CN103805633B - 有机化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于真核细胞培养方法和用于表达重组目的产物的新选择系统。该选择系统基于引入外源性功能性膜结合叶酸化合物受体基因以及编码目的产物的多核苷酸或基因到真核细胞中，并且该选择系统可广泛用于细胞生存力依赖于叶酸摄取的真核细胞。

Description

有机化合物
本申请是申请日为2008年12月19日的、发明名称为“有机化合物”的中国专利申请200880122105.7(PCT/EP2008/068046)的分案申请。
发明领域
本发明涉及用于真核细胞培养方法以及用于表达目的重组产物的新选择系统。该选择系统基于将外源性功能膜结合叶酸化合物(folate)受体基因以及编码目的产物的多核苷酸或基因引入到真核细胞中，其可广泛用于细胞生存力依赖于叶酸摄取的真核细胞。
发明背景
选择标记和选择系统广泛应用于基因工程、重组DNA技术以及重组产物例如抗体、激素和核酸在真核细胞培养物中的生产。此类显性选择标记和选择系统的首要目的是引入选择基因，所述选择基因在暴露于选择性生长条件后提供能高水平产生重组目的产物的细胞。
迄今，有3种可用的主要选择标记系统：
(a)谷氨酰胺合成酶系统：酶谷氨酰胺合成酶(GS)负责由谷氨酸和氨生物合成谷氨酰胺。该生物合成反应提供了哺乳动物细胞中谷氨酰胺形成的唯一途径。因此，在生长培养基中缺少谷氨酰胺时，酶GS对培养中哺乳动物细胞的存活是必不可少的。重要的是，包括小鼠骨髓瘤细胞在内的某些哺乳动物细胞系缺乏足够GS的表达，因此在没有外源加入的谷氨酰胺时不能存活。因此，此类细胞系是适宜的转染GS基因的受体，在该系统中转染的GS基因可用作允许细胞在缺少谷氨酰胺的培养基中生长的选择标记。相比之下，细胞系如广泛使用的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达足够的GS以支持在不含谷氨酰胺的培养基中的生长。因此，如果这些CHO细胞被用作转染GS基因的受体细胞，则为了抑制内源性GS活性可以应用特异且有效的GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚胺(sulfoximine)(MSX)，这样只有表达高水平的转染的GS基因的转染子可以在不含谷氨酰胺的培养基中存活。GS系统的主要缺点是为了建立稳定过表达目的靶基因的细胞，选择性生长的时间相对较长(即2-6个月)。另一个缺点是频繁利用细胞毒素剂MSX来提升选择压力。这种细胞毒素剂与重组目的产物(例如多肽如抗体)的一起存在可能需要额外纯化步骤来清除该细胞毒素剂。
(b)二氢叶酸还原酶/MTX选择系统：二氢叶酸还原酶(DHFR)催化二氢叶酸至四氢叶酸(THF)的NADP依赖性还原。然后THF与10-甲酰基-THF和5,10-亚甲基-THF（它们分别用于嘌呤和胸苷酸的从头生物合成）相与转换。DHF是胸苷酸合酶(TS)的催化活性的副产物，该胸苷酸合酶在5,10-亚甲基-THF依赖性反应中催化dUMP至dTMP的转化。因此，DHFR对THF辅因子的再循环是至关重要的，而THF辅因子对DNA复制所必要的嘌呤和嘧啶核苷酸的生物合成是必不可少的。因此，缺少DHFR基因(即通过靶向的基因组缺失)的细胞(例如CHO细胞)可用作在不含核苷酸的培养基中转染DHFR基因的受体。转染后，可使细胞接触浓度逐步增长的抗叶酸剂MTX（一种最有效的DHFR抑制剂(Kd=1pM)），由此迫使细胞产生增加水平的DHFR。经多轮选择后，选择标记DHFR通常经历显著的基因扩增。此外，对MTX具有较大耐药性的突变型小鼠DHFR也已广泛用作显著增加转染子细胞中高水平MTX-耐药性的获得的显性选择标记。DHFR/MTX选择系统的主要缺点是该技术利用了诱变性细胞毒素剂MTX，MTX可容易地改变受体细胞的基因型。此外，可能必须采取具体的安全措施来保护操作该活性剂的人员。这常常导致耐MTX的细胞群，在该细胞群中由于还原型叶酸化合物载体(RFC)的功能丧失性突变和/或RFC基因表达的丧失(两者均可破坏MTX摄取)，而不存在目的靶基因的表达。另一个缺点是诱变性药物MTX可容易地污染生长培养基中所含的分泌的过表达靶产物(例如多肽，如抗体)，因此需要费力、耗时且昂贵的色谱方法清除这种诱变性化合物MTX。此外，终产物中MTX的缺乏必须通过相应试验来证实。
(c)还原型叶酸化合物载体选择系统：还原型叶酸化合物载体(RFC)是一种泛表达的膜糖蛋白，其是摄取还原型叶酸化合物如5-甲基-THF和5-甲酰基-THF的主要转运蛋白。然而，RFC对氧化型叶酸化合物，即叶酸(folic acid)，具有很弱的亲和力。因此，缺少RFC表达或基因组RFC座位已缺失的细胞可以用作在如下条件下转染选择标记基因RFC的受体，在所述条件下逐渐从生长培养基中剥夺还原型叶酸化合物如5-甲酰基-THF，从而迫使细胞表达增加水平的该叶酸化合物转运蛋白。RFC选择系统有几个缺点：a)必须使用内源性RFC基因座已经被敲除或者已通过靶向敲除或功能丧失性突变而失活的RFC-无效受体细胞。b)RFC对氧化型叶酸化合物，即叶酸(folic acid)的转运亲和力极弱，因此这种氧化型叶酸化合物不能用于选择。c)与现基于叶酸化合物受体的系统(其为单向叶酸化合物摄取系统并且在下文详细地解释)相反，RFC是表现出同等有力的叶酸化合物输入和输出的双向叶酸化合物转运蛋白。这提示，在叶酸化合物剥夺的情况下，RFC过表达可能对受体细胞是有害的，所述受体细胞会经由过表达的RFC而进一步输出叶酸化合物。
本发明的目的是提供比上述的现有技术选择系统具有某些优势的新代谢选择系统。该新选择系统基于：在细胞培养基中使用叶酸化合物、以及存在经由表达载体引入意欲产生目的产物的重组真核细胞中的叶酸化合物受体。该新方法不需要内源性叶酸化合物受体(FR)基因的在先缺失。在引入包含FR选择基因以及编码目的产物(如多肽)的多核苷酸的载体后，使细胞在含有高度限制性浓度的叶酸化合物的选择培养基中生长。这样，只有显著过表达FR的细胞可摄取足够的叶酸化合物以维持细胞生长、DNA复制和细胞增殖，从而允许过表达目的靶产物。
氧化型叶酸化合物(即叶酸)以及叶酸的还原型衍生物(称为还原型叶酸化合物或四氢叶酸化合物(THF))是一组B-9维生素，其是真核细胞(特别是哺乳动物细胞)中生物合成嘌呤、胸苷酸和某些氨基酸所必不可少的辅因子和/或辅酶。THF辅因子对DNA复制并由此对细胞增殖尤其重要。具体来说，THF辅因子作为一碳单位的供体在一系列相互关联的代谢途径中起作用，所述代谢途径包括嘌呤和胸苷酸的从头生物合成、氨基酸以及甲基基团的代谢(包括DNA的CpG岛甲基化)。具体来说，THF辅因子，包括10-甲酰基-THF(10-CHO-THF)，在涉及嘌呤从头生物合成的两个关键性从头甲酰基转移酶反应中贡献一碳单位。第一个酶甘氨酰胺核苷酸转甲酰酶(GARTF)参与嘌呤的咪唑环形成，而由5-氨基咪唑-4-羧酰胺核苷酸转甲酰酶(AICARTF)介导的更下游反应产生嘌呤中间体肌苷5'-单磷酸(IMP)。后者是受调节的AMP和GMP生物合成的关键前体。此外，5,10-亚甲基-THF(5,10-CH2-THF)是另一个重要的THF辅酶，其作为酶胸苷酸合酶(TS)的关键辅因子起作用。TS催化由dUM P形成胸苷单磷酸(dTMP)。因此，这些叶酸化合物依赖性酶是DNA复制所必需的嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的从头生物合成的关键介质。由此，这些叶酸化合物依赖性酶被确定为叶酸拮抗剂(称为抗叶酸剂)活性的靶点。例如，4-氨基叶酸类似物氨基蝶呤及其同系物4-氨基-10-甲基叶酸氨甲蝶呤(MTX)是第一类抗代谢物，其被引入临床用于化疗治疗儿童急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。抗叶酸剂目前是当前用于治疗其它人类恶性肿瘤(包括骨肉瘤、乳腺癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、绒毛膜癌和妊娠滋养层细胞瘤形成)的不同化疗方案的关键组分。
与合成其自身叶酸化合物的大多数原核生物、植物、真菌和某些protests相比，哺乳动物和其它真核生物物种缺少THF辅因子生物合成，因此必须从外源性来源获得它们。目前已知三个独立的转运系统介导哺乳动物细胞中叶酸化合物和抗叶酸剂的摄取。
a)还原型叶酸化合物辅因子的主要细胞转运系统是还原型叶酸化合物载体(RFC)。RFC(也称为溶质载体家族19成员1，SLC19A1)是广泛表达的～85kDa膜糖蛋白，其是双向易化载体，通过交换有机磷酸(如已知蓄积至非常高细胞内水平的腺嘌呤核苷酸，以及硫胺素单磷酸和焦磷酸)介导还原型叶酸化合物的向上转运。RFC对THF辅因子(包括甲酰四氢叶酸(5-甲酰基-THF；Kt=1μM))显示高亲和力，然而对叶酸，即氧化型叶酸化合物，仅具有很弱的转运亲和力(Kt=200-400μM)。
b)叶酸化合物摄取的另一路径是最近已被克隆的质子偶联叶酸化合物转运蛋白(PCFT，也称为SLC46A)。PCFT似乎独立于RFC表达，在酸性pH(5.5)具有最佳功能并且介导氧化型叶酸化合物(例如叶酸)和THF辅因子(即还原型叶酸化合物)以及各种亲水性抗叶酸剂(包括MTX)的流入。PCFT在酸性pH(5.5)而非生理pH(7.4)显示最佳的叶酸化合物和抗叶酸剂转运，并在小肠上部的叶酸化合物和抗叶酸剂吸收中起关键作用。
c)第三转运路径，即本发明所基于的路径，涉及叶酸化合物受体(FR)。FR是由三种不同基因，FRα、FRβ和FRγ，编码的高亲和力叶酸化合物结合糖蛋白。FRα(或FR alpha)也被称为成人叶酸化合物结合蛋白或FDP、叶酸化合物受体1或FOLR(小鼠中folbp1)，以及卵巢癌相关抗原或MOv18。FRβ(或FR beta)也被称为FOLR2(胎儿)和FBP/PL-1(胎盘)。FRγ(或FR gamma)也被称为FOLR3和FR-G(由M.D.Salazar和M.Ratnam综述，Cancer Metastasis Rev.200726(1)，第141-52页)。成熟FR获得很好的表征，是具有～70-80%氨基酸同一性的同源蛋白，包含229至236个氨基酸以及两个至三个N-糖基化位点。FRα和FRβ是膜结合性的、特别地带糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚的，细胞表面糖蛋白，而FRγ缺少GPI锚且是分泌蛋白。FRα和FRβ对于叶酸(Kd=0.1-1nM)、5,10-二脱氮杂四氢叶酸(DDATHF；洛美曲索(lometrexol)；Ki=0.4-1.3nM，使用[3H]叶酸作为底物)和BGC945(其为仅通过FRα而不通过还原型叶酸化合物载体特异性转运的基于环戊并[g]喹唑啉的胸苷酸合酶抑制剂)(Kd=1nM)显示高亲和力，但对于MTX(Kd>100nM)则显示低得多的亲和力。叶酸化合物和抗叶酸剂的FR依赖性摄取通过经典的受体介导的内吞机制进行。基因敲除研究已显示，FRα(小鼠中也称为Folbp1)对早期胚胎发育以及母体叶酸化合物补充(挽救子宫内胚胎致死以及允许正常发育)是必不可少的。
持续需要安全、高效和成本有效的、能克服迄今已知的选择系统的一个或多个缺点的选择系统。
发明概述
本发明涉及真核生物表达载体，其包括编码功能性膜结合叶酸化合物受体的第一多核苷酸和编码目的产物的第二多核苷酸。
本发明还涉及细胞生存力依赖于叶酸摄取的真核细胞，该真核细胞已稳定地引入了所述表达载体，由此该细胞表达该载体所编码的功能性叶酸化合物受体。
此外，本发明涉及选择方法，该方法用于提供能高产率地稳定表达目的产物的重组真核细胞。
本发明可有利地用于高产率地生产目的产物的方法。
发明详述
在本发明中，现已令人惊讶地发现，可基于在细胞培养基中叶酸化合物的限制可用量，建立用于提供能够产生目的产物的重组真核细胞的选择系统。该系统将是广泛适用的，即，广泛地适用于细胞生存力依赖于叶酸化合物摄取的真核细胞。
该新系统可用于加速选择、筛选和建立在没有细胞毒性药物的情况下稳定地过表达高水平重组产物的真核细胞(例如哺乳动物细胞)克隆。进一步地，并且与其它已知的选择系统不同地，对于，例如通过突变或敲除内源性基因，提供修饰的细胞，并没有必然的需要(尽管有时是可行的)。因为例如FRα对FA(KD=0.1nM)的亲和力比例如RFC对甲酰四氢叶酸(Kt=1μM)的亲和力更高，且FRα通过单向途径转运叶酸到细胞中，因此本发明提供了FRα和其它叶酸化合物受体用作显著改良的显性代谢选择标记的用途，特别是通过从生长培养基中逐步剥夺叶酸化合物(例如叶酸)的方式。该新的基于叶酸化合物的选择是一个优良的策略，十分适于在不存在细胞毒性药物选择(在多种过表达系统中常规使用)的情况下靶蛋白在培养的哺乳动物细胞中加速的、稳定且高水平的过表达。
此新选择系统比现有技术中可用的选择系统具有几个重要的优势。
1.根据本发明的选择系统是非常快速的选择系统。在叶酸剥夺的四个星期内，可容易地分离出表达目的靶基因的细胞群或克隆细胞衍生物。这明显地有别于上述的GS系统，GS系统可能需要2-6个月的靶基因选择和稳定化。
2.根据本发明的选择系统在转染之前不需要内源性FRα、β或γ基因的基因组缺失或衰减，因此可用于任何受体细胞，即使在存在一些内源性FR基因表达时。这种关键的优势是基于以下事实：在FRα转染后，细胞可以暴露于生长培养基中突然且严重的叶酸化合物(例如叶酸)剥夺。由此，仅表达显著量的选择FRα标记的转染子细胞能够转运足够的叶酸化合物以维持DNA复制和细胞增殖。这发生在无内源性FRα基因表达的任何显著升高的情况下。这与上述的DHFR/MTX系统不同，DHFR/MTX系统中受体细胞往往是内源性DHFR基因缺失的(例如CHO DG44细胞和CHO Dux细胞)。
c)根据本发明的选择系统不会遭遇因叶酸化合物摄取替代路径的增加表达(包括内源性RFC的增加表达)引起的选择压力缓解而导致的选择严紧性的丧失。这种重要的优势是因为以下事实：FRα对于叶酸(Kd=0.1nM)具有突出的亲和力，而RFC对于叶酸(Km=0.2-0.4mM)显示极弱的亲和力。相比之下，由于在MTX选择后常常会导致没有选择标记表达或具有弱选择标记表达的MTX耐受性细胞，包括DHFR/MTX系统的多种现有技术选择系统可遭受选择严紧性的严重丧失。而RFC(主要的MTX转运蛋白)的功能丧失可能是MTX耐药性的常见机制。已经显示，这可由频繁出现的RFC基因中失活突变或RFC基因表达的严重丧失所致。
d)根据本发明的选择系统不使用可以改变受体细胞的基因型和目的靶基因的细胞毒性药物和/或诱变性化合物，如DHFR系统中的MTX或GS系统中的MSX。相反地，FR选择所利用的原理是自生长培养基中剥夺维生素。
因此，在一个方面，本发明涉及真核生物表达载体，其包括编码功能性膜结合叶酸化合物受体(即选择标记基因)的第一多核苷酸和编码目的产物的第二多核苷酸。
根据本发明的功能性膜结合叶酸化合物受体特别地被定义为能单向输入或摄取叶酸化合物到真核细胞中的功能性膜结合受体。
根据本发明的叶酸化合物可以是氧化型叶酸化合物(即叶酸)或还原型叶酸化合物。一般而言，任何叶酸化合物均可用于本发明中，只要该叶酸化合物能通过功能性膜结合叶酸化合物受体摄取到真核细胞中。优选的氧化型叶酸化合物的实例是叶酸。优选的还原型叶酸化合物的实例是5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰基-四氢叶酸、10-甲酰基-四氢叶酸和5,10-亚甲基-四氢叶酸。
在优选的实施方案中，本发明的表达载体能在真核细胞中表达功能性膜结合叶酸化合物受体和目的产物两者。
由第二多核苷酸编码的目的产物可以是能通过第二多核苷酸所编码的遗传信息的转录、翻译、或任何其他表达事件产生的任何生物学产物。在这点上，该产物是表达产物。例如，在优选的实施方案中，该产物选自多肽、RNA和DNA。“多肽”是指包括由肽键连在一起的氨基酸聚合物的分子。术语“多肽”包括任何长度的多肽，在较大分子(包括例如约50个以上氨基酸)的情况下可称为“蛋白质”或者在较小分子(包括例如2-49个氨基酸)的情况下可称为“肽”。产物可以是具有药学活性或治疗活性的化合物，或者可以是用于分析试验等的研究工具。在特别优选的实施方案中，该产物是多肽，优选药学上或治疗上活性的多肽，或者是用于诊断或其它分析试验等的研究工具。在最优选的实施方案中，该多肽是免疫球蛋白分子或抗体，或其片段(特别是功能性片段)，例如嵌合体，或部分或完全人源化的抗体。抗体可以是诊断抗体，或药学上或治疗上活性的抗体。通常，目的产物与用于表达的真核宿主细胞异源，这意味着宿主细胞在转染之前不会天然地或内源地产生目的产物。相反地，为了实现目的产物的生产或表达，必须将编码目的产物的多核苷酸，特别地通过用根据本发明的表达载体转染，引入到真核宿主细胞中。
根据本发明的载体可以以线性形式、或者优选地以环状形式例如质粒存在。
用于表达目的多核苷酸的载体通常包含适于驱动转录的转录控制元件，例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录停止信号或终止信号。如果所需产物是蛋白质，适宜的转录控制元件通常包括在载体中，例如5’非翻译区(导致适于募集核糖体的5’帽结构)和终止密码子(以终止翻译进程)。特别地，用作选择标记基因的多核苷酸以及编码目的产物的多核苷酸在存在于适宜启动子中的转录元件的控制下转录。所得的选择标记基因和目的产物的转录物包含利于实质性水平的蛋白质表达(即翻译)的功能性翻译元件。
因此，一个优选的实施方案涉及根据本发明的表达载体，其中第一多核苷酸和第二多核苷酸在分开的转录启动子的控制下。一般地，能引起第一和/或第二多核苷酸在真核细胞中表达(尤其是转录)的启动子是合适的。在一个优选的实施方案中，所述分开的转录启动子是相同的。在另一个优选的实施方案中，所述分开的转录启动子是不同的。优选地，转录启动子选自SV40启动子、CMV启动子、EF1α启动子、RSV启动子、BROAD3启动子、鼠rosa26启动子、pCEFL启动子和β-肌动蛋白启动子。在其一个优选的实施方案中，控制第一多核苷酸和/或第二多核苷酸转录的启动子是CMV启动子，或最优选是SV40启动子。在一个特别优选的实施方案中，控制第一多核苷酸转录的启动子是SV40启动子。
在本发明表达载体的另一个优选的实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸在共同转录启动子的控制下。优选地，该转录启动子选自SV40启动子、CMV启动子、RSV启动子、BROAD3启动子、鼠rosa26启动子、pCEFL启动子和β-肌动蛋白启动子。在其更优选的实施方案中，该共同转录启动子是SV40启动子。具有共同转录启动子的表达载体的一个更优选的实施方案包括功能性地位于第一多核苷酸和第二多核苷酸之间的IRES元件。
借助于本发明的表达载体引入到真核宿主细胞中的膜结合叶酸化合物受体可以来源于任何物种，只要它在本发明内是功能性的，即与所用的真核细胞相容即可。优选地，使用来源于哺乳动物物种的叶酸化合物受体，例如来源于啮齿类动物的叶酸化合物受体，或最优选地人叶酸化合物受体。一般地，引入到真核宿主细胞中且用作选择标记的该叶酸化合物受体可以与宿主细胞的内源性叶酸化合物受体同源或异源。如果是同源的，它来源于与宿主细胞相同的物种，且可以例如与宿主细胞的内源性叶酸化合物受体相同。如果是异源的，它来源于与宿主细胞不同的另一物种，因此可不同于宿主细胞的内源性叶酸化合物受体。通常，用作选择标记的引入的叶酸化合物受体与宿主细胞异源。例如人源性叶酸化合物受体可作为选择标记用于啮齿类动物宿主细胞如CHO细胞。
优选地，由本发明表达载体的第一多核苷酸编码的功能性膜结合叶酸化合物受体选自叶酸化合物受体α(FRα)、叶酸化合物受体β(FRβ)及其功能突变体。功能突变体包括以生理学方式起作用的（即能被真核细胞摄取并通过细胞的叶酸化合物代谢对细胞存活作出贡献的）叶酸化合物受体衍生物。例如，叶酸化合物受体的突变体形式可以包括一个或多个氨基酸突变，如置换、缺失和/或添加、以及化学衍生物，其中化学部分如聚合物(例如聚乙二醇结构(PEG))连接于叶酸化合物受体。优选地，由第一多核苷酸编码的叶酸化合物受体是人叶酸化合物受体α(hFRα)、人叶酸化合物受体β(hFRα)或其功能突变体。最优选的是人叶酸化合物受体α(hFRα)，优选具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO1，1字母代码，按N-端至C-端的方向显示)：
MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTULCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQCNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS
另一优选的实施方案涉及具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO2，1-字母代码，按N-端至C-端的方向显示)的人叶酸化合物受体β(hFRβ)：
MVWKWMPLLLLLVCVATMCSAQDRTDLLNVCMDAKHHKTKPGPEDKLHDQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVNQTWRKERFLDVPLCKEDCQRWWEDCHTSHTGKSNWHRGWDWTSGVNKCPAGALCRTFESYFPTPAALCEGLWSHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFOSAQGNPNEEVARFYAAAMHVNAGEMLHGTGGLLLSLALMLQLWLLG
在一个备选实施方案中，本发明涉及在其自然环境中不是膜结合的叶酸化合物受体。这种非膜结合受体可突变成为膜结合的，例如通过提供该非膜结合叶酸化合物受体与另一多肽的跨膜区之间的融合蛋白。同样地，对于本领域技术人员来说容易可得的其它突变形式也是可以的。在这点上，优选的例子基于可溶性叶酸化合物受体γ(FRγ)，优选人可溶性叶酸化合物受体γ(FRγ)。在其最优选的实施方案中，人可溶性叶酸化合物受体γ(FRγ)具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO3，1-字母代码，按N-端至C-端的方向显示)：
MDMAWQMMQL LLLALVTAAG SAQPRSARAR TDLLNVCMNA KHHKTQPSPEDELYGQCSPW KKNACCTAST SQELHKDTSR LYNFNWDHCG KMEPTCKRHFIQDSCLYECS PNLGPWIRQV NQSWRKERIL NVPLCKEDCE RWWEDCRTSYTCKSNWHKGW NWTSGINECP AGALCSTFES YFPTPAALCE GLWSHSFKVSNYSRGSGRCI QMWFDSAQGN PNEEVAKFYA AAMNAGAPSR GIIDS
然后其可以被突变或者被遗传改变或衍生化以形成能在本发明中实现叶酸化合物摄取的功能性膜结合叶酸化合物受体。
在另一个方面，根据本发明的表达载体还可包括编码一个或多个另外的选择标记的一个或多个其它的多核苷酸。因此，在一个优选的实施方案中，可以通过利用本发明的叶酸化合物系统以及一种或多种不同的选择系统(例如neo/G418)的共选择，提供最佳的性能。
在另一个方面，本发明涉及细胞生存力依赖于叶酸化合物摄取的真核细胞，其中该真核细胞中已稳定地引入了位于表达载体上且编码功能性膜结合叶酸化合物受体的第一多核苷酸和位于表达载体上且编码目的产物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表达载体上或位于分开的表达载体上。在其优选的实施方案中，所述功能性膜结合叶酸化合物受体和所述目的产物被所述真核细胞表达。
除通过表达载体引入到细胞系中的功能性膜结合叶酸化合物受体之外，根据本发明的真核细胞还可以包括至少一种内源功能性单向叶酸化合物转运系统，特别是一种或多种内源功能性膜结合叶酸化合物受体。本发明的一个优势在于，即使存在该内源功能性单向叶酸化合物转运系统(即在保持该内源系统的情况下)，也可以利用下文所描述的选择方法。因此，一个更优选的实施方案涉及本发明的真核细胞，其包括至少一种内源性单向功能性叶酸化合物转运系统，其中该内源性单向功能性叶酸化合物转运系统优选包括至少一种内源性功能性膜结合叶酸化合物受体。在其优选的实施方案中，所述内源性功能性膜结合叶酸化合物受体选自叶酸化合物受体α(FRα)和叶酸化合物受体β(FRβ)。
另一个优选的实施方案涉及根据本发明的真核细胞，其中所述内源性单向功能性叶酸化合物转运系统(例如，包括至少例如一种内源性功能性膜结合叶酸化合物受体)缺乏完全活性，即是衰减的。可以例如通过目的内源性叶酸化合物转运系统(例如内源性功能性膜结合叶酸化合物受体)的任何类型诱变，例如点突变、基因中断等，提供这种衰减。衰减可以是部分的或完全的。在后一情况下，根据本发明的真核细胞不包括内源性功能性单向叶酸化合物转运系统，例如内源性功能性膜结合叶酸化合物受体。因此，本发明一个优选的实施方案涉及已稳定地引入了本发明的表达载体的真核细胞，所述细胞缺乏至少一种内源性功能性膜结合叶酸化合物受体的完全活性。
就引入到所述宿主细胞中的表达载体而言，可以利用如本文所述的任何本发明表达载体(包括其优选的实施方案)。在本发明真核细胞的一个优选实施方案中，编码功能性膜结合叶酸化合物受体的第一多核苷酸和编码目的产物的第二多核苷酸位于同一表达载体上。优选地，该表达载体是根据本发明(即，如本文所述)的表达载体。
根据本发明的真核细胞优选选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。就真菌细胞和植物细胞而言，其对于叶酸化合物通常是原养型的(即，这种细胞可自主地合成对其细胞生存力，即细胞生长和增殖，所必需的自身叶酸化合物)。本发明特别包括可以变成叶酸化合物营养缺陷型的此类真菌和植物细胞。这可以例如通过基因操作实现，即，细胞目前不能合成对其细胞生存所必需的足量叶酸化合物。例如，可以通过诸如适当靶基因的基因破坏或基因沉默、或者关键酶的抑制等，失活该真菌或植物细胞（例如通过适当的代谢途径）内源性地生物合成叶酸化合物的能力。
在其优选的实施方案中，该真核细胞是哺乳动物细胞。优选地，该哺乳动物细胞选自啮齿类动物细胞、人细胞和猴细胞。特别优选的是啮齿类动物细胞，优选选自CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、小鼠3T3成纤维细胞和SP2/0细胞。最特别优选的啮齿类动物细胞是CHO细胞。还优选的是人细胞，优选选自HEK293细胞、MCF-7细胞、PerC6细胞和HeLa细胞。再优选为猴细胞，优选选自COS-1、COS-7细胞和Vero细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备根据本发明的真核细胞的方法，所述方法包括提供细胞生存力依赖于叶酸化合物摄取的真核细胞，和引入位于表达载体上且编码功能性膜结合叶酸化合物受体的第一多核苷酸和位于表达载体上且编码目的产物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表达载体上或位于分开的表达载体上。在优选的实施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表达载体上，在最优选的实施方案中，该表达载体是根据本发明(即，如本文所述)的表达载体。
本发明的再其它方面涉及用于选择真核细胞的方法，其中该真核细胞能稳定地表达由已引入到该细胞中的表达载体编码的目的产物，所述方法包括
(i)提供细胞生存力依赖于叶酸化合物摄取的多个真核细胞，其中在所述细胞中已经引入了位于表达载体上且编码功能性膜结合叶酸化合物受体的第一多核苷酸和位于表达载体上且编码目的产物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表达载体上或位于分开的表达载体上，
(ii)在具有限制性浓度的叶酸化合物的细胞培养基中培养所述多个真核细胞，由此获得稳定表达目的产物的真核细胞。原则上，该叶酸化合物可以是氧化型叶酸化合物或还原型叶酸化合物。优选的是氧化型叶酸化合物，特别是叶酸。
就限制量的叶酸化合物而言，培养基中的适宜浓度可依照宿主细胞的要求以及待用的选择条件的严紧性，由本领域技术人员确定。在叶酸用作该叶酸化合物的情况下，例如对于CHO宿主细胞，用于严紧性选择方法的细胞培养基中适宜的叶酸浓度约为100nM或更低，优选约30nM或更低，或者约10nM或更低。例如，适宜的叶酸浓度可以是在0.001nM-100nM的范围、优选在0.01nM-100nM的范围、更优选在0.1nM-100nM的范围或在1nM-100nM的范围内的任何值。同样地，优选0.001nM-30nM的范围、0.01nM-30nM的范围、0.1nM-30nM的范围、1nM-30nM的范围或3nM-10nM的范围。例如，适于选择的细胞培养基中的叶酸浓度可以是1nM、3nM、10nM或30nM。
在还原型叶酸化合物如甲酰四氢叶酸用于选择方法时，其浓度也可依照宿主细胞的要求以及待用的选择条件的严紧性，由本领域技术人员确定。对于严紧性选择方法，细胞培养基中的甲酰四氢叶酸浓度可以为例如0.2nM-2nM。
在其进一步的实施方案中，选择方法还包括鉴定和分离实现了目的产物的稳定表达的真核细胞。
在选择方法的一个最优选的实施方案中，该多个真核细胞由根据本发明(即，如本文所公开)的真核细胞组成。
本发明此方面的其它优选实施方案如本文所述，特别是就真核细胞和表达载体所描述的。
本发明的另一个实施方案涉及生产目的产物的方法，其包括
(i)实施根据本发明(即，如本文所公开)的选择方法，
(ii)从所述细胞培养基或所述细胞分离目的产物。
本发明此方面的优选实施方案也如本文所述，特别是就真核细胞和表达载体所描述的。
依照本发明产生的目的产物例如多肽可以通过本领域已知方法回收、进一步纯化和分离。例如，多肽可通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心。过滤、超滤、提取或沉淀。纯化可通过多种本领域已知的方法来进行，所述方法包括但不限于色谱法(例如离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、色谱聚焦和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如制备型等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)或提取。
本发明的其它方面涉及功能性膜结合叶酸化合物受体作为选择标记用于选择真核细胞的用途，其中该真核细胞的细胞生存力依赖于叶酸化合物摄取且该真核细胞能稳定地表达目的产物。在该用途的一个优选的实施方案中，所述叶酸化合物受体选自叶酸化合物受体α(FRα)、叶酸化合物受体β(FRβ)及其功能突变体。优选地，在本发明的这个方面中利用的叶酸化合物受体是相应的人叶酸化合物受体，优选人叶酸化合物受体α(FRα)。本发明的这个方面的其它优选的实施方案如本文所述，特别是就真核细胞和表达载体所描述的。
本文所提及的科教书和文件的全部内容通过引用并入本文。
下述实施例用来举例说明本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。具体来说，这些实施例涉及本发明的优选实施方案。
实施例
一般地，此处提及的材料如试剂为本领域技术人员所熟知，市售可得，并且可依照制造商的说明书来使用。
实施例1：利用基于叶酸化合物-受体的选择系统来高水平表达重组抗 体
实施例1.1：表达载体
适于在真核细胞(特别是CHO细胞)中表达的质粒载体(即试验载体)包含(i)包括编码IgG1型分泌重组人抗体的重链和轻链的多核苷酸的表达盒；和(ii)包括作为选择标记基因的编码人叶酸受体α(hFRα)的多核苷酸的不同表达盒，所述质粒载体被构建以研究在培养基中限制性浓度的叶酸化合物(即叶酸)下选择hFRα-转染的细胞的效率。人叶酸受体α(hFRα)的表达在SV40启动子和标准(SV40)多腺苷酸化信号的控制下。重组抗体的表达在CMV启动子和标准(SV40)多腺苷酸化信号的控制下。作为对照(即对照载体)，使用类似的表达载体，其编码相同的抗体，缺乏hFRα表达盒，但含有新霉素磷酸转移酶基因作为选择标记。
实施例1.2：细胞和生长条件
在含有2.3μM(microM)叶酸的适宜的化学成分确知生长培养基中、在悬浮培养条件下维持源自菌株CHO-K1的中国仓鼠卵巢细胞。
为了分析细胞存活对叶酸的依赖性，使用2300nM至0.1nM的叶酸浓度进行叶酸饥饿实验。在该培养基中培养细胞，分析细胞生存力以定量存活细胞的百分比。表1总结了用上述的CHO-K1细胞系所获得的结果。
表1：在不同叶酸浓度下CHO细胞的存活
FA浓度[nM] 存活百分比
0.1 2.08
1 2.45
3 2
10 2.7
30 6.8
100 55.5
300 88.6
1000 100.8
2300 100
这些结果显示，对于这种特定的宿主细胞系，就基于叶酸受体选择稳定转染的细胞而言，低于100nM、优选低于30nM的叶酸浓度应适于产生显著的选择压力。
实施例1.3：转染和选择
用含有hFRα表达盒的试验载体或缺少hFRα的对照载体，通过电穿孔转染细胞。随后在125ml摇瓶中、在补充有适宜浓度的谷氨酰胺和2.3μM(microM)叶酸的培养基中、在悬浮培养条件下生长转染子细胞。转染后48小时，对于试验载体转染的样品，将细胞转移至含有限制量的叶酸，即10nM或1nM叶酸的培养基中，在24孔板中起始根据本发明的选择方法。此外，用对照质粒转染的细胞通过向含有2.3μM(microM)叶酸(即对照1)的培养基中加入选择剂，即0.8mg/mL G418，来选择，或者在缺少任何选择(即对照2)的情况下培养该细胞。将从该选择方案成功回收的细胞转移至6孔板，并在摇瓶中进一步扩增以用于分析抗体生产水平。
实施例1.4：分析抗体的生产
从转染子和叶酸剥夺的细胞群，制备在摇瓶中过度汇合的(overconfluent)分批培养物，以分析抗体表达水平。将细胞以2x105细胞/mL接种在含有2.3μM(microM)叶酸的培养基中，并在悬浮培养(即摇床)条件下孵育。在第14天，收获细胞培养物的上清液，并使用蛋白A HPLC法(即亲合纯化)分析抗体水平。IgG分子主要通过其Fc-部特异地与柱子结合，而其它蛋白通过柱子与基质无相互作用。在低pH条件下，从柱子中洗脱捕获的IgG蛋白，通过UV吸收测量来定量，并在需要时，进一步纯化和分离。
实施例1.5：结果
本方法的目的在于提供下述观点的证据：叶酸化合物基因，特别是hFRα基因，可在叶酸化合物剥夺的条件下用作选择标记，由此选择共-过表达目的产物例如单克隆抗体的细胞。作为对照，也使用含有新霉素耐药性基因作为选择标记的载体。转染后，通过使培养基中的叶酸浓度从2.3μM(microM)突然降至10nM或1nM，对细胞进行严紧性选择。用包含叶酸受体的质粒转染的细胞在叶酸化合物剥夺的条件下容易恢复，并可在选择培养基中进一步扩增。相对地，在对照载体的情况下，叶酸浓度保持不变，但是施加使用G418的选择压力或根本未施加选择压力。然后使用在含有2.3μM(microM)叶酸的培养基中过度生长(即过度汇合)的悬浮(即摇瓶)培养物来分析所选择的细胞群的抗体生产。然后在第14天测定培养基中的抗体浓度。如下表2所示，转染了含有叶酸受体的质粒且通过减少的叶酸可用量选择的细胞过表达重组抗体。与用对照载体转染且用G418选择的细胞相比，由这些转染子细胞群产生的抗体的量更高。作为另一对照，当未应用选择压力时，获得不产生抗体的细胞。这些数据为下述观点提供了证据：目前的叶酸受体基因方法可容易地作为独立运作的显性代谢选择标记使用以快速建立过表达重组目的产物的细胞。
表2：(C叶酸：选择期间培养基中叶酸的浓度；CG418：选择期间培养基中G418的浓度；CmAb：过度生长培养物的培养基中分泌抗体的浓度)
实施例2：重组抗体生产水平随着生长培养基中叶酸浓度的下降而增 加
实施例2.1：表达载体
提供如上文实施例1.1中所述的质粒载体(即试验载体)。
实施例2.2：细胞和生长条件
在含有2.3μM(microM)叶酸的化学成分确知生长培养基RPMI-1640中、在单层培养条件下维持源自菌株CHO-K1的中国仓鼠卵巢细胞。如在其它地方(Assaraf，Y.G.和Schimke，R.T.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，7154-7158；Rothem，L.等人，Mol.Pharmacol.68：616-624)公开，该细胞缺乏RFC转运蛋白活性。该RFC缺陷型细胞在本实施例中使用，以避免因此另外的载体系统而导致的对该叶酸饥饿的潜在规避。
实施例2.3：转染和选择
通过电穿孔用试验载体转染RFC缺陷型C15细胞。转染后48小时，细胞在补充有30nM叶酸的无叶酸培养基中增殖以便促进选择标记以及重组抗体的表达，随后进行稀释克隆。将细胞稀释至5细胞/ml的最终密度，并以100μl/孔接种在96孔板中(即0.5细胞/孔)。然后将克隆维持在含有0.25nM叶酸和500μg/ml G418的培养基中。通过利用本发明叶酸化合物系统以及额外的选择系统(即neo/G418)的共选择，导致最佳性能的选择方法。然后在低叶酸浓度(即1200pM、600pM和60pM)下生长具有最高抗体生产水平的克隆，以进一步支持和建立抗体过表达。这通过进一步分析多个克隆中的抗体表达来确证。
实施例2.4：分析抗体的生产
根据如上文实施例1.4中所述的原理进行抗体生产的分析。如下使用ELISA试验来监控分泌抗体的浓度：Maxisorp微量板用抗-人IgG包被。用含有牛血清白蛋白(BSA)的缓冲液封闭并进行数次洗涤后，加入分泌抗体样品的多个稀释物。然后，加入由山羊抗-人IgG-过氧化物酶组成的过氧化物酶缀合的第二抗体。最后，加入比色的过氧化物酶底物，接着用分光光度法测定每孔中所得的染料浓度，然后与已知IgG浓度的标准浓度相比较。
2.5结果
如下表3所示，重组抗体的生产水平与叶酸剥夺的严紧性相关。因此，当培养基中的叶酸浓度下降时，抗体生产水平增加。这些结果进一步巩固了下述观点的证据：hFRα基因是有效的选择标记，其可用于在叶酸化合物剥夺的条件下过表达重组蛋白。
表3：(C叶酸：培养基中叶酸的浓度；CmAb：培养基中分泌抗体的浓度)

Claims (16)

1.一种用于在哺乳动物细胞中重组表达目的产物的哺乳动物表达载体，其包括编码功能性膜结合叶酸化合物受体作为选择标记的第一多核苷酸，和编码待重组表达的目的产物的第二多核苷酸，其中所述受体为叶酸化合物受体α(FRα)，其中所述目的产物是药学活性或治疗活性多肽或诊断多肽。
2.根据权利要求1中的表达载体，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是在分开的转录启动子的控制下。
3.根据权利要求1的表达载体，其中所述由第一多核苷酸编码的功能性膜结合叶酸化合物受体是人叶酸化合物受体α(hFRα)。
4.权利要求3的表达载体，其中人叶酸化合物受体α由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。
5.权利要求1至4中任一项的表达载体，其中所述多肽是抗体。
6.用于重组生产目的产物的哺乳动物细胞，其中所述细胞的细胞生存力依赖于叶酸化合物摄取，其中该哺乳动物细胞中已经稳定地引入了位于表达载体上且编码功能性膜结合叶酸化合物受体作为选择标记的第一多核苷酸和位于表达载体上且编码目的产物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表达载体上或位于分开的表达载体上，其中所述受体为叶酸化合物受体α(FRα)，其中所述目的产物是药物活性或治疗活性多肽或诊断多肽。
7.权利要求6的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞包含至少一个内源性单向功能性叶酸化合物转运系统。
8.权利要求7的哺乳动物细胞，其中所述内源性单向功能性叶酸化合物转运系统包含至少一个内源性功能性膜结合叶酸化合物受体。
9.根据权利要求6的哺乳动物细胞，其中所述细胞缺乏至少一种内源性功能性膜结合叶酸化合物受体的完全活性。
10.权利要求6的哺乳动物细胞，其中该引入的叶酸化合物受体对于所述哺乳动物细胞是异源的。
11.根据权利要求6至10中任一项的哺乳动物细胞，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表达载体上，且
其中所述表达载体如权利要求1至5中任一项所定义。
12.根据权利要求6至10中任一项的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是啮齿类动物细胞。
13.根据权利要求12的哺乳动物细胞，其中所述啮齿类动物细胞是CHO细胞。
14.制备根据权利要求6至13中任一项的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括提供细胞生存力依赖于叶酸化合物摄取的哺乳动物细胞，和引入位于表达载体上且编码功能性膜结合叶酸化合物受体作为选择标记的第一多核苷酸和位于表达载体上且编码目的产物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表达载体上或位于分开的表达载体上，其中所述受体为叶酸化合物受体α(FRα)，其中所述目的产物是药物活性或治疗活性多肽或诊断多肽。
15.根据权利要求14的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表达载体上。
16.根据权利要求15的方法，其中所述表达载体如权利要求1至5中任一项所定义。
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