PT2227549E

PT2227549E - Sistema de seleção para cultura de células eucarióticas com base num gene de recetor de folato ligado à membrana

Info

Publication number: PT2227549E
Application number: PT88653043T
Authority: PT
Inventors: Thomas Jostock; Hans-Peter Knopf; Yehuda G Assaraf
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2015-10-08
Also published as: JP5660900B2; CN101903526A; KR101706390B1; US20160355828A1; RU2010129550A; CA2709503A1; IL206233A; CA2709503C; CN103805633B; US20200370055A1; IL206233A0; US10767186B2; US20140295489A1; RU2502802C2; PL2227549T3; AU2008340017B2; KR20100111698A; US20100330572A1; ES2546086T3; JP6002183B2

Description

DESCRIÇÃO

SISTEMA DE SELEÇÃO PARA CULTURA DE CÉLULAS EUCARIOTICAS COM BASE NUM GENE DE RECETOR DE FOLATO LIGADO À MEMBRANA

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um sistema de seleção inovador para utilização num processo de cultura de células eucarióticas e para expressão de um produto recombinante de interesse. 0 sistema de seleção baseia-se na introdução de um gene de recetor de folato unido à membrana funcional exógeno em conjunto com o polinucleótido ou gene codificando o produto de interesse numa célula eucariótica e pode ser amplamente utilizado com células eucarióticas para as quais a viabilidade celular depende da absorção de ácido fólico.

Antecedentes da invenção São amplamente utilizados marcadores de seleção e sistemas de seleção na manipulação genética, tecnologia de ADN recombinante e produção de produtos recombinantes, por exemplo anticorpos, hormonas e ácidos nucleicos, em cultura celular eucariótica. 0 objetivo primário de tais marcadores de seleção e sistemas de seleção dominantes é a introdução de um gene selecionável que após exposição a condições de crescimento seletivo proporciona células capazes de produção a alto nivel dos produtos recombinantes de interesse.

Até à data, existem 3 sistemas de marcadores de seleção disponíveis: (a) 0 sistema da glutamina sintetase: A enzima glutamina sintetase (GS) é responsável pela biossíntese de glutamina a partir de glutamato e amoníaco. Esta reação biossintética proporciona a via única para a formação de glutamina em células de mamíferos. Assim, na ausência de glutamina no meio de crescimento, a enzima GS é essencial para a sobrevivência de células de mamíferos em cultura. De maneira importante, determinadas linhas celulares de mamíferos incluindo células de mieloma de ratinho carecem da expressão de GS suficiente e como tal não podem sobreviver sem glutamina adicionada de forma exógena. Por isso, uma tal linha celular é um acetor adequado para um gene GS transfetado que neste sistema pode funcionar como um marcador selecionável que permite o crescimento celular num meio carente de glutamina. Em contraste, linhas celulares tais como as amplamente utilizadas células de ovário de hámster chinês (CHO) expressam suficiente GS para sustentar o crescimento em meio isento de glutamina. Portanto, se estas células CHO se destinam a ser utilizadas como as células recetoras para a transfeção do gene GS, o inibidor específico e potente de GS sulfoximina de metionina (MSX) pode ser aplicado de forma a inibir a atividade de GS endógena para que somente transfetantes expressando níveis elevados do gene GS transfetado possam sobreviver num meio isento de glutamina. Uma principal desvantagem do sistema GS é o tempo relativamente longo (isto é, 2,6 meses) de crescimento seletivo de forma a estabelecer células sobre-expressando de forma estável o gene alvo de interesse. Outra desvantagem é a frequente utilização do agente citotóxico MSX para o aumento da pressão seletiva. A presença de um tal agente citotóxico juntamente com um produto de interesse recombinante (por exemplo um polipéptido como um anticorpo) pode requerer etapas de purificação adicional para eliminar este agente citotóxico. (b) 0 sistema de seleção da dihidrofolato redutase/MTX: A dihidrofolato redutase (DHFR) catalisa a redução dependente de NADP do ácido dihidrofólico a ácido tetrafólico (THF) . 0 THF é então interconvertido a 10- formil-THF e 5, 10-metileno-THF que são utilizados na biossintese de novo de purinas e timidilato, respetivamente. 0 DHF é o subproduto da atividade catalítica da timidilato sintase (TS) que catalisa a conversão de dUMP a dTMP numa reação dependente de 5,10-metileno-THF. Assim, DHFR é crucial para a reciclagem de cofatores de THF que são essenciais para a biossintese de nucleótidos de purina e pirimidina que são necessários para a replicação de ADN. Por isso, células (por exemplo células CHO) que carecem do gene DHFR (isto é, através de deleção genómica direcionada) podem ser utilizadas como recetores para a transfeção do gene DHFR num meio que é isento de nucleótidos. Após a transfeção, as células podem ser submetidas a um aumento gradual das concentrações do antifolato MTX, um inibidor de CHFR bastante potente (Kd=l pM) , desta forma forçando as células a produzir níveis aumentados de DHFR. Após várias rondas de seleção, o marcador selecionável DHFR é frequentemente submetido a amplificação génica significativa. Além disso, um DHFR de ratinho mutante com uma grande resistência a MTX foi também extensamente utilizado como um marcador selecionável dominante que potência marcadamente a aquisição de resistência a MTX de alto nível em células transfetantes. Uma principal desvantagem do sistema de seleção CHFR/MTX é que esta técnica utiliza um agente citotóxico mutagénico, MTX, que pode prontamente alterar o genótipo das células recetoras. Adicionalmente, podem ter de ser tomadas medidas de segurança específicas para proteger as pessoas manipulando tais agentes. Isto resulta frequentemente em populações de células resistentes a MTX nas quais não está presente qualquer expressão do gene alvo de interesse devido a mutações de perda de função no portador de folato reduzido (RFC) e/ou perda de expressão génica de RFC, dos quais ambos abolem a absorção de MTX.

Outra desvantagem é que o fármaco mutagénico MTX pode prontamente contaminar o produto alvo sobre-expresso secretado (por exemplo um polipéptido como um anticorpo) contido no meio de crescimento desta forma requerendo métodos cromatográficos de laboriosos, morosos e dispendiosos necessários para eliminar este composto mutagénico, MTX. Adicionalmente, a ausência de MTX no produto final deve ser demonstrada através de ensaios respetivos. (c) 0 sistema de seleção de portador de folato reduzido: 0 portador de folato reduzido (RFC) é uma glicoproteina de membrana expressa de forma ubíqua que serve como o principal transportador para a absorção de folatos reduzidos tais como 5-metil-THF e 5-formil-THF. Contudo, o RFC exibe uma afinidade muito pobre para o folato oxidado, o ácido fólico. Por isso, células que carecem da expressão de RFC ou que sofreram deleção do locus genómico de RFC podem servir como recetoras para a transfeção do RFC de gene marcador selecionável sob condições nas quais os folatos reduzidos tais como 5-formil-THF são gradualmente privados do meio de crescimento desta forma forçando as células a expressar níveis aumentados deste transportador de folato. Existem várias desvantagens para o sistema de seleção de RFC: a) Devem ser utilizadas células recetoras sem RFC nas quais o locus de RFC endógeno foi submetido a knock-out ou inativado através de knockout direcionado ou perda de mutações de função, b) o RFC tem uma afinidade de transporte muito pobre para o ácido fólico e como tal este folato oxidado não pode ser utilizado para seleção, c) Ao contrário do sistema à base de folato-recetor atual que é um sistema de absorção de folato unidirecional e que será explicado detalhadamente abaixo, RFC é um transportador de folato bidirecional que exibe importação e exportação igualmente potentes de folatos. Isto implica que sob condições de privação de folato, a sobre-expressão de RFC pode ser prejudicial para as células recetoras que exportam adicionalmente folato através do RFC sobre-expresso. 0 objetivo da presente invenção é proporcionar um sistema de seleção metabólico inovador que tem determinadas vantagens sobre os sistemas de seleção das técnicas anteriores mencionados acima. 0 sistema de seleção inovador é baseado na utilização de folatos no meio de cultura celular e na presença de recetores de folato introduzidos através de um vetor de expressão na célula eucariótica recombinante destinada a produzir um produto de interesse. Esta abordagem inovadora não requer qualquer deleção anterior de um gene de recetor de folato endógeno (FR) . Após a introdução de um vetor abrangendo tanto o gene selecionável de FR como o polinucleótido codificando um produto de interesse (como um polipéptido), as células crescem num meio seletivo contendo concentrações altamente limitantes de folatos. Por isso, somente células que sobre expressam marcadamente FR podem absorver folatos suficientes para sustentar o crescimento celular, replicação de ADN e proliferação celular, desta forma permitindo a sobre expressão do produto alvo de interesse. 0 folato oxidado, isto é, ácido fólico, bem como os derivados reduzidos do ácido fólico, conhecidos como folatos reduzidos ou tetrahidrofolatos (THF) são um grupo de vitaminas B-9 que são cofatores essenciais e/ou coenzimas para a biossintese de purinas, timidilato e determinados aminoácidos em células eucarióticas, em particular de mamíferos. Os cofatores de THF são particularmente cruciais para a replicação de ADN e como tal proliferação celular. Especificamente, os cofatores de THF funcionam como dadores de unidades monocarbono numa série de vias metabólicas interconetadas envolvendo biossíntese de novo de purinas e timidilato, aminoácidos bem como metabolismo do grupo metilo, incluindo metilação de ADN por ilhas de CpG. Especificamente, os cofatores de THF incluindo 10-formil-THF (10-CHO-THF) contribuem unidades monocarbono em duas reações de novo de formiltransferase fundamentais envolvidas na biossíntese de novo de purinas. A primeira enzima, glicinamida ribonucleótido transformilase (GARTF), está envolvida na formação do anel de imidazol de purinas, enquanto a reação mais a jusante mediada pela 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleótido transformilase (AICARTF) produz o intermediário de purina inosina 5'-monofosfato (IMP). Este último serve como um precursor fundamental na biossíntese regulada de AMP e GMP. Além disso, o 5, 10-metileno-THF (5,10-CH2-THF), é outra coenzima importante de THF que funciona como um cofator crucial para a enzima timidilato sintase (TS) . A TS catalisa a formação de timidina monofosfato (dTMP) a partir de dUMP. Por isso, estas enzimas dependentes de folato são mediadores fundamentais da biossíntese de novo de nucleótidos de purinas e timina essenciais para a replicação de ADN. Como tal, estas enzimas dependentes de folato foram identificadas como alvos para a atividade de antagonistas do ácido fólico conhecidos como antifolatos. Por exemplo, o análogo do ácido 4-amino fólico aminopterina e o seu homólogo ácido 4-animo-10-metilfólico, metotrexato (MTX) foram o primeiro tipo de antimetabolitos que foram introduzidos na clínica para o tratamento quimioterapêutico de leucemia linfoblástica aguda infantil (ALL). Os antifolatos são atualmente componentes fundamentais de diferentes regimes quimioterapêuticos atualmente utilizados para o tratamento de outras malignidades humanas incluindo osteossarcoma, cancro da mama, linfoma do sistema nervoso central primário, coriocarcinoma e neoplasia trofoblástica gestacional.

Em contraste com a maioria dos procariotas, as plantas, fungos e determinados protistas que sintetizam os seus próprios folatos, mamíferos e outras espécies eucarióticas são desprovidos da biossíntese do cofator THF e devem como tal obtê-los a partir de fontes exógenas. São atualmente conhecidos três sistemas de transporte para mediar a absorção de folatos e antifolatos em células de mamíferos: a) 0 sistema de transporte celular predominante de cofatores de folato reduzido é o portador de folato reduzido (RFC). 0 RFC (também conhecido como membro 1 da família de portadores de solutos 19, SLC19A1) é uma glicoproteína de membrana de -85 kDa expressa de forma ubíqua funcionando como um portador facilitador bidirecional que medeia o transporte ascendente de folatos reduzidos através de permuta de fosfatos orgânicos tais como nucleótidos de adenina que são conhecidos por acumular-se até níveis intracelulares muito elevados bem como tiamina mono- e pirofosfato. RFC exibe uma elevada afinidade para cofatores THF incluindo leucovorina (5-formil-THF; Kt = 1 μΜ) , enquanto abrangendo somente uma afinidade de transporte muito pobre (Kt = 200-400 μΜ) para o ácido fólico, um folato oxidado. b) Outra via de absorção de folato é o transportador de folato acoplado a protões (PCFT, também conhecido como SLC46A) que foi recentemente clonado. PCFT parece ser expresso independentemente de RFC, funciona otimamente a pH ácido (5,5) e medeia o influxo tanto de cofatores oxidados (por exemplo ácido fólico) como THF (por exemplo folatos reduzidos) bem como vários antifolatos hidrofílicos incluindo MTX. PCFT, que mostra um transporte ótimo de folatos e antifolatos a pH ácido (5,5) mas nenhum a pH fisiológico (7,4), tem um papel fundamental na absorção tanto de folatos como de antifolatos no intestino delgado superior. c) A terceira via de transporte, na qual se baseia a presente invenção, envolve recetores de folato (FRs). FRs são glicoproteínas de ligação a folato de elevada afinidade codificadas por três genes diferentes FRa (FR alfa), FRp (FR beta) e FRy (FR gama). FRa (ou FR-alfa) é também conhecido como Proteína de Ligação a Folato Adulta ou FDP, como Recetor de Folatol ou FOLR (em ratinhos folbpl), e como Antigénio Associado a Cancro de Ovário ou MOv 18. FRp (ou FR beta) é também conhecido como F0LR2 (fetal) e como FBP/PL-1 (placenta) . FRy (ou FR gama) é também conhecido como F0LR3 e como FR-G (revisto por M.D. Salazar e M. Ratnam, Cancer Metastasis Rev. 2007 26(1), pp.141-52). Os FRs maduros, que são bem caracterizados, são proteínas homólogas com 70-80% de identidade de aminoácidos e contêm 229 a 236 aminoácidos bem como dois a três sítios de N-glicosilação. FRa (FR alfa) e FRp (FR beta) são glicoproteínas de superfície celular, ligadas à membrana, em particular ancoradas a glicosilfosfatidilinositol (GPI), enquanto FRy é desprovido de uma âncora GPI e é uma proteína secretada. FRa (FR alfa) e FRp (FR beta) exibem uma afinidade elevada para ácido fólico (Kd = 0,1-1 nM) , ácido 5,10-dideazatetrahidrofólico (DDATHF); lometrexol; Ki = 0,4- 1,3 nM utilizando ácido [3H]fólico como substrato) e BGC945 (que é um inibidor de timidilato sintase á base de ciclopenta[g]quinazolina transportado especificamente somente através de FRa (FR alfa) e não através do portador de folato reduzido) (Kd = 1 nM), mas muito menor afinidade para MTX (Kd >100 nM) . A absorção de folato e antifolatos dependente de FR procede através de um mecanismo clássico de endocitose mediada por recetor. Estudos de knockout génico mostraram que FRa (FR alfa) (também conhecido como Folbpl em ratinhos) é essencial para o desenvolvimento embrionário precoce e a suplementação materna de folato evitou a letalidade embrionária in utero e permitiu o desenvolvimento normal.

Existe uma necessidade continuada de um sistema de seleção seguro, altamente eficaz e economicamente eficiente que supera uma ou mais das desvantagens dos sistemas de seleção conhecidas até à data.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a um vetor de expressão eucariótico compreendendo um primeiro polinucleótido codificando um recetor de folato ligado à membrana funcional e um segundo polinucleótido codificando um produto de interesse, em que o produto de interesse é um polipéptido farmaceuticamente ou terapeuticamente ativo ou de diagnóstico. A presente invenção refere-se adicionalmente a células eucarióticas para as quais a viabilidade celular é dependente da absorção de ácido fólico, e nas quais o dito vetor de expressão foi introduzido de forma estável de tal forma que o recetor de folato funcional codificado pelo vetor é expresso por parte das células.

Além disso, a presente invenção refere-se a um método de seleção para proporcionar uma célula eucariótica recombinante capaz de expressar de forma estável o produto de interesse em elevados rendimentos. A presente invenção pode favoravelmente ser utilizada num processo para a produção do produto de interesse em elevados rendimentos.

Descrição Detalhada da Invenção

No curso da presente invenção, foi agora surpreendentemente constatado que um sistema de seleção para proporcionar células eucarióticas recombinantes capazes de produzir um produto de interesse pode ser baseado na disponibilidade limitada de um folato num meio de cultura celular. 0 sistema será amplamente aplicável, isto é, a uma célula eucariótica cuja viabilidade celular depende da absorção de um folato. 0 sistema inovador pode ser utilizado para a seleção acelerada, rastreio e estabelecimento de clones celulares eucarióticos, por exemplo de mamíferos, que expressam de forma estável elevados níveis de produtos recombinantes na ausência de fármacos citotóxicos. Ainda mais, e em contraste com outros sistemas de seleção conhecidos, não existe a necessidade essencial (embora algumas vezes factível) de células modificadas, proporcionadas por exemplo mutando ou submetendo a knockout gene(s) endógeno (s) . Já que por exemplo FRa (FR alfa) exibe uma afinidade mais elevada para FA (KD = 0,1 nM) que, por exemplo, RFC para leucovorina (Kt = 1 μΜ) , e transporta ácido fólico para as células através de uma via unidirecional a presente invenção proporciona a utilização de FRa (FR alfa) e outros recetores de folato como um marcador selecionável metabólico dominante marcadamente melhorado, em particular, através de privação gradual de folato (por exemplo ácido fólico) a partir do meio de crescimento. A seleção baseada em folato inovadora é uma excelente estratégia que é bem adequada para a sobre expressão acelerada, estável e de alto nível de proteínas alvo em células de mamíferos cultivadas na ausência de seleção por fármacos citotóxicos conforme rotineiramente utilizado em vários sistemas de sobre expressão. O sistema de seleção inovador mostra várias ventagens importantes sobre os sistemas de seleção disponíveis nas técnicas anteriores. 1. O sistema de seleção de acordo com a presente invenção é um sistema de seleção muito rápido: No prazo de quatro semanas de privação de ácido fólico, a população celular ou os derivados celulares expressando o gene alvo de interesse podem ser prontamente isolados. Isto ocorre em contraposição ao sistema GS mencionado acima que pode requerer 2-6 meses de seleção e estabilização do gene alvo. 2. 0 sistema de seleção de acordo com a presente invenção não requer uma deleção genómica ou atenuação dos genes FRa (FR alfa) , β (beta) ou γ (gama) endógenos anteriormente à transfeção e como tal pode ser aplicado a qualquer recetor inclusive quando alguma expressão de genes FR endógenos está presente. Esta ventagem fundamental baseia-se no facto de que após a transfeção de FRa (FR alfa) , as células podem ser expostas a uma privação abrupta e grave de folatos (por exemplo ácido fólico) a partir do meio de crescimento. Consequentemente, somente células transfetantes que expressam quantidades significativas do marcador FRa (FR alfa) selecionável podem transportar suficiente folato para sustentar a replicação de ADN e a proliferação celular. Isto ocorre na ausência de qualquer elevação significativa da expressão do gene FRa (FR alfa) endógeno. Isto ocorre em contraste ao sistema DHFR/MTX mencionado acima no qual as células recetoras sofrem frequente eliminação do gene DHFR endógeno (por exemplo células CHO DG44 e células CHO Dux). c) Este sistema de seleção de acordo com a presente invenção não sofre perda de restringência de seleção devido à aliviação da pressão seletiva através do aumento da expressão de vias alternativas de absorção de folato incluindo aumento da expressão do RFC endógeno. Esta vantagem importante é devida ao facto de que enquanto FRa (FR alfa) tem uma excelente afinidade para o ácido fólico (Kd = 0,1 nM) , o RFC exibe uma afinidade extremamente pobre para o ácido fólico (Km = 0,2-0,4 mM). Em contraste, vários sistemas de seleção de técnicas anteriores incluindo o sistema DHFR/MTX podem sofrer uma perda grave de seleção já que após a seleção por MTX, podem ser frequentemente obtidas células resistentes a MTX que têm pouca ou nenhuma expressão de marcador selecionável. Em vez disso, a perda de função do RFC, o transportador primário de MTX pode tornar-se um mecanismo frequente de resistência a MTX. Isto foi mostrado como sendo devido à emergência frequente de mutações de inativação do gene RFC ou perda grave de expressão génica de RFC. d) 0 sistema de seleção de acordo com a presente invenção não utiliza um fármaco citotóxico e/ou composto mutagénico tal como MTX no sistema CHFR ou MSX no sistema GS que pode alterar o genótipo das células recetoras bem como o do gene alvo de interesse. Em vez disso, a seleção por FR utiliza o principio de privação de uma vitamina a partir do meio de crescimento.

Consequentemente, num aspeto a presente invenção refere-se assim a um vetor de expressão eucariótico compreendendo um primeiro polinucleótido codificando um recetor de folato ligado à membrana funcional (isto é, o gene marcador selecionável) e um segundo polinucleótido codificando um produto de interesse, em que o produto de interesse é um polipéptido farmaceuticamente ou terapeuticamente ativo ou de diagnóstico.

Um recetor de folato ligado à membrana funcional de acordo com a presente invenção é particularmente definido como um recetor ligado à membrana funcional capaz de importação unidirecional ou absorção de um folato por uma célula eucariótica.

Um folato de acordo com a presente invenção pode ou ser um folato oxidado (isto é, ácido fólico) ou um folato reduzido. Em geral, um folato pode ser útil dentro da presente invenção desde que tal folato seja capaz de ser absorvido por uma célula eucariótica através do recetor de folato ligado à membrana funcional. Um exemplo preferido de um folato oxidado é o ácido fólico. Exemplos preferidos de folatos reduzidos são o ácido 5-metil-tetrahidrofólico, ácido 5-formil-tetrahidrofólico, ácido 10-formil-tetrahidrofólico e ácido 5,10-metileno-tetrahidrofólico.

Numa forma de realização preferida, o vetor de expressão da presente invenção é capaz de expressar tanto o recetor de folato ligado à membrana funcional como o produto de interesse numa célula eucariótica. 0 produto de interesse codificado pelo segundo polinucleótido pode ser qualquer produto biológico capaz de ser produzido através de transcrição, tradução ou qualquer outro evento de expressão da informação genética codificada pelo segundo polinucleótido. Neste contexto, o produto será um produto de expressão. Por exemplo, numa forma de realização preferida, um tal produto é selecionado a partir do grupo consistindo num polipéptido, um ARN, e um ADN. Um "polipéptido" refere-se a uma molécula compreendendo um polímero de aminoácidos ligados através de ligação(ões) peptídica(s). 0 termo "polipéptido" inclui polipéptidos de qualquer comprimento, que podem ser chamados "proteína" no caso de uma molécula mais longa (compreendendo por exemplo mais de 50 aminoácidos) , ou "péptido" no caso de uma molécula mais pequena "compreendendo por exemplo 2-49 aminoácidos) . O produto pode ser um composto farmaceuticamente ou terapeuticamente ativo, ou uma ferramenta de pesquisa a ser utilizada em ensaios e semelhantes. Numa forma de realização particularmente preferida, o produto é um polipéptido, preferentemente um polipéptido farmaceuticamente ou terapeuticamente ativo, ou uma ferramenta de pesquisa a ser utilizada em diagnóstico ou outros ensaios e semelhantes. Numa forma de realização mais preferida o polipéptido é uma molécula de imunoglobulina ou anticorpo, ou um fragmento (em particular um fragmento funcional) do mesmo, por exemplo um anticorpo quimérico, ou parcialmente ou totalmente humanizado. Um tal anticorpo pode ser um anticorpo de diagnóstico, ou um anticorpo farmaceuticamente ou terapeuticamente ativo. Tipicamente, o produto de interesse será heterólogo à célula hospedeira eucariótica utilizada para a expressão, o que significa que a célula hospedeira não produz naturalmente ou endogenamente o produto de interesse anteriormente à transfeção. Em vez disso, de forma a alcançar a produção ou expressão do produto de interesse deve ser introduzido um polinucleótido codificando o produto de interesse na célula hospedeira eucariótica, em particular através de transfeção com um vetor de expressão de acordo com a presente invenção.

Um vetor de acordo com a presente invenção pode estar presente em forma linear ou, preferentemente, em forma circular, por exemplo um plasmideo.

Vetores utilizados para a expressão de polinucleótidos de interesse contêm habitualmente elementos de controlo transcricional adequados para conduzir a transcrição tais como por exemplo promotores, potenciadores, sinais de poliadenilação, pausas na transcrição ou sinais de terminação. Se o produto desejado é uma proteína, são habitualmente incluídos no vetor elementos de controlo traducional adequados, tais como por exemplo regiões 5' não traduzidas levando a estruturas de cap 5' adequadas para recrutar ribossomas e codões de terminação para terminar o processo de tradução. Em particular, tanto o polinucleótido servindo como o gene marcador selecionável como o polinucleótido codificando para o produto de interesse será transcrito sob o controlo de elementos de transcrição presentes em promotores adequados. Os transcritos resultantes tanto do gene marcador selecionável como do produto de interesse abrangem elementos de tradução funcionais que facilitam níveis substanciais de expressão proteica (isto é, tradução).

Consequentemente, uma forma de realização preferida refere-se a um vetor de expressão de acordo com a presente invenção em que o primeiro polinucleótido e o segundo polinucleótido estão sob o controlo de diferentes promotores da transcrição. Em geral, um promotor capaz de promover a expressão, em particular a transcrição, do primeiro e/ou segundo polinucleótido numa célula eucariótica será adequado. Numa forma de realização preferida, os diferentes promotores de transcrição são os mesmos. Noutra forma de realização preferida os diferentes promotores de transcrição são diferentes. Preferentemente, os promotores de transcrição são selecionados a partir do grupo consistindo num promotor SV40, um promotor CMV, um promotor EF1 alfa, um promotor RSV, um promotor BR0AD3, um promotor rosa 26 de ratinho, um promotor pCEFL e um promotor de β-actina. Numa forma de realização preferida do mesmo o promotor controlando a transcrição do primeiro polinucleótido e/ou segundo polinucleótido é o promotor CMV ou, mais preferentemente, um promotor SV40. Numa forma de realização preferida o promotor controlando a transcrição do primeiro polinucleótido é um promotor SV40.

Noutra forma de realização preferida de um vetor de expressão da presente invenção o primeiro polinucleótido e o segundo polinucleótido estão sob o controlo de um promotor de transcrição comum. Preferentemente, tal promotor de transcrição é selecionado a partir do grupo consistindo num promotor SV40, um promotor CMV, um promotor RSV, um promotor BR0AD3, um promotor rosa 26 de ratinho, um promotor pCEFL e um promotor de β-actina. Numa forma de realização adicional do mesmo o promotor de transcrição comum é um promotor SV40. Uma forma de realização preferida adicional do vetor de expressão tendo um tal promotor de transcrição comum compreende um elemento IRES funcionalmente situado entre o primeiro polinucleótido e o segundo polinucleótido. 0 recetor de folato ligado à membrana conforme introduzido na célula hospedeira eucariótica por meio de um vetor de expressão utilizado de acordo com a presente invenção pode ser derivado a partir de gualguer espécie desde que seja funcional dentro da presente invenção, isto é, compatível com a célula eucariótica utilizada. Preferentemente, será utilizado um recetor de folato derivado a partir de uma espécie de mamífero, por exemplo derivado a partir de um roedor, ou, mais preferido, um recetor de folato humano. Em geral, o recetor de folato introduzido na célula hospedeira eucariótica e utilizado como marcador de seleção pode ser homólogo ou heterólogo a um recetor de folato endógeno da célula hospedeira. Se for homólogo será derivado a partir da mesma espécie que a célula hospedeira, e pode, por exemplo, ser idêntico ao recetor de folato endógeno da célula hospedeira. Se for heterólogo será derivado a partir de uma espécie diferente à da célula hospedeira, e pode como tal ser diferente do recetor de folato endógeno da célula hospedeira. Tipicamente, o recetor de folato introduzido utilizado como o marcador de seleção será heterólogo à célula hospedeira. Por exemplo um recetor de folato derivado de humano pode ser utilizado como um marcador de seleção para uma célula hospedeira de roedor, por exemplo uma célula CHO.

Preferentemente, o recetor de folato ligado à membrana funcional codificado pelo primeiro polinucleótido de um vetor de expressão da presente invenção é selecionado a partir do grupo consistindo no recetor de folato alfa (FRa), o recetor beta de folato (FRp), e um mutante funcional do mesmo. Um mutante funcional compreende um derivado de um recetor de folato que é funcional de uma forma fisiológica, isto é, capaz de ser absorvido por parte da célula eucariótica e contribuindo para a viabilidade da célula através do metabolismo do folato da célula. Por exemplo, uma forma mutante do recetor de folato compreenderá uma ou mais mutação(ões) de aminoácidos, como uma substituição, deleção e/ou adição, bem como um derivado químico, em que uma fração química, como um polímero, por exemplo uma estrutura de polietilenoglicol (PEG), está unida ao recetor de folato. Preferentemente, o recetor de folato codificado pelo primeiro nucleótido é um recetor alfa de folato humano (hFRa), um recetor beta de folato humano (hFF^), ou um mutante funcional do mesmo. Mais preferido é um recetor alfa de folato humano (hFRa), preferentemente tendo a seguinte sequência de aminoácidos (SEQ ID NO 1, código de 1 letra, mostrada em direção desde o terminal N até ao terminal C):

MAQRMTTQLLLLLVWVAWGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRP

WRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWI

GQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEGWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVG

AACGPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAA

AMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS

Outra forma de realização preferida refere-se a um recetor beta de folato humano (ί^Εβ), tendo a seguinte sequência de aminoácidos (SEQ ID NO 2, código de 1 letra, mostrada em direção desde o terminal N até ao terminal C): MVWKWMPLLLLLVCVATMCSAQDRTDLLNVCMDAKHHKTKPGPEDKLHDGCSPWKKNA CCTASTSGELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVNQT WRKERFLDVPLCKEDCQRWWEDCHTSHTCKSNWHRGWDWTSGVNKCPAGALCRTFE SYFPTPAALCEGLWSHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVARFYAAAMHVNA GEMLHGTGGLLLSLALMLQLWLLG

Numa alternativa, a presente invenção refere-se a um recetor de folato que, no seu ambiente natural, não se encontra ligado à membrana. Um tal recetor não ligado à membrana pode ser mutado de forma a tornar-se ligado à membrana, por exemplo proporcionando uma proteína de fusão entre o recetor de folato não ligado à membrana e uma região transmembranar de outro polipéptido. Igualmente, são possíveis outras formas que poderiam estar prontamente disponíveis para um perito na especialidade. Exemplos preferidos neste contexto basear-se-iam no recetor gama de folato (FRy) solúvel, preferentemente o recetor gama de folato (FRy) solúvel humano. Numa forma de realização mais preferida do mesmo, o recetor gama de folato (FRy) solúvel humano teria a seguinte sequência de aminoácidos (SEQ ID NO 3, código de 1 letra, mostrada em direção desde o terminal N até ao terminal C):

MDMAWQMMQL LLLALVTAAG SAQPRSARAR TDLLNVCMNA KHHKTQPSPE DELYGQCSPW KKNACCTAST SQELHKDTSR LYNFNWDHCG KMEPTCKRHF IQDSCLYECS PNLGPWIRQV NQSWRKERIL NVPLCKEDCE RWWEDCRTSY TCKSNWHKGW NWTSGINECP AGALCSTFES YFPTPAALCE GLWSHSFKVS NYSRGSGRCI QMWFDSAQGN PNEEVAKFYA AAMNAGAPSR GIIDS que pode então ser mutado ou de outra forma geneticamente alterado ou derivado para formar um recetor de folato ligado à membrana funcional capaz de absorção de folato dentro do contexto da presente invenção.

Num aspeto adicional, o vetor de expressão de acordo com a presente invenção pode adicionalmente compreender um ou mais polinucleótido(s) adicional(is) codificando um ou mais marcador(es) de seleção adicional(is). Consequentemente, numa forma de realização preferida pode ser aplicada co-seleção utilizando o sistema de folato da presente invenção em conjunto com um ou mais sistema(s) de seleção diferente(s) (por exemplo neo/G418) para proporcionar desempenho ótimo.

Noutro aspeto, a presente invenção refere-se a células eucarióticas para as quais a viabilidade celular é dependente da absorção de folato, e em cuja célula eucariótica foram introduzidos um primeiro polinucleótido situado num vetor de expressão e codificando um recetor de folato ligado à membrana funcional e um segundo polinucleótido situado num vetor de expressão e codificando o produto de interesse, em que o primeiro polinucleótido e o segundo polinucleótido estão situados no mesmo vetor de expressão ou em vetores de expressão separados e em que o produto de interesse é um polipéptido farmaceuticamente ou terapeuticamente ativo ou de diagnóstico. Numa forma de realização preferida do mesmo, o recetor de folato ligado à membrana funcional e o produto de interesse são expressos por parte da célula eucariótica.

Adicionalmente ao recetor de folato ligado à membrana funcional introduzido na linha celular através de um vetor de expressão, a célula eucariótica de acordo com a presente invenção pode compreender pelo menos um sistema de transporte de folato funcional unidirecional endógeno, em particular um ou mais recetor(es) de folato ligado(s) à membrana funcional(is) endógeno(s). É uma vantagem da presente invenção que o método de seleção conforme descrito no presente documento possa ser utilizado inclusive na presença de tal sistema de transporte de folato funcional unidirecional endógeno, isto é, onde tal sistema endógeno se encontra retido. Consequentemente, uma forma de realização preferida adicional refere-se à célula eucariótica da presente invenção, compreendendo pelo menos um sistema de transporte de folato funcional unidirecional endógeno, em que tal sistema de transporte de folato funcional unidirecional endógeno preferentemente compreende pelo menos um recetor de folato ligado à membrana funcional endógeno. Numa forma de realização preferida do mesmo, o recetor de folato ligado à membrana funcional endógeno é selecionado a partir do grupo consistindo no recetor de folato alfa (FRa) e o recetor de folato beta (FR3).

Outra forma de realização preferida refere-se a uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção, em que o sistema de transporte de folato funcional unidirecional endógeno, por exemplo compreendendo pelo menos por exemplo um recetor de folato ligado à membrana funcional endógeno, carece de atividade completa, isto é, encontra-se atenuado. Tal atenuação pode ser proporcionada por exemplo através de qualquer tipo de mutagénese do sistema de transporte de folato endógeno em questão, por exemplo o recetor de folato ligado à membrana funcional endógeno, por exemplo através de mutação pontual, interrupção génica, e semelhantes. A atenuação pode ser parcial ou completa. No último caso a célula eucariótica de acordo com a presente invenção não compreende um sistema de transporte de folato funcional unidirecional endógeno, por exemplo um recetor de folato ligado à membrana funcional endógeno. Consequentemente, uma forma de realização da presente invenção refere-se a uma tal célula eucariótica em que foi introduzido de forma estável um vetor de expressão da presente invenção, e cuja célula carece de atividade completa de pelo menos um recetor de folato ligado à membrana funcional endógeno.

Relativamente ao vetor de expressão introduzido na tal célula hospedeira qualquer vetor de expressão da presente invenção, incluindo as suas formas de realização preferidas, conforme descrito no presente documento, pode ser utilizado. Numa forma de realização da célula eucariótica da presente invenção o primeiro polinucleótido codificando um recetor de folato ligado à membrana funcional e o segundo polinucleótido codificando o produto de interesse estão situados no mesmo vetor de expressão. Preferentemente, o tal vetor de expressão é um vetor de expressão de acordo com a presente invenção, isto é, conforme descrito no presente documento. A célula eucariótica de acordo com a presente invenção é, preferentemente, selecionada a partir do grupo consistindo numa célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula vegetal e uma célula de fungo. Relativamente a células vegetais e células de fungos, que habitualmente são prototróficas para folatos (isto é, tais células podem de maneira autónoma sintetizar os seus próprios folatos necessários para a sua viabilidade celular, isto é, crescimento e proliferação celular). A presente invenção abrange em particular as tais células de fungos e vegetais que podem tornar-se auxotróficas para folatos. Isto pode ser por exemplo devido a manipulação genética, isto é, células atualmente incapazes de sintetizar quantidades suficientes de folatos necessários para a sua viabilidade celular. Por exemplo, a capacidade das tais células de fungos ou vegetais para biossintetizar folatos de forma endógena, por exemplo, através de uma via metabólica adequada, será inativada, por exemplo através de interrupção génica ou silenciamento génico de genes alvo adequados, ou inibição de enzimas fundamentais, etc.

Numa forma de realização preferida da mesma a célula eucariótica é uma célula de mamifero. Preferentemente, a tal célula de mamifero é selecionada a partir do grupo que consiste numa célula de roedor, uma célula humana e uma célula de macaco. Particularmente preferida é uma célula de roedor, que preferentemente é selecionada a partir do grupo consistindo numa célula CHO, uma célula BHK, uma célula NSO, uma célula de fibroblasto 3T3 de ratinho, e uma célula SP2/0. Uma célula de roedor mais particularmente preferida é uma célula CHO. Também é preferida uma célula humana, que, preferentemente, é selecionada a partir do grupo que consiste numa célula HEK293, uma célula MCF-7, uma célula PerC6, e uma célula HeLa. Adicionalmente preferida é uma célula de macaco, que, preferentemente, é selecionada a partir do grupo que consiste numa célula COS-1, uma célula COS-7 e uma célula Vero.

Noutra forma de realização a presente invenção refere-se a um processo para produção de uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção, o dito processo compreendendo proporcionar uma célula eucariótica para a qual a viabilidade celular é dependente da absorção de folato, e introduzir um primeiro polinucleótido situado num vetor de expressão e codificando o recetor de folato ligado à membrana funcional e um segundo polinucleótido situado num vetor de expressão e codificando o produto de interesse, em que o primeiro polinucleótido e o segundo polinucleótido estão situados no mesmo vetor de expressão ou em vetores de expressão separados. Numa forma de realização preferida, o primeiro polinucleótido e o segundo polinucleótido estão situados no mesmo vetor de expressão que, numa forma de realização mais preferida, é um vetor de expressão de acordo com a presente invenção, isto é, conforme divulgado no presente documento.

Ainda outro aspeto da presente invenção refere-se a um método para seleção de uma célula eucariótica capaz de expressão de forma estável um produto de interesse codificado por um vetor de expressão que foi introduzido na célula, compreendendo (i) proporcionar uma pluralidade de células eucarióticas para a qual a viabilidade celular é dependente da absorção de folato, e em cujas células foram introduzidos um primeiro polinucleótido situado num vetor de expressão e codificando um recetor de folato ligado à membrana funcional e um segundo polinucleótido situado num vetor de expressão e codificando o produto de interesse, em que o primeiro polinucleótido e o segundo polinucleótido estão situados no mesmo vetor de expressão ou em vetores de expressão separados, (ii) cultivar a dita pluralidade de células eucarióticas num meio de cultura celular tendo uma concentração limitante de um folato, desta forma obtendo uma célula eucariótica em que a expressão estável do produto de interesse é alcançada. Em principio, o tal folato pode ser um folato oxidado ou um folato reduzido. Preferido é um folato oxidado, que em particular é ácido fólico.

Relativamente à quantidade limitante de um folato a concentração adequada no meio pode ser determinada por parte de um perito na especialidade de acordo com os requerimentos da célula hospedeira e a restringência da condição de seleção a ser aplicada. No case de que o ácido fólico seja utilizado como o folato, por exemplo com uma célula hospedeira CHO, uma concentração adequada de ácido fólico no meio de cultura celular para um processo de seleção restringente seria de cerca de 100 nM ou inferior, preferentemente cerca de 30 nM ou inferior, ou cerca de 10 nM ou inferior. Por exemplo, uma concentração adequada de ácido fólico pode ter qualquer valor no intervalo de 0,001 nM - 100 nM, preferentemente no intervalo de 0,01 - 100 nM, mais preferentemente no intervalo de 0,1 nM - 100 nM ou no intervalo de 1 nM - 100 nM. De forma semelhante preferido é o intervalo de 0,001 - 30 nM, o intervalo de 0,01 nM - 30 nM, o intervalo de 0,1 nM - 30 nM, o intervalo de 1 nM - 30 nM, ou o intervalo de 3 nM - 10 nM. Por exemplo, a concentração de ácido fólico no meio de cultura celular adequada para seleção pode ser 1 nM, 3 nM, 10 nM ou 30 nM.

No caso de que um folato reduzido como a leucovorina seja utilizado no processo de seleção a concentração do mesmo pode uma vez mais ser determinada por parte de um perito na especialidade de acordo com os requerimentos da célula hospedeira e a restringência da condição de seleção a ser aplicada. A tal concentração de leucovorina no meio de cultura celular pode por exemplo encontrar-se no intervalo de 0,2 nM - 2 nM para um processo de seleção restringente.

Numa forma de realização adicional do mesmo, o método para seleção compreende adicionalmente identificar e isolar uma célula eucariótica em que a expressão estável do produto de interesse é alcançada.

Numa forma de realização mais preferida do método para seleção, a pluralidade de células eucarióticas é composta por células eucarióticas de acordo com a presente invenção, isto é, conforme divulgado no presente documento. Formas de realização preferidas deste aspeto da presente invenção são descritas no presente documento, em particular relativamente à célula eucariótica e ao vetor de expressão.

Outra forma de realização da presente invenção refere-se a um processo para produção de um produto de interesse, compreendendo (i) realizar um método de seleção de acordo com a presente invenção, isto é, conforme divulgado no presente documento, (ii) e isolar o produto de interesse a partir do dito meio de cultura celular ou da dita célula.

Uma vez mais, formas de realização preferidas deste aspeto da presente invenção são descritos no presente documento, em particular relativamente à célula eucariótica e ao vetor de expressão. 0 produto de interesse, por exemplo um polipéptido, produzido de acordo com a invenção pode ser recuperado, adicionalmente purificado e isolado através de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipéptido pode ser recuperado a partir do meio de nutrientes através de procedimentos convencionais incluindo, mas não limitados a, centrifugação, filtração, ultrafiltração, extração ou precipitação. A purificação pode ser realizada através de uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, cromatografia (por exemplo permuta iónica, afinidade hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo precipitação por sulfato de amónio) ou extração.

Um aspeto ainda adicional da presente invenção refere-se à utilização de um recetor de folato ligado à membrana funcional que é introduzido através de um vetor de expressão como um marcador de seleção para seleção de uma célula eucariótica, para cuja célula eucariótica a viabilidade celular é dependente da absorção de folato, e cuja célula eucariótica expressa de forma estável um produto recombinante de interesse, em que o produto de interesse é um polipéptido farmaceuticamente ou terapeuticamente ativo ou de diagnóstico. Numa forma de realização preferida da tal utilização, o recetor de folato é selecionado a partir do grupo consistindo no recetor alfa de folato (FRa) , o recetor beta de folato (FRp) , e um mutante funcional do mesmo. Preferentemente, os recetores de folato utilizados neste aspeto da presente invenção são os respetivos recetores de folato humanos, o recetor alfa de ácido de folato (FRa) sendo preferido. Formas de realização preferidas adicionais deste aspeto da presente invenção são descritos no presente documento, em particular relativamente à célula eucariótica e ao vetor de expressão.

Os seguintes exemplos servem para ilustrar a presente invenção sem de qualquer forma limitar o âmbito da mesma. Em particular, os exemplos referem-se a formas de realização preferidas da presente invenção.

Exemplos

Em geral, os materiais mencionados no presente documento, tais como reagentes, são familiares para o perito na especialidade, estão comercialmente disponíveis e podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 1: Expressão a alto nível de um anticorpo recombinante utilizando o sistema de seleção baseado em folato-recetor

Exemplo 1.1; Vetores de Expressão

Um vetor de plasmídeo (isto é, o vetor de teste), adequado para expressão em células eucarióticas, em particular células CHO, abrangendo tanto (i) uma cassete de expressão que compreende um polinucleótido codificando as cadeias pesada e leve de um anticorpo humano recombinante secretado de tipo IgGl, e (ii) uma cassete de expressão diferente que compreende um polinucleótido codificando um recetor alfa de ácido fólico humano (hFRa) como gene marcador selecionável, é construído para explorar a eficácia de seleção de células transfetadas com hFRalfa (hFRa) sob concentrações limitantes de um folato, isto é, ácido fólico, no meio de cultura. A expressão do recetor alfa de ácido fólico humano (hFRa) encontra-se sob o controlo de um promotor SV40 e um sinal de poliadenilação (SV40) padrão. A expressão do anticorpo recombinante encontra-se sob o controlo de um promotor CMV e um sinal de poliadenilação (SV40) padrão. Como um controlo (isto é, o vetor de controlo), é utilizado um vetor de expressão semelhante, codificando o mesmo anticorpo, e carecendo da cassete de expressão de hFRalfa (hFRa), mas contendo um gene de neomicina fosfotransferase como um marcador selecionável.

Exemplo 1.2: Células e Condições de Crescimento Células de ovário de hámster chinês derivadas a partir da linha CH0-K1 são mantidas sob condições de cultura de suspensão em meio de crescimento adeguado definido quimicamente contendo ácido fólico a 2,3 μΜ (microM).

Para a análise da dependência de ácido fólico da sobrevivência celular, é efetuada uma experiência de subalimentação de ácido fólico utilizando concentrações de ácido fólico variando desde 2300 nM até 0,1 nM. As células são cultivadas no tal meio e a viabilidade celular é analisada para quantificar a percentagem de células sobreviventes. O Quadro 1 resume os resultados obtidos com a linha celular CHO-K1 mencionada acima.

Quadro 1: Sobrevivência de células CHO a diferentes concentrações de ácido fólico:

Estes resultados indicam que para esta linha celular específica, concentrações de ácido fólico por debaixo de 100 nM, preferentemente por debaixo de 30 nM deveriam ser adequadas para gerar pressão de seleção significativa para a seleção baseada no recetor de ácido fólico de células transfetadas de forma estável.

Exemplo 1.3: Transfeção e Seleção São transfetadas células através de eletroporação ou com o vetor de teste contendo uma cassete de expressão de hFRalfa (hFRa) ou o vetor de controlo carecendo de hFRalfa (hFRa). As células transfetantes crescem subsequentemente sob condições de cultura de suspensão em frascos de agitação de 125 ml em meio suplementado com uma concentração adequada de glutamina e ácido fólico a 2,3 μΜ (microM). Quarenta e oito horas após a transfeção, as células são transferidas para um meio contendo uma quantidade limitada de ácido fólico, nomeadamente ácido fólico a 10 nM ou 1 nM para iniciar o processo de seleção de acordo com a invenção em placas de 24 poços para amostras transfetadas com o vetor de teste. Adicionalmente, são selecionadas células transfetadas com o plasmídeo de controlo adicionando um agente de seleção, nomeadamente G418 a 0,8 mg/ml, a um meio contendo ácido fólico a 2,3 μΜ (microM) (isto é, controlo 1) ou cultivadas em ausência de qualquer seleção (isto é, controlo 2) . Células que tenham recuperado com êxito a partir deste esquema de seleção são transferidas para placas de 6 poços e expandidas adicionalmente em frascos de agitação para análise dos níveis de produção de anticorpos.

Exemplo 1.4: Análise da produção de anticorpos A partir das populações de células transfetantes e privadas de ácido fólico, são preparadas culturas de lotes sobreconfluentes em frascos de agitação para analisar os níveis de expressão de anticorpos. As células são semeadas a 2xl05 células/ml em meio contendo ácido fólico a 2,3 μΜ (microM) e incubadas sob condições de cultura de suspensão (isto é, agitador) . No dia 14, o sobrenadante da cultura celular é colhido e analisado quanto aos níveis de anticorpos utilizando uma metodologia de HPLC de proteína A, isto é, um tipo de purificação de afinidade. As moléculas de IgG ligam especificamente à coluna, principalmente através da sua parte Fc, enquanto outras proteínas passam através da coluna sem interagir com a matriz. Sob condições de pH baixo, as proteínas IgG capturadas são eluídas a partir da coluna, quantificadas através de medição de absorção UV, e, onde necessário, adicionalmente purificadas e isoladas.

Exemplo 1.5: Resultados 0 objetivo desta abordagem é proporcionar uma validação do conceito de que um gene de folato, em particular o gene hFRalfa (hFRa), pode servir como um marcador selecionável sob condições de privação de folato desta forma selecionando células que co-sobre-expressam um produto de interesse, por exemplo um anticorpo monoclonal. Como um controlo, é também utilizado um vetor contendo um gene de resistência à neomicina como um marcador selecionável. Após a transfeção, as células são submetidas a uma seleção restringente reduzindo abruptamente as concentrações de ácido fólico no meio desde 2,3 μΜ (microM) a 10 nM ou 1 nM. Células transfetadas com um plasmídeo abrangendo o recetor de ácido fólico recuperam prontamente sob condições de privação de folato e poder ser adicionalmente expandidas no meio seletivo. Em contraste, no caso do vetor de controlo, a concentração de ácido fólico permanece inalterada, mas são aplicadas ou uma pressão de seleção com G418 ou nenhuma pressão de seleção de todo. As populações celulares selecionadas são então analisadas para a produção de anticorpos utilizando culturas de frascos (isto é, de agitação) de suspensão com crescimento excessivo (isto é, sobreconfluentes) em meio contendo ácido fólico a 2,3 μΜ (microM). A concentração de anticorpos no meio de cultura é então determinada no dia 14. Conforme mostrado no Quadro 1 abaixo, as células transfetadas com o plasmídeo contendo o recetor de ácido fólico e selecionadas através da redução da disponibilidade de ácido fólico, sobre expressam o anticorpo recombinante. A quantidade de anticorpo produzido por parte destas populações celulares é superior em comparação com as células transfetadas com o vetor de controlo e selecionadas com G418. Como um controlo adicional, quando não é aplicada qualquer pressão de seleção, são obtidas células não proporcionando qualquer anticorpo. Estes dados proporcionam validação do conceito de que a abordagem do gene de recetor de ácido fólico atual pode ser prontamente aplicada como um marcador selecionável metabólico dominante autónomo para estabelecer rapidamente determinadas células sobre-expressando um produto recombinante de interesse.

Quadro 2: (Cáckío fólico: concentração de ácido fólico no meio durante a seleção; CG4is: concentração de G418 no meio durante a seleção; C nAib concentração do anticorpo secretado no meio de culturas com crescimento excessivo)

Exemplo 2: Os níveis de produção de anticorpo recombinante aumentam como uma função da diminuição da concentração de ácido fólico no meio de crescimento Exemplo 2.1: Vetor de Expressão É proporcionado um vetor de plasmídeo (isto é, o vetor de teste) conforme descrito no Exemplo 1.1 acima.

Exemplo 2.2: Células e Condições de Crescimento Células de ovário de hamster chinês derivadas a partir da linha CH0-K1 são mantidas sob condições de cultura de monocamada em meio de crescimento quimicamente definido RPMI-1640 contendo ácido fólico a 2,3 μΜ (microM). As células carecem de atividade de transportador RFC, conforme descrito noutro documento (Assaraf, Y.G. e Schimke, R.T. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 7154-7158; Rothem, L., et al. , Mol. Pharmacol. 68: 616-624) . Uma tal célula que carece de RFC é utilizada para evitar uma potencial evitação da subalimentação de ácido fólico através deste sistema de portador adicional neste exemplo.

Exemplo 2.3: Transfeção e Seleção Células C15 que carecem de RFC são transfetadas com o vetor de teste através de eletroporação. Quarenta e oito horas após a transfeção, as células são propagadas em meio isento de ácido fólico suplementado com ácido fólico a 30 nM de forma a promover a expressão tanto do marcador selecionável como do anticorpo recombinante e subsequentemente submetidas a clonagem por diluição. As células são diluídas a uma densidade final de 5 células/ml e semeadas a 100 μΐ/poço em placas de 96 poços (isto é, 0,5 células/poço). Os clones são então mantidos num meio contendo ácido fólico a 0,25 nM e G418 a 500 pg/ml. A co-seleção utilizando o sistema de folato da presente invenção em conjunto com um sistema de seleção adicional (isto é, neo/G418) é aplicada para proporcionar desempenho ótimo do processo de seleção. Clones com os níveis mais elevados de produção de anticorpos crescem então sob concentrações baixas de ácido fólico (isto é, 1200 pM, 600 pM, e 60 pM) para sustentar e estabelecer adicionalmente a sobre expressão de anticorpos. Isto é corroborado através de análises adicionais da expressão de anticorpos nos vários clones.

Exemplo 2.4; Análise da produção de anticorpos A análise da produção de anticorpos é levada a cabo em principio conforme delineado no Exemplo 1.4 acima. A concentração do anticorpo secretado é monitorizada utilizando um ensaio ELISA conforme segue: Microplacas

Maxisorp são revestidas com uma IgG anti-humana. Após bloqueamento com um tampão contendo albumina sérica bovina (BSA) e várias lavagens, são adicionadas várias diluições do anticorpo secretado. Posteriormente, é adicionado um segundo anticorpo conjugado com peroxidase consistindo em anticorpo de cabra anti-IgG humana-peroxidase. Finalmente, é adicionado um substrato de peroxidase colorimétrico após o qual é determinada a resultante concentração de coloração em cada poço espetrofotometricamente e posteriormente comparada com concentrações padrão de concentrações conhecidas de IgG. 2.5 Resultados

Conforme ilustrado no Quadro 2 abaixo, os níveis de produção de anticorpo recombinante estão correlacionados com a restringência da privação de ácido fólico. Por isso, os níveis de produção de anticorpo aumentam à medida que a concentração de ácido fólico é diminuída no meio. Estes resultados corroboram adicionalmente a validação do conceito de que o gene hFRalfa (hFRa) é um marcador selecionável eficaz que pode ser utilizado para a sobre-expressão de proteínas recombinantes sob condições de privação de folato.

Quadro 3: (Cáckío fóiico: concentração de ácido fólico no meio; C nAb- concentração do anticorpo secretado no meio) _C-Ácido fólico (pM)__CrrAb ( PÇT / 1 )_ _60_216±30_ 600_138±15_ 1200_119 ± 8_

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Novartis AG <120> Compostos orgânicos

<130> 52412-WO-PCT <150> EP07150326.2 <151> 21-12-2007 <160> 3 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1

Met Ala Gin Arg Met Thr Thr Gin Leu Leu Leu Leu Leu val Trp val 15 10 15

Ala val val Gly Glu Ala Gin Thr Arg lie Ala Trp Ala Arg Thr Glu 20 25 30

Leu Leu Asn val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly 35 40 45

Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gin Cys Arg pro Trp Arg Lys Asn Ala 50 55 60

Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gin Glu Ala His Lys Asp val Ser Tyr 65 70 75 80

Leu Tyr Arg phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala pro Ala Cys 85 90 95

Lys Arg His Phe lie Gin Asp Thr cys Leu Tyr Glu Cys ser pro Asn 100 105 110

Leu Gly Pro Trp lie Gin Gin Val Asp Gin Ser Trp Arg Lys Glu Arg 115 120 125

Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gin Trp Trp Glu 130 13 S 140

Asp Cys Arg Thr ser Tyr Thr cys Lys ser Asn Trp His Lys Gly Trp 145 150 155 160

Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala val Gly Ala Ala Cys Gin 165 170 175

Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr pro Thr val Leu Cys Asn Glu lie 180 185 190

Trp Thr His ser Tyr Lys val Ser Asn Tyr ser Arg Gly Ser Gly Arg 195 200 205 cys lie Gin Met Trp Phe Asp Pro Ala Gin Gly Asn Pro Asn Glu Glu 210 215 220 val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met 5er Gly Ala Gly pro Trp Ala 225 230 235 240

Ala Trp Pro Phe Leu Leu ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu 245 250 255

Ser

<210> 2 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met val Trp Lys Trp Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu val Cys val Ala 15 10 IS

Thr Met Cys Ser Ala Gin Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn val Cys Met 20 25 30

Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His 35 40 45

Asp Gin Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala cys cys Thr Ala ser Thr 50 55 60

Ser Gin Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp 65 70 75 80

Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe lie Gin 85 90 95

Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser pro Asn Leu Gly pro Trp lie Gin 100 105 110

Gin val Asn Gin Thr Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp val Pro Leu 115 120 125

Cys Lys Glu Asp Cys Gin Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His 130 135 140

Thr cys Lys ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr ser Gly val 145 ISO 155 160

Asn Lys Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe 165 170 175

Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp ser His ser Tyr Lys 180 185 190 val Ser Asn Tyr ser Arg Gly ser Gly Arg Cys lie Gin Met Trp Phe 195 200 205

Asp Ser Ala Gin Gly Asn Pro Asn Glu Glu val Ala Arg Phe Tyr Ala 210 215 220

Ala Ala Met His val Asn Ala Gly Glu Met Leu His Gly Thr Gly Gly 225 230 235 240

Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Gin Leu Trp Leu Leu Gly 245 250 255

<210> 3 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Met Asp Met Ala Trp Gin Met Met Gin Leu Leu Leu Leu Ala Leu val 15 10 15

Thr Ala Ala Gly Ser Ala Gin pro Arg $er Ala Arg Ala Arg Thr Asp 20 25 30

Leu Leu Asn val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Thr Gin pro ser 35 40 45

Pro Glu Asp Glu Leu Tyr Gly Gin Cys Ser pro Trp Lys Lys Asn Ala 50 55 60

Cys Cys Thr Ala ser Thr ser Gin Glu Leu His Lys Asp Thr ser Arg 65 70 75 80

Leu Tyr Asn Phe Asn Trp Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Thr cys 85 90 95

Lys Arg His Phe lie Gin Asp Ser cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn 100 105 110

Leu Gly Pro Trp lie Arg Gin val Asn Gin ser Trp Arg Lys Glu Arg 115 120 125 lie Leu Asn val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu 130 135 140

Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp 145 150 155 160

Asn Trp Thr ser Gly lie Asn Glu Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser 165 170 175

Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Pro Thr pro Ala Ala Leu cys Glu Gly Leu 180 185 190

Trp ser His Ser Phe Lys val ser Asn Tyr ser Arg Gly ser Gly Arg 195 200 205

Cys lie Gin Met Trp Phe Asp Ser Ala Gin Gly Asn pro Asn Glu Glu 210 215 220 val Ala Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Met Asn Ala Gly Ala pro Ser Arg 225 230 235 240

Gly lie lie Asp ser 245

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • EP 07150326 A [0059]

Documentos de não patente citados na descrição • M.D. SALAZAR; M. RATNAM. Cancer Metastasis Rev., 2007, vol. 26 (1), 141-52 [0006] • ASSARAF, Y.G. ; SCHIMKE, R.T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, vol. 84, 7154-7158 [0055] • ROTHEM, L. et al. Mol. Pharmacol., vol. 68, 616-624 [0055]

Lisboa, 26 de Agosto de 2015

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um vetor de expressão eucariótico compreendendo um primeiro polinucleótido codificando um recetor de folato ligado à membrana funcional e um segundo polinucleótido codificando um produto de interesse, em que o produto de interesse é um polipéptido farmaceuticamente ou terapeuticamente ativo ou de diagnóstico.
2. 0 vetor de expressão de acordo com a reivindicação 1, em que o recetor de folato ligado à membrana funcional codificado pelo primeiro polinucleótido é selecionado a partir do grupo que consiste num recetor alfa de folato (FRa), um recetor beta de folato (FR3) e um mutante funcional do mesmo.
3. 0 vetor de expressão de acordo com a reivindicação 2, em que o recetor de folato ligado à membrana funcional codificado pelo primeiro nucleótido é um recetor alfa de folato humano (hFRa).
4. Uma célula eucariótica para a qual a viabilidade celular é dependente da absorção de folato, e em cuja célula eucariótica foram introduzidos de forma estável um primeiro polinucleótido situado num vetor de expressão e codificando um recetor de folato ligado à membrana funcional e um segundo polinucleótido situado num vetor de expressão e codificando um produto de interesse, em que o primeiro polinucleótido e o segundo polinucleótido estão situados no mesmo vetor de expressão ou em vetores de expressão separados e em que o produto de interesse é um polipéptido farmaceuticamente ou terapeuticamente ativo ou de diagnóstico.
5. A célula eucariótica de acordo com a reivindicação 4, em que a dita célula carece de atividade completa de pelo menos um recetor de folato ligado à membrana funcional endógeno.
6. A célula eucariótica de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, em que o dito primeiro polinucleótido codificando um recetor de folato ligado à membrana funcional e o dito segundo polinucleótido codificando um produto de interesse estão situados no mesmo vetor de expressão.
7. A célula eucariótica de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 6, em que o vetor de expressão é conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 3.
8. Um processo para a produção de uma célula eucariótica de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 7, o dito processo compreendendo proporcionar uma célula eucariótica para a qual a viabilidade celular é dependente da absorção de folato, e introduzir um primeiro polinucleótido situado num vetor de expressão e codificando o recetor de folato ligado à membrana funcional e um segundo polinucleótido situado num vetor de expressão e codificando o produto de interesse, em que o primeiro polinucleótido e o segundo polinucleótido estão situados no mesmo vetor de expressão ou em vetores de expressão separados.
9. 0 processo de acordo com a reivindicação 8, em que o vetor de expressão é conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 3.
10. Um método para seleção de uma célula eucariótica capaz de expressar de forma estável um produto de interesse codificado por um vetor de expressão que foi introduzido na célula, compreendendo (i) proporcionar uma pluralidade de células eucarióticas para a qual a viabilidade celular é dependente da absorção de folato, e em cujas células foram introduzidos um primeiro polinucleótido situado num vetor de expressão e codificando um recetor de folato ligado à membrana funcional e um segundo polinucleótido situado num vetor de expressão e codificando o produto de interesse, em que o primeiro polinucleótido e o segundo polinucleótido estão situados no mesmo vetor de expressão ou em vetores de expressão separados, (ii) cultivar a dita pluralidade de células eucarióticas num meio de cultura celular tendo uma concentração limitante de um folato, desta forma obtendo uma célula eucariótica em que a expressão estável do produto de interesse é alcançada.
11. 0 método de acordo com a reivindicação 10, compreendendo adicionalmente identificar e isolar uma célula eucariótica em que a expressão estável do produto de interesse é alcançada.
12. O método de acordo com a reivindicação 10 ou reivindicação 11, em que a pluralidade de células eucarióticas é composta por células eucarióticas conforme definido em quaisquer das reivindicações 4 a 7.
13. Um processo para produção de um produto de interesse, compreendendo (i) realizar um método de seleção de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 12, (ii) e isolar o produto de interesse a partir do dito meio de cultura celular ou da dita célula.
14. Utilização de um recetor de folato ligado à membrana funcional que é introduzido através de um vetor de expressão como um marcador de seleção para seleção de uma célula eucariótica, para cuja célula eucariótica a viabilidade celular é dependente da absorção de folato, e cuja célula eucariótica expressa de forma estável um produto recombinante de interesse, em que o produto de interesse é um polipéptido farmaceuticamente ou terapeuticamente ativo ou de diagnóstico.
15. A utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o recetor de folato é selecionado a partir do grupo consistindo no recetor alfa de folato (FRa), o recetor beta de folato (FRp), e um mutante funcional do mesmo. Lisboa, 26 de Agosto de 2015