KR101706390B1 - 유기 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 진핵 세포 배양 방법에서 사용하기 위한 것으로서, 관심의 대상이 되는 재조합 생성물의 발현을 위한 신규한 선별 시스템에 관한 것이다. 선별 시스템은 외인성의 기능성 막-결합 폴레이트 수용체 유전자를, 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 유전자와 함께 진핵 세포 내로 도입하는 것을 기초로 한 것이며, 이는 세포 생존능력이 엽산 흡수에 의존하는 것인 진핵 세포에서 널리 사용될 수 있다.

Description

유기 화합물{ORGANIC COMPOUNDS}
본 발명은 진핵 세포 배양 방법에서 사용하기 위한 것으로서, 관심의 대상이 되는 재조합 생성물의 발현을 위한 신규한 선별 시스템에 관한 것이다. 선별 시스템은 외인성의 기능성 막-결합 폴레이트 수용체 유전자를, 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 유전자와 함께 진핵 세포 내로 도입하는 것을 기초로 한 것이며, 이는 세포 생존능력이 엽산 흡수에 의존하는 것인 진핵 세포에서 널리 사용될 수 있다.
선별 마커 및 선별 시스템은 유전 공학, 재조합 DNA 기술 및 진핵 세포 배양에서 재조합 생성물, 예를 들면, 항체, 호르몬 및 핵산의 생산에 널리 사용된다. 그런 주요한 선별 마커 및 선별 시스템의 1차 목표는, 선택적 성장 조건에 노출되었을 때에 관심의 대상이 되는 재조합 생성물을 높은 수준으로 생산할 수 있는 세포를 제공하는 선별가능한 유전자를 도입시키는 것이다.
현재까지, 이용가능한 주된 선별 마커 시스템에는 3가지가 있다:
(a) 글루타민 신테타제 시스템: 효소 글루타민 신테타제 (GS)는 글루타메이트 및 암모니아로부터 글루타민을 생합성하는 것을 담당한다. 이러한 생합성 반응은 포유동물 세포에서 유일의 글루타민 형성 경로를 제공한다. 따라서, 성장 배지 중 글루타민의 부재하에서 효소 GS는 배양물에서의 포유동물 세포 생존을 위해서는 필수적인 것이다. 마우스 골수종 세포를 비롯한, 특정의 포유동물 세포주에서는 GS가 충분하게 발현되지 못하고, 따라서, 글루타민이 외부에서 첨가되지 않는다면 생존이 불가능하다는 것은 중요한 사실이다. 그러므로, 그러한 세포주는 상기 시스템에서, 글루타민을 함유하지 않는 배지 중 세포가 성장할 수 있도록 하는 선별가능한 마커로서의 역할을 할 수 있는 형질감염된 GS 유전자에 대해 적합한 수용체가 된다. 대조적으로, 예를 들어, 널리 사용되는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 세포주는 글루타민을 함유하지 않는 배지 중에서의 성장을 지속시키는데 충분한 GS를 발현시킨다. 그러므로, 이런 CHO 세포를, GS 유전자 형질감염을 위한 수령체 세포로서 사용하고자 한다면, 형질감염된 GS 유전자를 높은 수준으로 발현시키는 형질감염체만이 글루타민을 함유하지 않는 배지 중에서 생존할 수 있도록 내인성 GS 활성을 억제시키기 위해서는 특이적인 효능이 있는 GS 억제제 메티오닌 설폭시민 (MSX)이 적용될 수 있다. GS 시스템이 갖는 주된 단점은 관심의 대상이 되는 표적 유전자를 안정적으로 과다발현시키는 세포를 확립시키기 위해서는 선택적 성장이 상대적으로 장시간 (즉, 2-6개월)에 걸쳐 소요된다는 점이다. 또다른 단점은 도태 압력을 증강시키기 위해서는 세포독성제인 MSX를 자주 사용해야 한다는 점이다. 그러한 세포독성제가 관심의 대상이 되는 재조합 생성물 (예로서, 항체와 같은 폴리펩티드)과 함께 존재한다면 이는 이러한 세포독성제를 제거하는 추가의 정제 단계가 필요할 수 있다.
(b) 디하이드로폴레이트 리덕타제/MTX 선별 시스템: 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)는 디하이드로엽산의 테트라하이드로엽산 (THF)으로의 NADP-의존성 환원을 촉매화시킨다. 이어서, THF는 각각 새로운 퓨린 및 티미딜레이트 생합성에 사용되는 10-포르밀-THF 및 5,10-메틸렌-THF로 상호 전환된다. DHF는 5,10-메틸렌-THF-의존성 반응에서 dUMP의 dTMP로의 전환을 촉매화시키는 티미딜레이트 신타제 (TS)의 촉매적 활성의 부산물이다. 따라서, DHFR은 DNA 복제에 필요한 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 생합성에 필수적인 THF 보조인자의 재순환에 중요하다. 그러므로, (즉, 표적화된 게놈 결실에 의한) DHFR 유전자가 없는 세포 (예로서, CHO 세포)는 뉴클레오티드가 없는 배지 중 DHFR 유전자의 형질감염을 위한 수령체로서 사용될 수 있다. 형질감염 이후, 가장 효능이 뛰어난 DHFR 억제제 (Kd=1 pM)인 항폴레이트 MTX의 농도를 점차적으로 증가시키면서 세포를 이에 가하면 세포는 DHFR을 증가된 수준으로 생산하게 된다. 다회에 걸쳐 반복하여 선별하였을 때, 선별가능한 마커 DHFR은 빈번하게 현저히 유전자를 증폭시킨다. 추가로, MTX에 대하여 주된 내성을 갖는 돌연변이체 마우스 DHFR은 또한 형질감염된 세포에서 높은 수준의 MTX-내성에 관한 획득을 현저히 증진시키는 주요한 선별가능한 마커로서 광범위하게 사용되어 왔다. DHFR/MTX 선별 시스템이 갖는 주된 단점은, 이러한 기법은 수령체 세포의 유전자형을 쉽게 변경시킬 수 있는 돌연변이 유발성 세포독성제인 MTX를 사용한다는 점이다. 추가로, 상기 제제를 취급하는 사람을 보호할 수 있도록 구체적인 안전 조치를 취해야 한다. 이를 통해서 빈번하게는, 환원된 폴레이트 운반체 (RFC)에서의 기능성 돌연변이의 상실 및/또는 RFC 유전자 발현 상실 (이 두가지 모두 MTX 흡수를 제거한다)에 기인하여 관심의 대상이 되는 표적 유전자가 발현되지 않는 MTX-내성 세포 집단이 생성된다. 또다른 단점은 돌연변이 유발성 약물 MTX가 성장 배지 중에 함유되어 있는 분비되어진 과다발현된 표적 생성물 (예로서, 항체와 같은 폴리펩티드)을 쉽게 오염시킴으로써 상기의 돌연변이 유발성 화합물인 MTX를 제거하는데 필요한, 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 비용이 많이 드는 크로마토그래피 방법이 필요하게 된다. 또한, 최종 생성물 중에 MTX가 존재하지 않는다는 것을 각 분석법에 의해 입증하여야 한다.
(c) 환원된 폴레이트 운반체 선별 시스템: 환원된 폴레이트 운반체 (RFC)는 환원된 폴레이트, 예를 들어, 5-메틸-THF 및 5-포르밀-THF의 흡수를 위한 주된 수용체로서의 역할을 하는, 편재하여 발현된 막 당단백질이다. 그러나, RFC는 산화된 폴레이트인 엽산에 대해서는 매우 낮은 친화성을 나타낸다. 그러므로, RFC가 발현되지 않거나, 게놈 RFC 유전자좌가 결실된 세포는, 5-포르밀-THF와 같은 환원된 폴레이트가 성장 배지로부터 점차적으로 손실됨으로써 세포는 상기 폴레이트 수송체를 증가된 수준으로 발현시킬 수 있게 하는 조건하에서 선별가능한 마커 유전자 RFC의 형질감염을 위한 수령체로서의 역할을 할 수 있다. RFC 선별 시스템에는 수개의 단점이 존재한다: a) 표적화된 넉아웃 또는 기능성 돌연변이의 상실에 의해 내인성 RFC 유전자좌가 넉아웃되었거나 불활성화된, RFC가 없는(RFC-null) 수령체 세포를 사용하여야 하고, b) RFC는 엽산에 대하여 극도로 낮은 수송 친화성을 갖는 바, 이에 상기의 산화된 폴레이트는 선별에 사용될 수 없고, c) 단방향성 폴레이트 흡수 시스템이고, 하기에서 더욱 상세하게 설명이 되는, 현 폴레이트-수용체 기반 시스템과는 반대로, RFC는 폴레이트의 유입과 유출에 대해 동등한 효능을 보이는 양방향성 폴레이트 수송체이다. 이는, 폴레이트 부족 상태하에서의 RFC 과다발현이 과다발현된 RFC를 통해 추가로 폴레이트를 유출시키는 수령체 세포에 해가 될 수 있다는 것을 암시한다.
본 발명의 목적은 상기 언급한 선행 기술의 선별 시스템보다 특정한 장점을 갖는 신규한 대사 선별 시스템을 제공하는 것이다. 신규한 선별 시스템은 관심의 대상이 되는 생성물을 생산하는 것을 목적으로 하는 재조합 진핵 세포 내로 발현 벡터을 통해 도입된 폴레이트 수용체가 존재할 때의 세포 배양 배지 중 폴레이트의 사용에 기초한다. 이러한 신규한 접근법은 내인성 폴레이트 수용체 (FR) 유전자가 이전에 결실될 필요는 없다. FR 선별가능한 유전자 뿐만 아니라, (폴리펩티드와 같은) 관심의 대상이 되는 생성물, 이 두가지 모두를 포함하는 벡터를 도입한 후, 농도가 고도로 제한된 폴레이트를 포함하는 선택 배지에서 세포를 배양한다. 그러므로, FR을 현저하게 과다발현시키는 세포만이 유일하게 충분한 폴레이트를 흡수함으로써 세포 성장, DNA 복제 및 세포 증식을 유지할 수 있고, 이로써 관심의 대상이 되는 표적 생성물이 과다발현될 수 있다.
산화된 폴레이트, 즉, 엽산, 뿐만 아니라, 환원된 폴레이트 또는 테트라하이드로폴레이트 (THF)로도 알려져 있는 것인 엽산의 환원된 유도체는 진핵 세포, 특히 포유동물 세포에서 퓨린, 티미딜레이트 및 특정 아미노산의 생합성에 필수적인 보조인자 및/또는 조효소인 B-9 비타민군이다. THF 보조인자는 특히 DNA 복제, 및 이에 세포 증식에 중요하다. 특히, THF 보조인자는 퓨린 및 티미딜레이트, 아미노산의 새로운 생합성 뿐만 아니라, DNA의 CpG 섬 메틸화를 비롯한 메틸기 대사를 포함하는 일련의 상호연결된 대사 경로에서 1탄소 단위의 공여체로서의 기능을 한다. 특히, 10-포르밀-THF (10-CHO-THF)를 비롯한, THF 보조인자는 퓨린의 새로운 생합성에 관여하는 2개의 중요한 새로운 포르밀트랜스퍼라제 반응에서 1탄소 단위를 제공한다. 제1 탄소인 글리신아미드 리보뉴클레오티드 트랜스포르밀라제 (GARTF)는 퓨린의 이미다졸 환의 형성에 관여하는 반면, 5-아미노이미다졸-4-카복스아미드 리보뉴클레오티드 트랜스포르밀라제 (AICARTF)에 의해 매개되는 반응으로서, 보다 하류에서 일어나는 반응을 통해 퓨린 중간체인 이노신 5'-모노포스페이트 (IMP)이 생산된다. 상기 이노신 5'-모노포스페이트 (IMP)는 AMP 및 GMP의 조절방식의 생합성에 대한 중요한 전구체로서의 역할을 한다. 추가로, 5,10-메틸렌-THF (5,10-CH2-THF)는 효소 티미딜레이트 신타제 (TS)에 대한 중요한 보조인자로서의 기능을 하는 또다른 중요한 THF 조효소이다. TS는 dUMP로부터의 티미딘 모노포스페이트 (dTMP)의 형성을 촉매화시킨다. 그러므로, 이러한 폴레이트-의존성 효소는 DNA 복제에 필수적인 퓨린 및 티민 뉴클레오티드의 새로운 생합성에 관한 중요한 매개 인자가 된다. 따라서, 이러한 폴레이트-의존성 효소가 항폴레이트로서 알려진 엽산 길항제의 활성에 대한 표적인 것으로 확인되었다. 예를 들면, 4-아미노 엽산 유사체 아미노프테린 및 그의 동족체 4-아미노-10-메틸엽산인 메토트렉세이트 (MTX)는 소아 급성 림프아구성 백혈병 (ALL)의 화학요법적 치료를 위해 진료소에 도입되었던 최초의 항대사물질 부류였다. 현재 항폴레이트는 골육종, 유방암, 원발성 중추 신경계 림프종, 융모막암종 및 임신성 융모성 종양을 비롯한, 기타 다른 인간 악성 종양 치료를 위해 현재 사용되고 있는 상이한 화학요법적 요법의 중요한 성분이다.
대부분의 원핵생물, 식물, 진균 및 그 자신의 폴레이트를 합성하는 특정의 프로테스트와는 대조적으로, 포유동물 및 기타 다른 진핵생물 종에는 THF 보조인자 생합성이 일어나지 않는 바, 이에 외인성 공급원으로부터 이를 수득하여야 한다. 3개의 독립적인 수송 시스템이 포유동물 세포에서 폴레이트 및 항폴레이트의 흡수를 매개하는 것으로 현재 알려져 있다:
a) 환원된 폴레이트 보조인자의 주된 세포 수송 시스템은 환원된 폴레이트 운반체 (RFC)이다. RFC (용질 운반체 패밀리 19 구성원 1, SLC19A1로도 알려져 있다)는 매우 높은 세포내 수준으로 축적되는 것으로 알려져 있는 유기 포스페이트, 예를 들어, 아데닌 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 티아민 모노- 및 피로포스페이트를 교환함으로써 환원된 폴레이트의 오르막 수송을 매개하는 양방향성의 촉진적 운반체로서의 기능을 하는 것인, 편재하여 발현되는 ~85 kDa의 막 당단백질이다. RFC 는 산화된 폴레이트인 엽산에 대해서는 단지 매우 낮은 수송 친화성 (Kt = 200-400 μM)을 제공하면서, 류코보린 (5-포르밀-THF; Kt = 1 μM)을 비롯한 THF 보조인자에 대해서는 높은 친화성을 나타낸다.
b) 또다른 폴레이트 흡수 경로는 최근에 클로닝된 양성자-커플링된 폴레이트 수송체 (PCFT, SLC46A로도 알려져 있다)이다. PCFT는 RFC와는 독립적으로 발현되는 것으로 보이며, 산성 pH (pH 5.5)에서 최적으로 기능을 하며, 산화된 것 (예로서, 엽산) 및 THF 보조인자 (즉, 환원된 폴레이트) 이 두가지 모두와, 이뿐만이 아니라, MTX를 비롯한 각종 친수성 항폴레이트의 유입을 매개한다. 산성 pH (pH 5.5)에서는 최적의 폴레이트 및 항폴레이트 수송을 보이는 반면, 생리학적 pH (pH 7.4)에서는 어떤 수송도 나타내지 않는 PCFT는 상부 소장에서의 폴레이트 및 항폴레이트, 두가지 모두의 흡수에 있어서 중요한 역할을 한다.
c) 본 발명에 기초가 되는 것인 세번째 수송 경로는 폴레이트 수용체 (FR)를 포함한다. FR은 3개의 상이한 유전자 FRα (FR 알파), FRβ (FR 베타) 및 FRγ (FR 감마)에 의해 코딩되는 고-친화성 폴레이트-결합 당단백질이다. FRα (또는 FR-알파)는 또한 성체 폴레이트 결합 단백질 또는 FDP로서, 폴레이트 수용체1 또는 FOLR (마우스에서는 folbp1)로서, 및 난소암-관련 항원 또는 MOv 18로서 알려져 있다. FRβ (또는 FR 베타)는 또한 FOLR2 (태아의 경우)로서, 및 FBP/PL-1 (태반의 경우)로서도 알려져 있다. FRγ (또는 FR 감마) 또한 FOLR3 으로서, 및 FR-G (문헌 [M. D. Salazar and M. Ratnam, Cancer Metastasis Rev. 2007 26(1), pp.141-52.]에서 리뷰)로서도 알려져 있다. 그의 특징이 잘 규명되어 있는 성숙 FR은 ~70-80%의 아미노산 동일성을 갖는 상동성 단백질이며, 이는 229개 내지 236개의 아미노산 뿐만 아니라, 2 내지 3개의 N-당화 부위를 포함한다. FRα (FR 알파) 및 FRβ (FR 베타)는 막-결합형, 특히, 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI)-막 부착형의 세포 표면 당단백질인 반면, FRγ에는 GPI 부착원이 없고, 이는 분비된 단백질이다. FRα (FR 알파) 및 FRβ (FR 베타)는 엽산 (Kd=0.1-1 nM), 5,10-디데아자테트라하이드로엽산 (DDATHF; 로메트렉솔; 기질로서 [3H]엽산을 사용한 경우, Ki=0.4-1.3 nM) 및 BGC945 (환원된 폴레이트 운반체가 아닌, 오직 FRα (FR 알파)만을 통해 특이적으로 수송되는, 사이클로펜타[g]퀴나졸린계의 티미딜레이트 신타제 억제제이다) (Kd=1 nM)에 대해서는 높은 친화성을 나타내지만, MTX (Kd >100 nM)에 대해서는 더욱더 낮은 친화성을 나타낸다. 폴레이트 및 항폴레이트의 FR-의존성 흡수는 고전적인 수용체-매개 세포내이입 기전을 통해 진행된다. 유전자 넉아웃 연구를 통해, FRα (FR 알파) (마우스에서는 Folbp1로서도 알려져 있다)가 조기 배아 발생에 필수적이고, 자궁 배아 치사로부터 구제되어 정상적인 발생을 할 수 있게 허용하는 모체성 폴레이트 보충에도 필수적인 것으로 나타났다.
현재까지 알려진 선별 시스템의 단점을 하나 이상 극복시킬 수 있는, 안전하고, 고도로 효과적이며 비용면에서 효율적인 선별 시스템이 현재 필요시 되고 있다.
본 발명의 요약
본 발명은 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 진핵생물 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 진핵 세포에 대한 세포 생존능력이 엽산 흡수에 의존하고, 상기 발현 벡터에 의해 코딩된 기능성 폴레이트 수용체가 본 진핵 세포에 의해 발현되도록 하기 본 발현 벡터가 그 안으로 안정적으로 도입되어 있는 진핵 세포에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 고수율로 관심의 대상이 되는 생성물을 안정적으로 발현시킬 수 있는 재조합 진핵 세포를 제공하는 선별 방법에 관한 것이다.
본 발명은 바람직하게는 고수율로 관심의 대상이 되는 생성물을 생산하는 방법에서 사용될 수 있다.
이에 놀랍게도 본 발명의 방법에 있어서 관심의 대상이 되는 생성물을 생산할 수 있는 재조합 진핵 세포를 제공하는 선별 시스템은 세포 배양 배지 중 폴레이트의 제한된 이용가능성에 기초할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 본 시스템은 광범위하게, 즉, 세포 생존능력이 폴레이트의 흡수에 의존하는 진핵 세포에 적용될 수 있을 것이다.
세포독성 약물의 부재하에서 높은 수준의 재조합 생성물을 안정적으로 과다발현시키는 진핵생물, 예를 들면, 포유동물 세포 클론의 선별, 스크리닝 및 확립을 가속화시키는데 신규한 시스템이 사용될 수 있다. 더욱, 그리고 기타 다른 공지된 선별 시스템과는 대조적으로, 내인성 유전자(들)를 예를 들면, 돌연변이화시키거나 또는 넉아웃시킴으로써 제공된 변형된 세포가 (비록 때때로 실현가능하긴 하지만) 필수적으로 필요한 것은 아니다. 예를 들면, FRα (FR 알파)는, 류코보린에 대해 RFC가 보이는 친화성 (Kt = 1 μM)보다 더 높은 친화성을 FA (KD=0.1 nM)에 대해 보이고, 단방향성 경로를 통해 엽산을 세포 내로 수송한다. 본 발명은 특히 성장 배지로부터 점차적으로 손실되는 폴레이트 (예로서, 엽산)를 통해 현저히 개선된 주요한 대사 선별가능한 마커로서 사용되는 FRα (FR 알파) 및 기타 다른 폴레이트 수용체의 용도를 제공한다. 신규의 폴레이트 기반 선별은 각종 과다발현 시스템에서 통상적으로 사용되는 세포독성 약물을 통해 이루어지는 선별없이 배양된 포유동물 세포 중 표적 단백질을 가속화된 속도로 안정적이게 높은 수준으로 과다발현할 수 있도록 잘 적합화된 탁월한 전략법이다.
신규한 선별 시스템은 선행 기술에서 이용될 수 있는 선별 시스템보다 중요한 수개의 중요한 장점을 보인다.
1. 본 발명에 따른 선별 시스템은 초고속 선별 시스템이다: 엽산 부족 상태가 일어난 후 4주 이내에 관심의 대상이 되는 표적 유전자를 발현하는 세포 집단 또는 클론 세포 유도체는 쉽게 단리될 수 있다. 이는, 선별하는데 2-6개월이 소요되고, 표적 유전자를 안정화시켜야 하는 것일 수 있는 상기 언급된 GS 시스템과는 대조적이다.
2. 본 발명에 따른 선별 시스템은 형질감염 이전에 내인성 FRα (알파), β (베타) 또는 γ (감마) 유전자를 게놈 결실시키거나 또는 약독화시킬 필요가 없고, 따라서, 몇몇 내인성 FR 유전자 발현이 일어나는 때라도 임의의 수령체 세포에 적용될 수 있다. 이것이 갖는 중요한 장점은, FRα (FR 알파) 형질감염 이후 세포가 성장 배지로부터의 폴레이트 (예로서, 엽산)가 급작스럽게 그리고 심각하게 손실될 수 있는 상황에 노출될 수 있다는 사실에 기초한다는 점이다. 결과적으로, 상당량의 선별가능한 FRα (FR 알파) 마커를 발현시키는 형질감염체 세포만이 유일하게 충분한 폴레이트를 수송할 수 있고, 이로써 DNA 복제 및 세포 증식을 유지할 수 있다. 이는 내인성 FRα (FR 알파) 유전자의 발현이 조금도 유의적으로 상승되지 않았을 때에 일어난다. 이는 수령체 세포 (예로서, CHO DG44 세포 및 CHO Dux 세포)에 빈번하게 내인성 DHFR 유전자가 결실되어 있는 것인, 상기 언급한 DHFR/MTX 시스템과는 대조적인 것이다.
c) 본 발명에 따른 선별 시스템에서는 내인성 RFC의 발현 증가를 비롯한, 폴레이트 흡수의 대체 경로의 발현 증가를 통한 도태 압력의 제거에 기인한 선별 엄격성이 상실되지 않는다. 이것이 갖는 중요한 장점은, FRα (FR 알파)가 FRα (FR 알파)에 대해서는 우수한 친화성 (Kd=0.1 nM)을 갖는 반면, RFC는 엽산에 대해 매우 낮은 친화성 (Km=0.2-0.4 mM)을 나타낸다는 사실에 기인한다는 점이다. 대조적으로, DHFR/MTX 시스템을 비롯한 각종의 선행 기술 선별 시스템에서는, MTX 선별시에 선별가능한 마커 발현을 전혀 갖지 않거나 불충분하게 갖는 MTX-내성 세포가 빈번하게 수득될 수 있기 때문에 선별 엄격성이 심각하게 상실될 수 있다. RFC의 기능을 상실하는 대신, 1차 MTX 수송체가 MTX 내성의 대해 빈번한 기전이 될 수 있다. 이는 RFC 유전자 중의 불활성화 돌연변이의 빈번한 출현 또는 RFC 유전자 발현의 심각한 상실에 기인하는 것으로 나타났다.
d) 본 발명에 따른 선별 시스템은 수령체 세포의 유전자형 뿐만 아니라, 관심의 대상이 되는 표적 유전자의 유전자형을 변경시킬 수 있는 세포독성 약물 및/또는 돌연변이 유발성 화합물, 예를 들면, DHFR 시스템 중 MTX 또는 GS 시스템 중 MSX를 사용하지 않는다. 반대로, FR 선별은 성장 배지로부터 비타민을 손실시키는 원리를 이용한다.
따라서, 하나의 측면에서 본 발명은 이에 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (즉, 선별가능한 마커 유전자) 및 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 진핵생물 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 기능성 막-결합 폴레이트 수용체는 특히 폴레이트를 진핵 세포 내로 단방향성으로 유입 또는 흡수할 수 있는 기능성 막-결합 수용체로서 정의된다.
본 발명에 따른 폴레이트는 산화된 폴레이트 (즉, 엽산) 또는 환원된 폴레이트일 수 있다. 일반적으로, 폴레이트는 기능성 막-결합 폴레이트 수용체에 의해서 진핵 세포 내로 흡수될 수 있는 한은 본 발명 내에서 유용할 수 있다. 산화된 폴레이트에 대한 바람직한 일례는 엽산이다. 환원된 폴레이트에 대한 바람직한 일례는 5-메틸-테트라하이드로엽산, 5-포르밀-테트라하이드로엽산, 10-포르밀-테트라하이드로엽산 및 5,10-메틸렌-테트라하이드로엽산이다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 발현 벡터는 진핵 세포에서 기능성 막-결합 폴레이트 수용체 및 관심의 대상이 되는 생성물, 두가지 모두를 발현할 수 있다.
제2 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 관심의 대상이 되는 생성물은 전사, 번역 또는 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 유전자 정보에 관한 임의의 기타 다른 발현 이벤트에 의해 생산될 수 있는 임의의 생물학적 생성물일 수 있다. 이와 관련하여, 생성물은 발현 생성물이 될 것이다. 예를 들면, 바람직한 실시태양에서, 그러한 생성물은 폴리펩티드, RNA, 및 DNA로 구성된 군으로부터 선택된다. "폴리펩티드"는 펩티드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산 중합체를 포함하는 분자를 지칭한다. "폴리펩티드"라는 용어는 임의 길이로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는데, 이는 (예를 들면, 약 50개 초과의 아미노산을 포함하는) 다량의 분자로 구성된 경우에는 "단백질"로 명명될 수 있거나, 또는 (예를 들면, 2-49개의 아미노산을 포함하는) 더 소량의 분자로 구성된 경우에는 "펩티드"로 명명될 수 있다. 생성물은 약제학적으로 또는 치료학적으로 활성인 화합물, 또는 분석 등에 사용될 수 있는 연구용 도구일 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 생성물은 폴리펩티드, 바람직하게는 약제학적으로 또는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드, 또는 진단 또는 기타 다른 분석 등에 사용될 수 있는 연구용 도구이다. 가장 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드는 면역글로불린 분자 또는 항체, 또는 그의 단편 (특히, 기능성 단편), 예를 들면, 키메라 또는 부분적으로 또는 전체적으로 인간화된 항체이다. 그러한 항체는 진단용 항체, 또는 약제학적으로 또는 치료학적으로 활성인 항체이다. 전형적으로, 관심의 대상이 되는 생성물은 발현에 사용되는 진핵 숙주 세포에 대해서는 이종성을 띨 것이며, 이는 숙주 세포가 형질감염 이전에는 관심의 대상이 되는 생성물을 천연적으로나 내인성 방식으로 생산하지 못한다는 것을 의미한다. 반대로, 관심의 대상이 되는 생성물을 생산하거나 발현시키기 위해서는 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 특히 본 발명에 따른 발현 벡터를 사용한 형질감염에 의해서 진핵 숙주 세포 내로 도입되어야 한다.
본 발명에 따른 벡터는 선형 형태로, 또는 바람직하게는 예로서, 플라스미드와 같이 환형 형태로 존재할 수 있다.
관심의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 사용되는 벡터는 일반적으로 예로서, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 정지 또는 종결 신호와 같이, 전사를 유도하는데 적합한 전사 제어 요소를 포함한다. 원하는 생성물이 단백질일 경우, 보통은 예로서, 리보솜을 동원하는데 적합한, 5' 캡 구조 앞에 있는 5' 비번역 영역과 번역 과정을 종결시키는 종결 코돈과 같은 적합한 번역 제어 요소가 벡터 중에 포함된다. 특히, 선별가능한 마커 유전자로서의 역할을 하는 폴리뉴클레오티드와, 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 두가지 모두가 적절한 프로모터에 존재하는 전사 요소의 제어하에서 전사될 것이다. 선별가능한 마커 유전자의 생성된 전사체와 관심의 대상이 되는 생성물의 전사체, 이 두가지 모두가 상당한 수준의 단백질 발현 (즉, 번역)을 촉진시키는 기능성 번역 요소를 포함한다.
따라서, 바람직한 실시태양은 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 별개의 전사 프로모터의 제어하에 있는 것인, 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 진핵생물에서 제1 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드의 발현, 특히, 전사를 촉진시킬 수 있는 프로모터가 적합할 것이다. 바람직한 실시태양에서, 별개의 전사 프로모터는 동일한 것이다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 별개의 전사 프로모터는 상이한 것이다. 바람직하게, 전사 프로모터는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, EF1알파 프로모터, RSV 프로모터, BROAD3 프로모터, 뮤린 rosa 26 프로모터, pCEFL 프로모터 및 β-액틴 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된다. 그의 바람직한 실시태양에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드의 전사를 제어하는 프로모터는 CMV 프로모터이거나, 대개는 SV40 프로모터인 것이 바람직하다. 특히 바람직한 실시태양에서, 제1 폴리뉴클레오티드의 전사를 제어하는 프로모터는 SV40 프로모터이다.
본 발명의 발현 벡터의 또다른 바람직한 실시태양에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 공통의 전사 프로모터의 제어하에 있다. 바람직하게, 그러한 전사 프로모터는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, RSV 프로모터, BROAD3 프로모터, 뮤린 rosa 26 프로모터, pCEFL 프로모터 및 β-액틴 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된다. 그의 추가로 바람직한 실시태양에서, 공통의 전사 프로모터는 SV40 프로모터이다. 그러한 공통의 전사 프로모터를 갖는 발현 벡터의 추가로 바람직한 실시태양은 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이에 작용할 수 있는 방식으로 위치하는 IRES 요소를 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 발현 벡터를 수단으로 하여 진핵 숙주 세포 내로 도입된 것과 같은 막 결합 폴레이트 수용체는, 본 발명 내에서 기능을 할 수 있는 한, 즉, 사용되는 진핵 세포에 적합하다면(compatible) 임의의 종으로부터 유래되는 것일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 종으로부터 유래된 폴레이트 수용체, 예를 들면, 설치류로부터 유래된 폴레이트 수용체가 사용될 것이고, 또는 대개는 인간 폴레이트 수용체가 사용되는 것이 바람직할 것이다. 일반적으로, 진핵 숙주 세포 내로 도입되고, 선별 마커로서 사용되는 폴레이트 수용체는 숙주 세포의 내인성 폴레이트 수용체와 상동성이거나 이종성일 수 있다. 만약 상동성이라면, 이는 숙주 세포와 동일한 종으로부터 유래된 것이거나, 또는 예를 들면, 숙주 세포의 내인성 폴레이트 수용체와 동일한 것일 수 있다. 만약 이종성이라면, 숙주 세포와는 다른 또다른 종으로부터 유래된 것이고, 따라서, 숙주 세포의 내인성 폴레이트 수용체와 상이한 것일 수 있다. 전형적으로, 선별 마커로서 사용되는 도입된 폴레이트 수용체는 숙주 세포에 대해 이종성일 것이다. 예를 들면, 인간으로부터 유래된 폴레이트 수용체는 설치류 숙주 세포, 예로서, CHO 세포에 대한 선별 마커로서 사용될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 발현 벡터의 제1 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 기능성 막-결합 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 알파 (FRα), 폴레이트 수용체 베타 (FRβ), 및 이들의 기능성 돌연변이체로 구성된 군으로부터 선택된다. 기능성 돌연변이체는 생리학적인 방식으로 기능을 발휘하는, 즉, 진핵 세포에 의해 흡수될 수 있고, 세포의 폴레이트 대사를 통한 세포의 생존능력에 기여하는 폴레이트 수용체의 유도체를 포함한다. 예를 들면, 폴레이트 수용체의 돌연변이체 형태는 치환, 결실 및/또는 부가와 같은 하나 이상의 아미노산 돌연변이(들) 뿐만 아니라, 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 구조체 (PEG)와 같은 화학적 부분이 폴레이트 수용체에 부착되어 있는 것인 화학적 유도체를 포함할 것이다. 바람직하게, 제1 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴레이트 수용체는 인간 폴레이트 수용체 알파 (hFRα), 인간 폴레이트 수용체 베타 (hFRβ), 또는 그의 기능성 돌연변이체이다. 바람직하게는 하기 아미노산 서열 (서열번호: 1, 1 문자 코드, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 표시)을 갖는 인간 폴레이트 수용체 알파 (hFRα)가 가장 바람직하다:
Figure 112010046626661-pct00001
또다른 바람직한 실시태양은 하기 아미노산 서열 (서열번호: 2, 1 문자 코드, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 표시)을 갖는 인간 폴레이트 수용체 베타 (hFRβ)에 관한 것이다:
Figure 112010046626661-pct00002
별법으로, 본 발명은 그의 천연 환경하에서는 막에 결합하지 않는 폴레이트 수용체에 관한 것이다. 그러한 막-비결합형 수용체는 예를 들면, 막-비결합형 폴레이트 수용체와 또다른 폴리펩티드의 막 횡단 영역 사이에 융합 단백질을 제공함으로써 막-결합형이 되도록 돌연변이화시킬 수 있다. 유사하게, 당업자가 쉽게 이용할 수 있는 또다른 돌연변이체 형태도 가능하다. 이와 관련하여 바람직한 일례는 가용성 폴레이트 수용체 감마 (FRγ), 바람직하게, 인간 가용성 폴레이트 수용체 감마 (FRγ)에 기초할 것이다. 그의 가장 바람직한 실시태양에서, 인간 가용성 폴레이트 수용체 감마 (FRγ)는 하기 아미노산 서열 (서열번호: 3, 1 문자 코드, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 표시)을 가질 것이며:
Figure 112010046626661-pct00003
이후, 돌연변이화되거나, 다르게는 유전적으로 변경되거나 유도체를 형성함으로써 본 발명의 배경 내에 있는 폴레이트 흡수가 가능한 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 형성할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명에 따른 발현 벡터는 추가로 하나 이상의 추가적인 선별 마커(들)를 코딩하는 하나 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드(들)를 포함할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 하나 이상의 상이한 선별 시스템(들) (예로서, neo/G418)과 함께 본 발명의 폴레이트 시스템을 사용한 공-선별이 적용됨으로써 최적의 성능을 발휘할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 진핵 세포 내로 안정적으로 도입되어 있으며; 여기서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동일한 발현 벡터 상에 위치하거나 별도의 발현 벡터 상에 위치하는 것인, 진핵 세포에 관한 것이다. 그의 바람직한 실시태양에서, 기능성 막-결합 폴레이트 수용체 및 관심의 대상이 되는 생성물은 상기 진핵 세포에 의해 발현된다.
발현 벡터를 통해 세포주 내로 도입된 기능성 막-결합 폴레이트 수용체 이외에도, 본 발명에 따른 진핵 세포는 적어도 하나의 내인성 기능을 갖는 단방향으로 작용하는 폴레이트 수송 시스템, 특히, 하나 이상의 내인성 기능을 갖는 막-결합 폴레이트 수용체(들)를 포함할 수 있다. 상기와 같은 내인성의 단방향으로 작용하는 폴레이트 수송 시스템이 존재하는 경우에라도, 즉, 상기와 같은 내인성 시스템이 유지되는 경우에라도 본원 하기에서 기술하는 선별 방법이 사용될 수 있다는 점이 본 발명의 이점이 된다. 따라서, 추가의 바람직한 실시태양은 적어도 하나의 내인성의 단방향으로 작용하는 폴레이트 수송 시스템을 포함하는 본 발명의 진핵 세포에 관한 것으로서, 여기서, 상기와 같은 내인성의 단방향으로 작용하는 폴레이트 수송 시스템은 바람직하게 적어도 하나의 내인성 기능을 갖는 막-결합 폴레이트 수용체을 포함하는 것인 진핵 세포에 관한 것이다. 그의 바람직한 실시태양에서, 내인성 기능을 갖는 막-결합 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 알파 (FRα) 및 폴레이트 수용체 베타 (FRβ)로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 바람직한 실시태양은 예를 들면, 적어도 하나의 내인성 기능을 갖는 막-결합 폴레이트 수용체를 포함하는 내인성의 단방향으로 작용하는 폴레이트 수송 시스템에 전반적인 활성이 결여되어 있는 것인, 즉, 약독화되어 있는 것인 본 발명에 따른 진핵 세포에 관한 것이다. 그러한 약독화는 예를 들면, 점 돌연변이, 유전자 파괴 등에 의해서 당해 내인성 폴레이트 수송 시스템, 예로서, 내인성 기능을 갖는 막-결합 폴레이트 수용체의 어느 유형의 돌연변이유발법에 의해서든 이루어질 수 있다. 약독화는 부분적으로 또는 전부가 약독화될 수 있다. 후자의 경우, 본 발명에 따른 진핵 세포는 내인성 기능을 갖는 단방향으로 작용하는 폴레이트 수송 시스템, 예로서, 내인성 기능을 갖는 막-결합 폴레이트 수용체를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시태양은 본 발명의 발현 벡터가 안정적으로 도입되어 있고, 이 세포에는 적어도 하나의 내인성 기능을 갖는 막-결합 폴레이트 수용체의 활성이 결여되어 있는 것인 진핵 세포에 관한 것이다.
상기 숙주 세포 내로 도입된 발현 벡터와 관련하여, 그의 바람직한 실시태양을 비롯한, 본 발명의 임의의 발현 벡터는 본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 본 발명의 진핵 세포의 바람직한 실시태양에서, 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드는 동일한 발현 벡터 상에 위치한다. 바람직하게, 그러한 발현 벡터는 본 발명에 따른 발현 벡터, 즉, 본원에 기술된 것이다.
본 발명에 따른 진핵 세포는 바람직하게 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 보통 폴레이트에 대해서는 원시영양성 성향을 띠는 것인 진균 세포 및 식물 세포 (즉, 그러한 세포는 그의 세포 생존능력, 즉, 세포 성장 및 증식에 필요한 그들 자신의 폴레이트를 자율적으로 합성한다)와 관련하여, 본 발명은 특히 폴레이트에 대해서 영양요구성 성향을 띠게 될 수 있는 상기와 같은 진균 및 식물 세포를 포함한다. 이는 예를 들면, 유전자 조작에 기인하는 것일 수 있으며, 즉, 세포는 이에 그들의 세포 생존능력에 필요한 폴레이트를 충분한 양으로 합성할 수가 없다. 예를 들면, 폴레이트를 예로서, 적절한 대사 경로를 통해 내인성 방식으로 생합성할 수 있는 상기와 같은 진균 및 식물 세포의 능력은 예로서, 유전자 파괴 또는 적절한 표적 유전자의 유전자 침묵화, 또는 주된 효소의 억제 등에 의해 불활성화될 것이다.
그의 바람직한 실시태양에서, 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 바람직하게, 그러한 포유동물 세포는 설치류 세포, 인간 세포 및 원숭이 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 설치류 세포가 특히 바람직하며, 바람직하게는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, 마우스 3T3 섬유모세포 세포, 및 SP2/0 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 특히 바람직한 설치류 세포는 CHO 세포이다. 인간 세포 또한 바람직하며, 바람직하게는 HEK293 세포, MCF-7 세포, PerC6 세포, 및 HeLa 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 원숭이 세포도 추가로 바람직하며, 바람직하게는 COS-1, COS-7 세포 및 베로(Vero) 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하는 진핵 세포를 제공하는 단계, 및 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하며, 여기서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동일한 발현 벡터 상에 위치하거나 별도의 발현 벡터 상에 위치하는 것인, 본 발명에 따른 진핵 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 가장 바람직한 실시태양에서 본 발명에 따른 발현 벡터, 즉 본원에 개시된 발현 벡터인 것인 동일한 발현 벡터 상에 위치한다.
또한 본 발명의 추가의 다른 측면은
(i) 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 진핵 세포 내로 안정적으로 도입되어 있는 복수 개의 진핵 세포를 제공하되, 여기서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동일한 발현 벡터 상에 위치하거나 별도의 발현 벡터 상에 위치하는 것인 단계,
(ii) 폴레이트의 농도가 제한된 세포 배양 배지 중에서 상기 복수 개의 진핵 세포를 배양하여, 관심의 대상이 되는 생성물이 안정적으로 발현이 되는 진핵 세포를 수득하는 단계
를 포함하는, 세포 내로 도입된 발현 벡터에 의해 코딩되는 관심의 대상이 되는 생성물을 안정적으로 발현시킬 수 있는 진핵 세포를 선별하는 방법에 관한 것이다. 대체로, 이러한 폴레이트는 산화된 폴레이트 또는 환원된 폴레이트일 수 있다. 산화된 폴레이트, 특히, 엽산인 것이 바람직하다.
폴레이트의 제한된 양과 관련하여, 배지 중의 적합한 농도는 적용되는 숙주 세포 및 선별 조건의 엄격성에 대한 요건에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, CHO 숙주 세포에서 엽산이 폴레이트로서 사용되는 경우, 엄격한 선별 방법을 위해 적합한, 세포 배양 배지 중의 엽산 농도는 약 100 nM 이하, 바람직하게 약 30 nM 이하, 또는 약 10 nM 이하가 될 것이다. 예를 들면, 적합한 엽산 농도는 값은 0.001 nM - 100 nM 범위, 바람직하게, 0.01 nM - 100 nM 범위, 더욱 바람직하게는 0.1 nM - 100 nM 범위 또는 1 nM - 100 nM 범위일 수 있다. 유사하게, 0.001 nM - 30 nM 범위, 0.01 nM - 30 nM 범위, 0.1 nM - 30 nM 범위, 1 nM - 30 nM 범위, 또는 3 nM - 10 nM 범위가 바람직하다. 예를 들면, 선별에 적합한, 세포 배양 배지 중의 엽산 농도는 1 nM, 3 nM, 10 nM 또는 30 nM일 수 있다.
류코보린과 같은 환원된 폴레이트가 선별 방법에서 사용되는 경우, 그의 농도는 다시 적용되는 숙주 세포 및 선별 조건의 엄격성에 대한 요건에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양 배지 중 류코보린의 농도는 엄격한 선별 방법을 위해서는 예를 들면, 0.2 nM - 2 nM 범위일 수 있다.
그의 추가의 실시태양에서, 선별 방법은 추가로 관심의 대상이 되는 생성물을 안정적으로 발현시킬 수 있는 진핵 세포를 확인하고 단리시키는 것을 포함한다.
선별 방법의 가장 바람직한 실시태양에서, 복수 개의 진핵 세포는 본 발명에 따른 진핵 세포, 즉, 본원에 개시된 것과 같은 진핵 세포로 구성된다.
본 발명의 이러한 측면의 추가로 바람직한 실시태양은 본원에 기술되어 있고, 특히, 진핵 세포 및 발현 벡터와 관련하여 본원에 기술되어 있다.
본 발명의 또다른 실시태양은
(i) 본 발명에 따른 선별 방법, 즉, 본원에 개시된 것과 같은 선별 방법을 수행하는 단계, 및
(ii) 상기 세포 배양 배지 또는 상기 세포로부터 관심의 대상이 되는 생성물을 단리시키는 단계
를 포함하는, 관심의 대상이 되는 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
다시, 본 발명의 이러한 측면의 바람직한 실시태양은 본원에 기술되어 있고, 특히 진핵 세포 및 발현 벡터와 관련하여 본원에 기술되어 있다.
본 발명에 따라 생산된 관심의 대상이 되는 생성물, 예를 들면, 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해 회수되고, 추가로는 정제되고 단리될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 원심분리법, 여과, 한외여과, 추출, 또는 침전을 포함하나, 이에 한정되지 않는 종래 방법에 의해서 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 크로마토그래피 (예로서, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 배제), 전기영동법 (예로서, 분취용 등전점 포커싱), 차별적인 용해도 (예로서, 황산암모늄 침전) 또는 추출법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 정제를 수행할 수 있다.
본 발명의 또다른 추가의 측면은 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고, 관심의 대상이 되는 생성물을 안정적으로 발현시킬 수 있는 진핵 세포를 선별하기 위한 선별 마커로서의 기능성 막-결합 폴레이트 수용체의 용도에 관한 것이다. 그러한 용도의 바람직한 실시태양 내에서, 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 알파 (FRα), 폴레이트 수용체 베타 (FRβ), 및 이들의 기능성 돌연변이체로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 본 발명의 이러한 측면 내에서 사용되는 폴레이트 수용체는 각 인간 폴레이트 수용체인데, 인간 폴레이트 산 수용체 알파 (FRα)가 바람직하다. 본 발명의 이러한 측면의 추가로 바람직한 실시태양은 특히 진핵 세포 및 발현 벡터와 관련하여 본원에 기술되어 있다.
본원에 언급된 바와 같이 텍스트 및 문서의 전문이 본원에서 참고로 인용된다.
하기 실시예는 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서 본 발명을 설명하는 역할을 한다. 특히, 본 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양에 관한 것이다.
실시예
일반적으로, 예를 들어, 시약과 같이 본원에서 언급하는 물질은 당업자에게 익숙한 것으로 상업적으로 이용가능한 것이며, 이는 제조사의 설명서에 따라 사용될 수 있다.
실시예 1: 폴레이트-수용체 기반 선별 시스템을 사용한 높은 수준의 재조합 항체 발현
실시예 1.1: 발현 벡터
배양 배지 중 농도가 제한되어 있는 폴레이트, 즉, 엽산하에서의 hFR알파 (hFRα)- 형질감염된 세포의 선별 효율을 조사하기 위하여 (i) IgG1 타입의 분비된 재조합 인간 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트, 및 (ii) 선별가능한 마커 유전자로서 인간 엽산 수용체 알파 (hFRα)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 별개의 발현 카세트, 이 두가지 모두를 포함하는 것으로서, 진핵 세포, 특히 CHO 세포에서의 발현을 위해 적합한 플라스미드 벡터 (즉, 시험 벡터)를 작제하였다. 인간 엽산 수용체 알파 (hFRα)의 발현은 SV40 프로모터 및 표준 (SV40) 폴리아데닐화 신호의 제어하에 있었다. 재조합 항체의 발현은 CMV 프로모터 및 표준 (SV40) 폴리아데닐화 신호의 제어하에 있었다. 대조군 (즉, 대조군 벡터)으로서는, 동일한 항체를 코딩하기는 하지만, hFR알파 (hFRα) 발현 카세트가 결여되어 있되, 선별가능한 마커로서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 포함하는 것인, 유사한 발현 벡터를 사용하였다.
실시예 1.2: 세포 및 성장 조건
2.3 μM (마이크로M) 엽산을 포함하는 적합한 합성(chemically defined) 성장 배지 중 현탁 배양 조건하에서 세포주 CHO-K1으로부터 유래된 차이니즈 햄스터 난소 세포를 유지시켰다.
세포 생존의 엽산 의존성에 대해 분석하기 위하여 2300 nM 내지 0.1 nM 범위의 엽산 농도를 사용하여 엽산 기아 실험을 수행하였다. 세포를 상기 배지에서 배양하고, 세포 생존율(%)을 정량화하여 세포 생존능력을 분석하였다. 하기 표 1은 상기 언급한 CHO-K1 세포주를 사용하여 수득한 결과를 요약한 것이다.
Figure 112010046626661-pct00004
이러한 결과는, 상기의 특이적인 숙주 세포주의 경우, 100 nM 아래, 바람직하게는 30 nM 아래의 엽산 농도가 안정적으로 형질감염된 세포의 선별을 토대로 하여 이루어지는 엽산 수용체에 대한 현저한 도태 압력을 생성하는데 적합하다는 것을 시사한다.
실시예 1.3: 형질감염 및 선별
전기천공법에 의해서 hFR알파 (hFRα) 발현 카세트를 포함하는 시험 벡터 또는 hFR알파 hFRα가 결여되어 있는 대조군 벡터를 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 이어서, 적절한 농도의 글루타민 및 2.3 μM (마이크로M) 엽산으로 보충된 배지 중 현탁 배양 조건하에 125 ml 진탕 플라스크에서 형질감염체 세포를 배양하였다. 형질감염 후 48시간이 경과하였을 때, 제한된 양의 엽산, 즉, 10 nM 또는 1 nM 엽산을 포함하는 배지로 세포를 옮겨 24-웰 플레이트 중에서 시험 벡터로 형질감염된 샘플에 대한, 본 발명에 따른 선별 방법을 개시하였다. 또한, 대조군 플라스미드로 형질감염된 세포는 선별제, 즉, 0.8 mg/mL G418을, 2.3 μM (마이크로M) 엽산을 포함하는 배지에 첨가함으로써 선별되거나 (즉, 대조군 1) 또는 어떤 선별도 없이 배양하였다 (즉, 대조군 2). 이러한 선별 계획으로부터 성공적으로 회수된 세포를 6-웰 플레이트로 옮기고, 항체 생산 수준에 대하여 분석하기 위해 진탕 플라스크에서 추가로 확장시켰다.
실시예 1.4: 항체 생산 분석
항체 발현 수준을 분석하기 위해 형질감염체 및 엽산이 부족 상태에 있는 세포 집단으로부터 과다융합된 배취 배양물을 제조하였다. 2.3 μM (마이크로M) 엽산을 포함하는 배지 중에 세포를 2x105개의 세포/mL로 시딩하고, 현탁 배양 (즉, 진탕기) 조건하에서 인큐베이션시켰다. 14일째, 세포 배양물의 상등액을 수거하고, 단백질-A HPLC 방법, 즉, 친화성 타입의 정제법을 사용하여 항체 수준에 대하여 분석하였다. IgG 분자는 주로 그의 Fc 부분을 통해 칼럼에 특이적으로 결합하는 반면, 기타 다른 단백질은 기질과의 상호작용없이 칼럼을 통과하게 된다. 낮은 pH 조건하에서 포획된 IgG 단백질을 칼럼으로부터 용리시키고, UV 흡광 측정을 통해 정량화하고, 필요할 경우, 정제하고 단리시킨다.
실시예 1.5: 결과
본 접근법의 목적은, 폴레이트 유전자, 특히, hFR알파 (hFRα) 유전자가 폴레이트가 부족한 상태인 조건하에서 선별가능한 마커로서의 역할을 하게 됨으로써 관심의 대상이 되는 생성물, 예로서, 모노클로날 항체를 과다발현시키는 세포를 선별할 수 있다는 개념을 증명한다. 선별가능한 마커로서 네오마이신-내성 유전자를 포함하는 벡터를 대조군으로서 사용하였다. 형질감염 이후, 배지 중 엽산의 농도를 2.3 μM (마이크로M)에서 10 nM 또는 1 nM로 급감소시킴으로써 세포를 엄격하게 선별하였다. 엽산 수용체를 포함하는 플라스미드로 형질감염된 세포는 폴레이트가 부족한 상태인 조건하에서 쉽게 회복되고, 선별 배지 중에서 추가로 확장시킬 수 있다. 대조적으로, 대조군 벡터의 경우에는, 엽산 농도가 변하지 않고 그대로 남아있던 반면에, G418을 사용하여 이루어진 도태 압력이 적용되거나, 도태 압력이 전혀 적용되지 않았다. 이어서, 2.3 μM (마이크로M) 엽산을 포함하는 배지 중 과다배양된 (즉, 과다융합된) 현탁 (즉, 진탕) 플라스크 배양물을 사용하여 선별된 세포 집단을 항체 생산에 대하여 분석하였다. 이어서, 14일째 배양 배지 중 항체의 농도를 측정하였다. 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 엽산 수용체를 포함하는 플라스미드로 형질감염되고, 감소된 엽산 이용가능성에 의해 선별된 세포는 재조합 항체를 과다발현시켰다. 이러한 형질감염체 세포 집단에 의해 생산된 항체의 양은 대조군 벡터로 형질감염되고, G418을 사용하여 선별된 세포와 비교하여 더욱 높았다. 추가 대조군으로서, 도태 압력이 전혀 적용되지 않았을 때에는 어떤 항체도 생산되지 않는 세포를 수득하게 되었다. 이러한 데이타는, 현 엽산 수용체 유전자 접근법이 관심의 대상이 되는 재조합 생성물을 과다발현시키는 세포를 신속하게 확립시키기는 단일의 주요한 대사 선별가능한 마커로서 용이하게 적용될 수 있다는 개념을 증명한다.
Figure 112010046626661-pct00005
실시예 2: 재조합 항체 생산 수준은 성장 배지 중의 엽산 농도 감소함에 따라 증가한다
실시예 2.1: 발현 벡터
상기 실시예 1.1에 기술된 바와 같은 플라스미드 벡터 (즉, 시험 벡터)를 제공하였다.
실시예 2.2: 세포 및 성장 조건
2.3 μM (마이크로M) 엽산을 포함하는 합성 성장 배지 RPMI-1640 중 단층 배양 조건하에서 세포주 CHO-K1으로부터 유래된 차이니즈 햄스터 난소 세포를 유지시켰다. 다른 문헌에서도 개시된 바와 같이 (문헌 ([Assaraf, Y.G. and Schimke, RT. (1987) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 84,7154-7158]; [Rothem, L., et al., Mol. Pharmacol . 68: 616-624])), 세포에는 RFC 수송체 활성이 결여되어 있다. 그러한 RFC-결여 세포는 본 실시예에서 상기 추가의 운반체 시스템에 의한 엽산 기아의 잠재적인 우회를 막기 위해 사용하였다.
실시예 2.3: 형질감염 및 선별
전기천공법에 의해서 RFC-결여 C15 세포를 시험 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간이 경과하였을 때, 선별가능한 마커 뿐만 아니라, 재조합 항체, 이 두가지 모두의 발현을 촉진시키기 위하여 엽산을 함유하지 않는 배지에 30 nM 엽산을 보충하여 상기 배지 중에서 세포를 증식시킨 후, 이어서, 희석 클로닝법으로 클로닝시켰다. 세포를 5개의 세포/ml인 최종 밀도로 희석시키고, 96-웰 플레이트 중 100 ㎕/웰 (즉, 0.5개의 세포/웰)로 시딩하였다. 이어서, 0.25 nM 엽산 및 500 ㎍/ml G418을 함유하는 배지 중에서 클론을 유지시켰다. 추가의 선별 시스템 (즉, neo/G418)과 함께 본 발명의 폴레이트 시스템을 사용하는 공-선별을 적용시켜 선별 방법이 최적의 성능을 발휘할 수 있도록 하였다. 이어서, 항체 생산 수준이 가장 높은 클론을 저농도의 엽산 (즉, 1200 pM, 600 pM, 및 60 pM) 하에서 배양함으로써 항체의 과다발현을 추가로 지지하고 확립시켰다. 이는 다양한 클론에서의 항체 발현을 추가로 분석함으로써 입증하였다.
실시예 2.4: 항체 생산 분석
항체 생산 분석은 대체로 상기 실시예 1.4에 개략적으로 설명된 바와 같이 수행하였다. 분비된 항체의 농도는 하기와 같이 ELISA 분석법을 사용하여 모니터링하였다: 맥시소르프(Maxisorp) 마이크로플레이트를 항-인간 IgG로 코팅하였다. 소 혈청 알부민 (BSA)을 포함하는 완충액으로 차단하고, 수회에 걸쳐 세척한 후, 분비된 항체 샘플을 다회에 걸쳐 희석시킨 희석액을 첨가하였다. 이어서, 염소 항-인간 IgG-퍼옥시다제로 구성된 퍼옥시다제-접합된 제2 항체를 첨가하였다. 마지막으로, 비색 퍼옥시다제 기질을 첨가한 후, 그 결과로 얻은 염료 농도는 각각의 웰에서 분광광도분석법으로 측정하고, 알려진 IgG 농도의 표준 농도와 비교하였다.
2.5 결과
하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 재조합 항체 생산 수준은 엽산 부족 상태의 엄격성과 상관관계에 있다. 그러므로, 항체 생산 수준은 배지 중 엽산 농도의 농도가 감소함에 따라서 증가한다. 이러한 결과는 추가로, hFR알파 (hFRα) 유전자가, 폴레이트가 부족한 상태인 조건하에서 재조합 단백질의 과다발현에 사용될 수 있는 효과적인 선별가능한 마커라는 개념 증명을 확실하게 한다.
Figure 112010046626661-pct00006
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> Organic compounds <130> 52412-WO-PCT <150> EP07150326.2 <151> 2007-12-21 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val 1 5 10 15 Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu 20 25 30 Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly 35 40 45 Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala 50 55 60 Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr 65 70 75 80 Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys 85 90 95 Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn 100 105 110 Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg 115 120 125 Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu 130 135 140 Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp 145 150 155 160 Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln 165 170 175 Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile 180 185 190 Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg 195 200 205 Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu 210 215 220 Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala 225 230 235 240 Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu 245 250 255 Ser <210> 2 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Trp Lys Trp Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Val Cys Val Ala 1 5 10 15 Thr Met Cys Ser Ala Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met 20 25 30 Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His 35 40 45 Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr 50 55 60 Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp 65 70 75 80 Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln 85 90 95 Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln 100 105 110 Gln Val Asn Gln Thr Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu 115 120 125 Cys Lys Glu Asp Cys Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His 130 135 140 Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val 145 150 155 160 Asn Lys Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe 165 170 175 Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys 180 185 190 Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe 195 200 205 Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala 210 215 220 Ala Ala Met His Val Asn Ala Gly Glu Met Leu His Gly Thr Gly Gly 225 230 235 240 Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Gln Leu Trp Leu Leu Gly 245 250 255 <210> 3 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Met Ala Trp Gln Met Met Gln Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val 1 5 10 15 Thr Ala Ala Gly Ser Ala Gln Pro Arg Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp 20 25 30 Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Thr Gln Pro Ser 35 40 45 Pro Glu Asp Glu Leu Tyr Gly Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala 50 55 60 Cys Cys Thr Ala Ser Thr Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg 65 70 75 80 Leu Tyr Asn Phe Asn Trp Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Thr Cys 85 90 95 Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Ser Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn 100 105 110 Leu Gly Pro Trp Ile Arg Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg 115 120 125 Ile Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu 130 135 140 Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp 145 150 155 160 Asn Trp Thr Ser Gly Ile Asn Glu Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser 165 170 175 Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu 180 185 190 Trp Ser His Ser Phe Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg 195 200 205 Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu 210 215 220 Val Ala Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Met Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg 225 230 235 240 Gly Ile Ile Asp Ser 245

Claims (37)

  1. 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 관심의 대상이 되는 생성물은 약제학적으로 또는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 진단용 폴리펩티드인, 포유동물 세포에서 관심의 대상이 되는 생성물의 재조합 발현을 위한 진핵생물 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 별개의 전사 프로모터의 제어하에 있는 것인 발현 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 전사 프로모터가 동일하거나 또는 상이한 것인 발현 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드의 전사를 제어하는 프로모터가 SV40 프로모터인 발현 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 공통의 전사 프로모터의 제어하에 있는 것인 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 공통의 전사 프로모터가 SV40 프로모터인 발현 벡터.
  7. 제5항에 있어서, 상기 벡터가 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이에 작용할 수 있는 방식으로 위치하는 IRES 요소를 포함하는 것인 발현 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 기능성 막-결합 폴레이트 수용체가 폴레이트 수용체 알파 (FRα), 폴레이트 수용체 베타 (FRβ), 및 이들의 기능성 돌연변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 발현 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 기능성 막-결합 폴레이트 수용체가 인간 폴레이트 수용체 알파 (hFRα)인 발현 벡터.
  10. 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 내부에 안정적으로 도입되어 있는 포유동물 세포로서; 여기서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하거나 별도의 발현 벡터 상에 위치하고, 관심의 대상이 되는 생성물이 약제학적으로 또는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 진단용 폴리펩티드인, 포유동물 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포에 적어도 하나의 내인성 기능을 갖는 막-결합 폴레이트 수용체의 전반적인 활성이 결여되어 있는 것인 포유동물 세포.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 상기의 제1 폴리뉴클레오티드 및 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 상기의 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하는 것인 포유동물 세포.
  13. 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 내부에 안정적으로 도입되어 있는 포유동물 세포로서; 여기서, 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 상기의 제1 폴리뉴클레오티드 및 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 상기의 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하고, 관심의 대상이 되는 생성물이 약제학적으로 또는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 진단용 폴리펩티드이며, 발현 벡터가 제1항에서 정의된 것과 같은 것인, 포유동물 세포.
  14. 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 내부에 안정적으로 도입되어 있는 포유동물 세포로서; 여기서, 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 상기의 제1 폴리뉴클레오티드 및 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 상기의 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하고, 관심의 대상이 되는 생성물이 약제학적으로 또는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 진단용 폴리펩티드이며, 발현 벡터가 제8항 또는 제9항에서 정의된 것과 같은 것인, 포유동물 세포.
  15. 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 내부에 안정적으로 도입되어 있는 포유동물 세포로서; 여기서, 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 상기의 제1 폴리뉴클레오티드 및 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 상기의 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하고, 관심의 대상이 되는 생성물이 약제학적으로 또는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 진단용 폴리펩티드이며, 발현 벡터가 제2항 또는 제5항에서 정의된 것과 같은 것인, 포유동물 세포.
  16. 제14항에 있어서, 설치류 세포인 포유동물 세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 설치류 세포가 CHO 세포인 포유동물 세포.
  18. 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하는 포유동물 세포를 제공하는 단계, 및 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하며, 여기서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하거나 별도의 발현 벡터 상에 위치하고, 관심의 대상이 되는 생성물이 약제학적으로 또는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 진단용 폴리펩티드인, 제10항에 따른 포유동물 세포를 생산하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 발현 벡터가 제1항에서 정의된 것과 같은 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 발현 벡터가 제8항 또는 제9항에서 정의된 것과 같은 것인 방법.
  22. (i) 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 생성물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 내부에 안정적으로 도입되어 있는 복수 개의 포유동물 세포를 제공하되, 여기서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동일한 발현 벡터 상에 위치하거나 별도의 발현 벡터 상에 위치하고, 관심의 대상이 되는 생성물은 약제학적으로 또는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 진단용 폴리펩티드인 단계, 및
    (ii) 폴레이트의 농도가 제한된 세포 배양 배지 중에서 상기 복수 개의 포유동물 세포를 배양하여, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드가 안정적으로 발현이 되는 포유동물 세포를 수득하는 단계
    를 포함하는, 세포 내로 도입된 발현 벡터에 의해 코딩되는 관심의 대상이 되는 생성물을 안정적으로 발현시킬 수 있는 포유동물 세포를 선별하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드가 안정적으로 발현이 되는 포유동물 세포를 확인하고 단리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 복수 개의 포유동물 세포가, 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 내부에 안정적으로 도입되어 있는 포유동물 세포로 구성되어 있으며; 여기서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하거나 별도의 발현 벡터 상에 위치하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 복수 개의 포유동물 세포가, 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 내부에 안정적으로 도입되어 있는 포유동물 세포로 구성되어 있으며; 여기서, 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 상기의 제1 폴리뉴클레오티드 및 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 상기의 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하며, 발현 벡터가 제1항에서 정의된 것과 같은 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 복수 개의 포유동물 세포가, 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 내부에 안정적으로 도입되어 있는 포유동물 세포로 구성되어 있으며; 여기서, 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 상기의 제1 폴리뉴클레오티드 및 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 상기의 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하며, 발현 벡터가 제8항 또는 제9항에서 정의된 것과 같은 것인 방법.
  27. 제24항에 있어서, 복수 개의 포유동물 세포가, 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 내부에 안정적으로 도입되어 있는 포유동물 세포로 구성되어 있으며; 여기서, 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 상기의 제1 폴리뉴클레오티드 및 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 상기의 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하며, 발현 벡터가 제2항 또는 제5항에서 정의된 것과 같은 것인 방법.
  28. (i) 제22항에 따른 선별 방법을 수행하는 단계, 및
    (ii) 상기 세포 배양 배지 또는 상기 세포로부터 관심의 대상이 되는 생성물을 단리시키는 단계
    를 포함하며, 여기서 관심의 대상이 되는 생성물은 약제학적으로 또는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 진단용 폴리펩티드인, 관심의 대상이 되는 생성물을 생산하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 단계 (i)에서, 복수 개의 포유동물 세포가, 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 내부에 안정적으로 도입되어 있는 포유동물 세포로 구성되어 있으며; 여기서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하거나 별도의 발현 벡터 상에 위치하는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 단계 (i)에서, 복수 개의 포유동물 세포가, 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 내부에 안정적으로 도입되어 있는 포유동물 세포로 구성되어 있으며; 여기서, 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 상기의 제1 폴리뉴클레오티드 및 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 상기의 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하며, 발현 벡터가 제1항에서 정의된 것과 같은 것인 방법.
  31. 제28항에 있어서, 단계 (i)에서, 복수 개의 포유동물 세포가, 세포 생존능력이 폴레이트 흡수에 의존하고; 발현 벡터 상에 위치하며 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 발현 벡터 상에 위치하며 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 내부에 안정적으로 도입되어 있는 포유동물 세포로 구성되어 있으며; 여기서, 기능성 막-결합 폴레이트 수용체를 코딩하는 상기의 제1 폴리뉴클레오티드 및 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 상기의 제2 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하며, 발현 벡터가 제8항 또는 제9항에서 정의된 것과 같은 것인 방법.
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