i gromadzących wolny lub estryfikowany pregnenolon.
  68. 68. Szczep drożdży, według zastrz. 67, znamienny tym, że białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7- sterolowej, jest białkiem A. thaliana delta-7Red.
  69. 69. Szczep drożdży, według zastrz. 67 zwany EC01/pCD63.
  70. 70. Ludzka sekwencja DNA określona w zastrz. 43, do stosowania jako sonda do diagnozowania wrodzonego niedoboru delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej.
  71. 71. Sposób detekcji niedoboru delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, znamienny tym, że obejmuje inkubację próbki zawierającej ludzki genomowy DNA z sondą określoną w zastrz. 70, w standardowych warunkach hybrydyzacji i ujawnienie przyłączenia lub nieprzyłączenia sondy do genomowego DNA, przy czym brak przyłączenia lub jego zmniejszenie świadczy o wrodzonym niedoborze delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej.
PL96312828A 1995-02-15 1996-02-15 Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, sposób klonowania takiego kwasu nukleinowego, białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i białko A. thaliana, sposób wytwarzania białka i sposób wytwarzania pregnenolonu, sposób redukcji in vivo i in vitro steroli nienasyconych w pozycji C-7, przeciwciało, wektor ekspresyjny, stransformowany szczep drożdży, stransformowane komórki gospodarza i sposób detekcji niedoboru delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej PL185569B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9501723A FR2730494B1 (fr) 1995-02-15 1995-02-15 Sequence d'adn codant pour une proteine d'a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta7-red, procede de production, souches de levures transformees, applications
FR9506517A FR2734839B1 (fr) 1995-06-01 1995-06-01 Sequence d'adn codant pour une proteine d'a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta-7red, procede de production, souches de levures transformees, applications.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL312828A1 PL312828A1 (en) 1996-08-19
PL185569B1 true PL185569B1 (pl) 2003-06-30

Family

ID=26231759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96312828A PL185569B1 (pl) 1995-02-15 1996-02-15 Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, sposób klonowania takiego kwasu nukleinowego, białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i białko A. thaliana, sposób wytwarzania białka i sposób wytwarzania pregnenolonu, sposób redukcji in vivo i in vitro steroli nienasyconych w pozycji C-7, przeciwciało, wektor ekspresyjny, stransformowany szczep drożdży, stransformowane komórki gospodarza i sposób detekcji niedoboru delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej

Country Status (24)

Country Link
US (3) US5759801A (pl)
EP (1) EP0727489B1 (pl)
JP (1) JP4082469B2 (pl)
KR (1) KR100422293B1 (pl)
CN (2) CN1216995C (pl)
AR (2) AR003407A1 (pl)
AT (1) ATE457354T1 (pl)
BR (1) BRPI9600729B8 (pl)
CA (1) CA2169524C (pl)
CZ (1) CZ294860B6 (pl)
DE (1) DE69638123D1 (pl)
DK (1) DK0727489T3 (pl)
ES (1) ES2339833T3 (pl)
FI (1) FI120877B (pl)
HR (1) HRP960078B1 (pl)
HU (1) HU220587B1 (pl)
IL (4) IL162476A (pl)
PL (1) PL185569B1 (pl)
PT (1) PT727489E (pl)
RU (1) RU2242517C2 (pl)
SI (1) SI0727489T1 (pl)
SK (1) SK283656B6 (pl)
TR (1) TR199600116A2 (pl)
UA (1) UA72172C2 (pl)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6639130B2 (en) * 1996-06-21 2003-10-28 The General Hospital Corporation Plant sterol reductases and uses thereof
DE19739940A1 (de) * 1997-09-11 1999-03-18 Hartmut Prof Dr Med Glossmann Protein mit Aminosäuresequenz der DELTA7-Sterolreduktase, isoliertes cDNA-Molekül, das für das Protein kodiert, rekombinanter DNA-Vektor und biologisch aktive Zusammensetzungen, die das Protein oder das cDNA-Molekül enthalten
FR2774393B1 (fr) * 1998-02-05 2000-03-24 Hoechst Marion Roussel Inc Souches de levure ayant le gene atf2 interrompu et leurs applications
US6465717B1 (en) * 1998-11-20 2002-10-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sterol metabolism enzymes
FR2812884B1 (fr) * 2000-08-08 2002-11-08 Aventis Pharma Sa Levures modifiees et utilisations, notamment pour la production de derives steroidiens
FR2820145B1 (fr) * 2001-01-31 2004-01-23 Aventis Pharma Sa Souche de levure produisant des steroides de facon autonome
US7193169B2 (en) * 2003-10-29 2007-03-20 Alcon, Inc. Ergonomic footswitch
FR2869914B1 (fr) * 2004-05-06 2012-11-09 Aventis Pharma Sa Souches de levure produisant du cholesterol et leurs applications
JP2008532553A (ja) * 2005-03-16 2008-08-21 メタボリックス， インコーポレイテッド 生合成経路の化学的に誘導可能な発現
KR100672006B1 (ko) * 2005-08-03 2007-01-19 길병옥 폐자재를 이용한 형강의 제조방법 및 그 제조방법에 의해생산된 형강
PT2227549E (pt) 2007-12-21 2015-10-08 Novartis Ag Sistema de seleção para cultura de células eucarióticas com base num gene de recetor de folato ligado à membrana
DE102009022772A1 (de) 2009-05-21 2010-11-25 Organobalance Gmbh Mikroorganismus zur Expression eines humanen Membranproteins
FR2961218A1 (fr) * 2010-06-10 2011-12-16 Sanofi Aventis Methode de detection de composes modulateurs du metabolisme du cholesterol
CN102286053B (zh) * 2011-06-20 2012-09-05 河北联合大学 孕甾烯醇酮吡咯化合物及其制备方法
JP6635917B2 (ja) * 2013-06-17 2020-01-29 サノフイＳａｎｏｆｉ チトクロムｐ４５０モノオキシゲナーゼ生体触媒作用のための全細胞系
CN110903993A (zh) * 2019-12-20 2020-03-24 河北兰升生物科技有限公司 一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
CN112813129B (zh) * 2021-02-05 2023-09-08 江南大学 利用区室化提高酵母菌中7-脱氢胆固醇产量的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2554986A (en) * 1950-01-05 1951-05-29 Upjohn Co Synthesis of pregnenolone
JPS6447380A (en) * 1987-08-19 1989-02-21 Agency Ind Science Techn Steroid-oxidizing yeast strain
CN1042567A (zh) * 1988-09-23 1990-05-30 吉斯特-布罗卡迪斯公司 类固醇多步氧化方法和所用的遗传工程细胞
JP2645130B2 (ja) * 1989-03-31 1997-08-25 日清製粉株式会社 ステロイド誘導体
US5212167A (en) * 1991-09-12 1993-05-18 Trustees Of Boston University Modulation of receptor-mediated ion transport
US5547868A (en) * 1993-06-09 1996-08-20 Regents Of The University Of California Cholesterol disposal fusion enzymes

Also Published As

Publication number Publication date
DE69638123D1 (de) 2010-03-25
EP0727489B1 (fr) 2010-02-10
CN1664107A (zh) 2005-09-07
ES2339833T3 (es) 2010-05-25
IL162476A (en) 2005-12-18
HRP960078A2 (pl) 1998-02-28
CZ294860B6 (cs) 2005-04-13
HRP960078B1 (en) 2011-11-30
RU2242517C2 (ru) 2004-12-20
KR100422293B1 (ko) 2004-06-14
PL312828A1 (en) 1996-08-19
KR960031607A (ko) 1996-09-17
PT727489E (pt) 2010-04-27
JP4082469B2 (ja) 2008-04-30
FI960663L (fi) 1996-08-16
BRPI9600729B1 (pt) 2017-06-20
CA2169524C (fr) 2012-05-01
US5759801A (en) 1998-06-02
US5965417A (en) 1999-10-12
AR003407A1 (es) 1998-08-05
IL116872A0 (en) 1996-07-23
CN1216995C (zh) 2005-08-31
IL162476A0 (en) 2005-11-20
JPH08289793A (ja) 1996-11-05
EP0727489A1 (fr) 1996-08-21
SK283656B6 (sk) 2003-11-04
CA2169524A1 (fr) 1996-08-16
HU220587B1 (hu) 2002-03-28
CZ43296A3 (en) 1996-12-11
ATE457354T1 (de) 2010-02-15
IL162477A0 (en) 2005-11-20
CN1145953A (zh) 1997-03-26
DK0727489T3 (da) 2010-05-31
AR053931A2 (es) 2007-05-23
TR199600116A2 (tr) 1996-08-21
HUP9600325A3 (en) 1999-07-28
IL116872A (en) 2004-12-15
UA72172C2 (uk) 2005-02-15
HUP9600325A1 (en) 1996-11-28
SK18896A3 (en) 1996-10-02
FI120877B (fi) 2010-04-15
US5989881A (en) 1999-11-23
BRPI9600729B8 (pt) 2021-07-06
FI960663A0 (fi) 1996-02-14
BRPI9600729A (pt) 1997-12-23
SI0727489T1 (sl) 2010-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL185569B1 (pl) Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej, sposób klonowania takiego kwasu nukleinowego, białko o aktywności delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej i białko A. thaliana, sposób wytwarzania białka i sposób wytwarzania pregnenolonu, sposób redukcji in vivo i in vitro steroli nienasyconych w pozycji C-7, przeciwciało, wektor ekspresyjny, stransformowany szczep drożdży, stransformowane komórki gospodarza i sposób detekcji niedoboru delta-7 reduktazy delta-5,7-sterolowej
CA2435096C (en) Yeast strains autonomously producing steroids
JP3283551B2 (ja) 酵母中でスクアレンおよび特異的なステロールの蓄積を増加させるための方法と組成物
JP5889200B2 (ja) 酵母による非酵母ステロールの生成
KR20140057319A (ko) 사프란 화합물의 재조합 생성을 위한 방법 및 물질
EP2386634A1 (en) Sterol side chain-cleaving enzyme protein and use thereof
AU2018285734B2 (en) Demethylation of reticuline and derivatives thereof with fungal cytochrome P450
EP1231266B1 (en) Arabidopsis-origin gdp-4-keto-6-deoxy-d-mannose-3,5-epimerase-4-reductase gene
CN1263558A (zh) 具有间断的atf2基因的酵母菌株及其用途
Galuska Regulated degradation of the Saccharomyces cerevisiae Δ-9 fatty acid desaturase
JP2001224389A (ja) シグナル配列を用いた遺伝子のクローニング方法
JPH10146200A (ja) シグナル配列を用いた遺伝子のクローニング方法
FR2730494A1 (fr) Sequence d&#39;adn codant pour une proteine d&#39;a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta7-red, procede de production, souches de levures transformees, applications